FR2839979A1 - Dispositif de culture de cellules - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un dispositif destiné notamment à la culture de cellules comprenant une enceinte (100) destinée à recevoir les cellules (10), ladite enceinte (100) comportant au moins un conduit d'injection de liquide (121, 122, 123, 124, 125, 126), la surface du liquide contenu dans l'enceinte (100) étant en contact libre avec l'air, caractérisé en ce qu'il comprend un élément collecteur (40) apte à établir avec la surface libre du liquide au moins un pont liquide, l'élément collecteur (40) comprenant une embouchure (43) positionnée sensiblement au niveau de la surface libre du liquide contenu dans l'enceinte (100), l'embouchure (43) étant maintenue en dépression de sorte qu'elle absorbe un flux d'air qui entraîne le film (30) de surface du liquide via le pont liquide.
Description
sensiblement horizontale.
DISPOSITIF DE CULTURE DE CELLULES
La presente invention concerne un dispositif de culture de cellules
permettant leur traitement par differents milieux en evitant leur manipulation.
Le document FR 2 659 347 (public le 13/09/1991) decrit un dispositif pour la culture de cellules comportant une enceinte destinee a recevoir les cellules. L'enceinte comprend un support horizontal forme par deux plaques de verre juxtaposees et espacees de maniere a former entre
elles une fente presentant une largeur inferieure aux diametres des cellules.
Les cellules a traiter vent positionnees sur la fente. Cette enceinte est destinee a contenir des milieux liquides de culture ou d'impulsion. Les differents milieux liquides vent injectes successivement dans l'enceinte par des tubulures distinctes positionnees au dessus de la paroi supportant les cellules. Une partie du liquide contenu injecte dans l'enceinte est evacuee par une ou plusieurs tubulure(s) situee(s) au- dessous de la paroi. Une autre
partie de ce liquide est evacuee par debordement.
Dans ce dispositif, les cellules vent maintenues sur la fente grace a la depression provoquee par ['aspiration du milieu liquide par la ou les
tubulure(s) d'evacuation.
Un tel dispositif est destine notamment a la culture d'ovocytes, d'ceufs fecondes ou d'embryons, etc. En particulier, il peut etre utilise pour ['activation d'ovocytes experimentaux, cette activation etant necessaire pour Ie bon developpement ulterieur des embryons. Pour provoquer cette activation, on injecte dans l'enceinte un milieu de culture et on positionne les cellules a activer dans ce milieu de cultur. Le milieu de culture riche en ions est ensuite evacue et simultanement remplace par un milieu d'impulsion contenant des ions Ca2+. Lorsque le milieu de culture a totalement ete evacue et rem place par le mil ieu d ' impulsion, on soumet les cell ules a u ne impulsion de champ electrique qui provoque l'electropermeabilisation transitoire de leur membrane plasmique et la penetration des ions Ca2+ a l'interieur des cellules. Puis le milieu d'impulsion est a son tour evacue et remplace par le milieu de culture. Ces etapes vent repetees un certain nombre de fois de sorte que les cellules vent soumises a une serie
controlee d'impulsions calciques qui declenche leur activation.
Un avantage de ce dispositif est qu'il permet le traitenent des
cellules par differents milieux en evitant leur manipulation.
Toutefois, un probibme pose par ce type de dispositif est que le remplacement d'un milieu par un autre est relativement long, ce qui limite la
frequence d'alternance des milieux dans l'enceinte.
Par exemple, dans le cas ou le dispositif est utilise pour ['activation de cellules, un temps minimal d'injection du milieu d'impuision est necessaire (de l'ordre de 40 secondes) pour remplacer le milieu de culture par le milieu dtimpulsion. Ce temps minimal garantit en effet un ravage
suffsant des cellules par le milieu d'impulsion.
