FR2944807A1 - Determining species of bacterial strain belonging to Staphylococcus, comprises determining length and/or sequence of N-terminal region of serine protease HtrA2 and determining species of bacterial strain belonging to Staphylococcus - Google Patents
Determining species of bacterial strain belonging to Staphylococcus, comprises determining length and/or sequence of N-terminal region of serine protease HtrA2 and determining species of bacterial strain belonging to Staphylococcus Download PDFInfo
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Abstract
Description
Domaine Technique La présente invention concerne le domaine de la microbiologie et, plus spécifiquement, un procédé pour déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus à des fins diagnostiques ou non, ainsi qu'un kit permettant la mise en oeuvre d'un tel procédé. Art Antérieur Les bactéries du genre Staphylococcus sont des espèces ubiquitaires qui occupent des niches écologiques variées et constituent un problème majeur de santé publique du fait, notamment, des infections nosocomiales dont elles sont responsables. Elles regroupent non seulement des souches pathogènes de l'homme et de l'animal, mais aussi des souches isolées d'aliments fermentés qui ne posent pas de problème à une population saine, et surtout des souches commensales, présentes sur la peau et les muqueuses. TECHNICAL FIELD The present invention relates to the field of microbiology and, more specifically, a method for determining the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus for diagnostic or non-diagnostic purposes, as well as a kit enabling the implementation of such a method. PRIOR ART Bacteria of the genus Staphylococcus are ubiquitous species that occupy various ecological niches and constitute a major public health problem due, in particular, nosocomial infections for which they are responsible. They include not only pathogenic strains of human and animal, but also isolated strains of fermented foods that do not pose a problem to a healthy population, and especially commensal strains, present on the skin and mucous membranes .
Ces bactéries sont classées en deux groupes, à savoir les staphylocoques à coagulase positive, ou Staphylococcus aureus, pathogène, et les autres espèces du genre Staphylococcus appelées à coagulase négative , par opposition à 5. aureus. Ces espèces à coagulase négative ou non aureus ont longtemps été considérées comme une seule espèce commensale non pathogène, à savoir Staphylococcus albus, sur la base de leur phénotype commun différent de celui de S. aureus (qui seul produit la coagulase) et leur portage par la population saine. En réalité, les espèces à coagulase négative , sont comme 5. aureus, des pathogènes. Les deux sont parmi les premières causes d'infections nosocomiales à l'hôpital, notamment chez des patients immuno-déprimés ou ayant subi des traitements lourds (chirurgie, transplantation, chimiothérapie, etc.). Et dans la population saine, S. aureus est responsable d'infections variées (toxi-infections alimentaires, infections localisées suppurées, furoncles etc.), et Staphylococcus saprophyticus, une espèce à coagulase négative , d'infections urinaires chez la femme. Ainsi, la désignation collective d'espèces à coagulase négative , qui n'est que phénotypique et historique, a largement occultée d'une part leur diversité, puisqu'il en existe en fait presque une quarantaine d'espèces distinctes (Staphylococcus epidermidis, 5taphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, 5. warneri, S. capitis etc.), mais également leur pathogénicité. En effet, les espèces à coagulase négative ont longtemps été considérées comme des commensaux inoffensifs et leur isolement à partir d'échantillons cliniques comme le résultat d'une contamination par la flore naturelle du patient ou de l'animal infecté. Cette vision a considérablement évolué. Aujourd'hui, chez l'homme notamment, on sait que Staphylococcus epidermidis est un agent opportuniste capable de former des biofilms sur du matériel chirurgical ou des prothèses, que certaines espèces agressives émergent (comme Staphylococcus lugdunensis responsable d'endocardites sévères) et surtout que les espèces à coagulase négative peuvent présenter des niveaux de résistance à la méthicilline très élevés que celui de S. aureus, d'où la difficulté de traiter les infections qu'elles causent. Pourtant, ces espèces à coagulase négative sont encore prises en compte collectivement dans les études épidémiologiques tant chez l'homme que chez l'animal, ainsi que dans les études qui décrivent les populations d'écosystèmes alimentaires, ce qui constitue une importante simplification par rapport à la réalité et surtout ne permet pas d'évaluer précisément l'importance des différentes espèces à coagulase négative dans les infections. Différentes méthodes ont toutefois été développées en vue de distinguer ces différentes espèces de Staphylococcus, avec notamment des tests phénotypiques ou des méthodes moléculaires de génotypage (PFGE, RFLP, TTGE, DDGE, ribotyping), les plus courantes reposant sur le polymorphisme de séquence d'un gène très bien conservé. Des méthodes à haut débit se développent (DNA microarrays, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis et Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis). These bacteria are classified into two groups, namely coagulase-positive staphylococci, or pathogenic Staphylococcus aureus, and the other species of Staphylococcus genus called coagulase negative, as opposed to 5. aureus. These coagulase-negative or non-aureus species have long been considered as a single non-pathogenic commensal species, namely Staphylococcus albus, based on their common phenotype different from that of S. aureus (which alone produces coagulase) and their carriage by the healthy population. In reality, coagulase negative species are like 5. aureus, pathogens. Both are among the leading causes of nosocomial infections in the hospital, especially in immuno-depressed patients or those undergoing heavy treatment (surgery, transplantation, chemotherapy, etc.). And in the healthy population, S. aureus is responsible for various infections (food poisoning, localized suppurated infections, boils, etc.), and Staphylococcus saprophyticus, a coagulase-negative species, of urinary infections in women. Thus, the collective designation of coagulase negative species, which is only phenotypic and historical, has largely overshadowed their diversity, since there are in fact almost forty distinct species (Staphylococcus epidermidis, 5taphylococcus). haemolyticus, Staphylococcus hominis, 5. warneri, S. capitis, etc.), but also their pathogenicity. In fact, coagulase-negative species have long been considered harmless commensals and their isolation from clinical specimens as a result of contamination by the natural flora of the patient or the infected animal. This vision has evolved considerably. Today, especially in humans, it is known that Staphylococcus epidermidis is an opportunistic agent capable of forming biofilms on surgical equipment or prostheses, that certain aggressive species emerge (such as Staphylococcus lugdunensis responsible for severe endocarditis) and especially that coagulase-negative species may have very high levels of methicillin resistance compared to S. aureus, making it difficult to treat the infections they cause. However, these coagulase-negative species are still considered collectively in epidemiological studies in both humans and animals, as well as in studies that describe populations of food ecosystems, which is an important simplification compared to to the reality and especially does not allow to evaluate precisely the importance of the different coagulase negative species in infections. However, various methods have been developed to distinguish these different species of Staphylococcus, including phenotypic tests or molecular genotyping methods (PFGE, RFLP, TTGE, DDGE, ribotyping), the most common ones based on DNA sequence polymorphism. a very well preserved gene. High throughput methods are developing (DNA microarrays, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis).
De manière plus générale, ces méthodes sont assez lourdes et coûteuses, et la plupart ne sont pas utilisables en routine sauf dans des laboratoires spécialisés qui possèdent un équipement et un savoir-faire technique particuliers. En conséquence, un des enjeux majeurs du diagnostic d'espèces (pour les médecins à l'hôpital, pour les vétérinaires ou les industriels de l'agro-alimentaire) est de pouvoir identifier avec précision et efficacité les espèces de Staphylococcus significatives du point de vue clinique (les agents étiologiques des infections), de celles qui peuvent contaminer les prélèvements (commensales ou présentes dans l'environnement). More generally, these methods are rather cumbersome and expensive, and most are not routinely usable except in specialized laboratories that possess special equipment and technical know-how. As a result, one of the major challenges of species diagnosis (for doctors in the hospital, for veterinarians or agro-food industry) is to be able to identify with precision and efficiency the species of Staphylococcus significant from the point of view of clinical view (the etiological agents of the infections), of those which can contaminate the samples (commensals or present in the environment).
