FR2973030A1 - Composes a groupements chromophore et photoreactif - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne le domaine du marquage de photoaffinité hydrophobe grâce à des sondes qui sont des composés multifonctionnels lipidiques. Ces composés comprennent au moins un groupement chromophore et deux chaînes lipidiques dont une comprend un groupement photoréactif. Ces composés peuvent être utilisés pour l'étude et l'identification de zones ou domaines hydrophobes au sein de protéines, notamment au sein de virus.
Description
COMPOSES A GROUPEMENTS CHROMOPHORE ET PHOTOREACTIF
DESCRIPTION L'invention concerne le domaine du marquage de photoaffinité hydrophobe grâce à des sondes qui sont des composés multifonctionnels lipidiques. Ces composés comprennent au moins un groupement chromophore et deux chaînes lipidiques dont une comprend un groupement photoréactif. Ces composés peuvent être utilisés pour l'étude et l'identification de zones ou domaines hydrophobes au sein de protéines, notamment au sein de virus.
On connait des sondes qui permettent de marquer ou d'identifier des domaines hydrophobes au sein de protéines. Toutefois, les sondes de l'état de la technique utilisent la détection au moyen d'un élément radioactif tel 1251 qui émet des rayonnements gamma. Outre les difficultés rencontrées lors de leur préparation, de telles sondes présentent également des risques lors de leur utilisation. Ainsi, l'utilisation de telles sondes est limitée voire empêchée pour certaines applications. Comme exemple de sondes d'identification de domaines hydrophobes de protéine, on connait celles décrites par Brunner qui mettent en oeuvre 1251 avec les inconvénients et problèmes qui en découlent (Annu. Rev. Biochim. 1993. 62. 483-514).
Il existe donc un besoin de disposer de sondes de marquage ou d'identification de protéines qui apportent une solution à ces problèmes et qui permettent d'éviter les inconvénients liés à l'utilisation des sondes connues.
La présente invention permet d'apporter une solution à tout ou partie des problèmes liés aux sondes de l'état de la technique. Ainsi et de manière particulièrement avantageuse, l'invention fournit des composés qui répondent à au moins à deux critères distincts : ils sont photoréactifs et ils sont détectables, par exemple par fluorescence. De manière encore plus avantageuse, ces composés selon l'invention possèdent au moins trois fonctionnalités. Ils sont de structure lipidique, ils sont photoactivables et ils sont détectables. Ces trois fonctionnalités sont connectées ensemble par une plateforme commune.
Ainsi, la présente invention fournit une sonde sous la forme d'un composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle, substituée par - au moins un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ; - une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ; - une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif. De manière avantageuse, le composé selon l'invention est de formule (I) et comprend - une plateforme de liaison Q au moins trifonctionnelle, substituée par - au moins un groupement chromophore Q1 choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ; - une première chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L1 ; - une deuxième chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L2 et comprenant un groupement photoréactif Q2 ;
L-1\~ H / , NL2i n Q 2 m H (I) dans laquelle - Q représente une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ; - p représente 1, 2 ou 3 ; - Q1, identique ou différent, représente indépendamment un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ; - L1 et L2, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupement choisi parmi NH, C(0), S, O ; - Q2 représente un groupement photoréactif ; - m représente un nombre entier allant de 0 à 24 ; - n représente un nombre entier allant de 1 à 24 ; - la somme de m et de n est comprise entre 1 et 30 ; - q représente un nombre entier allant de 1 à 30. De manière préférée, le composé selon l'invention est un composé de formule (I) dans laquelle - p représente 1 et Q1 représente un groupement fluorescent ; ou - p représente 2 et Q1 représente indépendamment deux groupements fluorescents, identiques ou différents ; un groupement fluorescent et un groupement absorbant ; un groupement fluorescent et un groupement luminescent ; ou - p représente 3 et Q1 représente indépendamment un groupement luminescent et deux groupements fluorescents, identiques ou différents. De manière préférée pour le composé selon l'invention, la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ou Q représente un groupement choisi parmi les dérivés acides aminés, les dérivés du glycérol, les dérivés triacides carboxyliques, les dérivés triamines ; en particulier un groupement dérivé d'un alpha-aminoacide et comprenant deux fonctions amines et une fonction carbonyle. Ainsi, l'invention concerne également un composé de formule (Il) O H QH L Q2 i H H m (Il) dans laquelle Q', L', L2, Q2, m, n et q sont tels que définis pour le composé de formule (I). De manière avantageuse, l'invention concerne également un composé de formule (III) O H N Q H H NH (III) dans laquelle Q', Q2, m, n et q sont tels que définis pour les composés de formule (I) ou de formule (Il).
De manière préférée, l'invention concerne un composé de formules (I), (Il) ou (III) pour lesquelles - m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou - n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou - q représente un nombre entier allant de 6 à 26 ; ou - la somme de m et de n est comprise entre 4 et 24 ; ou encore un composé de formules (I), (Il) ou (III) pour lesquelles - m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et - n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et - q représente un nombre entier allant de 8 à 24 ; et - la somme de m et de n est comprise entre 6 et 18.
De manière avantageuse pour le composé selon l'invention, le groupement chromophore ou Q' est indépendamment choisi parmi la rhodamine, la fluorescéine, les dérivés de la rhodamine, la rhodamine substituée et les dérivés de la fluorescéine, la fluorescéine substituée, tels que notamment les fluorophores disponibles commercialement dans la série Molecular Probes (Invitrogen) et couvrant une large gamme de fluorescence, les colorants, les substances colorées absorbant dans le visible (400 à 800 nm), la luciférine, le luminol, les dérivés du luminol. De manière préférée le groupement chromophore ou Q' est choisi parmi la rhodamine et ses analogues, par exemple la carboxytétraméthylrhodamine. De manière également avantageuse, le composé selon l'invention peut comprendre deux groupements chromophores, par exemple un dérivé de la rhodamine et un dérivé de la fluorescéine.