Dans le cas ou ce temps minimal de ravage ne serait pas respecte, le milieu d'impulsion contiendrait des ions residuels provenant du milieu de culture. Lors de ['application du champ electrique, ces ions induiraient un courant ionique trans-membranaire qui provoquerait la destn'.rtion des cellules. Un autre probleme lie au ravage est que ['exposition prolongee des cellules dans le milieu d'impulsion presentant une faible force ionique perturbe l'equilibre des cellules et les expose a des effets deleteres. Pour preserver la survie cellulaire, il est done necessaire de reduire la duree de
ravage des cellules.
Un but de ['invention est de fournir un dispositif de culture de cellules permettant de remplacer rapidement le milieu dans lequel les
cellules vent placees.
On a remarque que ['evacuation du liquide par debordement est un phenombne irregulier. En effet, pendant ['injection du liquide dans l'enceinte, la surface libre du liquide s'elbve au-dessus du plan superieur de la chambre de telle sorte que la surface du liquide prend la forme d'un menisque convexe. Ce phenombne est lie aux tensions superlioielles qui s'exercent a la surface du liquide et a la mouillabilite des parois verticales de la chambre par ce liquide. La denivellation du liquide au-dessus des bords de la chambre doit atteindre une valeur critique pour que l'equilibre entre les forces liees aux tensions superficielles d'une part et les forces liees a la gravite d'autre part, soit rompu. Cette rupture entrane
l'ecoulement du surplus de liquide par dessus les parois de la chambre.
II en resulte que ['evacuation du liquide par debordement se produit de maniere discontinue et imprevisible. Notamment, il peut arriver que durant une phase de remplacement d'un milieu par un autre, le milieu a remplacer ne soit pas evacue. Cette evacuation n'est done pas satisfaisante car elle ne garantit pas le ravage des cellules lors de cette phase de
rem placement.
Par ailleurs, un autre probleme est que cet ecoulenent -liscontinu genere une succession d'ondes de choc dans le liquide. Ces ondes de choc
deplacent les cellules sur le support.
Les cellules ont tendance a se translater le long de la fente de ltelement support vers le centre de la chambre ou elles de regroupent. Wiles vent comprimees les unes contre les autres. La reduction de l'espace entre
les cellules modifie l'efficacite du ravage a la peripherie de cheque cellule.
Enfin, un autre probleme encore est que ['interface entre le milieu de culture et le gaz environnant est le lieu de phenomenes de surface. Des films atomiques ou moleculaires se forment a la surface libre du liquide. Ces films ne vent pas renouveles lors du remplacement d'un milieu par un autre
dans l'enceinte.
Dans le cas ou le dispositif de culture est utilise pour appliquer aux cellules des impulsions de champ electrique, ces films peuvent constituer des poets de conductivite entre les electrodes. Ces poets de conductivite etablissent un court-circuit entre les electrodes. II en resulte une diminution
significative de l'efficacite du charp electrique applique.
Pour pallier ces inconvenients, I'invention propose un dispositif destine notamment a la culture de cellules comprenant une enceinte destinee a recevoir les cellules, ladite enceinte comportant au moins un conduit dtinjection de liquide, la surface du liquide contenu dans l'enceinte etant en contact libre avec ['air, caracterise en ce qu 'il comp rend u n element collecteur apte a etablir avec la surface libre du liquide au moins un pont liquide, I'element collecteur comprenant une embouchure positionnee . sensiblement au niveau de la surface libre du liquide contenu dans ltenceinte, I'embouchure etant maintenue en depression de sorte qu'elle absorbe un flux d'air qui entrane le film de surface du liquide v a le pont liquide. Le dispositif de ['invention permet de creer un pont liquide sous la
forme d'un menisque entre la surface libre du liquide et ['element collecteur.
Ce menisque regu le par effet d'equ il ibre les tensions su perficielles a la
surface du liquide contenu dans l'enceinte.
Un tel dispositif permet grace au flux d'air, d'eliminer de maniere continue le surplus de liquide dans l'enceinte et ainsi de maintenir un niveau
de liquide constant.
II permet egalement d'obtenir un renouvellement permanent du film
de surface du liquide de l'enceinte.
Dans une mise en oeuvre de ['invention, I'element collecteur est positionne sur un rebord d'une paroi de l'enceinte, son embouchure etant
en retrait de la paroi.