Résumé de l'Invention La présente invention concerne un procédé pour déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus comprenant les étapes de : (i) détermination de la longueur et/ou de la séquence de la région N- terminale de la protéase à sérine HtrA2 Ligh temperature requirement member A2) de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus, et (ii) détermination de l'espèce de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus au regard de la longueur et/ou de la séquence de ladite région N-terminale de la protéine HtrA2. L'invention concerne également un kit pour déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus, lequel kit comprend au moins un moyen permettant de déterminer la longueur et/ou de la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus. L'invention concerne enfin l'utilisation d'un tel moyen soit à des fins non diagnostiques en vue de déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus, soit aux fins de diagnostiquer chez un sujet une infection par une souche d'une bactérie appartenant au genre Staphylococcus. Description des figures Figure 1 : Représentation schématique des protéines HtrAl et HtrA2 chez différentes bactéries du genre 5taphylococcus. Figure 2 : Représentation schématique chez les bactéries du genre Staphylococcus de la région génomique contenant le gène htrA2 (l'encadré blanc représente le domaine N-terminal du gène htrA2) encadré par les gènes terC-like et trkH-like. Figure 3 : Gels d'électrophorèse des produits d'amplification du gène htrA2 pour différentes souches de Staphylococcus aureus. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a method for determining the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus comprising the steps of: (i) determining the length and / or sequence of the N-terminal region of the serine protease HtrA2 Ligh temperature requirement member A2) of said strain of bacterium belonging to the genus Staphylococcus, and (ii) determining the species of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus with regard to the length and / or the sequence of said N-terminal region of the HtrA2 protein. The invention also relates to a kit for determining the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus, which kit comprises at least one means for determining the length and / or sequence of the N-terminal region of the protease. serine HtrA2 of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus. The invention also relates to the use of such a means for non-diagnostic purposes in order to determine the species of a strain of bacterium belonging to the genus Staphylococcus, or for the purpose of diagnosing in a subject an infection with a strain. of a bacterium belonging to the genus Staphylococcus. Description of the Figures Figure 1: Schematic representation of HtrA1 and HtrA2 proteins in various bacteria of the genus 5taphylococcus. Figure 2: Schematic representation in bacteria of the genus Staphylococcus of the genomic region containing the htrA2 gene (the white box represents the N-terminal domain of the htrA2 gene) flanked by the genes terC-like and trkH-like. Figure 3: Electrophoresis gels of amplification products of the htrA2 gene for different strains of Staphylococcus aureus.
Figure 4 : Gels d'électrophorèse des produits d'amplification du gène htrA2 pour différentes souches de Staphylococcus epidermidis. Figure 5 : Gel d'électrophorèse des produits d'amplification du gène htrA2 pour différentes souches de Staphylococcus haemolyticus. Figure 4: Electrophoresis gels of the amplification products of the htrA2 gene for different strains of Staphylococcus epidermidis. FIG. 5: Electrophoresis gel of the amplification products of the htrA2 gene for different strains of Staphylococcus haemolyticus.
Figure 6 : Gel d'électrophorèse des produits d'amplification du gène htrA2 pour différentes souches de Staphylococcus saprophyticus. FIG. 6: Electrophoresis gel of the amplification products of the htrA2 gene for various strains of Staphylococcus saprophyticus.
Description détaillée de l'Invention Les protéines HtrA, conservées des procaryotes aux eucaryotes, forment une famille de protéases à sérine indépendantes de l'ATP et exportées. Plus qu'une conservation de séquence, c'est une structure modulaire en trois domaines qui caractérise cette famille de protéines HtrA avec un signal d'exportation N-terminal, un domaine central catalytique et un ou deux domaines C-terminaux appelés PDZ. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION HtrA proteins, conserved from eukaryotic prokaryotes, form a family of serine proteases independent of ATP and exported. More than a sequence conservation, it is a three-domain modular structure that characterizes this family of HtrA proteins with an N-terminal export signal, a catalytic core domain, and one or two C-terminal domains called PDZs.
Chez les procaryotes, elles sont plus spécifiquement impliquées dans la dégradation de ménage des protéines dans l'enveloppe (élimination des protéines mal repliées), la résistance aux stress, en particulier thermique, et la virulence chez de nombreux pathogènes. Dans une espèce donnée, on peut trouver plusieurs copies HtrA de même structure avec, par exemple, trois copies chez Escherichia coli ou Bacillus subtilis, ou deux copies (HtrAl et HtrA2) chez Staphylococcus aureus. En analysant la copie HtrA2 de Staphylococcus aureus qui présente un long domaine N-terminal de fonction inconnue, les inventeurs ont pu mettre en évidence que ce domaine N-terminal a la particularité d'être à la fois spécifique du genre Staphylococcus et également de bénéficier d'une taille variable selon les espèces. A titre d'illustration, la figure 1 représente la structure des protéines HtrAl et HtrA2 chez différentes bactéries du genre Staphylococcus. In prokaryotes, they are more specifically involved in household degradation of proteins in the envelope (elimination of misfolded proteins), resistance to stress, in particular heat, and virulence in many pathogens. In a given species, one can find several HtrA copies of the same structure with, for example, three copies in Escherichia coli or Bacillus subtilis, or two copies (HtrAl and HtrA2) in Staphylococcus aureus. By analyzing the HtrA2 copy of Staphylococcus aureus, which has a long N-terminal domain of unknown function, the inventors have been able to demonstrate that this N-terminal domain has the particularity of being both specific for the genus Staphylococcus and also of benefiting from of variable size depending on the species. By way of illustration, FIG. 1 represents the structure of the HtrA1 and HtrA2 proteins in various bacteria of the genus Staphylococcus.
Ainsi, un alignement de séquence avec les séquences protéiques non redondantes disponibles dans les bases de données montre que ce domaine N-terminal de HtrA2 ne présente d'homologie qu'avec lui-même, avec un degré de conservation élevé au sein d'une même espèce de Staphylococcus (95 à 100% d'identité globale) et un faible degré de conservation entre deux espèces de Staphylococcus (25 à 35 % d'identité globale dans certains cas, mais seulement une identité locale dans d'autres). En outre, la variabilité de séquence de ce domaine N-terminal se répercute également en terme de variabilité de taille (cf. Figure 1) avec 409 AA (acides aminés) chez 5. aureus, 276 AA chez S. haemolyticus, 226 AA chez 5. saprophyticus et 223 AA chez 5. epidermidis. Les inventeurs ont également pu mettre en évidence que le gène htrA2, malgré la variabilité de la région codant pour la région N-terminale de la protéine HtrA2, est présent dans une région très conservée dans tous les génomes de bactéries du genre Staphylococcus séquencés. Plus spécifiquement, les gènes immédiatement en amont et en aval du gène htrA2 (apparentés aux familles de gènes terC et trkH et appelés terC-like et trkH-like) montrent une très bonne conservation quelle que soit l'espèce de Staphylococcus. Finalement, et sur la base de ces découvertes, les inventeurs ont pu développer une méthode permettant d'identifier l'espèce à laquelle appartient une bactérie du genre Staphylococcus tirant partie de ces spécificités du gène htrA2. Thus, a sequence alignment with the non-redundant protein sequences available in the databases shows that this N-terminal domain of HtrA2 has homology only with itself, with a high degree of conservation within a same species of Staphylococcus (95-100% global identity) and a low degree of conservation between two species of Staphylococcus (25-35% global identity in some cases, but only local identity in others). In addition, the sequence variability of this N-terminal domain is also reflected in terms of size variability (see Figure 1) with 409 AA (amino acids) in 5. aureus, 276 AA in S. haemolyticus, 226 AA in 5. saprophyticus and 223 AA in 5. epidermidis. The inventors have also been able to demonstrate that the htrA2 gene, despite the variability of the region coding for the N-terminal region of the HtrA2 protein, is present in a highly conserved region in all genomes of sequenced Staphylococcus bacteria. More specifically, the genes immediately upstream and downstream of the htrA2 gene (related to the terC and trkH gene families and called terC-like and trkH-like) show a very good conservation regardless of the species of Staphylococcus. Finally, and on the basis of these findings, the inventors have been able to develop a method for identifying the species to which belongs a bacterium of the genus Staphylococcus taking advantage of these specificities of the htrA2 gene.
