FR2952382A1 - Vaccins et diagnostics contre les trypanosomoses animales africaines - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un nouveau matériel génétique codant pour des protéines trans-sialidase-like appartenant aux parasites trypanosomes africains, et concerne l'utilisation desdits gènes et protéines à des fins vaccinale, thérapeutique et diagnostique. La présente invention concerne également l'immunisation des animaux non humains contre les trypanosomoses animales africaines.

Description

VACCINS ET DIAGNOSTICS CONTRE LES TRYPANOSOMOSES ANIMALES AFRICAINES

La présente invention a pour objet un nouveau matériel génétique codant pour des protéines trans-sialidase-like appartenant aux parasites trypanosomes africains, et concerne l'utilisation desdits gènes et protéines à des fins vaccinale, thérapeutique et diagnostique. La présente invention concerne également l'immunisation des animaux non humains contre les trypanosomoses animales africaines. Les trypanosomes sont responsables chez les ruminants domestiques de maladies appelées les trypanosomoses ou trypanosomiases africaines animales (TAA) également connues sous le nom de Nagana. Les TAA sévissent dans toutes les régions d'Afrique infestées par les glossines, soit environ une quarantaine de pays. Selon l'OMS, les trypanosomoses animales représentent encore de nos jours un sérieux obstacle au développement de l'agro-industrie et de l'élevage en Afrique. Les TAA ont des conséquences économiques massives, telles que la perte du bétail, la réduction de la productivité chez le bétail (lait, viande et traction animale), la baisse de la fécondité et de la production à cause des avortements et des faibles taux de vêlage, ainsi que les coûts élevés du traitement. Les bovins, porcs, moutons, chèvres, qui sont les principales sources de protéines animales par élevage industriel ou domestique, sont atteints par ces parasitoses qui, même si elles ne tuent pas l'animal au cours d'une infection aiguë, empêchent son engraissement et sa reproduction au cours d'une maladie chronique. Le risque d'infection se compterait en effet par plusieurs dizaines de millions de têtes de bétail, et les pertes directes dues aux TAA sont estimées à 1,3 milliard de dollars par an. Les trypanosomes africains sont des protozoaires parasites du sang, et appartiennent au groupe Salivaria, c'est-à-dire qu'ils sont principalement transmis par la salive de vecteurs tels que les diptères du genre Glossina spp, plus couramment appelés les mouches tsé-tsé ou les glossines dont ils colonisent le tube digestif et les glandes salivaires. Ces mouches piquent de jour, et leur durée de vie est de l'ordre de trois mois. Leur distribution géographique est restreinte à l'Afrique. Pour certaines espèces, la transmission est aussi possible par simple transport mécanique dans la trompe infectée de mouches piqueuses hématophages. Les mouches tsé-tsé dépendent du sang pour leur alimentation. Les différentes espèces de glossines ont des préférences diverses pour la source de leur repas sanguin. Certaines espèces, anthropophiles, préfèrent en particulier le sang humain et sont donc des vecteurs importants de la maladie chez l'homme. Les glossines mâles et femelles sont hématophages et sont donc vecteurs des parasites. La distribution de la trypanosomiase africaine est liée à la variété de son vecteur, la mouche tsé-tsé. En raison des délimitations climatiques de la mouche tsé-tsé, la maladie se trouve entre la 14ième Latitude Nord et la 29ième Latitude Sud, en Afrique uniquement. Il existe 29 espèces et sous-espèces de mouches tsé-tsé qui sont divisées en trois groupes en fonction de leurs particularités morphologiques et bio-écologiques : (i) le groupe Morsitans se trouve principalement dans des régions boisées de la savane à travers l'Afrique subsaharienne. Il comprend d'importants vecteurs de la trypanosomiase animale entre autres G. pallidipes, G. morsitans, G. longipalpis et G. austeni, (ii) le groupe Palpalis comprend des espèces que l'on trouve principalement dans les régions boisées près des rivières en Afrique Centrale et de l'Ouest. Dans ce groupe, on trouve les vecteurs de la maladie du sommeil tels que G. fuscipes et G. palpalis, (iii) le groupe Fusca est majoritairement localisé dans les forêts humides. Quelques espèces (G. brevipalpis) ont été impliquées en tant que vecteurs de la trypanosomiase animale. Les mouches tsé-tsé se développent sous des climats chauds et humides (25-26°C). Leurs sites de reproduction en Afrique de l'Est sont les plages de sable asséchées, l'ombre sous la végétation dense, les débris de feuilles dans les forêts ou sous les haies des espèces de lantana ou d'euphorbe. Le genre Trypanosoma comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas. Seul le sous-genre Trypanozoon comporte, outre des espèces infectantes pour les animaux, deux espèces infectantes pour l'homme chez qui elles provoquent la maladie du sommeil. Les autres sous-genres comprennent des espèces qui infectent les animaux sauvages et domestiques et ne sont jamais infectantes pour l'homme mais peuvent avoir des répercussions indirectes importantes pour sa santé. Le sous genre Trypanozoon est constitué de trypanosomes polymorphes (forme longue et forme courte ou trapue), avec un flagelle libre facultatif et un petit kinétoplaste en position subterminale (postérieur). Les espèces de ce sous-genre sont Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi et T. equiperdum. T. brucei comprend trois sous-espèces : T. b. brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodesiense, qui sont très proches sur les plans morphologique, antigénique et biochimique, et se distinguent par leurs caractères infectieux, leur pathogénicité et leur distribution géographique. T. brucei et ses sous-espèces sont transmis par les glossines. T. evansi est transmis au bétail, aux chevaux et aux chameaux par des mouches piqueuses autres que les glossines (Tabanidae) en Afrique, en Amérique du Sud et dans le Sud Est Asiatique. T. equiperdum n'a pas d'hôte invertébré (transmission sexuelle chez les chevaux). Ces deux dernières espèces débordent largement des régions à glossines et sont cosmopolites. Leur morphologie est semblable à celle de T. brucei mais elles sont monomorphes (formes longues uniquement).

Les trypanosomes appartenant au sous-genre Duttonella ont une forme de massue ou de gourdin, avec l'extrémité postérieure arrondie et large, le corps se rétrécissant vers l'extrémité antérieure. Le kinétoplaste est volumineux, arrondi et en position terminale; la membrane ondulante peu développée, étroite, se termine en flagelle libre. T. vivax et T. uniforme, sont des espèces parasites des ruminants sauvages et domestiques. Ils peuvent être transmis par voie mécanique ou par les glossines, dont ils colonisent exclusivement la trompe et le proventricule. Les trypanosomes du sous-genre Nannomonas sont de petite taille (8 à 24 µm), ils n'ont de flagelle libre à aucun stade de leur développement. Le kinétoplaste de taille moyenne se trouve en position subterminale ou marginale. L'extrémité postérieure est arrondie et la membrane ondulante étroite. La pathogénicité est importante pour le bétail, le porc et le chien en Afrique. Le développement chez la glossine prend place dans l'estomac et le proboscis exclusivement. Les principales espèces sont T. congolense et T. simiae. Ces trypanosomes sont de petite taille, avec extrémité postérieure arrondie, kinétoplaste en position marginale, membrane ondulante étroite. Les ruminants domestiques en Afrique sont essentiellement infectés par trois espèces de trypanosomes pathogènes, T. congolense, T. vivax, ou T. brucei qui sont responsables de la pathologie Nagana. D'autres animaux sont infectés par une autre espèce de trypanosome pathogène, T. evansi, qui est responsable d'une pathologie dénommée Surra. Les trypanosomes sont caractérisés par une grande diversité génétique, qui concerne l'infectivité, la virulence, la pathogénicité, la transmissibilité, et la sensibilité aux produits trypanocides. T. congolense est l'agent principal de la trypanosomose bovine en Afrique, par sa fréquence et sa pathogénicité. Il s'adapte également à diverses espèces animales non humaines, et peut ainsi parasiter indifféremment les bovidés, les porcins, les ovins, les caprins, les équidés, et les canidés.