La présence de deux groupements chromophores au sein du composé selon l'invention est particulièrement avantageuse lors de sa mise en oeuvre pour des utilisations selon le principe de transfert de fluorescence par énergie de résonance (FRET). 25 De manière avantageuse pour le composé selon l'invention, le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi les groupements générateurs de carbène, les groupements générateurs de nitrène, les dérivés d'arylcétone. De manière préférée, le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi un groupement comprenant une fonction diazo ou diazoester, un groupement dérivé de la diazirine, notamment le 3-trifluorométhyl-3-phényl-diazirine (TID) ou la pentafluorophenylazide, un groupement comprenant une fonction arylazide, acylazide, alkylazide, diazoester, un groupement dérivé de la benzophénone et un groupement de formule (IV) (IV)
Outre un composé utile comme sonde, l'invention concerne également un procédé de préparation d'un tel composé. Ce procédé de préparation selon l'invention comprend la réaction - d'un composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ; - d'au moins un composé comprenant un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent et un groupement luminescent ; - d'un composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité; - d'un composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une 20 extrémité et comprenant un groupement photoréactif.
De manière générale, pour le procédé de préparation selon l'invention, l'ordre des étapes n'a pas un caractère essentiel. Ainsi, l'ordre de mise en oeuvre des différents réactifs est indifférent, cet ordre peut aisément être adapté selon les réactifs utilisés ou encore selon les conditions réactionnelles. Le procédé de préparation selon l'invention permet de préparer l'ensemble des composés selon l'invention, en particulier les composés de formules (I), (Il) ou (III) ainsi que leurs analogues préférés.
De manière avantageuse, le procédé selon l'invention met en oeuvre une plateforme de liaison au 3o moins trifonctionnelle qui comprend une fonction amine primaire libre, une fonction amine primaire protégée et une fonction acide carboxylique. De manière avantageuse, le procédé selon l'invention comprend alors les étapes : - de réaction de la fonction amine primaire avec le composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ; - de réaction de la fonction acide carboxylique avec le composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif ; - de déprotection de la fonction amine primaire protégée ; - de réaction de la fonction amine primaire déprotégée avec le composé comprenant un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, groupement fluorescent ou un groupement luminescent. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre pour la préparation d'un composé selon l'invention, en particulier pour la préparation d'un composé de formule (I), de formule (Il) ou de formule (III).
De manière particulière, le procédé de préparation selon l'invention met en oeuvre, comme plateforme, un squelette d'a-aminoacide disponible commercialement : l'acide Na-Boc-L-2,3-diaminopropionique (Boc-Dpr-OH). Il a l'avantage de présenter trois fonctionnalités différentes : une amine primaire libre, une amine primaire protégée et un acide carboxylique libre et est capable de réagir de manière sélective et successivement, par formation d'une liaison peptidique avec trois molécules différentes. La benzophénone est choisie comme groupement photoréactif et est intégrée au sein d'un acide gras. Enfin, un dérivé de la rhodamine est utilisé comme groupement chromophore : la carboxytétraméthylrhodamine (CTMR). Ce dérivé présente des propriétés avantageuses telles que sa fluorescence ainsi que sa stabilité dans les conditions de synthèse et sa relative insensibilité aux changements de pH. Le procédé de préparation selon l'invention peut être mis en oeuvre selon l'enchaînement des schémas 1, 2 et 3. toluene AICI3 CI o lb o Schéma 1 Ainsi, trois précurseurs lipidiques la-c sont préparés selon une procédure connue ou bien selon la méthode de préparation selon l'invention. Ainsi, les composés la et lb peuvent être préparés selon la méthode décrite par Lala et al. (J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 3982-3988) et par Gan et al. (J. Org. Chem., 2006, 71, 9487-9490). Tandis que le précurseur lipidique 1c peut être préparé à partir de la méthode décrite par Gan et al. (J. Org. Chem., 2006, 71, 9487-9490) modifiée selon les conditions du schéma 2. 7 O 1. MeOH, DMAP 2. LiAIH4, Et2O 3. Swern O
OH OR 6a-b OH AcO H/THF/H 20 ou Bu4N-F*, THF OH 8 1c Schéma 2 Le précurseur 4-n-décylbenzaldéhyde 5 peut être préparé en trois étapes avec un bon rendement (77 %) à partir du chlorure de 4-décylbenzoyle commercialement disponible. Tout d'abord le chlorure 5 d'acyle est transformé en son ester méthylique puis complètement réduit en son alcool correspondant. L'alcool primaire est oxydé en 5 en utilisant la méthode décrite par Omura et Swern (Tetrahedron 1978, 34, 1651-1660). De manière alternative, le précurseur 5 peut également être synthétisé en une seule étape par une réduction de Rosemund à partir du chlorure de 4-décylbenzoyle avec un rendement de 64 %.
Parallèlement, deux stratégies sont disponibles pour protéger l'alcool 2-(4-bromophenyl)éthanol commercialement disponible. Tout d'abord, le dihydropyrane (DHP) est utilisé et après 6h de réaction, l'acétal correspondant 6a est obtenu avec un rendement de 92% puis couplé avec l'aldéhyde 5 avec un rendement de 19 %. Une stratégie alternative consiste à utiliser du chlorure de triisopropylsilyle (TIPSCI) en présence d'imidazole pour permettre la conversion du 2-(4-bromophenyl)éthanol en son éther de silyle correspondant 6b avec un très bon rendement (99%) et en 2h. Le composé 6b est traité avec du n-butyl-lithium à -78 °C puis couplé avec 5 pour donner l'alcool secondaire 7b sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 70 %. Ensuite, du tétra-n-butylammonium fluoride (TBAF) est utilisé pour déprotéger 7b et l'alcool primaire 8 est obtenu avec un rendement de 73 %. Enfin, 8 est doublement oxydé suivant la méthode de Jones pour obtenir 1c sous la forme d'un solide blanc avec un rendement de 91 %.