En conséquence, la présente invention concerne un nouveau procédé pour déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus comprenant les étapes de : (i) détermination de la longueur et/ou de la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 ( igh temperature requirement member A2) de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus, et (ii) détermination de l'espèce de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus au regard de la longueur et/ou de la séquence de ladite région N-terminale de la protéine HtrA2. Par là même, l'invention fournit donc un procédé in vitro simple qui permet de distinguer différentes espèces de Staphylococcus les unes des autres et, également, des autres espèces bactériennes. Naturellement, la souche testée par le procédé selon l'invention est 30 une souche isolée ou non à partir d'un échantillon biologique. Le terme de échantillon biologique s'entend au sens large et correspond à tout type de prélèvements microbiologiques, tel que par exemple un prélèvement de matières alimentaires (produits laitiers, viande, etc.), un prélèvement d'un sol, un prélèvement sur un mammifère vivant 25 (peau, muqueuses, etc.), ou l'un de ses dérivés comme une pré-culture issue d'un tel prélèvement. Selon la nature de l'échantillon biologique testé, à savoir s'il s'agit ou non d'un prélèvement sur un mammifère vivant ou de l'un de ses dérivés, le procédé selon l'invention pourra être considéré comme un procédé à visée thérapeutique (diagnostique) ou non. La méthode selon l'invention permet de déterminer pour une bactérie appartenant au genre Staphylococcus, l'espèce à laquelle appartient cette dernière parmi les espèces suivantes : Staphylococcus afermentans, , Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus muscae, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus vitulus, Staphylococcus warneri ou Staphylococcus xylosus. Plus spécifiquement, les bactéries appartenant au genre Staphylococcus dont on pourra déterminer simplement l'espèce par le procédé selon l'invention sont choisies dans le groupe comprenant Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus saprophyticus et Staphylococcus warneri. Plus spécifiquement, la Région N-terminale de la sérine protéase HtrA2 correspond à la région s'étendant de la méthionine en position 1 de la protéine HtrA2 jusqu'à l'acide aminé précédant le signal d'exportation de la protéine HtrA2. Sachant que ce domaine d'exportation correspond à une séquence hydrophobe d'une dizaine d'acides aminés conservée entre les différentes protéines HtrA2, la région N-terminale de la protéine HtrA2 peut donc aisément être déterminée. Accordingly, the present invention relates to a novel method for determining the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus comprising the steps of: (i) determining the length and / or sequence of the N-terminal region of the serine protease HtrA2 (igh temperature requirement member A2) of said strain of bacterium belonging to the genus Staphylococcus, and (ii) determining the species of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus with regard to the length and / or the sequence of said N-terminal region of the HtrA2 protein. By the same token, the invention thus provides a simple in vitro method which makes it possible to distinguish different species of Staphylococcus from each other and also from other bacterial species. Naturally, the strain tested by the method according to the invention is a strain isolated or not from a biological sample. The term biological sample is understood in the broadest sense and corresponds to any type of microbiological samples, such as for example a sample of food materials (dairy products, meat, etc.), a sample of a soil, a sample taken from a sample. living mammal (skin, mucous membranes, etc.), or one of its derivatives as a pre-culture derived from such a sample. Depending on the nature of the biological sample tested, whether or not it is a live mammalian sample or a derivative thereof, the method according to the invention may be considered as a method for therapeutic aim (diagnostic) or not. The method according to the invention makes it possible to determine, for a bacterium belonging to the genus Staphylococcus, the species to which the latter belongs among the following species: Staphylococcus afermentans, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus muscae, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus vitulus, Staphylococcus warneri or Staphylococcus xylosus. More specifically, the bacteria belonging to the genus Staphylococcus which can be determined simply by the method according to the invention are selected from the group comprising Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus saprophyticus and Staphylococcus warneri. More specifically, the N-terminal region of the serine protease HtrA2 corresponds to the region extending from the methionine at the 1-position of the HtrA2 protein to the amino acid preceding the export signal of the HtrA2 protein. Given that this export domain corresponds to a hydrophobic sequence of about ten amino acids conserved between the different HtrA2 proteins, the N-terminal region of the HtrA2 protein can therefore easily be determined.
A titre d'exemple, ce domaine d'exportation correspond à la séquence allant des acides aminés 410 à 423 de la séquence SEQ ID N°1 de Staphylococcus aureus, la séquence allant des acides aminés 224 à 237 de la séquence SEQ ID N°19 de Staphylococcus epidermidis, la séquence allant des acides aminés 277 à 290 de la séquence 5EQ ID N°25 de Staphylococcus haemolyticus, la séquence allant des acides aminés 227 à 240 de la séquence SEQ ID N°28 de Staphylococcus saprophyticus, la séquence allant des acides aminés 283 à 296 de la séquence SEQ ID N°35 de Staphylococcus capitis, la séquence allant des acides aminés 218 à 230 de la séquence SEQ ID N°36 de Staphylococcus carnosus et la séquence allant des acides aminés 224 à 238 de la séquence SEQ ID N°33 de Staphylococcus xylosus. L'étape de détermination de la longueur de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 peut être effectuée, selon les cas, par l'analyse de la longueur de la protéine HtrA2 et/ou de la longueur de l'acide nucléique codant pour celle-ci. En effet, l'analyse des inventeurs montre que si cette région présente une taille variable, les autres régions de HtrA2 présentent elles une taille et, également, une séquence conservées entre les espèces de Staphylococcus. Aussi, une variation de la taille de la protéine HtrA2 totale ou de la taille de l'acide nucléique codant pour la protéine totale permet par déduction simple et directe de conclure à une variation de la taille de cette région N-terminale. L'étape de détermination de la longueur de la région N-terminale peut 25 se faire par détermination de la taille de l'acide nucléique codant pour cette région ou pour la protéine HtrA2 entière. Dans ce cas de figure, de nombreuses méthodes bien connues sont utilisables telles que les techniques d'amplification comme la PCR, les techniques d'hybridation comme le Southern blot, le Northern blot, les 30 techniques de digestion enzymatique comme la RFLP ou encore des techniques mixtes comme la PRA (PCR-restriction length polymorphism analysis). Avantageusement, la technique utilisée pour cette étape de détermination de la longueur de la région N-terminale de la protéine HtrA2 35 correspond à la PCR. By way of example, this export domain corresponds to the sequence ranging from amino acids 410 to 423 of the sequence SEQ ID No. 1 of Staphylococcus aureus, the sequence ranging from amino acids 224 to 237 of the sequence SEQ ID No. Staphylococcus epidermidis, the sequence from amino acids 277 to 290 of Staphylococcus haemolyticus sequence 5EQ ID No. 25, the sequence from amino acids 227 to 240 of sequence SEQ ID No. 28 of Staphylococcus saprophyticus, the sequence of amino acids 283 to 296 of the sequence SEQ ID No. 35 of Staphylococcus capitis, the sequence ranging from amino acids 218 to 230 of the sequence SEQ ID No. 36 of Staphylococcus carnosus and the sequence from amino acids 224 to 238 of SEQ ID NO: 33 sequence of Staphylococcus xylosus. The step of determining the length of the N-terminal region of the serine protease HtrA2 can be carried out, as the case may be, by analyzing the length of the HtrA2 protein and / or the length of the nucleic acid. coding for it. Indeed, the analysis of the inventors shows that if this region has a variable size, the other regions of HtrA2 have a size and also a sequence conserved between the species of Staphylococcus. Also, a variation in the size of the total HtrA2 protein or in the size of the nucleic acid coding for the total protein makes it possible, by simple and direct deduction, to conclude that the size of this N-terminal region varies. The step of determining the length of the N-terminal region can be done by determining the size of the nucleic acid coding for that region or for the entire HtrA2 protein. In this case, many well-known methods can be used, such as amplification techniques such as PCR, hybridization techniques such as Southern blotting, Northern blotting, enzymatic digestion techniques such as RFLP or else mixed techniques such as PRA (PCR-restriction length polymorphism analysis). Advantageously, the technique used for this step of determining the length of the N-terminal region of the HtrA2 protein corresponds to PCR.
Un mode de réalisation préféré est décrit dans les exemples, lequel mode tire partie de la conservation importante des séquences (gènes) encadrant le gène htrA2. Aussi, cette amplification par PCR peut être réalisée simplement en utilisant au moins un couple d'amorces, dont chaque amorce s'hybride respectivement et de façon spécifique avec une séquence du gène terC-like et avec une séquence du gène trkH-like, lequel couple d'amorce permet l'amplification du gène htrA2. Le gène terC-like codant pour la protéine intégrale membranaire TerC (Tellurium resistance protein member C) et le gène trkH-like codant pour la protéine membranaire TrkH (Transporter K+ (potassium) member H protein) sont bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemple, la position de ces deux gènes pour différentes souches de bactéries appartenant au genre Staphylococcus est donnée dans le tableau I qui suit. A preferred embodiment is described in the examples, which mode takes advantage of the important conservation of the sequences (genes) flanking the htrA2 gene. Also, this PCR amplification can be carried out simply by using at least a pair of primers, each primer of which hybridises respectively and specifically with a sequence of the terC-like gene and with a sequence of the trkH-like gene, which primer pair allows amplification of the htrA2 gene. The terC-like gene coding for the integral membrane protein TerC (Tellurium resistance protein member C) and the trkH-like gene coding for the membrane protein TrkH (Transporter K + (potassium) member H protein) are well known to those skilled in the art. . By way of example, the position of these two genes for different strains of bacteria belonging to the genus Staphylococcus is given in Table I which follows.