T. brucei et notamment la sous-espèce Trypanosoma brucei gambiense est probablement la plus connue puisqu'elle est responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil chez l'homme en Afrique occidentale et centrale. La sous-espèce Trypanosoma brucei brucei est un parasite des animaux domestiques et sauvages dans toute l'Afrique, mais elle n'est pas infectieuse pour l'homme en raison de l'effet lytique sur les formes sanguines de ces trypanosomes, de la protéine Apolipoprotéine L présente dans le sérum humain. La troisième sous-espèce est Trypanosoma brucei rhodesiense qui est l'agent de la maladie du sommeil dans sa forme aiguë en Afrique. Egalement, la sous-espèce T. evansi est transmise aux bovidés, chevaux et dromadaires, et a des répercussions économiques importantes en Afrique notamment pour les élevages des bovins et des buffles.

Enfin, T. vivax est un parasite essentiellement des ongulés en Afrique tropicale et la transmission est assurée par les taons ou les tabanidés. Les trypanosomes présentent un cycle de vie complexe qui inclut différentes formes morphologiques. Ils présentent en général un corps fusiforme et possèdent un flagelle qui est relié au corps par une membrane ondulante. Ils se reproduisent de manière asexuée par fission binaire. Lors de l'infection, la glossine (glossina sp.) ou mouche tsé-tsé injecte dans le derme de l'hôte à l'endroit de la piqûre, les formes métacycliques infectieuses présentes dans les pièces buccales. Les parasites se multiplient dans le derme au point de l'inoculation. Une réaction locale liée à la multiplication des parasites dans le derme se produit, et les parasites donnent naissance aux formes sanguines. Ce stade peut durer de 1 à 3 semaines par exemple dans le cas de T. congolense. Ensuite, les parasites envahissent le sang, le système lymphatique, notamment les ganglions lymphatiques, ainsi que différents organes, tels le foie, la rate, le coeur, les reins, les testicules, et d'importantes lésions apparaissent alors. La glossine s'infecte et se nourrit sur les animaux parasités. Une fois infectée, elle reste infectieuse durant toute sa vie. Dans le cas de T. brucei et T. congolense, le trypanosome subit chez l'insecte un cycle complexe impliquant une dédifférenciation dans l'intestin en formes procycliques non-infectieuses. Dans les glandes salivaires, ou les pièces buccales, les trypanosomes se transforment en formes épimastigotes, adhérentes, qui se multiplient activement. Leur différenciation conduit au stade infectieux représenté par les formes métacycliques, qui ne se divisent plus. Le cycle de T. vivax ne comporte pas de stade procyclique. Il débute par l'attachement flagellaire des formes sanguines ingérées par la glossine. Elles se différencient en formes épimastigotes, qui prolifèrent puis se différencient en formes métacycliques infectieuses. La durée totale du cycle chez la glossine est d'environ 5 à 10 jours pour T. vivax, 18 jours pour T. congolense, et 30 jours pour T. brucei. Les sources d'infection des animaux domestiques sont les autres animaux domestiques ou les animaux sauvages malades ou porteurs sains. L'existence de réservoir provient du fait que certaines espèces sont peu réceptives à l'infection, et peu sensibles à la maladie.

Les vecteurs potentiels varient en fonction de l'espèce de trypanosome considérée. T. congolense et T. brucei sont exclusivement transmis par des vecteurs biologiques comme les mouches tsé-tsé, mais T. vivax peut être également transmis par des vecteurs mécaniques tels que les mouches piqueuses (tabanidés ou stomoxes). T. evansi est exclusivement transmis par des vecteurs mécaniques. L'efficacité de la transmission dépend du taux d'infection des glossines et des interactions hôte-vecteurs. De façon générale, les trypanosomes infectieux pour l'animal donnent des taux d'infection plus élevés que les trypanosomes infectant l'homme, ce qui contribue à la très large distribution de la trypanosomose animale. L'analyse des trypanosomes par microscopie électronique montre l'existence d'un manteau d'environ 15 nm recouvrant la totalité du corps cellulaire du parasite. Ce manteau est présent uniquement à la surface des formes sanguines et métacycliques. Il est essentiellement constitué d'une glycoprotéine appelée VSG (Antigène Variable de Surface) et d'autres protéines membranaires en faibles quantités. Les VSGs forment ainsi une structure très dense constituant une barrière physique entre la membrane plasmique et l'hôte. La structure 3D prédit que seule une faible partie de la protéine est exposée à la surface du parasite. Ainsi le principal rôle du manteau serait de masquer les antigènes membranaires non variables du parasite en présentant quelques motifs immunodominants aux défenses immunitaires de l'hôte. Le manteau protège par ailleurs les formes sanguines contre la lyse par activation de la voie alterne du complément. La lutte contre la trypanosomiase animale africaine (TAA) dépend du dépistage chez les animaux et du traitement sur la base de recouvrement des coûts. Les principaux composés chimiques utilisés pour le traitement des TAA sont : l'Acéturate de diminazène, le bromure ou le chlorure d'homidium, le chlorure d'isométamidium, la quinapyramine, la suramine et la melarsomine. Toutefois aucune nouvelle molécule n'a été mise sur le marché depuis au moins trente ans, alors que l'on observe depuis quelques années une recrudescence de la maladie du fait de l'apparition de résistances aux trypanocides, de l'emploi extensif et parfois inapproprié de médicaments entraînant la sélection et l'amplification des résistances qui sont rapportées dans toutes les régions de l'Afrique concernées par la maladie.

Résumé de l'invention Le Demandeur a identifié et obtenu un nouveau matériel génétique codant pour de nouvelles protéines de type trans-sialidase-like, dénommées TcoTS-like 1, 2, et 3, reconnues par des anti-sera anti-trypanosomes africains. Le matériel génétique peut être utilisé pour produire des protéines et polypeptides destinés au développement de tests de diagnostic, à la préparation de compositions vaccinales ou pharmaceutiques contre les infections par des trypanosomes africains. De même, la protéine et tout fragment polypeptide correspondant peuvent être utilisés pour la production d'anticorps spécifiques contre le parasite, à des fins de diagnostic ou d'immunisation passive.35 Brève description des Figures Figure 1 : représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de type transsialidase-like TcoTS-like 1 ; Figure 2: représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de type trans- sialidase-like TcoTS-like 2 Figure 3 : représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de type transsialidase-like TcoTS-like 3 Figure 4 : représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de type transsialidase-like TcoTS-like 1 ; Figure 5 : représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de type transsialidase-like TcoTS-like 2 Figure 6 : représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de type transsialidase-like TcoTS-like 3 Figure 7 : représente un alignement de séquence entre la protéine de type trans- sialidase-like (TcoTS-like 2) et une protéine de type trans-sialidase du parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi TS); Figures 8A et 8B : représentent un schéma des 5 sous familles de protéines apparentées à des trans-sialidases du parasite T. congolense ; les pourcentages d'identité entre les gènes d'une même sous-famille sont indiqués (Fig. 8A) avec un tableau montrant les pourcentages d'identité entre ces protéines (Fig. 8B) 6 Figure 9 : Figure 10 : Figure 11 : Figure 12 : Figure 13 : Figure 14 : Figure 15 : Figure 16 : Figure 17 : Figure 18 : Figure 19 : Figure 20 : Figure 21 : Figure 22 : Figure 23 : représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-Al représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-A2 représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-A3 représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-B1 représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-B2 représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-C; représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-D1 représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine TcoTS-D2; représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-Al représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-A2 représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-A3 représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-B1 représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-B2 représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de TcoTS-C ; représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-D1 Figure 24 : représente la séquence peptidique correspondant à la protéine TcoTS-D2 ; Figures 25A et 25B : représentent un alignement de séquence entre les 11 protéines apparentées à des trans-sialidases du parasite Trypanosoma congolense; Figure 26 : représente un tableau montrant les pourcentages d'identité entre les protéines apparentées à des trans-sialidases des parasites T. congolense et T. brucei. Figure 27 : représente un tableau des différents peptides identifiés dans l'expérience d'immunoprécipitation avec le sérum anti-TcoTS-A1 (A), leur appartenance aux protéines TcoTS-A1, TcoTS-A2 ou TcoTS-A3 est figuré par un + ; et un tableau des peptides appartenant à la protéine TcoTS-like 2 identifiés lors des expériences d'immunoprécipitation avec les sérums anti-peptide 1, anti-peptide 2 ou anti-peptide 3 (B). Figures 28A et 28B: représentent la mesure de l'hématocrite (A) et de la survie moyenne (B) de souris après immunisation avec les protéines TcoTS-like 2, TcoTS-Al et TcoTS-B1 ou avec la BSA. Le nombre de souris (n) utilisées lors des différentes immunisations est indiqué.