De preference, une portion du rebord situee devant lten^,bouchure
de ['element collecteur est recouverte d'une substance hydrophile.
De preference, I'embouchure est en retrait de la paroi a une
distance d comprise entre 10 et 30,um.
De preference, I'embouchure du collecteur presente une forme
allongee et s'etend longitudinalement le long du bord de la paroi.
Dans une mise en osuvre de ['invention, I'ouverture presente une
longueur de ltordre de 2 a 4 mm.
Dans une mise en cauvre de ['invention, I'ouverture presente une
hauteur de l'ordre de 0,15 a 0,30 r;nm.
Dans une mise en oeuvre de ['invention, I'embouchure de ['element
collecteur presente une forme generale rectangulaire.
Avantageusement, le dispositif comprend plusieurs elements
positionnes le long des bords des parois de l'enceinte.
L' invention concerne egalement u n procede de regulation d u niveau d'un liquide contenu dans une enceinte destinee a recevoir des cellules, iadite enceinte comportant au moins un conduit d'injection de liquide, la surface du liquide contenu dans l'enceinte etant en contact libre aves ['air, caracterise en ce qu'on etablit avec la surface libre du liquide au moins un pont liquide et on aspire un flux d'air a proximite du pont liquide, de sorte
que ce flux d'air entrane le fllm de surface du liquide via le pont liquide.
D'autres caracteristiques et avantages ressortiront encore de la
description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative et doit
etre iue en regard des figures annexees parmi lesquelles: - la figure 1 est un schema representatif d'un exemple de dispositif de culture de cellules conforme a une mise en aeuvre de ['invention, - la figure 2 est un schema de detail d'un collecteur du dispositif de la figure 1,
- la figure 3 est un schema en coupe du collecteur de la figure 2.
Sur la figure 1, le dispositif de culture de cellules represente comprend une enceinte 100 comprenant des parois 11, 12, 13 delirnitant une chambre 20 destinee a contenir un milieu liquide. La chambre est remplie d'un milieu liquide correspondent a la phase de traitement des cellules en cours. Dans la chambre 20, un element support horizontal est
positionne, forme par la juxtaposition de deux plaques de verre 101 et 102.
Les plaques de verre 101 et 102 vent maintenues encastrees dans les parois 11 et 12 laterales de l'enceinte. Ces plaques de verre 101 et 102 vent espacees de maniere a definir entre elles une fente rectiligne 103 de
largeur inferieure au diametre des ovocytes 10 a traiter.
L'enceinte 100 comprend egalement des electrodes 111 et 112
s'etendant longitudinalement de part et d'autre de la fente 103.
Le liquide de culture est amene en partie superieure de la chambre par une serie de conduits dnt les embouchures 121, 122, 123, 124, , 126 vent positionnees a intervalles reguliers le long des parois 11, 12 et 13. Par ailleurs, une partie du liquide contenu dans l'enceinte es evacue par un conduit d'evacuation 104 situe a un niveau inferieur a celui de I'element support. Le courant de liquide maintient par depression les
ovocytes 10 plaques sur la fente 103.
La surface libre du liquide contenu dans l'enceinte 100 forme un film moleculaire 30 presentant une forme convexe. Ce film 30 est constitue par - un alignement de molecules orientees dont la fonction hydrophile se positionne vers le fluide et la portion hydrophobe se positionne vers l'air exterieur. Pour eliminer le film moleculaire 30 et absorber le surplus de liquide contenu dans la chambre 20, le dispositif de culture comprend des collecteurs 40 positionnes sur un rebord horizontal 21 de la paroi 11 de la
chambre 20.
De maniere symetrique, le dispositif peut comprendre des collecteurs positionnes sur des rebords 22 ou 23 des parois 12 ou 13 (aux
emplacements representes en traits pointilles).
Ges collecteurs 40 peuvent etre disposes a intervalles reguliers
autour de la chambre 20.
La figure 2 est un schema representant plus en detail un collecteur
du dispositif de culture de cellules de la figure 1.