En partant du 4-n-décylbenzaldéhyde, le rendement global de la synthèse est de 46 % alors qu'il n'est que de 22 % avec des synthèses déjà décrites dans la littérature. Finalement, le rendement global de cette synthèse est de 35 %, 7 étapes peuvent être nécessaires pour obtenir le produit final l c à partir du chlorure de 4-décylbenzoyle commercialement disponible suivant une stratégie de synthèse convergente. Ainsi, il est possible d'obtenir l'acide (4-(4-décylbenzoyl)phényl)éthanoique (C10-BP-C1- COOH, 1c) avec un bon rendement et un nombre d'étapes réduit, à partir de l'aldéhyde. Cette amélioration ouvre une nouvelle voie plus efficace pour la synthèse d'autres analogues selon la méthode de préparation selon l'invention. Les précurseurs lipidiques la-c peuvent être utilisés pour la préparation de composés 12a-c selon l'invention selon le schéma 3. o O Boc-Dpr-OH (CH2), OH O N + \~\OH O o la-c NH2 O PyBOP, DIEA H N \~\OH PyBOP, DIEA H N /,,, / H (CH2)14 o NH NHr -(CH2)14 O NH 9a-c o HZN /~ / TFA, CH2Cl2 \/\H (CHZ)14 NH 11a-c 10a-c \N/ (CH2)14 H Schéma 3
Trois précurseurs lipidiques ou analogues d'acide gras comprenant un groupement benzophénone (FABP) 1 a-c sont ainsi disponibles et utilisés dans la synthèse de composés selon l'invention, 20 notamment utiles comme nouvelles sondes lipidiques. Toutes les expériences sont réalisées à l'abri de la lumière. Afin de contrôler l'état d'avancement de chaque étape de la synthèse par UV, l'acide gras contenant la benzophénone (FABP) est introduit sur le squelette ou plateforme lors de la première étape de synthèse des composés selon l'invention. Pour ce faire la fonction acide carboxylique de ce synthon est activée grâce à du PyBOP en milieu basique (DIEA). Ensuite le Boc-Dpr-OH est ajouté à la solution. Après traitement, Boc-Dpr(FABP)-OH 9a-c sont isolés, caractérisés et ensuite la fonction acide carboxylique libre de Boc-Dpr(FABP)-OH est activée avec du PyBOP en présence de DIEA avant l'ajout de l'hexadécylamine. Boc-Dpr(FABP)-NHC16H33 10 a-c sont isolés, caractérisés et ensuite la fonction amine est déprotégée en milieu acide : mélange de TFA et dichlorométhane (1/1 v/v). Après traitement H-Dpr(FABP)-NH-C16H33 11 a-c sont isolés et caractérisés. Pour finir et de manière très avantageuse, CTMR est le dernier synthon à être introduit sur le squelette. Après l'activation de la fonction acide carboxylique de CTMR par du PyBOP en présence de DIEA, H-Dpr(FABP)-NH-C16H33 est ajouté. La progression de la réaction est suivie par CCM. Après traitement, Rhod-Dpr(FABP)-NH-C16H33 12 a-c sont isolés sous la forme d'une poudre violette. Tous les composés finaux ou intermédiaires sont caractérisés par CCM, MS ou RMN. Il est à noter que la carboxytétraméthylrhodamine est disponible commercialement, en particulier sous la forme d'un mélange de deux régio-isomères. Ces deux régio-isomères sont détectables en HPLC mais généralement difficilement séparables. Cette séparation n'est pas nécessaire pour l'utilisation des composés selon l'invention, en particulier comme sondes en milieu biologique.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un composé selon l'invention pour l'identification d'une protéine. Ainsi, l'invention concerne une méthode d'identification d'une protéine comprenant l'utilisation d'un composé selon l'invention.
De manière avantageuse, la méthode d'identification selon l'invention est mise en oeuvre pour l'identification d'un fragment hydrophobe au sein d'une protéine. De manière également avantageuse, la méthode d'identification selon l'invention est mise en oeuvre pour l'identification d'un ou plusieurs domaines transmembranaires au sein d'une protéine membranaire.
De manière préférée, la méthode d'identification selon l'invention est mise en oeuvre pour l'identification d'une protéine de fusion ou d'un peptide de fusion virale. La protéine de fusion à identifier peut être une protéine de fusion d'un virus de l'hépatite, par exemple de l'hépatite B ou de l'hépatite C, ou encore du VIH, d'un virus de la grippe ou d'un virus vétérinaire.
De manière également préférée, la méthode d'identification selon l'invention comprend a- la mise en contact du composé avec la protéine ; b- la photoactivation du composé ou du groupement photoréactif du composé ; c- la réaction du groupement photoactivé du composé avec la protéine ; d- l'activation et la détection ou la détection de la fluorescence ou de l'absorbance du groupement chromophore au sein du produit de réaction.
De manière avantageuse, la mise en contact du composé selon l'invention avec la protéine est effectuée au moyen de micelles ou de systèmes à bicouches lipidiques, par exemple des liposomes.40 La méthode d'identification selon l'invention comprend la photoactivation d'un composé selon l'invention qui est avantageusement réalisée - avec une source choisie parmi une lampe ou un laser ; ou - la puissance d'activation est comprise entre 0,1 et 1000 W ; ou - la longueur d'onde est comprise entre 250 et 500 nm ; ou - la durée d'activation est comprise entre 1 seconde et 2 heures, qu'elle soit effectuée de manière continue ou de manière séquencée ou pulse.
De manière particulièrement avantageuse, la méthode d'identification selon l'invention permet une très large gamme d'identification grâce au photomarquage hydrophobe de nombreux domaines ou zones protéiques. En effet, selon la position du groupement photoactivable sur la chaîne lipidique au sein du composé selon l'invention qui est utilisé, ce composé va pouvoir se lier de manière particulière et en une positon spécifique au sein de la protéine à identifier. De la même manière, l'autre chaîne lipidique, notamment du fait de sa longueur, peut être adaptée en fonction de l'environnement lipidique ou membranaire rencontré lors de la mise en oeuvre de la méthode d'identification selon l'invention. Ainsi, l'adaptation de la longueur des chaînes lipidiques permet au composé selon l'invention de se positionner convenablement au sein du domaine hydrophobe de la protéine, notamment en évitant ou en limitant ses mouvements ou bien en limitant ou en évitant que ses chaînes lipidiques ne se replient sur elles-mêmes empêchant ainsi leur positionnement correct vis-à- vis du domaine hydrophobe étudié ou à identifier. Le composé selon l'invention mis en oeuvre pour la méthode d'identification selon l'invention permet donc un ancrage convenable au sein de la protéine à identifier. Par ailleurs, parmi tous les groupements chimiques photoréactifs ou photoactivables qui peuvent être présents au sein du composé selon l'invention, la benzophénone est particulièrement avantageuse pour l'étude des interactions protéine-protéine et protéine-lipide. En effet, la longueur d'onde d'activation de la benzophénone se situant aux alentours de 365 nm, la dégradation des protéines est limitée voire nulle, permettant donc de réaliser des études en milieu cellulaire ou au sein d'autres systèmes vivants. De plus, le radical généré lors de la photoactivation de la benzophénone va réagir en milieu hydrophobe sur une liaison C-H de manière covalente avec un bon rendement et permet donc une identification précise de l'environnement chimique de l'adduit formé. Enfin, la benzophénone est chimiquement stable à la lumière ambiante et vis-à-vis de la plupart des conditions de synthèse utilisées en chimie.