Description détaillée de l'invention La présente invention a pour objet une molécule d'ADN ou d'ARN, codant pour de nouvelles protéines de type trans-sialidase-like, dénommées TcoTS-like 1, 2, et 3, et appartenant aux trypanosomes africains. Ces nouvelles molécules d'ADN ou d'ARN comprennent au moins un brin comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 1-3, une séquence complémentaire, anti-sens, ou équivalente à une des séquences SEQ ID Nos : 1-3, et notamment une séquence comprenant une identité d'au moins 70%, avec une des séquences SEQ ID NOs : 1-3, ou une séquence présentant, sur une séquence de 100 nucléotides contigus, a moins 50%, de préférence au moins 60%, ou au moins 70%, ou encore au moins 80% d'homologie avec lesdites séquences, ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider avec une des séquences SEQ ID NOs : 1-3 dans des conditions stringentes d'hybridation. On entend par conditions stringentes d'hybridation, une hybridation à une température de 65°C pendant une nuit dans une solution contenant 0,1% de SDS, 0,7% de lait en poudre écrémé et 6X de SSC, suivie de lavages à température ambiante dans du 2X SSC - 0,1% SDS et à 65°C dans du 0,2X SSC - 0,1% SDS. L'invention concerne également des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à l'une quelconque des séquences suivantes SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, ou SEQ ID NO : 3, et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou encore, au moins 85 % d'homologie avec l'une quelconque desdites séquences. Par séquence nucléotidique, on entend au moins un brin d'ADN ou son brin complémentaire, soit un brin d'ARN ou son brin anti-sens ou leurs ADN complémentaires correspondants. La séquence d'ADN telle que représentée dans une des séquences SEQ ID NOs : 1-3 correspond à la séquence de l'ARN messager, étant entendu que la thymine (T) dans l'ADN est remplacé par l'uracile (U) dans l'ARN. Selon l'invention, deux séquences nucléotidiques sont dites équivalentes l'une par rapport à l'autre, du fait de la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de l'espèce à partir de laquelle elles ont été identifiées, ou induite, ainsi que des séquences homologues, l'homologie étant définie ci-après. Par variabilité, on entend toute modification, spontanée ou induite d'une séquence, notamment par substitution, et/ou insertion, et/ou délétion de nucléotides et/ou de fragments nucléotidiques, et/ou extension et/ou raccourcissement de la séquence à l'une au moins des extrémités, ou bien une variabilité non naturelle pouvant résulter des techniques de génie génétique utilisées. Cette variabilité peut se traduire par des modifications de toute séquence de départ, considérée comme référence, et pouvant être exprimées par un degré d'homologie par rapport à ladite séquence de référence. L'homologie caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques (ou peptidiques) comparés; elle se mesure par le pourcentage d'identité qui est notamment déterminé pair comparaison directe de séquences nucléotidiques (ou peptidiques), par rapport à des séquences nucléotidiques (ou peptidiques) de référence. L'invention a aussi pour objet des protéines, dénommées TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, présentant une masse moléculaire apparente d'environ 85 kDa pour la protéine TcoTS-like 1, d'environ 76 kDa pour la protéine TcoTS-like 2, et d'environ 78 kDa pour la protéine TcoTS-like 3, et reconnues par des anti-sera anti-Trypanosomes africains, ainsi que leurs fragments peptidiques antigéniques ou un équivalent immunologique de ces protéines ou fragments. Les séquences en acides aminés de ces protéines sont représentées dans les séquences SEQ ID Nos : 4-6 et comprennent également les séquences de protéines homologues à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou au moins 95%. Les protéines nouvellement caractérisées par le Demandeur présentent en C-terminal une partie lectine conservée visant à permettre la fixation sur des acides sialiques des animaux infectés et en N-terminal une partie catalytique présentant une similitude avec celle des enzymes trans-sialidases et ont donc été désignées par le Demandeur transsialidases-like.

Par équivalent immunologique, on entend tout polypeptide ou peptide susceptible d'être immunologiquement reconnu par les anticorps dirigés contre lesdites protéines TcoTS-like 1, 2, et 3. L'invention concerne par ailleurs tout fragment des protéines TcoTS-like 1, 2, et 3, et plus particulièrement tout fragment peptidique antigénique spécifiquement reconnu par des antisera anti-Trypanosomes africains. Les protéines et lesdits fragments protéiques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité. La présente invention concerne donc aussi un ou plusieurs peptides, dont la séquence en acides aminés correspond à une partie de la séquence des protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et/ ou TcoTS-like 3, et présentant seuls ou en mélanges une réactivité avec la totalité des sera d'animaux non humains infectés par Trypanosomes africains. Les peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique, lyse des protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou par des techniques de recombinaison génétique.

Selon un deuxième aspect de la présente invention, cette dernière a pour objet une cassette d'expression fonctionnelle, notamment dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour la totalité ou un fragment des protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 tels que décrits précédemment. En particulier, un fragment d'ADN tel que défini précédemment et placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Ladite protéine ou fragment protéique ainsi exprimé est reconnu par des antisera anti-trypanosomes africains. D'une façon générale, toute cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. De telles cellules sont connues de l'homme de l'art. A titre d'exemples, on peut citer les cellules issues d'un organisme eucaryote, telles que les cellules issues d'un mammifère, notamment les cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian); les cellules d'insectes; les cellules issues d'un champignon, notamment unicellulaire ou d'une levure, notamment de la souche Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces et tout particulièrement sélectionnée dans le groupe constitué de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus. De même, parmi les cellules issues d'un organisme procaryote, on peut avoir recours, sans que cela constitue une limitation, aux cellules d'une souche Escherichia coli (E coli) ou à des cellules d'entérobactéries. La cellule peut être de type sauvage ou mutant. Les mutations sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier. De préférence, on utilise une cellule E. coli, telle que par exemple BL21 (DE3).

La cassette d'expression de l'invention est destinée à la production des protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 ou des fragments de ces protéines par exemple dans E. coli, qui sont reconnus par des antisera anti-trypanosomes africains. De tels antisera proviennent d'animaux ayant contracté une infection récente ou ancienne par les espèces de trypanosomes, T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax, et contiennent des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement les protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3. Egalement, les protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 peuvent être reconnues par d'autres anticorps, comme par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par immunisation d'espèces variées avec la protéine précitée naturelle, la protéine recombinante, leurs fragments ou peptides. Par protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou fragment on entend l'antigène ou fragment antigénique des Trypanosomes africains naturels, appartenant aux espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax, produit notamment par les techniques de recombinaison génétique décrites dans la présente demande, ou tout fragment ou mutant de cet antigène à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec des anticorps dirigés contre les protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 de ces parasites. De manière avantageuse, lesdites protéines possèdent une séquence en acides aminés présentant un degré d'homologie d'au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou au moins 95% par rapport aux séquences SEQ ID Nos : 4-6. En pratique, un tel équivalent peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou recombinante. Il est à la portée de l'homme de l'art d'effectuer par des techniques connues ces modifications sans affecter la reconnaissance immunologique. Dans le cadre de la présente invention, les protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 peuvent être modifiées in vitro, notamment par délétion ou addition de groupements chimiques, tels que des phosphates, sucres ou acides myristiques, de manière à améliorer sa stabilité ou la présentation d'un ou de plusieurs épitopes. La cassette d'expression selon l'invention permet la production des TcoTS protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou d'un fragment antigénique de ces protéines, ayant les séquences en acides aminés telles que spécifiées précédemment, et de fragments desdites protéines, peuvent être avantageusement fusionnées à un élément exogène pouvant aider à sa stabilité, sa purification, sa production ou sa reconnaissance. Le choix d'un tel élément exogène est à la portée de l'homme de l'art. Il peut notamment s'agir d'un haptène, ou d'un peptide exogène.

