FR2940655A1

FR2940655A1 - Peptides isoles de facteur vii de lapin.

Info

Publication number: FR2940655A1
Application number: FR0807517A
Authority: FR
Inventors: Julien Gras; Annick Sauger
Original assignee: LFB Biotechnologies SAS
Current assignee: LFB Biotechnologies SAS
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2010-07-02
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: FR2940655B1; IL213454A0; KR20110119622A; AU2009334324A1; WO2010076768A1; CA2748586A1; JP2012514028A; CN102272606A; US20110250702A1; BRPI0917765A2; EP2384441A1

Abstract

La présente invention concerne des peptides isolés à partir du facteur VII de lapin et leur utilisation pour la génération d'anticorps spécifiquement dirigés contre celui-ci. L'invention se rapporte aussi à l'utilisation des anticorps dirigés contre le facteur VII de lapin pour la détection ou la purification du facteur VII de lapin, en particulier lorsque ledit facteur VII de lapin est présent dans un échantillon biologique contenant conjointement du facteur VII humain.

Description

PEPTIDES ISOLES DE FACTEUR VII DE LAPIN

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne des peptides isolés à partir du facteur VII de lapin et leur utilisation pour la génération d'anticorps spécifiquement dirigés contre celui-ci. L'invention se rapporte aussi à l'utilisation des anticorps dirigés contre le facteur VII de lapin pour la détection ou la purification du facteur VII de lapin, en particulier lorsque ledit facteur VII de lapin est présent dans un échantillon biologique contenant conjointement du facteur VII humain.

ART ANTERIEUR La production de protéines recombinantes dans un animal transgénique est désormais une alternative de production de protéines largement utilisée. Lorsque la protéine recombinante transgénique est destinée à être administrée à des patients, la pureté et l'innocuité de la préparation de protéine recombinante transgénique administrée est particulièrement importante. De nombreux procédés de purification ou de détection d'une protéine recombinante se basent sur l'affinité et la spécificité d'un composé capable de se lier à ladite protéine recombinante.

Ces étapes de détection et de purification d'une protéine recombinante sont tout particulièrement délicates quand ladite protéine recombinante est susceptible d'être présente concomitamment avec une protéine fortement homologue. En effet, lorsque la protéine recombinante se trouve en solution avec une ou plusieurs protéines homologues à cette protéine recombinante, il devient alors difficile de mettre au point des outils de détection ou de purification permettant de réaliser un haut niveau de discrimination entre la protéine recombinante d'intérêt et la ou les protéine(s) homologue(s) indésirables, en utilisant des méthodes classiques de purification ou de détection. La difficulté de purifier ou détecter spécifiquement des protéines présentant une homologie entre elles se rencontre lorsqu'une protéine recombinante transgénique est produite dans un organisme ou un microorganisme transgénique qui exprime aussi naturellement une protéine homologue de ladite protéine transgénique. Sont visées notamment les protéines recombinantes produites dans des organismes possédant de R' Brevets 2,1800 29857 LFB 29857FR-U81230 - Demande tri déposéedoc manière naturelle dans leur génome un gène dit orthologue codant une protéine fortement homologue à la protéine recombinante codée par un transgène. Il est courant qu'une protéine transgénique humaine ou animale exprimée dans un animal transgénique soit l'homologue d'une protéine endogène exprimée naturellement chez l'animal transgénique. La production de la protéine naturelle endogène homologue représente un inconvénient technique important dans des situations où l'on cherche à éviter la réalisation d'une co-extraction ou d'une codétection de la protéine transgénique et de la protéine naturelle endogène homologue. Lorsque la protéine recombinante transgénique consiste en une protéine d'intérêt thérapeutique, destinée à la fabrication d'un médicament, la présence, dans la préparation purifiée de la protéine recombinante, de toute protéine endogène homologue de la protéine transgénique peut entraîner des effets indésirables pour le patient à qui le médicament est administré, y compris l'induction d'une réponse immunitaire indésirable à l'encontre de la protéine naturelle contaminante, qui est susceptible de réduire l'efficacité du traitement médical et même parfois provoquer des réponses auto-immunes de nature à mettre en danger la vie du patient. De tels problèmes sont rencontrés de plus en plus souvent avec le recours croissant à la fabrication de protéines transgéniques thérapeutiques chez des animaux transgéniques. Afin de proposer des produits thérapeutiques ayant une haute innocuité, les protéines transgéniques doivent donc être purifiées spécifiquement, en présence de très faibles quantités de protéines homologues indésirables, et si possible en Labsence totale de protéines homologues indésirables. Il est donc nécessaire de disposer d'outils permettant la détection ou la purification d'une protéine endogène d'un animal transgénique, homologue à la protéine exogène d'intérêt, les deux protéines étant susceptible d'être contenues dans un même échantillon biologique de l'animal transgénique. La demande de brevet US5861491 propose une méthode de séparation de lactoférine humain à partir du lait de vache contenant de la lactoférine bovine. Cette méthode est basée sur une chromatographie d'interactions hydrophobes. Cette chromatographie utilise une résine qui contient groupe butyle ou un groupe phényl qui sert de ligand lui-même lié à un support d'agarose. Le brevet européen EP 1 181 351 propose une méthode de séparation de protéines hétérologues présentes dans le lait d'un animal transgénique (HSA humaine et BSA Bovine). La méthode est basée sur la suppression de l'expression de la protéine R Brevets 2 800 29857 LFB 29857FR-081230 - Demande tri déposée.doc endogène de l'animal transgénique par remplacement du gène codant la protéine endogène par une séquence ADN codant pour le polypeptide hétérologue. Cette méthode de biologie moléculaire est particulièrement lourde à mettre en oeuvre. La présente invention propose des anticorps spécifiquement dirigés contre le facteur VII de lapin pour détecter et/ou purifier ledit facteur VII de lapin susceptible d'être retrouvé dans un échantillon biologique d'un lapin transgénique, destiné à produire du facteur VII humain.

DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention a pour objet des peptides isolés du facteur VII de lapin, dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi EHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :1), KLHHGIQRH (SEQ ID NO :2) et AALMNGSTL (SEQ ID NO :3). Ces peptides correspondent respectivement aux séquences d'acides aminés allant de l'acide aminé 354 à l'acide aminé 365, de l'acide aminé 433 à l'acide aminé 441 et de l'acide aminé 207 à l'acide aminé 215 de la séquence protéique du facteur VII de lapin (Oryctolagus cuniculus) accessible sous le numéro d'accès P98139 dans la base de données Swissprot. La présente invention a également pour objet un polypeptide constitué par un peptide selon l'invention, et par au moins un oligopeptide additionnel comprenant de 1 à l0 acides aminés placé à l'une et/ou l'autre des extrémités N-terminale et C-terminale dudit peptide. Dans le cadre de la présente invention, le terme polypeptide se réfère donc à une séquence d'acides aminés comportant de 10 à 32 acides aminés, de préférence de 15 à 32 acides aminés, et comprenant l'un des peptides de l'invention. La taille du polypeptide de l'invention est choisie de manière à optimiser l'immunogénicité des peptides de l'invention. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le polypeptide de l'invention comprend au moins un oligopeptide additionnel dont les acides aminés sont choisis dans la région flanquante N- ou C-terminale du peptide de l'invention, lorsque l'on se réfère à la séquence protéique du facteur VII de lapin accessible sous le numéro d'accès P98139. Le polypeptide est donc formé en allongeant le peptide de l'invention par la sélection d'acides aminés additionnels naturellement contigus à l'extrémité N-terminale et/ou à l'extrémité C-terminale de ce peptide dans la séquence du facteur VII de lapin. Lorsque le peptide de l'invention a pour séquence R:.Brevets.29800.29857 LFB 29857FR-081330 - Demande tq déposée.doc EHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :1), les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité N-terminale du peptide sont donc choisis dans la séquence LMTQDCVEQS (SEQ ID NO:7) et/ou les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité C-terminale sont donc choisis dans la séquence MFCAGYLDGS (SEQ ID NO :8). Lorsque le peptide de l'invention a pour séquence KLHHGIQRH (SEQ ID NO :2), les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité N-terminale du peptide sont donc choisis dans la séquence TEWLSRLMRS (SEQ ID NO:9) et/ou les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité C-terminale sont donc choisis dans la séquence PFP (SEQ ID NO :10). Enfin, lorsque le peptide de l'invention a pour séquence AALMNGSTL (SEQ ID NO :3), les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité N-terminale du peptide sont donc choisis dans la séquence VCPKGECPWQ (SEQ ID NO:11) et/ou les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité C-terminale sont donc choisis dans la séquence LCGGSLLDTH (SEQ ID NO :12).