Tableau I Souche Numéro Position du gène Position du gène d'accession TerC-Iike dans le trkH-like dans le du génome génome génome (dénomination locus) (dénomination locus) S. aureus USA300 CP000730.1 1026156..1026959 1029519..1030877 (USA300HOU_0979) (USA300HOU_098 1) S. aureus Mu3 AP009324.1 1073809..1074612 1077172..1078530 (SAHV_1015) (SAHV_1017) S. aureus COL CP000046.1 1035682..1036485 1039045..1040403 (SACOL1026) (SACOL1030) S. epidermidis RP62A CP000029.1 603719..604525 606511..607869 (SERP0610) (SERP0612) S. epidermidis ATCC 12228 AE015929.1 711492..712298 714285..715643 (SE_0721) (SE_0724) S. haemolyticus JCSC1435 AP006716.1 1984930..1985727 1981384..1982742 (SH 1937) (SH 1935) S. saprophyticus ATCC AP008934.1 1835146..1835946 1831604..1832962 15305 (SSP1764) (SSP1762) Assez classiquement, les amorces choisies présenteront une longueur d'au moins 15 acides nucléiques et, de préférence, d'au moins 20 acides nucléiques. Parallèlement, ces mêmes amorces présenteront une longueur inférieure à 30 acides nucléiques, de préférence inférieure à 25 acides nucléiques, essentiellement en vue de bénéficier de coûts de synthèse attractifs. Concernant la condition d'une hybridation spécifique, celle-ci peut être remplie simplement en choisissant des amorces qui présentent au moins 95% d'identité, voire au moins 99% d'identité avec les séquences complémentaires des séquences ciblées sur le gène terC-like et sur le gène trkH-like. Bien évidement, on choisira de préférence des amorces présentant une identité de séquence de 100% avec ces mêmes séquences. Dans le mode de réalisation préféré décrit dans les exemples, le 10 procédé selon l'invention envisage l'utilisation d'au moins un couple d'amorces choisi dans le groupe suivant : 1) le couple d'amorces ATCCAGGACTTGAAGGTGC (5EQ ID N° 66) et CGTTCTCTAATTCCAATATG (SEQ ID N° 67), et 2) le couple d'amorces CCACTCATTGTATCTTTATTAT (5EQ ID 15 N° 68) et TGGYATGGACTTAGGTCAATT (SEQ ID N° 69). Le premier couple d'amorces (1) permet de déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre 5taphylococcus qui est choisie dans le groupe comprenant 5. aureus et S. epidermidis. Le second couple d'amorces (2) permet de déterminer l'espèce d'une 20 souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus qui est choisie dans le groupe comprenant S. warneri, 5. cohnii, S. equorum, S. kloosii, 5. haemolyticus et 5. saprophyticus. Ainsi, l'utilisation combinée de ces deux couples d'amorces permet de déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre 25 Staphylococcus qui est choisie dans un large groupe comprenant 5. aureus, 5. epidermidis, 5. warneri, S. cohnii, S. equorum, S. kloosii, S. haemolyticus et 5. saprophyticus. Tou jours pour la détermination de la longueur de la région N-terminale de la protéine HtrA2, il est également possible d'effectuer cette étape par 30 la détermination de la taille de la protéine HtrA2 entière. Comme nous l'avons vu précédemment, seule cette région N-terminale de la protéine HtrA2 montre une variation de sa longueur entre les différentes espèces appartenant au genre 5taphylococcus, la détermination de la longueur de la protéine entière permet donc simplement et directement de déterminer la longueur de cette région N-terminale. Pour cette étape de détermination particulière, de nombreuses méthodes bien connues sont là encore utilisables telles que les techniques d'immuno-blots comme le Western blot, de dégradation chimique ou enzymatique, ou encore les techniques de chromatographie. Avantageusement, la technique utilisée pour cette étape de détermination de la longueur de la région N-terminale de la protéine HtrA2 correspond au Western blot. Table I Strain Number Position of the gene Position of the accession gene TerC-Iike in trkH-like in the genome genome genome (denomination locus) (denomination locus) S. aureus USA300 CP000730.1 1026156..1026959 1029519..1030877 (USA300HOU_0979) (USA300HOU_098 1) S. aureus Mu3 AP009324.1 1073809..1074612 1077172..1078530 (SAHV_1015) (SAHV_1017) S. aureus COL CP000046.1 1035682..1036485 1039045..1040403 (SACOL1026) (SACOL1030) S epidermidis RP62A (SERP0612) S. epidermidis ATCC 12228 AE015929.1 711492..712298 714285..715643 (SE_0721) (SE_0724) S. haemolyticus JCSC1435 AP006716.1 1984930 ## EQU5 ## The classically selected primers will have a length of at least Nucleic acids and, preferably, at least 20 nucleic acids. In parallel, these same primers will have a length of less than 30 nucleic acids, preferably less than 25 nucleic acids, essentially in order to benefit from attractive synthesis costs. As regards the condition of a specific hybridization, this can be fulfilled simply by choosing primers which have at least 95% identity, or even at least 99% identity, with the complementary sequences of the sequences targeted on the terC gene. like and on the trkH-like gene. Of course, primers having a sequence identity of 100% with these same sequences will preferably be chosen. In the preferred embodiment described in the examples, the method according to the invention contemplates the use of at least one pair of primers selected from the following group: 1) the primer pair ATCCAGGACTTGAAGGTGC (5EQ ID NO. 66) and CGTTCTCTAATTCCAATATG (SEQ ID NO: 67), and 2) the primer pair CCACTCATTGTATCTTTATTAT (5EQ ID No. 68) and TGGYATGGACTTAGGTCAATT (SEQ ID NO: 69). The first pair of primers (1) makes it possible to determine the species of a bacterium strain belonging to the genus 5taphylococcus which is selected from the group comprising 5. aureus and S. epidermidis. The second pair of primers (2) makes it possible to determine the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus which is selected from the group comprising S. warneri, 5. cohnii, S. equorum, S. kloosii, haemolyticus and 5. saprophyticus. Thus, the combined use of these two pairs of primers makes it possible to determine the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus which is selected from a broad group comprising 5. aureus, 5. epidermidis, 5. warneri, S. cohnii, S. equorum, S. kloosii, S. haemolyticus and 5. saprophyticus. In order to determine the length of the N-terminal region of the HtrA2 protein, it is also possible to perform this step by determining the size of the entire HtrA2 protein. As we have seen previously, only this N-terminal region of the HtrA2 protein shows a variation of its length between the different species belonging to the genus 5taphylococcus, the determination of the length of the whole protein thus allows simply and directly to determine the length of this N-terminal region. For this particular determination step, many well-known methods are again usable such as immunoblots techniques such as Western blotting, chemical or enzymatic degradation, or chromatography techniques. Advantageously, the technique used for this step of determining the length of the N-terminal region of the HtrA2 protein corresponds to the Western blot.
Bien qu'une telle technique ne soit pas décrite dans les exemples, celle-ci peut être simplement mise en oeuvre à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement un épitope conservé de la protéine HtrA2, lequel épitope n'est naturellement pas localisé dans la région N-terminale de la protéine HtrA2. Although such a technique is not described in the examples, it can simply be implemented with the aid of an antibody specifically recognizing a conserved epitope of the HtrA2 protein, which epitope is naturally not localized. the N-terminal region of the HtrA2 protein.
L'étape de détermination de la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 peut elle être effectuée, selon les cas, par l'analyse de la séquence de la protéine HtrA2 et/ou de la séquence d'acides nucléiques codant pour celle-ci. Cette étape de détermination de la séquence de la région N-terminale 20 peut se faire par : • la détermination de la séquence de l'acide nucléique codant pour cette région directement par séquençage ou, indirectement par des techniques d'hybridation telles que le DNA array, le 5outhern blot ou le Northern blot avec des sondes ou des techniques d'amplification, lesquelles 25 techniques utilisent des sondes (éventuellement des amorces pour certaines d'entre elles) qui s'hybrident spécifiquement avec une région correspondant à tout ou partie de la séquence codant pour la région N-terminale de la protéine HtrA2, laquelle région est conservée entre les différentes souches d'une même espèce appartenant au genre Staphylococcus et est 30 différente dans les autres espèces appartenant à ce même genre. L'identification de telles régions conservées ne présente aucune difficulté particulière et peut être réalisée simplement sur la base des alignements de séquences effectués entre les différentes protéines HtrA2. • la détermination de la séquence de la région N-terminale de la 35 protéine HtrA2 directement par des techniques telles que la spectroscopie de masse ou, indirectement, par des techniques telles que le Western blot à l'aide d'au moins un anticorps qui reconnaît spécifiquement un épitope localisé dans la région N-terminale de la protéine HtrA2, lequel épitope est conservé entre les différentes souches d'une même espèce appartenant au genre Staphylococcus et est absent dans les autres espèces appartenant à ce même genre. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend les étapes de : (i) détermination, de préférence par séquençage, de la séquence d'acides nucléiques codant pour la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus, et (ii) détermination de l'espèce de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus au regard de ladite séquence. The step of determining the sequence of the N-terminal region of the serine protease HtrA2 can be carried out, as appropriate, by the analysis of the sequence of the HtrA2 protein and / or the nucleic acid sequence. coding for it. This step of determining the sequence of the N-terminal region can be done by: • determining the sequence of the nucleic acid coding for this region directly by sequencing or, indirectly by hybridization techniques such as DNA array, 5outhern blot or Northern blot with probes or amplification techniques, which techniques use probes (possibly primers for some of them) which specifically hybridize with a region corresponding to all or part of the sequence coding for the N-terminal region of the HtrA2 protein, which region is conserved between the different strains of the same species belonging to the genus Staphylococcus and is different in the other species belonging to this genus. The identification of such conserved regions presents no particular difficulty and can be achieved simply on the basis of the sequence alignments made between the different HtrA2 proteins. Determining the sequence of the N-terminal region of the HtrA2 protein directly by techniques such as mass spectroscopy or, indirectly, by techniques such as Western blotting using at least one antibody which specifically recognizes an epitope located in the N-terminal region of the HtrA2 protein, which epitope is conserved between different strains of the same species belonging to the genus Staphylococcus and is absent in the other species belonging to this genus. According to a preferred embodiment, the method according to the invention comprises the steps of: (i) determining, preferably by sequencing, the nucleic acid sequence coding for the N-terminal region of the serine protease HtrA2 of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus, and (ii) determining the species of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus with regard to said sequence.