Les différents aspects de l'invention peuvent être illustrés par les exemples qui suivent.
Exemples de méthode de préparation et de composés : L'acide aminé Boc-L-Dpr-OH est acheté chez Iris Biotech GmbH. La ninhydrine, l'acide phosphomolybdique et l'acide trifluoroacétique proviennent de chez Sigma-Aldrich. La carboxytétraméthylrhodamine et le PyBOP sont achetés chez Novabiochem. L'hexadécylamine provient de chez Aldrich et la DIEA de chez Alfa Aesar. L'acide 6-(4-(4-nhexylbenzoyl)phényl)hexanoïque est synthétisé suivant le protocole mentionné ci-dessus. Les réactifs chimiques sont utilisés sans purification supplémentaire. Le CH2Cl2 et le THF sont distillés sous atmosphère inerte (flux d'argon) et séché sur CaH2 et sodium (en présence de benzophénone) respectivement. La chromatographie est réalisée sur gel de silice 60 (40-63 µm): la poudre et les plaques d'aluminium pour les CCM sont achetés chez Merck. Les spectres RMN 1H et 13C sont enregistrés sur des appareils Brucker 300 MHz ou 400 MHz. Les déplacements chimiques du proton (a) sont rapportés en ppm et le spectre est calibré par rapport au pic du solvant résiduel deutérée. Les constantes de couplage (J) sont rapportées dans Hz. Les spectres de masse (ES-MS) sont enregistrés sur un spectromètre de masse ESI / TOF Mariner. Pour les composés décrit pour la première fois, une masse à haute résolution (HR-MS) est mesurée sur spectromètre de masse GC / TOF Agilent. Les points de fusion sont mesurés sur un Büchi B-540. Les analyses HPLC sont effectuées avec une colonne Jupiter 5u C4 300A (150 x 4,6 mm, C4) Phenomenex avec un débit de 1 mL / min en utilisant un gradient linéaire de 10 min de 0 à 100 % de CH3CN dans l'eau (0,1% de TFA), suivies de 5 min à 100% CH3CN (0,1% de TFA). Les temps de rétention (Tr) des analyses HPLC sont présentés en minutes.
Acide (4-(4-décvlbenzovl)phényl)éthanoiaue Méthyl 4-décvlbenzoate C18H2802 - PM : 276,4 g.mol-1 m 10 9 11 ^ i/O
12 7 h 12 o Du chlorure de 4-décylbenzyole (1,00 g - 3,56 mmol) est dissous dans 10 mL de méthanol sous agitation et à température ambiante. Puis du diméthylaminopyridine (43 mg - 0,36 mmol) est ajouté à la solution et le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 1 h. Le méthanol est ensuite évaporé sous pression réduite puis la solution est redissous dans 20 mL de CH2Cl2. Le mélange obtenu est lavé avec de l'eau (2 fois 20 mL). La phase aqueuse est extraite avec CH2Cl2 et les phases organiques récupérées sont séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit formé est séché sous la pompe à palettes pendant une nuit pour conduire au produit désiré sous la forme d'une huile incolore (973 mg - Rdt : 99%).
CCM : Rf = 0,7 (cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v) RMN 1 H (400 MHz ; CDCI3) 8 = 7,96 (d, 2H8+12, J = 8,2), 7,24 (d, 2H9+11, J = 8,2), 3,90 (s, 3Hh), 2,66 (t, 2Hj, J= 7,8), 1,63 (m, 2Hk), 1,32-1,27 (m, 14H1+m), 0,89 (t, 3H,, J= 6,7) RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) 8 = 167,8 (C;), 149,1 (C10), 130,3 (C8+12), 129,0 (C9+11), 128,3 (C7), 52,5 (Ch), 36,7 (Ci), 32,6, 31,8, 30,2, 30,2, 30,1, 30,0, 29,9 (Cl+k pour les sept pics), 23,3 (Cm), 14,7 (Ch) 35 Masse : m/z = 277,2 [M+H]+, masse calculée = 276,2 4-décylphénylméthanol C17H280 - PM : 248,4 g.mol-1 8 De l'aluminium lithium hybride (40 mg - 1,03 mmol) est dissous dans 15 mL d'éther diéthylique sous agitation, sous argon et à température ambiante dans un ballon sec muni d'un condenseur. Puis du méthyl 4-décylbenzoate (950 mg - 3,43 mmol) est ajouté goutte à goutte à la solution et le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 1 h. 20 mL d'eau sont ensuite ajoutées avec précaution à la solution puis celle-ci est versée dans de l'eau glacée et une solution aqueuse à 10 % H2SO4 (v/v) est ensuite ajoutée. La phase aqueuse est extraite avec de l'éther diéthylique et les phases organiques récupérées sont séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution Cyclohexane/AcOEt 95/5 à 80/20 v/v) pour conduire au produit désiré obtenu sous la forme d'un solide blanc (768 mg - Rdt : 90%). CCM : Rf = 0,6 (Cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v) RMN 1H (300 MHz ; CDCI3) 8 = 7,29 (d, 2H8+12, J= 7,9), 7,19 (d, 2H9+11, J= 7,9), 4,65 (s, 2H;), 2,63 (t, 2Hj, J= 7,8), 1,63 (m, 2Hk), 1,29 (m, 14H1+m), 0,91 (t, 3Hn, J= 6,8) RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) 8 = 143,1 (C7), 138,8 (C10), 129,2 (C9+11), 127,8 (C8+12), 65,9 (C;), 36,3 (Ci), 32,6, 32,2, 30,3, 30,2, 30,0 (Cl+k pour les 5 pics), 23,3 (Cm), 14,7 (Cri) Masse (GCMS) : m/z = 246,2 [M]+, masse calculée = 248,2 g.mol-1 4-décylbenzaldéhyde (5) C17H260 - PM : 246,4 g.mol-1 m I I I 12 A du chlorure d'oxalyle (390 pL - 4,63 mmol) à -78 °C est ajouté, avec précaution, du diméthylsulfoxyde (460 pL - 6,49 mmol) en solution dans 10 mL de CH2Cl2 à -78 °C, sous argon et sous agitation pendant 10 min. Puis du 4-décylphényl méthanol (768 mg - 3,09 mmol) dissous dans 10 mL de CH2Cl2 est ajouté prudemment à -78 °C. La solution résultante est agitée pendant 20 min.