La cassette d'expression selon l'invention comprend les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule considérée. Par "éléments nécessaires à Il l'expression", on entend l'ensemble des éléments qui permettent la transcription du fragment d'ADN en ARN messager (ARNm), tels que des séquences promotrice (par exemple le promoteur CMV) et terminatrice de la transcription, ainsi que des éléments permettant la traduction de ce dernier en protéine.

La présente invention s'étend à un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Il peut également s'agir d'un vecteur plasmidique à réplication autonome et en particulier d'un vecteur multiplicateur. Il peut s'agir d'un vecteur viral et notamment d'un vecteur dérivé d'un baculovirus, plus particulièrement destiné à l'expression dans les cellules d'insectes, ou un vecteur dérivé d'un adénovirus pour l'expression dans les cellules de mammifères. La présente invention concerne également une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant une cassette d'expression, soit sous forme intégrée dans le génome cellulaire, soit insérée dans un vecteur. La présente invention a en outre pour objet un procédé de préparation d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, ou de fragments antigéniques de ladite protéine, selon lequel: (i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant la cassette d'expression selon l'invention; et (ii) on récupère la protéine exprimée issue de l'organisme précité.

Selon un troisième aspect, l'invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain à un agent immunogène constitué par une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, naturelles ou recombinantes, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques, tels que définis précédemment. A titre d'exemples, les anticorps polyclonaux selon la présente invention peuvent être générés en utilisant les protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 (SEQ ID Nos : 4-6), qui sont injectés à des lapins afin de les immuniser comme cela est décrit dans l'Exemple 2. Les sérums polyclonaux de lapin ainsi obtenus qui ont été désignés respectivement anticorps anti-peptide 1, anticorps anti-peptide 2, et anticorps anti-peptides 3, font également partis de la présente invention étant donné qu'ils présentent une réactivité contre leur peptide de l'invention par ELISA indirect. Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet une composition immunothérapeutique active, notamment une préparation vaccinale, qui comprend une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 naturelles, recombinantes, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques, et/ou d'un mélange d'une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, et/ou un mélange d'un ou plusieurs fragments peptidiques tels que définis ci-dessus, et éventuellement un excipient et/ou un adjuvant approprié. Les compositions vaccinales ou vétérinaires selon l'invention sont destinées au traitement et/ou la prévention d'une infection par les trypanosomes africains chez un animal non humain, particulièrement contre les infections par les espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax. Les trypanosomoses africaines se traduisent chez l'animal par des syndromes de gravité variable, allant de l'infection aiguë mortelle en 3 à 4 semaines, jusqu'à l'infection chronique durant des mois voire des années. L'évolution chronique, caractérisée par des parasitémies intermittentes, est la plus fréquente chez les bovins africains. La maladie débute par une phase d'hyperthermie, puis deux à trois semaines après la piqûre infectante, le nombre de globules rouges, le taux d'hémoglobine et l'hématocrite chutent, reflétant l'anémie, qui est le symptôme majeur des trypanosomoses animales. Les animaux chroniquement infectés ont une consommation alimentaire réduite, ils deviennent cachectique, leur croissance est freinée, et des effets négatifs sur la reproduction sont observés. L'anémie des trypanosomoses animales s'établit selon deux phases. Au cours de la phase initiale, l'anémie s'accompagne de la parasitémie et résulte essentiellement d'une hémolyse extra-vasculaire : les globules rouges sont détruits par le système phagocytaire dans la rate, le foie, dans la circulation et la moelle osseuse. A terme, l'anémie se traduit par une dysfonctionnement de la moelle osseuse. Lesdites compositions vaccinales vétérinaires peuvent se présenter sous la forme de vaccin antigénique et comprennent alors une quantité thérapeutiquement efficace d'une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3 naturelles, recombinantes, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques tels que précédemment décrits. Alternativement, les compositions vaccinales peuvent comprendre une quantité thérapeutique efficace d'un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit ci-dessous. Enfin, les compositions vaccinales peuvent se présenter sous forme de vaccins ADN et peuvent alors comprendre une cassette d'expression, un vecteur, une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote tels que définis précédemment, susceptible d'exprimer une ou plusieurs protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, et/ou leurs fragments peptidiques antigéniques, et/ou encore une combinaison de ceux-ci. Les compositions vaccinales selon la présente invention sont particulièrement utiles pour traiter et/ou prévenir les pathogénies induites par les trypanosomoses africaines, telles que notamment les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression des animaux non humains.

Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet des sondes ou des amorces spécifiques des Trypanosomes africains, et leurs utilisations dans des tests de diagnostic. Le terme sonde tel qu'utilisé dans la présente invention fait référence à l'ADN ou l'ARN comportant au moins un brin présentant une séquence nucléotidique permettant l'hybridation aux acides nucléiques présentant au moins une séquence nucléotidique telle que représentée dans les séquences SEQ ID Nos : 1-3, ou une séquence complémentaire, ou anti-sens, ou équivalente à ladite séquence, et notamment une séquence présentant, 5 à 100 nucléotides contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou au moins 85 0/0 d'homologie aux séquences SEQ ID Nos :1-3, ou à un oligonucléotide de synthèse permettant une telle hybridation, non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5- désoxyuridine ou toute autre base modifiée. De même, ces sondes peuvent être modifiées au niveau du sucre, à savoir le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide ou au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, dialkyle et arylphosphonate et de phosphorothioate. Les sondes peuvent être beaucoup plus courtes que les séquences identifiées dans les séquences SEQ ID Nos : 1-3. En pratique, de telles sondes comprennent au moins 5 nucléotides, avantageusement entre 5 et 50 nucléotides, de préférence aux alentours de 20 nucléotides possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec l'ADN ou l'ARN ayant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment. Les amorces selon l'invention comprennent une séquence de 5 à 30 monomères choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 1-3, et possèdent une spécificité d'hybridation dans des conditions prédéterminées, pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé d'élongation tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue.

Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées à des fins de diagnostic, comme sonde de capture et/ou de détection. Selon un sixième aspect, la présente invention concerne un réactif pour la détection et/ou la surveillance ainsi qu'un procédé et des kits pour le diagnostic d'infections par les trypanosomes africains, notamment par T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax.