Comme cela a été décrit précédemment, cette étape (ii) de détermination est effectuée simplement par comparaison de la séquence obtenue avec les séquences d'acides nucléiques codant pour la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 décrites dans la présente demande de brevet et/ou disponibles dans les bases de données. As previously described, this step (ii) of determination is carried out simply by comparison of the obtained sequence with the nucleic acid sequences coding for the N-terminal region of the HtrA2 serine protease described in the present patent application. and / or available in the databases.
La présente invention envisage également un nouveau kit pour déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus, lequel kit comprend au moins un moyen permettant de déterminer la longueur et/ou la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus. Ce kit permet alors, dans le cadre de sa mise en oeuvre dans le procédé décrit précédemment, de déterminer l'espèce de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus au regard de la longueur et/ou de la séquence de ladite région N-terminale de la protéine HtrA2. The present invention also contemplates a new kit for determining the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus, which kit comprises at least one means for determining the length and / or sequence of the N-terminal region of the protease. serine HtrA2 of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus. This kit then makes it possible, as part of its implementation in the process described above, to determine the species of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus with regard to the length and / or sequence of said N-terminal region. of the HtrA2 protein.
Dans le cas présent, la nature des moyens permettant de déterminer la longueur et/ou la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus pourront être simplement déterminés au regard du descriptif qui précède et l'on pourra citer, à titre d'exemples : • des moyens d'amplification (polymérase, tampon, nucléotides libres et amorces) comprenant au moins un couple d'amorces, dont chaque amorce s'hybride respectivement et de façon spécifique avec une séquence du gène terC-like et avec une séquence du gène trkH-like, lequel couple d'amorces permet l'amplification du gène htrA2 ; • des anticorps reconnaissant spécifiquement un épitope conservé de la protéine HtrA2, lequel épitope n'est naturellement pas localisé dans la région N-terminale de la protéine HtrA2 ; ou encore • des anticorps qui reconnaissent spécifiquement un épitope localisé dans la région N-terminale de la protéine HtrA2, lequel épitope est conservé entre les différentes souches d'une même espèce appartenant au genre Staphylococcus mais est absent dans les autres espèces appartenant a ce meme genre. De préférence, ce moyen permettant de déterminer la longueur et/ou la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus correspond à un moyen d'amplification comprenant un couple d'amorces, dont chaque amorce s'hybride respectivement et de façon spécifique avec une séquence du gène terC-like et avec une séquence du gène trkH-like, lequel couple d'amorces permet l'amplification du gène htrA2. Avantageusement, ce couple d'amorce est choisi dans le groupe suivant : 1) le couple d'amorces ATCCAGGACTTGAAGGTGC (SEQ ID N° 66) et CGTTCTCTAATTCCAATATG (SEQ ID N° 67), et 2) le couple d'amorces CCACTCATTGTATCTTTATTAT (5EQ ID N° 68) et TGGYATGGACTTAGGTCAATT (SEQ ID N° 69). Avantageusement encore, le kit selon l'invention comprend les deux couples d'amorces mentionnés précédemment. La présente invention envisage en outre l'utilisation non thérapeutique (non diagnostique) en vue de déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus d'au moins un moyen permettant de déterminer la longueur et/ou la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie . In the present case, the nature of the means making it possible to determine the length and / or the sequence of the N-terminal region of the serine protease HtrA2 of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus can be determined simply by reference to the description which precedes and examples that may be mentioned are: amplification means (polymerase, buffer, free nucleotides and primers) comprising at least one pair of primers, each primer of which hybridises respectively and specifically with a sequence of the terC-like gene and with a trkH-like gene sequence, which pair of primers allows the amplification of the htrA2 gene; Antibodies specifically recognizing a conserved epitope of the HtrA2 protein, which epitope is naturally not located in the N-terminal region of the HtrA2 protein; or else antibodies which specifically recognize an epitope located in the N-terminal region of the HtrA2 protein, which epitope is conserved between the different strains of the same species belonging to the genus Staphylococcus but is absent in the other species belonging to the same species. kind. Preferably, this means making it possible to determine the length and / or the sequence of the N-terminal region of the serine protease HtrA2 of said strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus corresponds to an amplification means comprising a pair of primers, each primer hybridizes respectively and specifically with a sequence of the terC-like gene and with a trkH-like gene sequence, which pair of primers allows the amplification of the htrA2 gene. Advantageously, this pair of primer is chosen from the following group: 1) the pair of primers ATCCAGGACTTGAAGGTGC (SEQ ID No. 66) and CGTTCTCTAATTCCAATATG (SEQ ID No. 67), and 2) the pair of primers CCACTCATTGTATCTTTATTAT (5EQ ID No. 68) and TGGYATGGACTTAGGTCAATT (SEQ ID NO: 69). Advantageously, the kit according to the invention comprises the two pairs of primers mentioned above. The present invention further contemplates the non-therapeutic (non-diagnostic) use for determining the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus of at least one means for determining the length and / or sequence of the N-terminal region of the serine protease HtrA2 of said bacterial strain.
Dans le cadre de cette utilisation non diagnostique (non thérapeutique), l'échantillon biologique à partir duquel est isolé cette souche n'est pas un prélèvement sur un mammifère vivant ou de l'un de ses dérivés mais correspond, par exemple, à un prélèvement de matières alimentaires (produits laitiers, viande, etc.) ou à un prélèvement d'un sol. Concernant la nature du moyen utilisé, ses caractéristiques correspondent à celles décrites précédemment. La présente invention envisage également un moyen pour diagnostiquer chez un sujet une infection par une souche d'une bactérie appartenant au genre 5taphylococcus, lequel moyen permet de déterminer la longueur et/ou la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie La souche de bactérie dont il est question présentement est choisie parmi celles décrites précédemment. Il pourra s'agir notamment de 5taphylococcus aureus qui est responsable d'infections variées (toxi-infections alimentaires, infections localisées suppurées, etc.), de 5taphylococcus saprophyticus qui est responsable d'infections urinaires chez la femme ou encore de 5taphylococcus lugdunensis qui est responsable d'endocardites sévères. In the context of this non-diagnostic (non-therapeutic) use, the biological sample from which this strain is isolated is not a live mammalian sample or a derivative thereof, but corresponds, for example, to a collection of food materials (dairy products, meat, etc.) or removal of soil. Regarding the nature of the means used, its characteristics correspond to those described above. The present invention also contemplates a means for diagnosing in a subject an infection with a strain of a bacterium belonging to the genus Taphylococcus, which means makes it possible to determine the length and / or the sequence of the N-terminal region of the HtrA2 serine protease. of said strain of bacterium The bacterial strain which is in question is selected from those described above. This may include 5-taphylococcus aureus which is responsible for various infections (food poisoning, localized suppurated infections, etc.), 5-taphylococcus saprophyticus which is responsible for urinary tract infections in women or 5-taphylococcus lugdunensis which is responsible for severe endocarditis.