Plus préférablement, le polypeptide de l'invention a pour séquence : - VEQSEHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :4), c'est-à-dire que l'extrémité N-terminale du peptide de séquence EHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :1) est allongée de 4 acides aminés (naturellement contigus à ce peptide dans la séquence protéique du facteur VII de lapin), - SRLMRSKLHHGIQRH (SEQ ID NO :5), c'est-à-dire que l'extrémité N-terminale du peptide de séquence KLHHGIQRH (SEQ ID NO :2) est allongée de 6 acides aminés (naturellement contigus à ce peptide dans la séquence protéique du facteur VII de lapin), ou - AALMNGSTLLCGGSLLDTH (SEQ ID NO :6), c'est-à-dire que l'extrémité C-terminale du peptide de séquence AALMNGSTL (SEQ ID NO :3) est allongée de 10 acides aminés (naturellement contigus à ce peptide dans la séquence protéique du facteur VII de lapin). Un autre objet de la présente invention est une protéine chimérique comprenant au moins un peptide de l'invention et/ou au moins un polypeptide de l'invention, en combinaison avec une protéine vecteur, le(s)dit(s) peptide(s) et/ou le(s)dit(s) polypeptide(s) et ladite protéine vecteur étant éventuellement séparés par espaceur. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine chimérique de l'invention comprend, en tant que protéine vecteur, une protéine choisie parmi l'hémocyanine de keyhole R Brevets 29X00 29857 LFB 29857FR-08123 1 - Demande ty dcposeedoc limpet (KLH), la sérum-albumine bovine (BSA), l'ovalbumine (OVA) et la thyroglobuline bovine (THY). Dans un mode de réalisation préféré, la protéine chimérique de l'invention comprend les peptides de SEQ ID NO : 1, 2 et 3 ou les polypeptides de SEQ ID NO : 4, 5 et 6, lesdits peptides ou lesdits polypeptides étant organisés de manière séquentielle et étant séparés entre eux par un espaceur. L'espaceur permettant de séparer les peptides et ou les polypeptides entre eux est choisi selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine chimérique de l'invention comprend, en tant que protéine vecteur, une protéine choisie parmi l'hémocyanine de keyhole limpet (KLH), la sérum-albumine bovine (BSA), l'ovalbumine (OVA) et la thyroglobuline bovine (THY). La protéine vecteur peut indifféremment occuper l'extrémité N- ou C-terminale de la protéine chimérique de l'invention. La présente invention a également pour objet une composition peptidique pour l'induction de la production d'anticorps comprenant au moins un peptide de SEQ ID NO :1, 2 et/ou 3, et/ou au moins un polypeptide de l'invention et/ou au moins une protéine chimérique de l'invention. Lorsque la composition peptidique selon l'invention comprend plusieurs peptides et/ou polypeptides de l'invention, ces derniers peuvent se présenter sous une forme individualisée ou sous une forme concaténée. Lorsque la composition selon l'invention comprend plusieurs peptides et/ou polypeptides de l'invention sous une forme concaténée, les peptides et/ou polypeptides peuvent être séparés les uns des autres par un espaceur. La composition peptidique selon l'invention peut également comprendre un adjuvant. L'utilisation d'un adjuvant peut être requise pour accroître l'intensité ou la durée de la réponse immunitaire et ainsi permettre de réduire la quantité de peptide/polypeptide/protéine chimérique par dose ou le nombre total de doses nécessaires pour assurer l'immunité. Les adjuvants pouvant être utilisés dans le cadre de l'invention, sont de manière non limitative, des sels d'aluminium (hydroxyde, phosphate, sulfate, des sels de calcium ou de produits bactériens). La composition peptidique de l'invention permet d'induire chez un animal hôte, des anticorps dirigés spécifiquement contre le facteur VII de lapin. R Brevets 29800 29857 LFB 29857FR-081230 - Demande tq déposée.doc Les peptides, polypeptides ou protéines chimériques selon l'invention peuvent également être utilisés pour réaliser le criblage d'anticorps reconnaissant spécifiquement le facteur VII de lapin. La présente invention a également pour objet un anticorps ou fragment fonctionnel d'anticorps dirigé contre au moins l'un des peptides, au moins l'un des polypeptides ou au moins l'une des protéines chimériques décrits ci-dessus et capable de reconnaître de manière spécifique le facteur VII de lapin (et en particulier de l'espèce Oryctolagus cuniculus). Un tel anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Par fragment fonctionnel d'anticorps, on entend un fragment Fab, un fragment Fab', un fragment F(ab)2 ou un fragment scFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 et Bird et la., 1988, Science 242 : 423-426). Par reconnaissance spécifique, il est entendu, au sens de la présente invention, que les anticorps dirigés contre au moins l'un des peptides, au moins l'un des polypeptides ou au moins l'une des protéines chimériques de l'invention sont capables de se fixer au facteur VII de lapin mais ne sont pas capables de se fixer au facteur VII d'une autre espèce. De manière préférée, les anticorps de l'invention peuvent se fixer au facteur VII de lapin mais ne peuvent pas se fixer au facteur VII humain, et permettent donc de discriminer le facteur VII de lapin du facteur VII humain. Pour produire des anticorps polyclonaux, les peptides, polypeptides ou protéines chimériques selon l'invention sont synthétisés et injectés dans un animal hôte, qui peut être, une souris, un lapin ou tout autre animal connu de l'homme du métier pour la production d'anticorps. Après cette étape dite d'immunisation, les sérums de l'animal hôte sont récoltés et purifiés de manière à obtenir les anticorps polyclonaux. La purification des anticorps à partir des sérums peut se faire par chromatographie d'affinité, par précipitation au sulfate d'aluminium, par chromatographie échangeuse d'ions, par filtration sur gel ou par toute autre technique connue de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lesdits anticorps polyclonaux sont séparés des autres constituants du sérum par chromatographie d'affinité sur colonne, sur laquelle est fixé un peptide, un polypeptide ou une protéine chimérique selon l'invention, qui sera reconnu par les anticorps générés. Pour produire des anticorps monoclonaux, les peptides, polypeptides ou protéines chimériques selon l'invention sont synthétisés et injectés dans un animal hôte, qui peut être, une souris, un lapin ou tout autre animal connu de l'homme du métier R. Bre'els 2,1800 29857 1.1'B 29857FR-081230 - Demande iq déposée.doc pour la production d'anticorps. Après cette étape dite d'immunisation, les animaux exprimant des anticorps dirigés contre les peptides de l'invention sont immunisés une nouvelle fois avant la date prévue de l'étape de fusion destinée à la préparation d'un hybridome. La rate des animaux est prélevée afin de récupérer les lymphocytes B qui produisent les anticorps dirigés contre les peptides de l'invention et les lymphocytes B sont fusionnés avec des cellules cancéreuses pour former des hybridomes. Les meilleurs clones sont ensuite sous-clonés pour permettre la production de l'anticorps monoclonal de l'invention. L'anticorps ou le fragment fonctionnel d'anticorps de l'invention peuvent être utilisés à des fins de détection ou de purification du facteur VII de lapin, en particulier lorsque ledit facteur VII de lapin est contenu dans un échantillon biologique contenant également du facteur VII humain. Un autre objet de l'invention concerne également un procédé de détection et/ou de quantification du facteur VII de lapin susceptible d'être présent dans un échantillon biologique contenant du facteur VII humain et susceptible de contenir du facteur VII de lapin, de préférence un échantillon biologique prélevé chez un lapin transgénique, ledit lapin transgénique étant destiné à produire du facteur VII humain, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - mettre en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps ou un fragment fonctionnel d'anticorps selon l'invention dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre le facteur VII de lapin et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps et ne permettant pas la formation d'un complexe entre le facteur VII humain et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps ; et - détecter et/ou quantifier la formation dudit complexe par tout moyen approprié. 25 La détection du facteur VII de lapin peut être réalisée à l'aide de toute technique appropriée connue de l'homme du métier et, en particulier d'une technique d'ELISA sandwich ou de résonnance plasmodique de surface (BiaCore). Un procédé de détection selon l'invention peut en outre comprendre classiquement les étapes : 30 - d'immobilisation d'un anticorps monoclonal anti-facteur VII de lapin de l'invention, par exemple sur une puce ; - de dépôt de l'échantillon à tester ; et R: Brevets2980029857 LFB29857FR-081230 - Demande tq déposée.doc - de révélation à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-facteur VII biotinylé, ou par mesure du niveau de liaison de l'échantillon à tester avec l'anticorps monoclonal de l'invention. Un autre objet de l'invention concerne également un procédé de purification du facteur VII humain à partir d'un échantillon biologique contenant du facteur VII humain et susceptible de contenir du facteur VII de lapin, de préférence un échantillon biologique prélevé chez un lapin transgénique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: - mettre en contact ledit échantillon biologique avec l'anticorps ou le fragment fonctionnel d'anticorps selon l'invention dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre le facteur VII de lapin et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps et ne permettant pas la formation d'un complexe entre le facteur VII humain et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps, - Séparer le facteur VII humain dudit complexe formé par le facteur VII de lapin et 15 ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps. Le procédé de purification selon l'invention peut en outre comprendre classiquement les étapes de : - immobilisation de l'anticorps monoclonal anti-facteur VII de lapin de l'invention (ou d'un fragment fonctionnel de celui-ci) sur un support d'affinité (gel ou bille 20 magnétique) ; - mise en présence de l'échantillon biologique contenant le facteur VII humain et susceptible de contenir le facteur VII lapin avec l'anticorps monoclonal immobilisé ; et - séparation du facteur VII humain dudit complexe formé par le facteur VII de lapin et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps après un temps de contact 25 adapté. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'échantillon biologique est issu d'une lapine transgénique, ladite lapine transgénique étant destinée à produire du facteur VII humain. L'échantillon biologique contient donc le facteur VII humain, qualifié de protéine d'intérêt, et est susceptible de contenir une protéine homologue au 30 facteur VII humain et notamment du facteur VII de lapin. Avantageusement, l'échantillon biologique est un fluide corporel, une cellule, un broyat cellulaire, un tissu, un broyat tissulaire, un organe ou un organisme entier. De préférence l'échantillon biologique est un échantillon biologique liquide tel que du R: Brevets `, 29800', 29857 LFB 29857FR-081230 - Demande tq déposée.doc sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait ou un dérivé du lait. Il peut s'agir du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés. Avantageusement, la lapine transgénique produit du facteur VII transgénique humain dans ses glandes mammaires sous le contrôle d'un promoteur spécifique 5 permettant l'expression de ladite protéine transgénique dans le lait de ladite lapine transgénique. Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un 10 plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par micro-injection 15 dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. 20 D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter, les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (Production de facteur Von Willebrand dans un mammifère transgénique), mentionnant notamment le promoteur de la caséïne. 25 Exemples Exemple 1 : Sélection de peptides immunogènes pour la préparation d'anticorps reconnaissant spécifiquement le facteur VII de lapin