Les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment. Alternativement, les réactifs pour la détection ou kit de diagnostic des trypanosomes peuvent comprendre une sonde et/ou une amorce telle que définie précédemment, pour détecter et/ou identifier les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, en particulier une sonde de capture et une sonde de détection, l'une et/ou l'autre répondant à la définition ci- dessus. Le réactif ci-dessus peut être fixé directement ou indirectement sur un support solide approprié. Le support solide peut être notamment sous la forme d'un cône, d'un tube, d'un puits, de bille, ou analogues. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un réactif pour une utilisation dans les tests de diagnostic. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés chimiquement ou non peuvent être utilisés comme supports solides, notamment des polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose; des polymères tels que chlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou copolymères tels que polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymères de chlorure de vinyle et acétate de vinyle, des copolymères à base de styrène, des fibres naturelles telles que le coton et les fibres synthétiques telles que le nylon. La fixation du réactif sur le support solide peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, deux approches sont possibles: soit par adsorption du réactif sur le support solide, c'est à dire par des liaisons non covalentes (principalement de type hydrogène, Van der Walls ou ionique), soit par établissement de liaisons covalentes entre le réactif et le support. De manière indirecte, on peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur le support solide un composé "anti-réactif" capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support solide. A titre d'exemple, on peut citer un anticorps anti-TcoTS-like 1, 2, et 3, à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec une partie de la protéine différente de celle intervenant dans la réaction de reconnaissance des anticorps des sera; un système ligand-récepteur, par exemple en greffant sur les protéines TcoTS-like 1, 2, et 3 une molécule telle qu'une vitamine, et en immobilisant sur la phase solide le récepteur correspondant (par exemple le système biotine-streptavidine). Par manière indirecte, on entend également le greffage au préalable ou fusion par recombinaison génétique d'une protéine, ou un fragment de cette protéine, ou d'un polypeptide, à une extrémité des protéines TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, et TcoTS-like 3, et l'immobilisation de ces dernières sur le support solide par adsorption passive ou covalence de la protéine ou du polypeptide greffé ou fusionné. Les sondes de capture peuvent être immobilisées sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive. Les sondes de détection sont marquées au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la phosphatase alcaline, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotidique, et la biotine.

Les sondes de la présente invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment les techniques dites "Dot-Blot" (Maniatis et al. (1982) (14)), Southern Blot (Southern E.M. (1975) (15)), Northern Blot, qui est une technique identique à la technique Southern Blot mais qui utilise de l'ARN comme cible, la technique sandwich (Dunn A.R. et al. (1977)(16)).

Le procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un animal non humain susceptible d'avoir été infecté par les trypanosomes africains, consiste à mettre en contact ledit échantillon et un réactif tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un complexe immun avec ledit réactif. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection par la technique ELISA en une ou plusieurs étapes, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de compétition bien connues de l'homme du métier. Alternativement, le procédé pour la détection sélective des trypanosomes africains dans un échantillon biologique, et le diagnostic des trypanosomoses africaines consiste à prélever un échantillon de sang, exposer l'ADN extrait de l'échantillon et éventuellement dénaturé à au moins une sonde telle que définie précédemment et on détecte l'hybridation de ladite sonde. Enfin, la présente invention a pour objet un kit à usage vétérinaire pour le diagnostic de trypanosomiase africaine dans un échantillon biologique comprenant une sonde ou une amorce telle que décrite ci-dessus, ou bien un anticorps tel que précédemment décrit ainsi qu'un réactif pour la détection d'une réaction immunologique. Les kits selon la présente invention comportent au moins un compartiment pour un conditionnement éventuellement stérile comprenant une quantité thérapeutique efficace d'un réactif tel que précédemment décrit, ainsi qu'une fiche d'instructions concernant le protocole de mise en oeuvre du diagnostic vétérinaire selon l'invention.

Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet les séquences apparentées aux trans-sialidases-like chez T. congolense. Plus précisément, onze gènes codant pour des séquences apparentées à des sialidases ont été caractérisés et classifiés en 5 sous-familles selon leurs homologies de séquences (Figures 8A et 8B) : La première sous-famille des Trans-sialidases-like comprend les 3 gènes précédemment décrits et désignés TcoTS-like 1, 2, et 3, qui présentent 17 à 24% d'identité entre eux (Figures 1 à 6). La deuxième sous-famille a été nommée sous famille A et comprend trois gènes désignés A1, A2, et A3 et dont les séquences nucléotidiques sont données respectivement dans les SEQ ID Nos : 7, 8, et 9. Les gènes A1, A2, et A3 présentent 94 à 97% d'identité entre eux (Figures 9 à 11) et codent respectivement pour trois protéines TcoTS-Al, TcoTSA2, et TcoTS-A3, dont les séquences en acides aminés sont fournies respectivement dans les SEQ ID Nos : 15, 16, et 17 (Figures 17 à 19). La troisième sous-famille désignée B comprend deux gènes désignés ci-après B1 et B2, dont séquences nucléotidiques sont données respectivement dans les SEQ ID Nos : 10 et 11, et qui présentent 76% d'identité entre eux (Figures 12 et 13). Les deux gènes B1 et B2 codent pour les trans-sialidases TcoTS-B1 et TcoTS-B2 dont les séquences peptidiques sont représentées dans les SEQ ID Nos : 18 et 19 (Figures 20 et 21). La quatrième sous-famille désignée C comprend un seul gène désigné C, dont la séquence nucléotidique est représentée dans la SEQ ID NO : 12 (Figure 14), et qui code pour la protéine TcoTS-C dont la séquence peptidique est fournie dans la SEQ ID NO : 20 (Figure 22). Enfin, la cinquième sous-famille qui a été désignée sous-famille D comprend deux gènes nommés D1 et D2, dont les séquences nucléotidiques sont fournies dans les SEQ ID Nos : 13 et 14 (Figures 15 et 16). Ces deux gènes D1 et D2 présentent en effet 96% d'identité entre eux. Ils codent pour les protéines TcoTS-D1 et TcoTS-D2 dont les séquences en acides aminés sont fournies dans les SEQ ID Nos : 21 et 22 (Figures 23 et 24). Les pourcentages d'identité entre les protéines codées par ces 11 gènes selon l'invention tels que décrits ci-dessus sont présentés dans les Figures 8A et 8B. Un alignement des séquences est donné dans les Figures 25A et 25B. Les trans-sialidases-like 1 à 3 sont très divergentes par rapport aux autres gènes. Selon cet aspect, la présente invention a donc pour objet de nouvelles séquences nucléotidiques, codant pour de nouvelles protéines de type trans-sialidase-like, dénommées TcoTS-Al , TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2 appartenant aux trypanosomes africains Ces nouvelles molécules d'ADN ou d'ARN comprennent au moins un brin comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 7-14, une séquence complémentaire, anti-sens, ou équivalente à une des séquences SEQ ID Nos : 7-14, et notamment une séquence comprenant une identité d'au moins 70%, avec une des séquences SEQ ID NOs : 7-14, ou une séquence présentant, sur une séquence de 100 nucléotides contigus, a moins 50%, de préférence au moins 60%, ou au moins 70%, ou encore au moins 80% d'homologie avec lesdites séquences, ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider avec une des séquences SEQ ID NOs : 7-14 dans des conditions stringentes d'hybridation, telles que définies précédemment. L'invention concerne également des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs : 7-14, et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN, pour toute suite de 30 monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou encore, au moins 85 % d'homologie avec l'une quelconque desdites séquences. Egalement, selon cet aspect, l'invention concerne les protéines dénommées TcoTS- Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2, ainsi que les séquences peptidiques de ces protéines telles que représentées respectivement dans les séquences SEQ ID Nos : 15-22, et toutes séquences en acides aminés présentant une homologie d'au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou d'au moins 95% avec les séquences peptidiques SEQ ID Nos : 15-22. L'invention a également pour objet tous fragments peptidiques antigéniques des protéines TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTSB1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2, spécifiquement reconnu par des antisera anti-Trypanosomes africains, ainsi que tous équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines susceptibles d'être immunologiquement reconnus par les anticorps dirigés contre les protéines TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2 de la présente invention. Les protéines et lesdits fragments peptidiques antigéniques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité. A titre d'exemple, un fragment antigénique peptidique selon la présente invention peut être le peptide PKNIKGSWHRDRLQLWLTD (SEQ ID NO : 24) appartenant à la protéine TcoTS-B1 ou des peptides homologues à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou au moins 95% avec ledit fragment. La présente invention concerne en outre la combinaison ou un mélange d'un ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines. Egalement, elle a pour objet un procédé de préparation d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTSDl, et TcoTS-D2, ou un mélange desdites protéines, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines. Ces techniques de production des protéines, fragments, équivalents fonctionnels, et des combinaisons sont effectuées par synthèse chimique, lyse des protéines, ou par des techniques de recombinaison génétique. Elles sont bien connues de l'homme du métier, et ont été par ailleurs décrites ci-dessus. Selon cet aspect, l'invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain à un agent immunogène constitué par une ou plusieurs protéines TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2 naturelles, ou recombinantes et leurs fragments peptidiques tels que précédemment décrits. Elle a également pour objet une composition vaccinale comprenant un mélange d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines et/ou une combinaison desdites protéines, fragments ou équivalents fonctionnels.