Parmi les moyens d'ores et déjà décrits dans la présente demande de brevet, l'on citera, de préférence, un moyen d'amplification comprenant un couple d'amorces, dont chaque amorce s'hybride respectivement et de façon spécifique et avec une séquence du gène terC-like et avec une séquence du gène trkH-like, lequel couple d'amorces permet l'amplification du gène htrA2. Avantageusement, ce couple d'amorce est choisi dans le groupe suivant : 1) le couple d'amorces ATCCAGGACTTGAAGGTGC (5EQ Ib N° 66) et CGTTCTCTAATTCCAATATG (5EQ Ib Na 67), et 2) le couple d'amorces CCACTCATTGTATCTTTATTAT (5EQ Ib N° 68) et TGGYATGGACTTAGGTCAATT (5EQ Ib N° 69). Le premier couple d'amorces (1) permet d'identifier l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre 5taphylococcus qui est choisie dans le groupe comprenant S. aureus et S. epidermidis et donc de diagnostiquer une infection associée à l'une de ces espèces. Le second couple d'amorces (2) permet de d'identifier l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus qui est choisie dans le groupe comprenant S. warneri, 5. cohnii, S. equorum, S. kloosii, 5. haemolyticus et S. saprophyticus, et donc de diagnostiquer une infection associée à l'une de ces espèces. Finalement, l'utilisation combinée de ces deux couples d'amorces permet de déterminer l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus qui est choisie dans un large groupe comprenant S. aureus, S. epidermidis, 5. warneri, S. cohnii, S. equorum, 5. kloosii, S. haemolyticus et S. saprophyticus et, là encore, de diagnostiquer une infection associée à l'une de ces espèces. La présente invention envisage enfin l'utilisation, pour diagnostiquer chez un sujet une infection par une souche d'une bactérie appartenant au genre Staphylococcus, d'au moins un moyen permettant de déterminer la longueur et/ou la séquence de la région N-terminale de la protéase à sérine HtrA2 de ladite souche de bactérie. Le sujet envisagé correspond à un mammifère et préférentiellement à 20 un humain. L'invention sera maintenant décrite plus en détail à l'aide des exemples, lesquels ont valeur d'illustration et ne limitent aucunement le cadre de celle-ci. Among the means already described in the present patent application, there will be mentioned, preferably, an amplification means comprising a pair of primers, each primer hybridizes respectively and specifically and with a sequence of the terC-like gene and with a trkH-like gene sequence, which pair of primers allows the amplification of the htrA2 gene. Advantageously, this pair of primer is chosen from the following group: 1) the pair of primers ATCCAGGACTTGAAGGTGC (5EQ Ib No. 66) and CGTTCTCTAATTCCAATATG (5EQ Ib Na 67), and 2) the pair of primers CCACTCATTGTATCTTTATTAT (5EQ Ib No. 68) and TGGYATGGACTTAGGTCAATT (5EQ Ib No. 69). The first pair of primers (1) makes it possible to identify the species of a strain of bacterium belonging to the genus 5taphylococcus which is selected from the group comprising S. aureus and S. epidermidis and thus to diagnose an infection associated with the one of these species. The second pair of primers (2) makes it possible to identify the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus which is selected from the group comprising S. warneri, 5. cohnii, S. equorum, S. kloosii, 5. haemolyticus and S. saprophyticus, and thus to diagnose an infection associated with one of these species. Finally, the combined use of these two pairs of primers makes it possible to determine the species of a strain of bacteria belonging to the genus Staphylococcus which is selected from a broad group comprising S. aureus, S. epidermidis, 5. warneri, S. Cohnii, S. equorum, 5. kloosii, S. haemolyticus and S. saprophyticus and, again, to diagnose an infection associated with one of these species. The present invention finally envisages the use, for diagnosing in a subject an infection with a strain of a bacterium belonging to the genus Staphylococcus, of at least one means for determining the length and / or the sequence of the N-terminal region. of serine protease HtrA2 of said bacterial strain. The subject envisaged corresponds to a mammal and preferentially to a human. The invention will now be described in more detail with the aid of the examples, which are illustrative and in no way limit the scope thereof.
Exemples 25 Le Domaine N-terminal présente une séquence et une taille espèce-spécifique Dans le cadre de recherches antérieures, les inventeurs se sont attachés à déterminer la fonction respective des protéines HtrAl et HtrA2 des bactéries appartenant au genre Staphylococcus. Ces travaux leur ont 30 permis de déterminer que la résistance au stress thermique impliquait la protéine HtrAl (RIGOULAY et al., FEMS Microbiology Letters, vol.237, p :279-288, 2004) et, dans une moindre mesure, la protéine HtrA2 (RIGOULAY et al., Infection and Immunity, vol.73(1), p : 563-572, 2005). Examples The N-terminal Domain Has a Sequence and Species-Specific Size In previous research, the inventors have focused on determining the respective function of the HtrA1 and HtrA2 proteins of bacteria belonging to the genus Staphylococcus. This work enabled them to determine that heat stress resistance implicated the HtrAl protein (RIGOULAY et al., FEMS Microbiology Letters, vol.237, p: 279-288, 2004) and, to a lesser extent, the HtrA2 protein. (RIGOULAY et al., Infection and Immunity, vol.73 (1), p: 563-572, 2005).
Ces travaux leur ont également permis de démontrer que ces deux protéines HtrA présentaient des rôles distincts chez Staphylococcus aureus en fonction de la souche analysée, probablement du fait de différences spécifiques dans la régulation de l'expression de facteurs de virulence et de protéines de stress. Il n'en reste pas moins que la fonction des protéines HtrA et, plus spécifiquement, de la protéine HtrA2, reste encore largement inconnue. C'est en vue de déterminer la fonction de cette protéine HtrA2 chez les bactéries appartenant au genre Staphylococcus que les inventeurs ont effectués une analyse génomique des différentes séquences connues des protéines HtrA2 de bactéries appartenant au genre Staphylococcus. Pour se faire, les inventeurs ont effectué, à l'aide d'un algorithme spécifique (BLAST), des alignements de séquences sur la base des séquences disponibles de protéines HtrA2 de bactéries appartenant au genre Staphylococcus. Ces alignements ont été effectués d'une part entre ces séquences spécifiques et les séquences protéiques disponibles dans les bases de données et, d'autre part, uniquement entre ces séquences spécifiques de protéines htrA2. Les numéros d'accès et les séquences correspondantes des protéines HtrA2 de bactéries appartenant au genre Staphylococcus sont listées dans le tableau II qui suit. Ce tableau inclut également le détail des séquences de protéines HtrA2 pour différentes souches de Staphylocoques et qui ont été obtenues dans le cadre des expériences réalisées pour la présente étude. This work also allowed them to demonstrate that these two HtrA proteins had distinct roles in Staphylococcus aureus depending on the strain analyzed, probably because of specific differences in the regulation of the expression of virulence factors and stress proteins. Nevertheless, the function of the HtrA proteins and, more specifically, of the HtrA2 protein remains largely unknown. In order to determine the function of this HtrA2 protein in bacteria belonging to the Staphylococcus genus, the inventors carried out a genomic analysis of the various known sequences of the HtrA2 proteins of bacteria belonging to the genus Staphylococcus. To do this, the inventors carried out, using a specific algorithm (BLAST), sequence alignments based on the available sequences of HtrA2 proteins of bacteria belonging to the genus Staphylococcus. These alignments were carried out on the one hand between these specific sequences and the protein sequences available in the databases and, on the other hand, only between these specific sequences of htrA2 proteins. Access numbers and corresponding sequences of the HtrA2 proteins of bacteria belonging to the genus Staphylococcus are listed in Table II which follows. This table also includes details of the HtrA2 protein sequences for different strains of Staphylococci that were obtained as part of the experiments performed for this study.