30 Des peptides immunogènes destinés à la préparation d'anticorps spécifiquement dirigés contre le facteur VII de lapin sont sélectionnés dans la séquence protéique du facteur VII de lapin portant le numéro d'accès P98139 dans la base protéique Swiss Prot. Trois peptides sont retenus : R:' Brevets 29800 29857 LFB 29857FR-081230 - Demande tq déposéedoc - le peptide de séquence EHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :1) ; - le peptide de séquence KLHHGIQRH (SEQ ID NO :2) ; et - le peptide de séquence AALMNGSTL (SEQ ID NO :3).

L'accessibilité au solvant de ces peptides est analysée de sorte à s'assurer qu'aucun d'entre eux ne se trouve enfouit à l'intérieur de la structure tertiaire de la protéine. Par ailleurs, une analyse complémentaire montre qu'aucun de ces peptides ne semble comporter de sites de glycosylation.

l 0 a - Préparation des polypeptides utilisés pour mettre en oeuvre l'immunisation : Les peptides sélectionnés sont allongés par la sélection d'acides aminés additionnels naturellement présents à l'extrémité N-terminale et/ou à l'extrémité C-terminale de chaque peptide dans la séquence du facteur VII de lapin afin d'obtenir un polypeptide possédant une taille d'au moins 15 acides aminés, permettant ainsi 15 d'optimiser l'immunogénicité des peptides de l'invention lors de l'immunisation. L'extrémité N-terminale du peptide de séquence EHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :1) est allongée de 4 acides aminés (naturellement contigus à ce peptide dans la séquence protéique du facteur VII de lapin) pour obtenir le polypeptide de séquence VEQSEHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :4). 20 L'extrémité N-terminale du peptide de séquence KLHHGIQRH (SEQ ID NO :2) est allongée de 6 acides aminés (naturellement contigus à ce peptide dans la séquence protéique du facteur VII de lapin) pour obtenir le polypeptide de séquence SRLMRSKLHHGIQRH (SEQ ID NO :5). Enfin, l'extrémité C-terminale du peptide de séquence AALMNGSTL (SEQ ID 25 NO :3) est allongée de 10 acides aminés (naturellement contigus à ce peptide dans la séquence protéique du facteur Vil de lapin pour obtenir le polypeptide de séquence AALMNGSTLLCGGSLLDTH (SEQ ID NO :6).