De la triéthylamine (1,73 mL - 12,4 mmol) est ensuite ajoutée puis la solution est laissée revenir à température ambiante. 20 mL d'une solution de NaHCO3 saturée sont ensuite ajoutés au milieu réactionnel. La phase aqueuse est extraite avec du diéthyl éther (1 fois 50 mL). Les phases organiques réunies sont lavées avec une solution de KHSO4 saturée, avec une solution de NaHCO3 saturée et avec de la saumure puis séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire au produit 5 obtenu sous la forme d'une huile incolore (662 mg - Rdt : 87%). CCM : Rf = 0,7 (Cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v) RMN 1H (300 MHz ; CDCI3) 8 = 9,98 (s, l Hi), 7,80 (d, 2H8+12, J= 8,0), 7,34 (d, 2H9+11, J= 8,1), 2,69 (t, 2Hi, J= 7,8), 1,65 (m, 2Hk), 1,27 (m, 14H1+m), 0,89 (t, 3Hn, J= 6,6) m 11 >OH 7 12 12 RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) 8 = 192,5 (C;), 151,1 (C10), 135,1 (C7), 130,5 (C8+12), 129,7 (C9+11), 36,9 (Ci), 32,6, 31,7, 30,2, 30,1, 30,0 (Cl+k pour les 5 pics), 23,3(Cm), 14,7 (Cri) Masse : m/z = 247,2 [M+H]+, masse calculée = 246,2 g.mol-' 4-bromophénéthoxytriisopropvlsilane (6b) C17H29OBrSi - PM : 357,4 g.mol-' De l'alcool 4-bromophénéthyle (500 mg - 2,48 mmol) est dissous dans 10 mL CH2Cl2 puis du chlorure de triisopropylsilyle (720 mg - 3,73 mmol) et de l'imidazole (506 mg - 7,44 mmol) y sont ajoutés. La solution est agitée à température ambiante pendant 2 h. La phase organique est lavée avec une solution de NaHCO3 saturée (2 fois 10 mL), avec de l'eau (1 fois 10 mL) et avec de la saumure (1 fois 10 mL). La phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2 (2 fois 30 mL). Les deux phases organiques collectées sont séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution cyclohexane/AcOEt 100/0 à 100/10 v/v) pour conduire au produit 6b obtenu sous la forme d'une huile incolore (880 mg - Rdt : 99 %).
CCM : Rf = 0,9 (cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v) RMN 1H (300 MHz ; CDCI3) 8 = 7,40 (m, 2H3+5), 7,11 (m, 2H2+6), 3,87 (t, lHb, J = 6,9), 2,81 (t, 1 Ha, J = 6,9), 1,05 (m, 21 Hc+d) RMN 13C (CDCI3) 8= 139,0 (C1), 131,9 (C3+5), 131,6 (C2+6), 120,6 (C4), 65,1 (Cb), 39,8 (Ca), 18,6 (Cd), 12,7 (Cc) Masse : m/z = 357,1 [M+H]+, masse calculée = 356,1 g.mol-' Synthèse de (4-décvlphényl)(4-(2-(triisopropvlsilyleoxy)éthyl)phényl)méthanol (7b) C34H56O2Si - PM : 524,9 g.mol-1 OH L'alcool protégé 6b (957 mg - 2,67 mmol) est dissous dans 10 mL de THF sous agitation, sous argon et à -78 °C dans un bicôl sec. Puis du n-butyl lithium (1,8 mL - 2,92 mmol) est ajouté goutte à goutte à la solution et celle-ci est laissée sous agitation à -78 °C pendant 1 h. L'aldéhyde 5 (600 mg - 2,43 mmol) dissous dans 10 mL de THF est ensuite ajouté, goutte à goutte, à la solution maintenue à - 78°C puis on laisse le milieu réactionnel revenir à température ambiante et la solution est agitée pendant 12 h. 20 mL d'une solution de NaHCO3 saturée sont ajoutés à la solution et celle-ci est ensuite extraite avec AcOEt. Les phases organiques récupérées sont lavées avec une solution de NaHCO3 saturée et de la saumure puis séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution m i d d c/ d 2 a cc 83 SÎ' d Cyclohexane/AcOEt 100/0 à 100/7 v/v) pour conduire au produit 7b obtenu sous la forme d'une huile incolore (892 mg- Rdt : 70%) CCM : Rf = 0,6 (Cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v) RMN 1H (400 MHz ; CDCI3) 8 = 7,32 - 7,13 (m, 8H2,3,5,6,8s,11,12), 5,81 (s, l Hi), 3,89 (dt, 2Hb, J = 10,6, 7,2), 2,86 (dt, 2Ha, J = 10,6, 7,2), 2,59 (t, 2Hi, J = 7,8), 1,59 (m, 2Hk), 1,30 (m, 14H1+m), 1,05 (m, 21 Hc+d), 0,89 (t, 3Hn, J= 6,7) RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) 8 = 142,9, 142,5 (C7+4 pour les 2 pics), 141,9 (C10), 139,2 (C1), 129,9, 129,1, 127,1 (C2,3,5,6,8,911,12 pour les 3 pics), 76,7 (C;), 65,5(Cb), 40,1 (Ca), 36,3 (Ci), 32,6, 32,2, 30,3, 30,2, 30,0 (Ck,l pour les 5 pics), 23,4 (Cm), 18,6 (Cd), 14,8 (Cn), 12,7 (Co) Masse : m/z = 547,4 [M+Na]+, masse calculée = 524,4 g.mol-1 Synthèse de 2-(4-((4-décvlphénvl)(hydroxy)méthvl)phénvl)éthanol (8) C25H3602 - PM : 368,5 g.mol-1 mi 9 2 a 1i 8 3 OH 11 6 7 4 5 12 OH 7b (842 mg - 1,60 mmol) est dissous dans 10 mL de THF sous agitation et du fluorure de tetra-n- butylammonium (3 mL - 3 mmol) est ajouté à la solution. Celle-ci est laissée sous agitation pendant 1,5 h. 10 mL d'une solution de NaHCO3 saturée sont ajoutés à la solution et celle-ci est ensuite extraite avec AcOEt. Les phases organiques récupérées sont lavées avec une solution de NaHCO3 saturée puis séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2C12/MeOH 100/0 à 98/2 v/v) pour conduire au produit 8 obtenu sous la forme d'un solide blanc (427 mg- Rdt : 73%) CCM : Rf = 0,5 (CH2C12/MeOH 9/1 v/v) RMN 1H (300 MHz ; CDCI3) 8 = 7,36 - 7,14 (m, 8H2335566889911112), 5,82 (s, 1H,), 3,85 (m, 2Hb), 2,86 (t, 2Ha, J= 6,5), 2,58 (t, 2HJ, J= 7,8), 1,59 (m, 2Hk), 1,26 (m, 14HI+m), 0,89 (t, 3Hn, J= 6,7) RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) 8 = 143,0 (C7), 142,9 (C4), 141,8 (C10), 138,3 (C1), 129,7 (C9,11), 129,2 (C2,6), 127,4 (C8,12), 127,1 (C3,5), 76,6 (Cl 64,2 (Cb), 39,5 (Ca), 36,3 (Ci), 32,6, 32,1, 30,3, 30,2, 30,0 (Ck+l pour les 5 pics), 23,4 (Cm), 14,8 (Cn) Masse : m/z = 351,2 [M+H-H2O]+, masse calculée = 368,3 g.mo1-1 Acide (4-(4-décvlbenzovl)phénvl)éthanoiaue (1 c) C25H3203 - PM : 380,5 g.mol-1 2 a 1 b 11 6 7 4 5 12 O