Tableau II Espèce Souche Numéro d'accès Séquence Séquence Taille Acides Acides (~°`A) aminés nucléiques COL YP_185894.1 SEQ ID SEQ ID 769 N°1 N°37 NCTC8325 YP_499511 SEQ ID SEQ ID 774 Staphylococcus N°2 N°38 aureus N315 NP_374143 SEQ ID SEQ ID 769 N°3 N°39 MW2 NP_645720 SEQ ID SEQ ID 769 N°4 N°40 Newman YP_001331926 SEQ ID SEQ ID 774 N°5 N°41 Espèce Souche Numéro d'accès Séquence Séquence Taille Acides Acides (A) aminés nucléiques MRSA252 YP_040410.1 SEQ ID SEQ ID 769 N°6 N°42 MSSA476 YP_043082.1 SEQ ID SEQ ID 769 N°7 N°43 Mu50 NP_371547.1 SEQ ID SEQ ID 769 N°8 N°44 RF122 YP_416375.1 SEQ ID SEQ ID 769 N°9 N°45 USA300 YP_493623.1 SEQ ID SEQ ID 769 N°10 N°46 Staphylococcus USA300_TCH1516 YP_001574879 SEQ ID SEQ ID 769 aureus N°11 N°47 JH1 YP_001316246 SEQ ID SEQ ID 774 N°12 N°48 JH9 YP_001246458 SEQ ID SEQ ID 774 N°13 N°49 A44 .. SEQ ID SEQ ID 769 N°14 N°50 A19 - SEQ ID SEQ ID 769 N°15 N°51 A40 - SEQ ID SEQ ID 769 N°16 N°52 A22 - SEQ ID SEQ ID 769 N°17 N°53 A36 - SEQ ID SEQ ID 769 N°18 N°54 Staphylococcus RP62A YP_188198 SEQ ID SEQ ID 585 epidermidis N°19 N°55 E2 - SEQ ID SEQ ID 585 N°20 N°56 E17 - SEQ ID SEQ ID 585 N°21 N°57 El0 - SEQ ID SEQ ID 585 N°22 N°58 E4 - SEQ ID SEQ ID 606 N°23 N°59 E5 - SEQ ID SEQ ID 606 N°24 N°60 Staphylococcus JCSC1435 YP_253851 SEQ ID SEQ ID 639 haemolyticus N°25 N°61 Hae7 - SEQ ID - 639 N°26 Espèce Souche Numéro d'accès Séquence Séquence Taille Acides Acides (PA) aminés nucléiques Staphylococcus Hae8 - SEQ ID - 639 haemolyticus N°27 Staphylococcus ATCC15305 YP_301853.1 SEQ ID SEQ ID 597 saprophyticus N°28 N°62 Sap4 - SEQ ID - 596 N°29 Sap2 - SEQ ID .. 597 N°30 Staphylococcus K2 - SEQ ID - 580 kloosii N°31 Staphylococcus W3 - SEQ ID - 599 warneri N°32 Staphylococcus C2a - SEQ ID - 593 xylosus N°33 Staphylococcus Cl - SEQ ID SEQ ID 580 cohnii N°34 N°63 Staphylococcus SK14 I ZP_03613065 SEQ ID SEQ ID 644 capitis N°35 N°64 Staphylococcus TM300 YP_002633722.1 SEQ ID SEQ ID 583 camosus N°36 N°65 Les résultats de ces différents alignements ont confirmés que le domaine N-terminal de la protéine HtrA2 n'existe que dans les génomes de staphylocoques actuellement séquencés et n'ont pas apporté d'éléments susceptibles de déterminer la fonction de ce domaine spécifique. Table II Species Strain Accession number Sequence Sequence Size Acid acids (~ ° `A) nucleic amines COL YP_185894.1 SEQ ID SEQ ID 769 No. 1 No. 37 NCTC8325 YP_499511 SEQ ID SEQ ID 774 Staphylococcus No. 2 No. 38 aureus N315 NP_374143 SEQ ID SEQ ID 769 No. 3 No. 39 MW2 NP_645720 SEQ ID SEQ ID 769 No. 4 No. 40 Newman YP_001331926 SEQ ID SEQ ID 774 No. 5 No. 41 Species Strain Access number Sequence Sequence Size Acids Nucleic amino acids (A) MRSA252 YP_040410.1 SEQ ID SEQ ID 769 No. 6 No. 42 MSSA476 YP_043082.1 SEQ ID SEQ ID 769 No. 7 No. 43 Mu50 NP_371547.1 SEQ ID SEQ ID 769 No. 8 No. 44 RF122 YP_416375.1 SEQ ID SEQ ID 769 No. 9 No. 45 USA300 YP_493623.1 SEQ ID SEQ ID 769 No. 10 No. 46 Staphylococcus USA300_TCH1516 YP_001574879 SEQ ID SEQ ID 769 aureus No. 11 No. 47 JH1 YP_001316246 SEQ ID SEQ ID 774 No. 12 No. 48 JH9 YP_001246458 SEQ ID SEQ ID 774 No. 13 No. 49 A44 .. SEQ ID SEQ ID 769 No. 14 No. 50 A19 - SEQ ID SEQ ID 769 No. 15 No. 51 A40 - SEQ ID SEQ ID 769 No. 16 No. 52 A22 - SEQ ID SEQ ID 769 No. 17 No. 53 A36-SEQ ID SEQ ID 769 No. 18 No. 54 Staphylococcus RP62A YP_188198 SEQ ID SEQ ID 585 Epidermidis No. 19 No. 55 E2 - SEQ ID SEQ ID 585 No. 20 No. 56 E17 SEQ ID SEQ ID 585 No. 21 No. 57 El0-SEQ ID SEQ ID 585 No. 22 No. 58 E4-SEQ ID SEQ ID 606 No. 23 No. 59 E5-SEQ ID SEQ ID 606 No. 24 No. 60 Staphylococcus JCSC1435 YP_253851 SEQ ID SEQ ID 639 haemolyticus No. 25 No. 61 Hae7 - SEQ ID - 639 No. 26 Species Strain Access number Sequence Sequence Size Acids Nucleic amino acids (PA) Staphylococcus Hae8 - SEQ ID - 639 haemolyticus N 27 Staphylococcus ATCC15305 YP_301853.1 SEQ ID SEQ ID 597 saprophyticus No. 28 No. 62 Sap4-SEQ ID-596 No. 29 Sap2-SEQ ID No. 597 No. 30 Staphylococcus K2-SEQ ID-580 kloosii No. 31 Staphylococcus W3 - SEQ ID - 599 warneri No. 32 Staphylococcus C2a - SEQ ID - 593 xylosus No. 33 Staphylococcus C1 - SEQ ID SEQ ID 580 cohnii No. 34 No. 63 Staphylococcus SK14 I ZP_03613065 SEQ ID SEQ ID 644 capitis No. 35 N ° 64 Staphylococcus TM300 YP_002633722.1 The results of these different alignments confirmed that the N-terminal domain of the HtrA2 protein exists only in the genomes of staphylococci currently sequenced and did not bring any elements. likely to determine the function of this specific area.
De façon surprenante, ces résultats ont toutefois montré que ce même domaine N-terminal présente la particularité d'être à la fois spécifique du genre Staphylococcus et également de séquence et de taille variables selon les espèces. En effet, les résultats montrent que ce domaine N-terminal présente un fort degré de conservation au sein d'une espèce donnée (95 à 100% d'identité globale) mais, à l'opposé, un faible degré de conservation d'une espèce de Staphylococcus à une autre (25 à 35% d'identité globale dans certains cas, mais seulement une identité locale dans d'autres). Surprisingly, these results have however shown that this same N-terminal domain has the particularity of being both specific to the genus Staphylococcus and also of varying size and sequence depending on the species. Indeed, the results show that this N-terminal domain has a high degree of conservation within a given species (95 to 100% global identity) but, on the other hand, a low degree of conservation of a given species. species of Staphylococcus to another (25-35% overall identity in some cases, but only local identity in others).
Concernant la taille des protéines HtrA2, la figure 1 représente schématiquement l'organisation des protéines HtrAl et HtrA2 dans les espèces appartenant au genre Staphylococcus. Plus spécifiquement, cette figure montre l'organisation des domaines de la protéine HtrA2 au sein des espèces 5. aureus, 5. epidermidis, S. saprophyticus, et 5. haemolyticus avec le domaine N-terminal de taille espèce-spécifique (blanc), le signal d'exportation (gris foncé), le domaine catalytique (noir) et le domaine PDZ (gris clair). En vue de préciser l'organisation du gène htra2 au sein du génome des bactéries appartenant au genre Staphylococcus, les inventeurs ont également effectué une analyse génomique des séquences génomiques adjacentes à celui-ci. Les résultats de cette analyse ont montré que le gène htrA2 se trouve localisé au sein d'une région très conservée dans tous les génomes de staphylocoques séquencés. En particulier, l'analyse de ces séquences adjacentes montre que le gène htrA2 est encadré par les gènes terC-Iike et trkH-like, apparentés aux familles de gènes terC et trkH respectivement. Le Domaine N-terminal d'une protéine HtrA2 d'un staphylocoque permet la détermination de l'espèce correspondante de celui-ci Tirant partie de l'encadrement du gène htrA2 par des gènes présentant une importante conservation entre les différentes espèces de staphylocoques, les inventeurs ont définis deux couples d'amorces distincts permettant l'amplification du gène htrA2 pour les espèces 5. aureus, 5. epidermidis, 5. saprophyticus, et S. haemolyticus, chaque couple d'amorces présentant une amorce localisée dans le gène terC-like et une amorce localisée dans le gène trkH-like. Les amorces utilisées sont listées dans le tableau III qui suit. Concerning the size of the HtrA2 proteins, FIG. 1 schematically represents the organization of the HtrA1 and HtrA2 proteins in the species belonging to the genus Staphylococcus. More specifically, this figure shows the organization of the domains of the HtrA2 protein within the species 5. aureus, 5. epidermidis, S. saprophyticus, and 5. haemolyticus with the N-terminal domain of species-specific size (white), the export signal (dark gray), the catalytic domain (black) and the PDZ domain (light gray). In order to specify the organization of the htra2 gene within the genome of bacteria belonging to the genus Staphylococcus, the inventors have also carried out a genomic analysis of the genomic sequences adjacent thereto. The results of this analysis showed that the htrA2 gene is located within a highly conserved region in all sequenced staphylococcal genomes. In particular, the analysis of these adjacent sequences shows that the htrA2 gene is flanked by the terC-Iike and trkH-like genes, related to the terC and trkH gene families, respectively. The N-terminal domain of a HtrA2 protein of a staphylococcus allows the determination of the corresponding species thereof. Part of the framework of the htrA2 gene by genes having a significant conservation between the different species of staphylococci, the inventors have defined two distinct pairs of primers for amplification of the htrA2 gene for species 5. aureus, 5. epidermidis, 5. saprophyticus, and S. haemolyticus, each pair of primers having a localized primer in the terC gene. like and a localized primer in the trkH-like gene. The primers used are listed in Table III which follows.