b - Construction des protéines chimériques utilisées pour immuniser les souris 30 Les peptides VEQSEHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :4), SRLMRSKLHHGIQRH (SEQ ID NO :5) et AALMNGSTLLCGGSLLDTH (SEQ ID NO :6) sont synthétisés et chimiquement couplés à la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), une protéine vecteur (Calbiochem). R:Brevets29800 29857 LFB 29857FR-081230 - Demande ty dcposée_doc Exemple 2 : Immunisation de souris Chacune des protéines chimériques formée à partir des peptides de l'invention est ensuite utilisée pour immuniser un lot de 6 souris à raison de 3 injections à J0, J15 et J30. A J45, les sérums de souris sont testés quant à leur capacité à fixer le peptide correspondant de l'invention ou le polypeptide qui a été couplé à la protéine vecteur pour former la protéine chimérique utilisée pour l'immunisation. Le test utilisé consiste en une technique d'ELISA sandwich . a- Préparation d'anticorps polyclonaux dirigés spécifiquement contre le facteur VII de lapin

Pour obtenir les anticorps polyclonaux dirigés contre l'un ou l'autre des peptides de l'invention, les souris testées positivement sont sacrifiées et la totalité du sérum de ces souris est purifiée par chromatographie d'affinité en employant une colonne sur laquelle est greffé le peptide (ou le polypeptide) de l'invention correspondant au sérum obtenu. Les anticorps polyclonaux fixés sur la colonne sont ensuite élués en modifiant leur affinité de liaison pour les peptides greffés sur la colonne, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. b- Préparation d'anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre le facteur VII de lapin

La ou les souris choisie(s) exprimant des anticorps dirigés contre les peptides de l'invention est (sont) immunisée(s) une nouvelle fois 3 jours avant la date prévue de l'étape de fusion destinée à la préparation d'un hybridome. La rate des souris est prélevée afin de récupérer les lymphocytes B qui produisent les anticorps dirigés contre les peptides de l'invention. Les lymphocytes B sont fusionnés avec les cellules myélomateuses de la lignée SP20 pour former des hybridomes.

Après fusion avec SP20, les cellules sont réparties dans des plaques de cultures cellulaires en milieu sélectif. Un criblage des puits de fusion est réalisé. Les puits retenus, c'est-à-dire ceux présentant un anticorps capable de reconnaitre spécifiquement le facteur VII de lapin, sont clonés par dilution limite et un nouveau crible différentiel en ELISA est réalisé. R:ABrecets298OO29857 LFB 29857FR-081230 - Demande tq déposée.doc 11 Les meilleurs clones sont ensuite sous-clonés. Les cellules permettant de produire les anticorps monoclonaux de l'invention sont ensuite remise en culture et le lysat ou le surnageant cellulaire contenant les anticorps monoclonaux selon l'invention sont préparés selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Exemple 3 : Screening des anticorps obtenus Le criblage des anticorps produits (polyclonaux ou monoclonaux) est réalisé par la mise en oeuvre de deux tests successifs basés sur une technique d'ELISA sandwich. 10 Le premier test consiste à détecter des anticorps qui reconnaissent le facteur VII de lapin et comprend les étapes de : - immobilisation d'un anticorps polyclonal reconnaissant à la fois le facteur VlI de lapin et le facteur VII humain dans une plaque de culture - dépôt d'un échantillon de plasma de lapin afin de fixer le facteur VII de lapin sur 15 l'anticorps polyclonal - dépôt d'un échantillon contenant l'anticorps monoclonal ou polyclonal à tester obtenu après l'immunisation d'un animal hôte (voir exemple 2) - révélation de la fixation dudit anticorps à l'aide d'un anticorps biotinylé anti-animal hôte (ici, la souris) 20 Le deuxième test consiste à détecter les anticorps qui reconnaissent le facteur VII humain et comprend les étapes de : - immobilisation d'un anticorps polyclonal reconnaissant à la fois le facteur VII de lapin et le facteur VII humain dans une plaque de culture 25 - dépôt d'un échantillon de plasma humain afin de fixer le facteur VII humain sur l'anticorps polyclonal - dépôt d'un échantillon contenant l'anticorps monoclonal ou polyclonal à tester obtenu après l'immunisation d'un animal hôte (voir exemple 2) - révélation de la fixation dudit anticorps à l'aide d'un anticorps biotinylé anti-animal 30 hôte (ici, la souris) La procédure d'ELISA Sandwich est réalisée en utilisant une microplaque en polychlorure de vinyle (PVC). 50 ml d'une solution (à 20 mg/ml dans du PBS) d'un anticorps polyclonal reconnaissant à la fois le facteur VII de lapin et le facteur VII humain sont ajoutés dans chaque puits. Environ 100 ng de cet anticorps se lieront au R: Brevets 29800 29357 LFB 29357FR-O3123O - Demande tri déposée.doc5 PVC dans chaque puits (soit environ 300 ng d'anticorps/cmz). La microplaque est laissée à 4°C pendant la nuit pour permettre la liaison d'un maximum d'anticorps. Les puits sont ensuite lavés deux fois avec du PBS. Les sites restant sont saturés avec un tampon de saturation composé de PBS et de 3% de BSA (Bovine Serum Albumine), pendant une durée d'au moins deux heures sous atmosphère humide à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés deux fois avec du PBS. 50 ml de la solution d'antigène (ici, l'échantillon de plasma de lapin dans le premier test ou de plasma humain dans le deuxième test) sont ajoutés dans les puits et incubés pendant au moins 2 heures sous atmosphère humide et à température ambiante.

Les plaques sont lavées 4 fois avec du PBS. Une fraction de l'échantillon contenant l'anticorps monoclonal ou polyclonal à tester (obtenu après l'immunisation des souris) est ensuite ajouté . Plusieurs dilutions de cet échantillon sont testées, allant de préférence de 1 :10 à 1 :10000, et comprenant classiquement les dilutions 1 :10, 1 :100, 1 :1000 et 1 :10000. Le choix des dilutions appropriées pour procéder au criblage des anticorps de l'invention peut se fonder sur des test préliminaires de fixation qui sont bien connus de l'homme du métier. L'échantillon contenant l'anticorps monoclonal ou polyclonal à tester est incubé en contact avec les microplaques pendant au moins 2 heures sous atmosphère humide à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés à plusieurs reprises avec du PBS.