8 (410 mg - 1,11 mmol) est dissous dans 10 mL d'acétone puis 1 mL de réactif de Jones 2,67 M (26,72 g de trioxyde de chrome, 23 mL d'acide sulfurique concentré, 77 mL d'eau) est ajouté goutte à goutte à la solution. Celle-ci est agitée à température ambiante pendant 2 h. L'excès de réactif est réduit par quelques gouttes d'isopropanol. 20 mL d'eau sont ensuite ajoutés au milieu réactionnel pour b dissoudre le précipité de sel de chrome. L'acétone est évaporée sous pression réduite. La phase aqueuse est alors extraite avec du CH2Cl2 (4 fois 20 mL). Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution Cyclohexane/AcOEt 95/5 à 85/15 v/v) pour conduire au produit 1c obtenu sous la forme d'un solide blanc (384 mg - Rdt : 91%) CCM : Rf = 0,4 (CH2Cl2/MeOH 9/1 v/v) Point de fusion : 71.0 - 72.5 °C RMN 1H (300 MHz ; CDCI3) 8 = 7,77 (dd, 4H3,5,8,12, J = 12,8, 8,2), 7,35 (dd, 4H2,6,9,11, J = 38,7, 8,1), 3,76 (s, 2Ha), 2,69 (t, 2Hj, J= 7,7), 1,64 (m, 2Hk), 1,28 (m, 14Hi+m), 0,89 (t, 3H,, J= 6,4) RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) 8 = 196,8 (C;), 177,4 (Cb), 149,0 (C1o), 138,3, 137,6, 135,6 (C1,4,7 pour les 3 pics), 131,0, 130,0, 129,0 (C2,3,5,6,8,9 11,12 pour les 3 pics), 41,6 (Ca), 36,7 (G), 32,6, 31,8, 30,2, 30,0 (Ck+, pour les 4 pics), 23,3 (Cm), 14,8 (Cri) Masse : m/z = 381,2 [M+H]+, masse calculée = 380,2 g.mol-1 Rhod-Dpr(FABP)-NH-C16H33 Boc-L-Dpr(FABP)-OH (9) À une solution de FABP (1 éq) dans le dichlorométhane anhydre, de la DIEA (5 éq) et du PyBOP (1 éq) sont ajoutés. La solution est agitée pendant 10 min afin d'activer l'acide. Puis, du Boc-L-Dpr-OH (1 éq) solubilisé dans un mélange de dichlorométhane anhydre et de méthanol (3/2 v/v) est ajouté à la solution précédente. La solution résultante est agitée à température ambiante, protégée de la lumière. Puis, la phase organique est lavée avec une solution de NaHCO3 saturée et la phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2. Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/15 v/v).
Exemple avec l'acide (S)-2-(tert-butoxvcarbonvlamino)-3-(6-(4-(4-hexvlbenzovl)phénvl) hexanamido) propanoïaue (9a) Temps de réaction : 12h; CCM : Rf = 0,3 (CH2Cl2/MeOH v/v 9/1); RMN 1H (300 MHz; CDCI3) 8=7,67 (m, 4H), 7,24 (m, 4H), 4,14 (m, 1H), 3,73 (q, 1H, J= 7,0), 3,14 (q, 1H, J= 7,0), 2,65 (m, 4H), 2,17 (m, 2H), 1,62 - 1,21 (m, 23H), 0,87 (m, 3H). Masse : m/z = 567,4 [M+H]+, masse calculée = 566,3 g.mol-1
Boc-L-Dpr(FABP)-NH-C16H33 10 À une solution de Boc-L-Dpr(FABP)-OH (1 éq) dans le dichlorométhane anhydre, de la DIEA (5 éq) et du PyBOP (1,3 éq) sont ajoutés et cette solution est agitée pendant 10 min afin d'activer l'acide. Puis, de l'hexadécylamine (1 éq) est ajouté à la solution qui est agitée à température ambiante, protégée de la lumière. Ensuite la phase organique est lavée avec une solution de NaHCO3 saturée et la phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2. Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/4 v/v).
Exemple avec (S)-tert-butvl 1-(hexadécvlamino)-3-(6-(4-(4-hexylbenzovl)phényl)hexanamido) -1-oxopropan-2-ylcarbamate (10a) Temps de réaction : 6h; CCM : Rf = 0,4 (CH2Cl2/MeOH 9/2 v/v); RMN 1H (300 MHz; CDCI3) 8= 7,73 (m, 4H), 7,27 (m, 4H), 6,86 (s, 1H), 6,35 (s, 1H), 5,98 (d, 1H, J = 6,0), 4,16 (m, 1H), 3,71 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,23 (m, 2H), 2,69 (t, 4H, J = 7,5), 2,20 (t, 2H, J = 7,5), 1,70 - 1,25 (m, 51 H), 0,88 (m, 6H); RMN 13C (75 MHz ; CDCI3) 8 = 196,9, 175,5, 171,1, 148,6, 148,0, 136,3, 136,0, 130,9, 128,9, 81,0, 42,7, 40,2, 37,0, 36,7, 36,4, 32,6, 32,4, 31,8, 31,5, 30,4-29,5, 29,0, 27,5, 26,1, 23,3, 14,7. Masse : m/z = 790,7 [M+H]+, masse calculée = 789,6 g.mol-1 H-L-Dpr(FABP)-NH-C16H33 I Du Boc-L-Dpr(FABP)-NH-C16H33 est dissous dans une solution de CH2Cl2/TFA 1/1 v/v. Cette solution est agitée pendant 1h à température ambiante protégée de la lumière puis diluée avec CH2Cl2. La phase organique est lavée avec une solution de NaHCO3 saturée et la phase aqueuse est extraite avec du CH2Cl2. Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgSO4, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite.