Jusqu'à présent, aucune de ces onze protéines n'avait été mise en évidence dans les formes sanguines de T. congolense. En effet, Tiralongo et al. ((2003) J. Biol. Chem 278(26) :23301-10) ainsi que la publication internationale W02004/055176 décrivent le clonage dans les formes procycliques présentes chez l'insecte vecteur de deux transsialidases TS1 et TS2 de T. congolense. Ces protéines ont été uniquement décrites comme étant exprimées dans les formes procycliques présentes chez l'insecte vecteur. Egalement, une étude des gènes apparentés à des sialidases a également été réalisée chez T. brucei (Montagna et al. (2006) J. Biol. Chem. 281(45) : 33949-58). Montagna et al. décrit ainsi l'identification de plusieurs séquences de protéines de la famille du gène TbTS (AF310231.1) chez T. brucei. Il décrit notamment une version tronquée du gène TbTS, à savoir TbTSsh, les gènes B et C codant pour les transialidases TbSA B et TbSA C de T. brucei, et enfin des gènes Dl, D2, et E codant pour des trans-sialidases-like de T. brucei. Les pourcentages d'identité entre les séquences identifiée chez T. congolense et T. brucei sont présentés dans la Figure 26. Montagna et al. décrit que ces trans-sialidases sont exprimées in vivo dans les formes insectes ou formes procycliques, et jouent probablement un rôle important dans le transfert d'acide sialique sur la membrane des parasites, assurant ainsi la protection des parasites et leur survie lorsqu'ils sont transportés par des insectes vecteurs. Toutefois, Montagna et al. ne décrit pas la possibilité de détecter ces trans-sialidases en quantité suffisante dans les formes sanguines des parasites, c'est-à-dire chez les animaux infectés et ainsi de les utiliser en tant que vaccins ou diagnostics. Egalement, jusqu'à présent aucune activité sialidase n'avait été décrite de ces onze protéines dans les formes sanguines; la littérature décrivant au contraire l'absence d'activité de type sialidase dans les formes sanguines de T. congolense (Engstler et al. (1995) Acta Trop. 59 : 117-29). Alors qu'aucune de ces onze protéines n'avait jamais été mise en évidence dans les formes sanguines de T. congolense et aucune activité sialidase n'a été décrite dans ces formes, le Demandeur a mis en évidence de manière suprenante une activité sialidase dans les formes sanguines de T. congolense, et a démontré par immunoprécipitation suivie d'une analyse en spectrométrie de masse, l'expression des protéines TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, et TcoTS-like 2 dans les formes sanguines de T. congolense (Exemple 3 et Figure 27). Le Demandeur a par ailleurs démontré lors d'expérience de protection par vaccination sur modèles murins (Exemple 4, Figures 28A et 28B) que les protéines antigéniques TcoTS-Al, TcoTS-B1, et TS-like 2 permettaient d'obtenir un effet protecteur supérieur en termes de survie moyenne des animaux ainsi que par rapport à l'hématocrite. Par conséquent, la présente invention a pour objet des compositions vaccinales ou vétérinaires destinées au traitement et/ou la prévention d'une infection par les trypanosomes africains chez un animal non humain, particulièrement contre les infections par les espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax. Ces compositions vaccinales vétérinaires peuvent se présenter sous la forme de vaccin antigénique et comprennent alors une quantité thérapeutiquement efficace d'une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS- C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2, et/ou d'un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de ces protéines, et/ou d'un ou plusieurs équivalents fonctionnels immunologiques de ces protéines et/ou une combinaison desdites protéines, fragments ou équivalents fonctionnels. De préférence, lesdites compositions vaccinales ou vétérinaires comprennent au moins d'une protéine choisie parmi TcoTS-Al, TcoTS-B1, et TcoTS-like 2. De manière encore plus préférentielle, lesdites compositions vaccinales ou vétérinaires comprennent au moins la protéine TcoTS-like 2, et/ou un fragment peptidique antigénique, et/ou un équivalent fonctionnel immunologique de TcoTS-like 2. Alternativement, les compositions vaccinales peuvent comprendre une quantité thérapeutique efficace d'un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTSDl, et TcoTS-D2. Elles sont particulièrement utiles pour traiter et/ou prévenir les pathogénies induites par les trypanosomoses africaines, telles que notamment les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression des animaux non humains. Encore selon cet aspect, la présente invention concerne un réactif pour la détection et/ou la surveillance ainsi qu'un procédé et des kits pour le diagnostic d'infections par les trypanosomes africains, notamment par T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax. Les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre une ou plusieurs protéines TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2. De préférence, les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, et TcoTS-like 2. Le procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un animal non humain susceptible d'avoir été infecté par les trypanosomes africains, consiste à mettre en contact ledit échantillon et un réactif tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et détecter ensuite la présence d'un complexe immun avec ledit réactif.

A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection par la technique ELISA en une ou plusieurs étapes, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de compétition bien connues de l'homme du métier. Enfin selon cet aspect, la présente invention a pour objet un kit à usage vétérinaire pour le diagnostic de trypanosomose africaine animale dans un échantillon biologique comprenant un anticorps tel que précédemment décrit ainsi qu'un réactif pour la détection d'une réaction immunologique. Les kits selon la présente invention comportent au moins un compartiment pour un conditionnement éventuellement stérile comprenant une quantité thérapeutique efficace d'un réactif tel que précédemment décrit, ainsi qu'une fiche d'instructions concernant le protocole de mise en oeuvre du diagnostic vétérinaire selon l'invention.

EXEMPLES Exemple 1 : Production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine TcoTS-Al La protéine TcoTS-Al a été produite dans la levure Pichia pastoris. Pour cela, la souche X33 a été transformée par le vecteur PICZa (Invitrogen) contenant la séquence codant pour la protéine TcoTS-Al dépourvue de ses 29 premiers acides aminés. La protéine sécrétée dans le surnageant de culture après 4 jours d'induction d'expression au méthanol a été purifiée par des chromatographies échangeuses d'ions successives. Premièrement le surnageant de culture a été dialysé contre du tampon Na acétate 20mM pH4,5 pendant 16 heures, centrifugé 30 minutes à 10000g, puis soumis à une chromatographie sur 1 colonne HiTrap SP HP de l ml (GE Healthcare). L'élution a été réalisée selon un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl. Les fractions contenant une activité sialidase (test par fluorimétrie avec le substrat 2'-(4-methylumbelliferryl)-a-D-N-acetylneuraminic acid, comme décrit dans la publication Montagna et al. (2006) J. Biol. Chem. 281(45) : 33949-58), ont été rassemblées et dialysées 16 heures contre du tampon Tris-HCI 20 mM pH 8. Après centrifugation 30 minutes à 10000g, le surnageant a été soumis à une deuxième chromatographie sur 1 colonne HiTrap Q HP de 1 ml (GE Healthcare). L'élution a été réalisée selon un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl. Les fractions contenant une activité sialidase ont été regroupées et soumises à un traitement par la déglycosidase endoHF (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. L'échantillon déglycosylé a été à nouveau soumis à une chromatographie sur 1 colonne HiTrap Q HP de 1 ml (GE Healthcare) comme décrit ci-dessus. L'intégrité de la protéine a été vérifiée par électrophorèse SDS-PAGE et coloration au bleu de coomassie. Cette protéine recombinante purifiée a été ensuite utilisée pour immuniser des souris de type Balb-c ou des lapins. 20 µg de protéine recombinante ont été injectés aux souris à raison de 4 fois espacées de 15 jours ou 100 µg de protéine recombinante ont été injectés aux lapins à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Pour la première injection la protéine recombinante a été mélangée sous forme d'émulsion à de l'adjuvant de Freund complet puis pour les injections suivantes avec de l'adjuvant de Freund incomplet. Le sérum des animaux immunisés a été collecté en fin d'expérimentation (sérum anti-TcoTS-A1) et sa réactivité contre la protéine recombinante a été vérifiée en test ELISA indirect.