L'anticorps biotinylé anti-souris est ensuite ajouté selon les recommandations du fabriquant, à une dilution de 1 :1000, dans un tampon PBS contenant 0.5% de Tween 20. Lorsqu'on a atteint le temps d'incubation recommandé avec l'anticorps biotinylé anti-souris, on procède ensuite à la détection de la quantité d'anticorps monoclonal ou polyclonal à tester qui s'est fixé.

Les techniques de type ELISA sandwich sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être aisément modifiées pour ajuster les quantités et concentrations de chacun des anticorps et/ou antigène pour atteindre le résultat souhaité. Un anticorps selon l'invention sera caractérisé en ce qu'il répond positivement au premier test (il détecte le facteur VII de lapin) et négativement au deuxième test (il 30 ne détecte pas le facteur Vll humain). 35 R:'-Brevets 29800`29857 LFB29857FR-081230 - Demande tq déposée-doc Exemple 4 : Détection du facteur VII de lapin à partir de lait de lapin transgénique utilisé pour produire du facteur VII humain Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention qui répondent respectivement positivement puis négativement au premier et au second test de l'exemple 3 permettent donc de détecter de manière spécifique le facteur VII de lapin, y compris lorsque ce dernier se trouve dans un échantillon biologique susceptible de contenir également du facteur VII humain. Ces anticorps polyclonaux ou monoclonaux peuvent en particulier être mis en oeuvre dans un procédé de détection, et le cas échéant de quantification, du facteur VII de lapin dans le lait de lapines transgéniques utilisées pour produire le facteur VII humain. Les techniques de détection d'une protéine dans un échantillon se fondant sur des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre cette protéine sont bien connues de l'homme du métier, qui pourra sans difficulté les adapter à l'utilisation des anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon contenant les anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention est déposé dans une microplaque en polychlorure de vinyle (PVC) à une dilution de 1 :100. La microplaque est laissée à 4°C pendant la nuit. Les puits sont ensuite lavés deux fois avec du PBS, puis les sites restés libres sont saturés avec un tampon de saturation composé de PBS et de 3% de BSA (Bovine Serum Albumine), pendant une durée d'au moins deux heures sous atmosphère humide à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés deux fois avec du PBS. 50 ml du lait de lapin provenant d'une lapine transgénique utilisée pour produire du facteur VII humain sont ajoutés dans les puits et incubés pendant au moins 2 heures sous atmosphère humide et à température ambiante. De manière préférentielle, différentes dilutions du lait de lapine transgénique sont déposées dans les puits de la microplaque. Les dilutions généralement utilisées sont les suivantes : 1, 1 :10, 1 :50, 1 :100, 1 :500, et 1 :1000, toutefois, d'autres dilutions peuvent aisément être utilisées.

Le lait de lapine transgénique peut également faire l'objet d'une ou de plusieurs étapes de prépurification avant d'être employé pour y détecter le facteur VII de lapin. Les plaques sont ensuite lavées 4 fois avec du PBS. Une solution d'anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre le facteur VII de lapin et couplé à la péroxydase est ajoutée dans les puits et est incubée en contact avec les microplaques pendant au moins 2 heures sous atmosphère humide à R:: Brevets 29800 29857 LFB 2985 7 FR-(181 _230 - Demande tq déposée-doc température ambiante. La dilution d'anticorps couplés à la péroxydase dans la solution utilisée est généralement de 1 :1000 dans un tampon PBS contenant 0.5% de Tween 20. Les puits sont ensuite lavés à plusieurs reprises avec du PBS. L'anticorps couplé à la péroxydase utilisé peut être un anticorps disponible commercialement (on agira alors selon les recommandations du fabriquant) ou un anticorps selon l'invention qui aura préalablement été couplé à la péroxydase. La détection est effectuée par l'ajout d'une solution contenant de l'Orthophénylènediamine (OPD-H2O2). La solution contenant dOPD est incubée avec les microplaques à température ambiante pendant environ 3 minutes. En présence de péroxydase, l'ajout de la solution d'OPD entraine l'apparition d'une coloration révélatrice de la présence de facteur VII de lapin dans le lait transgénique testé. La réaction est stoppée grâce à un réactif stoppant (H2SO4 3M ou HCI 1M) et la densité optique du mélange réactionnel est lue dans un délai de 10 minutes à 2 heures après arrêt de la réaction à l'aide d'un lecteur spectrophotométrique de microplaque.

L'absorbance à 492 nm est mesurée (le blanc étant ajusté sur le contenu d'un puits n'ayant pas été incubé en présence de lait transgénique. L'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d'anticorps couplé à la péroxydase et donc à la quantité de facteur VII de lapin lié sur la phase solide. De manière préférentielle, parallèlement à la préparation de la microplaque destinée à être mise en contact avec le lait de lapine transgénique, on procède également à la préparation d'une microplaque mise en contact avec une gamme de concentration croissante de facteur VII de lapin. Le protocole reste similaire à celui décrit ci-dessus. Lors de la détection, la microplaque mise en contact avec la gamme de concentration de facteur VII de lapin permet de tracer une courbe étalon correspondant à l'évolution de I'absorbance en fonction de la concentration en facteur VII. La concentration du lait de lapine transgénique en facteur VII de lapin est déterminée en reportant la valeur d'absorbance mesurée sur la courbe étalon.