Exemple avec (S)-N-(2-amino-3-(hexadecvlamino)-3-oxopropvl)-6-(4-(4-hexylbenzovl) phényl) hexanamide (11a) Temps de réaction : 1h; CCM : Rf = 0,4 (CH2Cl2/MeOH 9/1 v/v); RMN 1H (300 MHz ; CDCI3) 8= 7,73 (m, 4H), 7,50 (m, 1H), 7,27 (m, 4H), 6,29 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,47 - 3,37 (m, 2H), 3,23 (m, 2H), 2,69 (t, 4H, J = 7,5), 2,20 (t, 2H, J = 7,5), 1,66 - 1,25 (m, 42H), 0,88 (m, 6H); RMN 13C (75 MHz ; CDCI3) 8= 196,9, 174,8, 173,9, 148,6, 148,0, 136,2, 136,0, 130,8, 128,9, 55,9, 44,3, 39,8, 37,2, 36,6, 36,4, 32,6, 32,3, 31,8, 31,4, 30,3-29,5, 27,6, 26,1, 23,3, 14,7. Masse : m/z = 690,5 [M+H]+, masse calculée = 689,5 g.mol-1 Rhod-Dpr(FABP)-NH-C16H33 12 À une solution de CTMR (1,3 éq) dans le dichlorométhane anhydre, de la DIEA (5 éq) et du PyBOP (1,3 éq) sont ajoutés et cette solution est agitée pendant 10 min afin d'activer l'acide. Puis, du H-LDpr(FABP)-NH-C16H33 (1 éq) solubilisé dans le dichlorométhane anhydre est ajouté à la solution précédente. La solution résultante est agitée à température ambiante, protégée de la lumière. Puis, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2Cl2/MeOH 100/0 à 100/15 v/v). Exemple avec Rhod-Dpr(CO-05-BP-C6 - 16H33 12a Temps de réaction : 24h; CCM : Rf = [0,7 ; 0,5] (CH2Cl2/MeOH 9/2 v/v); HRMS calculée pour C69H92N507 = 1102.6997 trouvée 1102.6961; HPLC : Tr = 13,6 min
Exemple de méthode d'identification : Réactifs : La dodécylphosphocholine (DPC) et la bactériorhodopsine de Halobacterium salinarum proviennent de SIGMA. La phosphatidylcholine de jaune d'oeuf (PC) et le cholestérol (chol, 99% pur) proviennent d'Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA). Préparation des liposomes : PC, chol et le lipide-outil (12a-c) (65:30:5 rapport molaire) dissous dans du chloroforme sont mélangés dans un tube à essai. Après évaporation du solvant à la chaleur (45 min à 37°C), le film sec est hydraté par addition de 300 pl de PBS pH 7.4 pour obtenir une concentration finale de 5 mM en lipides. Le mélange est agité et la suspension résultante est chauffée à 37°C, puis refroidie dans l'azote liquide 5 fois, puis passée à travers une extrudeuse équipée de 2 filtres de 100 nm (35 passages). Spectroscopie de fluorescence : Les spectres d'excitation et d'émission des composés sondes selon l'invention au sein de liposomes sont enregistrés à 32°C sur un spectrofluorimètre TECAN Infinite M1000. La composition en lipides des liposomes est PC:chol:lipide-outil 65:30:5 (rapport molaire). Les liposomes contrôle « blancs » sont composés de PC:chol, et leur fluorescence résiduelle est soustraite des spectres de fluorescence mesurés. Photomarquage de la bactériorhodopsine : DPC est ajoutée à une solution composé dans chloroforme-méthanol (2/1, v/v), dans la proportion composé/détergent 1:50 molaire. Après évaporation sous vide poussé pendant 2h, le film lipidique sec est hydraté par addition de 50 pl d'eau distillée et 50 pl de Tris-HCI pH 8.0. La bactériorhodopsine resuspendue dans l'eau distillée, est incubée avec les composés selon l'invention en micelles de détergent, dans un rapport molaire protéine-composé de 1:5. Le mélange est ensuite laissée 1h à l'obscurité à 4°C, puis soumis pendant 45s à I"irradiation UV avec un dispositif UV Flood Dymax, équipé d'une lampe à mercure haute pression 400W, placée à une distance de 10 cm de l'échantillon dans une cuvette en quartz. Le tampon de Laëmmli est ensuite ajouté au mélange irradié, puis incubé 15 min à température ambiante. L'analyse se fait sur gel d'électrophorèse (15% d'acrylamide / 20% glycérol). Après migration, le gel est d'abord analysé sur un Fluorimager Typhoon 8600 équipé d'un filtre rhodamine, pour détecter la fluorescence; le gel est ensuite coloré au bleu de Coomassie pour visualiser toutes les bandes protéiques.
On constate alors que la protéine n'est visualisée par Fluorimager qu'après photomarquage et qu'elle n'est pas dégradée dans les conditions de notre test (coloration Coomassie). De plus, l'efficacité du pontage covalent dépend de la distance entre le double cycle aromatique de la benzophénone et le carbonyle (cf. tableau 1). 40 Nom Formule chimique Intensité du signal de d(A) photomarquage (unité arbitraire - UA) C1-BP-C10-COOH distal FABP (lb)
C6-BP-05-COOH medium FABP (la) C10-BP-CI-COOH proximal FABP (1c) OH o 18,7 10 12,7 5 7,9 1 Tableau 1
Claims (29)
- REVENDICATIONS1. Composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle substitué par - au moins un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ; - une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ; - une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif.