Exemple 2 : Production d'anticorps polyclonaux dirigés contre des peptides issus de séquences apparentées à des sialidases. Les peptides suivants : C-RTSIDYHLIDTVAKYSADDG (SEQ ID NO : 23), CPKNIKGSWHRDRLQLWLTD (SEQ ID NO : 24), et C-PVSAQGQDHRYEAANAEHT (SEQ ID NO : 25), respectivement nommés peptides 1, 2 et 3 ont été couplés grâce à la cystéine Nter à une protéine carrier (KLH) activée par une fonction maleimide et utilisés pour immuniser des lapins à raison de 5 injections de 100 µg espacées de 20 jours. Pour la première injection la protéine recombinante a été mélangée sous forme d'émulsion à de l'adjuvant de Freund complet puis pour les injections suivantes avec de l'adjuvant de Freund incomplet. Les sérums polyclonaux obtenus ont été désignés respectivement anticorps anti- peptide 1, anticorps anti-peptide 2, et anticorps anti-peptides 3, ont été récoltés en fin d'expérimentation et vérifiés pour leur réactivité contre leur peptide respectif par ELISA indirect.

Exemple 3 : Mise en évidence de l'expression des protéines TcoTS-Al, TcoTS-A2, 10 TcoTS-A3, TcoTS-like 2 dans les formes sanguines de T. congolense. 3 mL de sérum de lapin ou 1 mL de sérum de souris ont été dialysés contre 1 L de tampon phosphate 20 mM pH7 pendant 16 heures. Le sérum dialysé a été centrifugé 20 minutes à 5000g puis passé sur 1 colonne de sépharose protéine G Fast Flow (GE healthcare) préalablement préparée comme indiqué par le fournisseur. Après lavage de la colonne avec 15 du tampon phosphate 20 mM pH7, les IgG fixées sur la colonne ont été éluées avec du tampon Glycine HCI 0,1 M pH2,6. Les IgG ainsi purifiées ont a été dialysées 16 heures contre 1 L de tampon NaHCo3 0,1 M pH8,3, NaCl 0,5M. Les IgG ont a été ensuite incubées 2 heures à température ambiante avec de la sépharose activée au BrCN (Sigma) préalablement préparée selon les recommandations du fournisseur. Après centrifugation 1 minute à 1000g, 20 la résine a été lavée avec le précédent tampon puis saturée par ajout de Tris-HCI 0,1 M pH8 pendant 2 heures à température ambiante. Après centrifugation 1 minute à 1000g, la résine a été lavée successivement avec du tampon Tris-HCI pH8 NaCl 0,5M puis du tampon Na Acétate 0,1M pH4 NaCl 0,5M. La résine ainsi prête à l'utilisation pour une expérience d'immunoprécipitation a été équilibrée avec du tampon OLB (100 mM KCI, 17% glycérol, 1 25 mM MgCl2, 2,25 mM CaCl2 0,5% NP40, 10 mM Tris-HCI pH8). 109 cellules de la souche IL3000 ont été lysées dans le tampon OLB pendant 1heure à 4°C puis centrifugées 10 minutes à 20000g. Le surnageant a été incubé avec la résine préalablement préparée pendant 16 heures à 4°C. La résine a été alors centrifugée 1 minute à 1000g puis rincée avec du tampon OLB. Les antigènes liés aux IgG ont été élués avec du SDS2% bouillant. 30 L'éluat a été mis en dialyse contre de l'eau puis soumis à lyophilisation. Le lyophilisat a été ensuite repris dans du tampon Laemmli (50 mM Tris-HCI pH=6,8 ; 10 % glycérol ; 1 % SDS ; 2,5 % R-mercaptoéthanol ; 0.01 % bleu de bromophénol) puis soumis à une électrophorèse SDS PAGE. Le gel a été ensuite coloré au nitrate d'argent et les bandes ainsi révélées ont été découpées et analysées en spectrométrie de masse par la technologie MSMS. 35 Ce protocole a été réalisé avec les sérums polyclonaux anti-TcoTS-A1, anti-peptide 1, antipeptide 2 et anti-peptide 3 sur les formes procycliques et sur les formes sanguines de la souche IL3000 de T congolense. Les résultats concernant les formes sanguines ont été représentés dans la Figure 27. L'immunoprécipitation avec le sérum anti-TcoTS-A1 a permis d'identifier les protéines TcoTS-A1, TcoTS-A2 et TcoTS-A3 dans les formes procycliques et dans les formes sanguines de T. congolense. Les immunoprécipitations avec les sérums anti-peptide 1 anti-peptide 2 et anti-peptide 3 ont permis d'identifier la protéine TcoTS-like2 uniquement dans les formes sanguines de T. congolense. Ces résultats ont démontré pour la première fois l'expression des protéines TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3 et TcoTS-like2 dans les formes sanguines du parasite.

Exemple 4 : Essais de vaccination sur modèle murins Exemple 4.1 : Essais de vaccination avec TcoTS-like 1 2 lots de souris de type Balb-c sont injectées en intrapéritonéal avec 20 µg de BSA (lot de souris témoin négatif) ou avec une protéine recombinante TcoTS-like 1 (lot de souris immunisés) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris sont infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie sont mesurés tous les 2 jours sur les deux lots de souris.

Exemple 4.2 : Essais de vaccination avec TcoTS-like 2 14 souris de type Balb-c ont été injectées en intrapéritonéal avec 20 µg de BSA (7 souris témoin négatif) ou avec la protéine recombinante TcoTS-like 2 (7 souris) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris ont été infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie ont été mesurés tous les 2 jours. L'hématocrite moyen sur toute la durée de la parasitémie a été calculé : il est de 43,3±1,2% pour les souris immunisées avec TcoTS-like2 et de 37,0±0,7% pour les souris témoins immunisées par de la BSA (Figure 28) La survie moyenne des souris a également été déterminée, elle est de 453±81 heures pour les souris immunisées par avec TcoTS-like2 et de 267±23 heures pour les souris témoins immunisées par de la BSA.

Exemple 4.3 : Essais de vaccination avec TcoTS-like 3 2 lots de souris de type Balb-c sont injectées en intrapéritonéal avec 20 µg de BSA (lot de souris témoin négatif) ou avec la protéine recombinante TcoTS-like 3 (lot de souris immunisés) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris sont infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie sont mesurés tous les 2 jours sur les deux lots de souris.

Exemple 4.4 : Essais de vaccination avec TcoTS-A1 13 souris de type Balb-c ont été injectées en intrapéritonéal avec 20 µg de BSA (8 souris témoin négatif) ou de protéine recombinante TcoTS-Al (5 souris) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris ont été infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie ont été mesurés tous les 2 jours.

L'hématocrite moyen sur toute la durée de la parasitémie a été calculé : il est de 41,4±0,9% pour les souris immunisées avec TcoTS-Al et de 37,0±0,7% pour les souris témoins immunisées par de la BSA (Figure 28) La survie moyenne des souris a également été déterminée, elle est de 299±14 heures pour les souris immunisées par avec TcoTS-Al et de 267±23 heures pour les souris témoins immunisées par de la BSA.