Exemple 5: Extraction et purification du facteur VII contenu dans le lait de lapines transgéniques produisant du facteur VII humain Le lait brut non écrémé de lapine transgénique produisant du facteur VII humain est dilué avec du tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2 et centrifugé à 10 000g 35 durant 1 heure à 15°C. Après centrifugation, trois phases sont présentes : une phase lipidique en surface (crème), une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en facteur R: Brevets 29800 29857 LFB 29857FR-081230 - Demande tq déposée doc VII (phase majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non solubles et de composés de calcium). La phase aqueuse non lipidique contenant le facteur VII est collectée puis filtrée sur une séquence de filtres ayant une taille de pores de l m à 0,45 m.

La phase aqueuse non lipidique filtrée est ensuite dialysée sur membrane d'ultrafiltration pour la rendre compatible avec la phase de chromatographie. La phase aqueuse non lipidique contenant le facteur VII est ensuite purifiée par chromatographie.sur gel d'hydroxyapatite (chromatographie d'affinité), suivie d'une filtration tangentielle 100 kDa et d'une concentration/dialyse 50 kDa. Lors de la filtration tangentielle, le facteur VII passe à travers la membrane ayant une porosité de 100 kDa, tandis que les protéines de hauts poids moléculaire (c'est à dire de poids moléculaire supérieur à 100 kDa) sont quant à elle retenues. Ce traitement permet notamment de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des étapes de purification subséquentes.

La solution résultante contenant le facteur VII est ensuite purifiée par l'intermédiaire de 3 chromatographies successives sur gel échangeur d'ions QSépharose Fast Flow (QSFF) sont réalisées pour purifier et concentrer le facteur VII et permettre l'activation du facteur VII en facteur VII activé (facteur Vlla). Lors de la première chromatographie, réalisée sur sur gel Q-Sepharose FF. la fraction protéique riche en facteur VII est éluée avec un tampon comprenant du chlorure de calcium 0,05 M, à pH 7,5 (élution high clacium ) et permet également l'activation du facteur VII en facteur Vlla. Après dialyse, l'éluat est ensuite séparé sur une colonne Q-Sepharose FF 2. Au cours de cette étape, une fraction contenant du facteur VII de très haute pureté est éluée avec un tampon contenant du chlorure de calcium 0,005 M, à pH 7,5 (élution low calcium ). Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des protéines accompagnantes (protéines du lait de lapine). Enfin, la solution contenant le facteur VII est séparée sur Q-Sepharose FF 3. Au cours de cette étape, le facteur VII est ensuite élué avec un tampon contenant du 30 chlorure de sodium 0,28 M, à pH 7,0 (élution sodium ). La composition de facteur VII qui résulte de cette élution présente un degré de pureté supérieur à 95%. Le produit est alors compatible avec une injection par voie intraveineuse. R:Brecets 29800 29857 LF B 29857FR-08 1230 - Demande tq déposée.doc Exemple 6 : Purification d'une solution contenant du facteur VII de lapin et du facteur VII humain sur une résine greffée avec les anticorps de l'invention dirigés spécifiquement contre le facteur VII de lapin Les anticorps polyclonaux ou monoclonaux de l'invention sont greffés sur une colonne de sorte qu'on puisse les utiliser pour réaliser une chromatographie d'affinité. De manière préférée, la colonne utilisée est une colonne de type Protéine A ou de type protéine G . Le greffage est réalisé selon les recommandations du fabriquant et, ainsi qu'il est bien connu de l'homme du métier, le protocole mis en oeuvre peut être adapté au type de colonne choisi. Les amines primaires susceptibles d'être présentes dans l'échantillon contenant les anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention sont éliminées par une filtration sur résine ou par une dialyse contre un tampon phosphate. La résine d'agarose-protéine G est remise en suspension puis lavée et équilibrée avec le tampon de lavage contenant 50 mM de borate de sodium, pH 8,2.

La solution d'anticorps (à environ 100gg/ml) est placée en contact avec la résine et le mélange est doucement homogénéisé. Le mélange résine/anticorps est ensuite coulé dans une colonne. La colonne est ensuite lavée 2 fois avec du tampon de lavage. Du subérate de disuccinimidyl (DSS) est mis en suspension dans du DMSO ou du DMF, et 1 volume équivalent de tampon phosphate 0, I M, contenant 0,15M de NaCl, pH 7,2 est ajouté. Ce mélange est déposé sur la colonne, et délicatement homogénéisé avec la résine pendant 1 heure à température ambiante. La colonne est ensuite lavée avec du tampon phosphate 0,1 M, contenant 0,15M de NaCl, pH 7,2. On ajoute ensuite sur la colonne du tampon de blocage comprenant 0,1 M d'éthanolamine pour bloquer tout groupe ester encore activé. Le mélange résine/tampon de blocage est lentement homogénéisé pendant 10 minutes à température ambiante, puis du tampon contenant une amine primaire (à pH 2,8) est passé sur la colonne, afin d'éluer tout anticorps n'étant pas lié de manière covalente à la protéine G. La colonne est ensuite lavée 2 fois avec du tampon de lavage avant son utilisation pour la chromatographie d'affinité. Pour réaliser la chromatographie d'affinité, la colonne est équilibrée avec un tampon de type PBS à pH 7,2. La solution contenant le facteur VII de lapin (et correspondant à l'une quelconque des étapes de purification du facteur VII mentionnées plus haut) est diluée (l v/l v) par l'ajout de PBS. Cette solution diluée est ensuite passée sur colonne et la colonne est lavée avec du tampon PBS jusqu'au retour à la ligne de base de l'Absorbance à 280 nm. RaBrevets'29800',29857 LFB29857FR-081230 - Demande tq déposée.doc La solution non retenue sur la colonne, maintenant spécifiquement dépourvue de facteur VII de lapin, est récupérée. L'absence de facteur VII de lapin est vérifiée par exemple par réaction immunologique. Cette solution non retenue, qui ne contient plus que le facteur VII humain produit par les lapines transgéniques, peut ensuite être 5 concentrée, purifiée, et/ou conditionnée pour préparer une composition de facteur VII humain à usage thérapeutique. R: Brevets 29800 29857 LFB'29857FR-081230 - Demande tq déposée.doc