- 2. Composé de formule (I) selon la revendication 1 comprenant - une plateforme de liaison Q au moins trifonctionnelle, substitué par - au moins un groupement chromophore Q' choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ; - une première chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L' ; - une deuxième chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L2 et comprenant un groupement photoréactif Q2 ; (I) dans laquelle - Q représente une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ; - p représente 1, 2 ou 3 ; - Q', identique ou différent, représente indépendamment un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ; - L' et L2, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupement choisi parmi NH, C(0), S, O ; - Q2 représente un groupement photoréactif ; - m représente un nombre entier allant de 0 à 24 ; - n représente un nombre entier allant de 1 à 24 ; - la somme de m et de n est comprise entre 1 et 30 ; - q représente un nombre entier allant de 1 à 30.
- 3. Composé selon la revendication 2 pour lequel - p représente 1 et Q' représente un groupement fluorescent ; ou 19 10- p représente 2 et Q' représente indépendamment deux groupements fluorescents, identiques ou différents ; un groupement fluorescent et un groupement absorbant ; un groupement fluorescent et un groupement luminescent ; ou - p représente 3 et Q' représente indépendamment un groupement luminescent et deux 5 groupements fluorescents, identiques ou différents.
- 4. Composé selon les revendications 1 à 3 pour lequel la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ou Q représente un groupement choisi parmi les dérivés acides aminés, les dérivés du glycérol, les dérivés triacides carboxyliques, les dérivés triamines.
- 5. Composé selon la revendication 4 pour lequel la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ou Q représente un groupement dérivé d'un alpha-aminoacide et comprenant deux fonctions amines et une fonction carbonyle. 15
- 6. Composé de formule (Il) selon la revendication 5 O H Q'N H L \ /Lz Qz H N H \~ln m (Il) dans laquelle Q', L', L2, Q2, m, n et q sont tels que définis par les revendications 2 et 3. 20
- 7. Composé de formule (III) selon la revendication 6 O H N QH qH NH (III) dans laquelle Q', Q2, m, n et q sont tels que définis par les revendications 2 et 3. 25
- 8. Composé selon les revendications 1 à 7 pour lequel le groupement chromophore ou Q' est indépendamment choisi parmi la rhodamine, la fluorescéine, les dérivés de la rhodamine, la rhodamine substituée, les dérivés de la fluorescéine, la fluorescéine substituée, les colorants, les substances colorées absorbant dans le visible (400 à 800 nm), la luciférine, le luminol, les dérivés du luminol. 30
- 9. Composé selon la revendication 8 pour lequel le groupement chromophore ou Q' est choisi parmi la rhodamine et ses analogues.
- 10. Composé selon la revendication 9 pour lequel le groupement chromophore ou Q' est la carboxytétraméthylrhodamine.
- 11. Composé selon les revendications 2 à 10 pour lequel - m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou - n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou - q représente un nombre entier allant de 6 à 26 ; ou - la somme de m et de n est comprise entre 4 et 24.
- 12. Composé selon la revendication 11 pour lequel - m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et - n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et - q représente un nombre entier allant de 8 à 24 ; et - la somme de m et de n est comprise entre 6 et 18.
- 13. Composé selon les revendications 1 à 12 pour lequel le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi les groupements générateurs de carbène, les groupements générateurs de nitrène, les dérivés d'arylcétone.
- 14. Composé selon la revendication 13 pour lequel le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi un groupement comprenant une fonction diazo ou diazoester, un groupement dérivé de la diazirine, un groupement comprenant une fonction arylazide, acylazide, alkylazide, diazoester, un groupement dérivé de la benzophénone et un groupement de formule (IV)
- 15. Procédé de préparation d'un composé selon les revendications 1 à 14 par réaction - d'un composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ; - d'au moins un composé comprenant un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent et un groupement luminescent ; 5- d'un composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité; - d'un composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif.
- 16. Procédé selon la revendication 15 pour lequel le composé comprenant la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle comprend une fonction amine primaire libre, une fonction amine primaire protégée et une fonction acide carboxylique. 10
- 17. Procédé selon la revendication 16 comprenant - la réaction de la fonction amine primaire avec le composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ; - la réaction de la fonction acide carboxylique avec le composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement 15 photoréactif ; - la déprotection de la fonction amine primaire protégée ; - la réaction de la fonction amine primaire déprotégée avec le composé comprenant un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, groupement fluorescent ou un groupement luminescent. 20
- 18. Procédé selon les revendications 15 à 17 pour la préparation d'un composé selon les revendications 1 à 14.
- 19. Méthode d'identification d'une protéine comprenant l'utilisation d'un composé selon les 25 revendications 1 à 14.
- 20. Méthode d'identification selon la revendication 19 d'un fragment hydrophobe au sein d'une protéine comprenant l'utilisation d'un composé selon les revendications 1 à 14. 30
- 21. Méthode selon la revendication 20 pour l'identification d'un ou plusieurs domaines transmembranaires au sein d'une protéine membranaire.
- 22. Méthode selon les revendications 19 à 21 pour l'identification d'une protéine de fusion. 35
- 23. Méthode selon les revendications 19 à 22 pour l'identification d'un peptide de fusion virale.
- 24. Méthode selon les revendications 19 à 23 pour l'identification d'une protéine de fusion d'un virus de l'hépatite, du VIH, d'un virus de la grippe, d'un virus vétérinaire.
- 25. Méthode selon la revendication 24 pour l'identification d'une protéine de fusion d'un virus de l'hépatite B ou de l'hépatite C.
- 26. Méthode selon les revendications 19 à 25 comprenant a- la mise en contact du composé avec la protéine ; b- la photoactivation du composé ou du groupement photoréactif du composé ; c- la réaction du groupement photoactivé du composé avec la protéine ; d- l'activation et la détection ou la détection de la fluorescence ou de l'absorbance du groupement chromophore au sein du produit de réaction.
- 27. Méthode selon la revendication 26 pour laquelle la mise en contact du composé avec la protéine est effectuée au moyen de micelles ou de systèmes à bicouches lipidiques.
- 28. Méthode selon la revendication 27 pour laquelle les systèmes à bicouches lipidiques sont des liposomes.
- 29. Méthode selon les revendications 26 à 28 pour laquelle la photoactivation est réalisée - avec une source choisie parmi une lampe ou un laser ; ou - la puissance d'activation est comprise entre 0,1 et 1000 W ; ou - la longueur d'onde est comprise entre 250 et 500 nm ; ou - la durée d'activation est comprise entre 1 seconde et 2 heures.
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