Tableau III espèces Nom Séquence SEQ ID Tm N° (°C) S. aureus et S.ae- ATCCAGGACTTGAAGGTGC 66 58 S. Forward/S.ae- epidermidis Amont1 S.ae- CGTTCTCTAATTCCAATATG 67 54 Reverse/S.ae- Aval l S. S.hs- CCACTCATTGTATCTTTATTAT 68 56 haemolyticus Forward/S.hs- et S. Av5 saprophyticus S.hs- TGGYATGGACTTAGGTCAATT 69 56 ReverseB/S.hs -Am2 Les inventeurs ont alors effectué une amplification du gène htrA2 à l'aide de ces amorces spécifiques sur de l'ADN génomique de souches de bactéries d'origines diverses (humaine, animale ou alimentaire) appartenant aux espèces S. aureus (54 souches différentes), S. epidermidis (25 souches différentes), S. saprophyticus (15 souches différentes), S. haemolyticus (7 souches différentes), S. kloosii (3 souches différentes), S. warneri (3 souches différentes), S. equorum (2 souches différentes), S. cohnii (1 souche). Table III species Name Sequence SEQ ID Tm No. (° C) S. aureus and S.ae-ATCCAGGACTTGAAGGTGC 66 58 S. Forward / S.ae-epidermidis Amont1 S.ae- CGTTCTCTAATTCCAATATG 67 54 Reverse / S.ae-Aval l The inventors then performed an amplification of the htrA2 gene using these specific primers. on genomic DNA of strains of bacteria of various origins (human, animal or food) belonging to S. aureus species (54 different strains), S. epidermidis (25 different strains), S. saprophyticus (15 different strains) , S. haemolyticus (7 different strains), S. kloosii (3 different strains), S. warneri (3 different strains), S. equorum (2 different strains), S. cohnii (1 strain).
Pour ces expériences, les différentes souches testées sont listées dans le tableau IV pour les souches de Staphylococcus aureus, V pour les souches de Staphylococcus epidermidis, VI pour les souches de Staphylococcus haemolyticus et VII pour les souches de Staphylococcus saprophyticus. For these experiments, the different strains tested are listed in Table IV for strains of Staphylococcus aureus, V for strains of Staphylococcus epidermidis, VI for strains of Staphylococcus haemolyticus and VII strains of Staphylococcus saprophyticus.
Pour ces amplifications, les inventeurs ont utilisés les mélanges réactionnels et programmations ci-après. Mélanqe réactionnel par tube (volume réactionnel de 50 IL) Staphylococcus aureus 1- eau : 42,25 pL 2- Tampon EXPAND HIGH FIDELITY (10X, 15mM MgCl2, ROCHE) : 5 pL 3- Mélange dNTPs (25mM chacun des 4 dNTPs, QBIOGEN) : 0,4 pL 4- Amorces (solution mère à 50iM) : 0,3 pL de chaque amorce 5- Taq EXPAND HIGH FIDELITY (3,5U/pL, ROCHE) : 0,75 pL (2,6U) 6- ADN chromosomique: 1 pL Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus et Staphylococcus saprophyticus : 1- eau : 42,1 pL 2- Tampon 10X (QBIOGEN) : 5 pL 3- Mélange dNTPs (25mM chacun des 4 dNTPs, QBIOGEN) : 0,4 pL 4- Amorces (solution mère à 50pM) : 0,5 pL de chaque amorce 5- Taq (5U/pL, QBIOGEN) : 0,5 pL (2,5U) 6- ADN chromosomique: 1 pL Programme d'amplification Staphylococcus aureus (recommandé par ROCHE pour Taq EXPAND HIGH FIDELITY) : Nombre Temps (minutes) Temperature (°C) de cycle 1 3 94 10 0, 5 94 0,5 50 2 68 20 0,5 94 0,5 50 2 +0,2 à chaque cycle 68 1 7 68 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus et Staphylococcus saprophyticus : Nombre Temps (minutes) Temperature (°C) de cycle 1 3 94 30 0,5 94 0,5 50 4 72 Après amplification, les produits de PCR obtenus sont déposés sur gel d'électrophorèse. La figure 3 (A, B, C et D) montre les gels d'électrophorèse obtenus 20 pour les produits d'amplification du gène htrA2 pour les différentes souches testées de Staphylococcus aureus. For these amplifications, the inventors used the reaction mixtures and programming below. Reaction mixture per tube (reaction volume of 50 IL) Staphylococcus aureus 1- water: 42.25 μL 2- EXPAND HIGH FIDELITY buffer (10X, 15mM MgCl 2, ROCHE): 5 μL 3- Mixture dNTPs (25mM each of the 4 dNTPs, QBIOGEN ): 0.4 μL 4- Primers (50 μM stock solution): 0.3 μL of each 5-Taq primer EXPAND HIGH FIDELITY (3.5 μL / μL, ROCK): 0.75 μL (2.6U) 6- Chromosomal DNA: 1 μL Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus saprophyticus: 1- water: 42.1 μL 2- 10X buffer (QBIOGEN): 5 μL 3- Mix dNTPs (25 μM each of 4 dNTPs, QBIOGEN): 0.4 μL 4- Primers (50 μM stock solution): 0.5 μl of each 5-Taq primer (5 μl / μl, QBIOGEN): 0.5 μl (2.5 μ) 6-chromosomal DNA: 1 μl Amplification program Staphylococcus aureus (recommended by ROCHE for Taq EXPAND HIGH FIDELITY): Number Time (minutes) Cycle Temperature (° C) 1 3 94 10 0, 5 94 0.5 50 2 68 20 0.5 94 0.5 50 2 +0, 2 at each cycle 68 1 7 68 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus saprophyticus: Number Time (minutes) Temperature (° C) cycle 1 3 94 30 0.5 94 0.5 50 4 72 After amplification, the PCR products obtained are deposited on electrophoresis gel. Figure 3 (A, B, C and D) shows the electrophoresis gels obtained for the amplification products of the htrA2 gene for the different strains tested for Staphylococcus aureus.
La figure 4 (A et B) montre les gels d'électrophorèse obtenus pour les produits d'amplification du gène htrA2 pour les différentes souches testées de 5taphylococcus epidermidis. La figure 5 montre le gel d'électrophorèse obtenu pour les produits 5 d'amplification du gène htrA2 pour les différentes souches testées de Staphylococcus haemolyticus. La figure 6 montre le gel d'électrophorèse obtenu pour les produits d'amplification du gène htrA2 pour les différentes souches testées de Staphylococcus saprophyticus.Figure 4 (A and B) shows the electrophoresis gels obtained for the amplification products of the htrA2 gene for the different strains tested for 5taphylococcus epidermidis. Figure 5 shows the electrophoresis gel obtained for the amplification products of the htrA2 gene for the different strains tested for Staphylococcus haemolyticus. FIG. 6 shows the electrophoresis gel obtained for the amplification products of the htrA2 gene for the various strains tested of Staphylococcus saprophyticus.
10 Les résultats confirment donc que pour une espèce donnée, les produits du gène htrA2 et, par déduction, la région N-terminale de HtrA2 présente une taille similaire. De ce fait, la détermination de la taille de la région N-terminale d'une protéine HtrA2 permet d'en déduire l'espèce de Staphylococcus à laquelle appartient la souche de staphylocoque de la 15 protéine htrA2 correspondante. Le séquençage du gène htrA2 pour nombre de souches confirme en outre les précédents résultats montrant que le domaine N-terminal de HtrA2 présente un fort degré de conservation au sein d'une espèce donnée avec, à l'opposé, un faible degré de conservation d'une espèce de 20 Staphylococcus à une autre. L'utilisation des deux couples d'amorces du tableau III pour des souches appartenant aux espèces S. warneri, S. cohnii, S. equorum et 5. kloosii a permis d'obtenir une amplification du gène htrA2 avec le couple d'amorces 5.hs-Forward/S.hs-Av5 et S.hs-ReverseB/5.hs-Am2 utilisé avec 25 S. haemolyticus et 5. saprophyticus. L'analyse des produits d'amplification a révélé une fois encore que le domaine N-terminal bénéficiait d'une taille et d'une séquence variables en fonction de l'espèce concernée, laquelle taille ou séquence de la région N-terminal de HtrA2 permettant de déterminer l'espèce de Staphylococcus à laquelle appartient la souche de staphylocoque 30 correspondant à la protéine HtrA2 analysée. The results thus confirm that for a given species, the products of the htrA2 gene and, by inference, the N-terminal region of HtrA2 has a similar size. As a result, determining the size of the N-terminal region of an HtrA2 protein makes it possible to deduce therefrom the Staphylococcus species to which the staphylococcal strain of the corresponding htrA2 protein belongs. Sequencing of the htrA2 gene for a number of strains further confirms the previous results showing that the N-terminal domain of HtrA2 has a high degree of conservation within a given species with, on the other hand, a low degree of conservation. one species of Staphylococcus to another. The use of the two pairs of primers in Table III for strains belonging to the S. warneri, S. cohnii, S. equorum and 5. kloosii species made it possible to obtain an amplification of the htrA2 gene with the pair of primers. .hs-Forward / S.hs-Av5 and S.hs-ReverseB / 5.hs-Am2 used with 25 S. haemolyticus and 5. saprophyticus. The analysis of the amplification products revealed once again that the N-terminal domain had a variable size and sequence depending on the species concerned, which size or sequence of the N-terminal region of HtrA2 to determine the species of Staphylococcus to which belongs the staphylococcus strain corresponding to the HtrA2 protein analyzed.
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