Claims

REVENDICATIONS1. Peptide isolé ayant pour séquence d'acides aminés l'une des séquences choisies parmi EHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :1), KLHHGIQRH (SEQ ID NO :2) et 5 AALMNGSTL (SEQ ID NO :3).
2. Polypeptide isolé constitué par un peptide selon la revendication 1, et par au moins un oligopeptide additionnel de 1 à 10 acides aminés, placé à l'une et/ou l'autre des extrémités N-terminale et C-terminale dudit peptide. 10
3. Polypeptide isolé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, lorsque le peptide a pour séquence EHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :1), les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité N-terminale sont choisis dans la séquence LMTQDCVEQS (SEQ ID NO:7) et/ou les acides aminés constituant l'oligopeptide 15 ajouté à l'extrémité C-terminale sont choisis dans la séquence MFCAGYLDGS (SEQ ID NO :8).
4. Polypeptide isolé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, lorsque le peptide a pour séquence KLHHGIQRH (SEQ ID NO :2), les acides aminés constituant 20 l'oligopeptide ajouté à l'extrémité N-terminale sont choisis dans la séquence TEWLSRLMRS (SEQ ID NO:9) et/ou les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité C-terminale sont choisis dans la séquence PFP (SEQ ID NO :10).
5. Polypeptide isolé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, lorsque le peptide a 25 pour séquence AALMNGSTL (SEQ ID NO :3), les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité N-terminale sont choisis dans la séquence VCPKGECPWQ (SEQ ID NO:I 1) et/ou les acides aminés constituant l'oligopeptide ajouté à l'extrémité C-terminale sont choisis dans la séquence LCGGSLLDTH (SEQ ID NO :12). 30
6. Polypeptide selon l'une des revendications 3 à 5, ayant pour séquence d'acides aminés l'une des séquences choisies parmi VEQSEHKPGSPEVTGN (SEQ ID NO :4), SRLMRSKLHHGIQRH (SEQ ID NO :5) et AALMNGSTLLCGGSLLDTH (SEQ ID NO :6). RBrevets 2980029857 LFB29857FR-081230 - Demande tri déposée.doc
7. Protéine chimérique comprenant au moins un peptide selon la revendication 1 et/ou au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, en combinaison avec une protéine vecteur, le(s)dit(s) peptide(s) et/ou le(s)dit(s) 5 polypeptide(s) et ladite protéine vecteur étant éventuellement séparés par espaceur.
8. Protéine chimérique selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine vecteur est choisie parmi l'hémocyanine de keyhole limpet (KLH), la sérum-albumine bovine (BSA), l'ovalbumine (OVA) et la thyroglobuline bovine (THY).
9. Composition peptidique pour l'induction de la production d'anticorps comprenant au moins un peptide selon la revendication 1, et/ou au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, et/ou au moins une protéine chimérique selon l'une des revendications 7 à 8.
10. Anticorps ou fragment fonctionnel d'anticorps dirigé spécifiquement contre au moins l'un des peptides selon la revendication 1, au moins l'un des polypeptides selon l'une des revendications 2 à 6 ou au moins l'une des protéines chimériques selon l'une des revendications 7 à 8.
11. Anticorps selon la revendication 10 dans lequel l'anticorps est polyclonal ou monoclonal.
12. Fragment fonctionnel d'anticorps selon la revendication 10 consistant en un 25 fragment Fab, un fragment Fab', un fragment F(ab)2 ou un fragment scFv.
13. Utilisation d'un peptide selon la revendication 1, d'un polypeptide selon l'une des revendications 2 à 6 ou d'une protéine chimérique selon l'une des revendications 7 à 8 pour le criblage d'anticorps dirigés contre le facteur VII de lapin.
14. Utilisation d'un anticorps ou d'un fragment fonctionnel d'anticorps selon l'une des revendications l0 à 12, pour la détection ou la purification du facteur VII de lapin. R:' Brevets 29800''29857 LFB'29857FR-081230 - Demande tq déposée.doc 10 15 20 30
15. Utilisation selon la revendication 14, dans laquelle le facteur VII de lapin est contenu dans un échantillon biologique contenant également du facteur VII humain.
16. Procédé de détection et/ou de quantification du facteur VII de lapin susceptible d'être présent dans un échantillon biologique prélevé chez un lapin transgénique, ledit lapin transgénique étant destiné à produire du facteur VII humain, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - Mettre en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps ou un fragment fonctionnel d'anticorps selon les revendications 10 à 12 dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre le facteur VII de lapin et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps et ne permettant pas la formation d'un complexe entre le facteur VII humain et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps ; et - détecter et/ou quantifier la formation dudit complexe par tout moyen approprié.
17. Procédé de purification du facteur VII humain à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un lapin transgénique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: - Mettre en contact ledit échantillon biologique avec l'anticorps ou le fragment fonctionnel d'anticorps selon les revendications 10 à 12 dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre le facteur VII de lapin et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps et ne permettant pas la formation d'un complexe entre le facteur VII humain et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps, - Séparer le facteur VII humain dudit complexe formé par le facteur VII de lapin et ledit anticorps ou ledit fragment fonctionnel d'anticorps. R: Brevets 29800.29857 LFB.29857FR-081230 - Demande tri déposée.doc