Exemple 4.5 : Essais de vaccination avec TcoTS-B1 12 souris de type Balb-c ont été injectées en intrapéritonéal avec 20 µg de BSA (8 souris témoin négatif) ou de protéine recombinante TcoTS-B1 (4 souris) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris ont été infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie ont été mesurés tous les 2 jours. L'hématocrite moyen sur toute la durée de la parasitémie a été calculé : il est de 41,4±0,5% pour les souris immunisées avec TcoTS-B1 et de 37,0±0,7% pour les souris témoins immunisées par de la BSA (Figure 28) La survie moyenne des souris a également été déterminée, elle est de 463±94 heures pour les souris immunisées par avec TcoTS-B1 et de 267±23 heures pour les souris témoins immunisées par de la BSA.

Exemple 4.6: Essais de vaccination avec une ou plusieurs protéines choisies parmi TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2. 2 lots de souris de type Balb-c sont injectées en intrapéritonéal avec 20 µg de BSA (lot de souris témoin négatif) ou avec une ou plusieurs protéines recombinantes choisies parmi les protéines TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2 (lot de souris immunisés) à raison de 4 fois espacées de 15 jours. Puis, les souris sont infectées avec 104 parasites de la souche IL3000 de T. congolense. L'hématocrite ainsi que la parasitémie sont mesurés tous les 2 jours sur les deux lots de souris.

Exemple 5 : Essais de vaccination sur les bovins. 2 lots de bovins sont injectés en sous-cutané avec un ou plusieurs antigènes tels que TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2, mélangés avec deux types d'ajuvants Quil A (saponine) 1 mg/ml et Adjuphos (Phosphate d'aluminium colloidal) volume à volume selon un volume final de 1 mL ou juste avec le mélange d'adjuvants (contrôle). 3 injections à 3 semaines d'intervalle sont réalisées avec respectivement 100 µg, 50 µg et 25 µg d'antigène(s). Les animaux sont infectés par la souche IL3000 de T. congolense 3 semaines après la dernière injection à raison de 1000 parasites par animal en intradermique. Des prélèvements de sang journaliers sont réalisés jusqu'à ce que tous les animaux soient reconnus infectés, la détermination de la parasitémie se faisant sur buffy-coat. Puis des prélèvements de sang hebdomadaires sont réalisés pour suivre la parasitémie et l'anémie, le poids des animaux est suivi mensuellement. La cinétique de réponse à l'immunisation et à l'infection est suivie par ELISA sur les différents antigènes immunisants. Les antigènes utilisés lors de cette expérience d'immunisation peuvent être TcoTS-like 1, 2 ou 3 ou TcoTS-Al ou TcoTS-B1, seuls ou en association selon toutes les combinaisons possibles.

Exemple 6 : Exemple de tests de diagnostic sur sang d'animaux infectés. Ce test est réalisé par détection des antigènes circulants tels que TcoTS-Al, TcoTS-A2, TcoTS-A3, et TcoTS-like 2 par la méthode ELISA sandwich. L'anticorps dit de capture est adsorbé dans les puits d'une plaque 96 puits par incubation sur la nuit à 4°C de 1 à 10 µg/mL d'anticorps de capture dilué dans 100 µL tampon NaHCO3 50 mM pH9,6. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween (3,2 mM Na2HPO4 ; 0,5 mM KH2PO4 ; 1,3 mM KCI ; 135 mM NaCl, pH 7,4 ; 0,05% Tween 20). Puis 100 µL d'une solution de blocage (PBS-Tween 0,2% de gélatine) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 30 minutes à température ambiante. Les plaques sont vidées puis 100 µl des sérums d'animaux à tester sont déposés dans les puits et incubés 2 heures à 37°C. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 µL d'une solution contenant le deuxième anticorps couplé à de la biotine (PBS-Tween contenant 1 à 10 µg/mL d'anticorps biotinylé) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 1 heure à 37°C. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 µL de PBS-Tween contenant de la streptavidine couplée à la peroxydase (Sigma) sont ajoutés selon recommandations du fournisseur. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween. Enfin la réaction est révélée par ajout de substrat de la peroxydase selon les recommandations du fournisseur (exemple de révélateur pouvant être utilisé : ABTS (Sigma)). Le résultat est lu à l'aide d'un lecteur de plaque ou fluorimètre selon recommandations du fournisseur. L'anticorps de capture utilisé peut être soit un sérum polyclonal immunopurifié contre une ou un mélange des protéines de type sialidase de T. congolense, telles que TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, TcoTSC, TcoTS-D1, et TcoTS-D2, ou bien un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope présent sur une ou plusieurs de ces protéines de type sialidase de T. congolense. Le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal différent de l'anticorps de capture qui reconnaît un épitope différent d'une ou plusieurs des protéines de type sialidase TcoTS-like 1, TcoTS-like 2, TcoTS-like 3, TcoTS-A1, TcoTS-A2, TcoTS-A3, TcoTS-B1 TcoTS-B2, 15 TcoTS-C, TcoTS-D1, et TcoTS-D2 de T. congolense.

Claims (18)

1. REVENDICATIONS1. Molécule d'ADN ou d'ARN caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique isolée codant pour une trans-sialidase-like appartenant aux trypanosomes africains, choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 1-3, une séquence complémentaire d'une séquence choisie d'une des séquences SEQ ID Nos : 1-3, une séquence comprenant une identité d'au moins 70% avec une des séquences SEQ ID NOs : 1-3, un fragment de celles-ci, ou une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider avec une des séquences SEQ ID NOs : 1-3 dans des conditions stringentes d'hybridation.
2. 2. Une protéine codée par la séquence nucléotidique selon la revendication 1.
3. 3. Un protéine selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence choisie parmi les SEQ ID Nos :
4. 4-6, désignées respectivement TcoTS-like 1, 2, et 3, ou un fragment peptidique antigénique desdites protéines. 4. Une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule d'ADN selon la revendication 1.
5. 5. Un vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 4.
6. 6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit vecteur est d'origine eucaryote ou procaryote.
7. 7. Une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon la revendication 1, une cassette d'expression selon la revendication 4, ou encore un vecteur recombinant selon la revendication 5 ou 6. 30
8. 8. Cellule hôte selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite cellule est d'origine eucaryote, telle que notamment les cellules issues d'un mammifère, les cellules d'insectes, les cellules issues d'un champignon, les cellules issues d'une levure, ou ladite cellule est d'origine procaryote, telle que notamment les cellules issues d'E.coli, ou les cellules d'entérobactéries. 27 35
9. 9. Protéine selon la revendication 2 ou 3, ou un fragment peptidique antigénique, caractérisé en ce que ladite protéine ou ledit fragment présente une réactivité avec les sera des animaux infectés par un trypanosome africain.
10. 10. Protéine selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle présente une réactivité avec les sera des animaux infectés par les trypanosomes africains, le Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, ou Trypanosome brucei.
11. 11. Un vaccin pour la prévention et/ou le traitement des trypanosomoses africaines et pathogénies induites, chez les animaux non humains, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité thérapeutique efficace d'une ou plusieurs protéines selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 9, et 10.
12. 12. Vaccin selon la revendication 11 pour la protection contre les infections à 15 Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, ou Trypanosoma brucei.
13. 13. Vaccin selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce que lesdites pathogénies induites comprennent les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, 20 et/ou l'immunosuppression desdits animaux non humains.
14. 14. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain avec au moins une protéine ou un fragment peptidique antigénique selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 9, et 10.
15. 15. Sonde pour l'identification des parasites trypanosomes africains, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique selon la revendication 1. 30
16. 16. Réactif pour la détection de trypanosomiase africaine dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon la revendication 14 ou une sonde selon la revendication 15.
17. 17. Procédé de détection de trypanosomiase africaine dans un échantillon biologique, tel 35 que le sang d'un animal non humain susceptible d'avoir été infecté par un trypanosome africain, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon et un anticorps selon la 25revendication 14 dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et en ce que l'on détecte ensuite la présence d'un complexe immun.
18. 18. Kit pour le diagnostic de trypanosomiase africaine dans un échantillon biologique comprenant un anticorps selon la revendication 14 ou une sonde selon la revendication 15.