Ce collecteur 40 est positionne sur le rebord 21 de la pcroi 11 de ltenceinte en retrait par rapport a cette paroi d'une distance d. I comprend un corps 41 creux presentant une ouverture rectangulaire 42 stetendant le long de la paroi 11. Cette ouverture presente une longueur L=2mm et une
hauteur l=0,2mm.
Deux poets liquides 51 et 52 vent formes entre la surface 30 du
liquide contenu dans la chambre 20 et les bords verticaux de l'ouverture 42.
Ces poets liquides 51 et 52 vent formes par des deformations de la surface
du liquide (ou menisques) au contact des bords de l'ouverture 42.
Le collecteur 40 comprend par ailleurs un conduit d'evacuation 43 relic a un dispositif d'aspiration non represente. Ce dispositif d'aspiration permet d'aspirer l'air contenu ans le collecteur 40. Cette aspiration provoque une circulation d'air a travers l'ouverture 42 qui entrane une portion superieure du liquide contenu dans l'enceinte via les poets liquides 51 et 52.11 en resulte que le film moleculaire 30 a la surface du quide est en permanence entrane par l'air circulant dans le collecteur et elimine de la
surface du liquide.
La longueur L de l'ouverture a ete choisie de maniere a etre au moins deux fois superieure a la longueur capillaire k-' du liquide contenu dans l'enceinte. Cette caracteristique garantit la formation de deux menisques lateraux et done la non obturation de l'ouverture 42 par le
liquide. L'air est done toujours libre de circuler a travers l'ouverture 42.
Les liquides generalement utilises pour le traitement des cellules presentent generalement des longueurs capillaires comprises entre 1mm et 2mm. La longueur L de l'ouverture sera done de preference de l'ordre de 2
a 4mm.
Le collecteur 40 est positionne en retrait de la paroi d'une distance d. En effet, l'ouverture ne doit pas etre trop proche de la paroi 11, auquel cas, les forces de capillarite conduiraient a la formation d'un pont liquide unique qui obturerait l'ouverture 42 et qui viderait la chambre 20 du liquide
qutelle contient.
Neanmoins, l'ouverture 42 ne doit pas etre trop eloignee de la paroi
11, auquel cas, le collecteur ntaurait plus aucun effet sur le liquide.
Par ailleurs, une distance d de quelques microns conduit a la formation d'un menisque concave. Or ia forme concave presente plusieurs inconvenients: - d'une part, elle augmente les tensions superficielles vers le fond de la chambre 20, au voisinage des cellules 10, ce qui rend la mise en place ou le prelevement des cellules plus delicat pour l'operateur, - d'autre part, la forme concave modifie le trajet optc,ue de la
lumiere et rend plus difficile ia visualisation des cellules par l'operateur.
Par consequent, il est souhaitable de maintenir un menisque de forme convexe stable. C'est pourquoi, la distance d est de preference
comprise entre 10 et 30,um.
Ainsi, dans le collecteur 40 represente sur la figure 2, la distance d
est de 20,um.
De maniere preferentielle, les rebords 21, 22 et 23 des parois 11, 12 et 13 de ltenceinte vent recouverts d'une substance hydrophobe, excepte devant les ouvertures 42 des collecteurs ou ils vent recouverts d'une substance hydrophile. Cette disposition favorise l'amorce de pont
liquide au niveau des collecteurs 40.
Surla Dgum 3,un coIecteur40 est presents en coupe long du conduit d'bvacuaBon 43. Le tnJ de Fag aspire est mpsentA par des Caches. i'
Claims (10)
1. Dispositif destine notamment a la culture de cellules comprenant une enceinte (100) destinee a recevoir les cellules (10), ladite enceinte (100) comportant au moins un conduit d'injection (121, 122, 123, 124, 125, 126) de liquide, la surface du liquide contenu dans l'enceinte (100) etant en contact libre avec ['air, caracterise en ce qu'il comprend un element collecteur (40) apte a etablir avec la surface libre du liquide au moins un pont liquide (51, 52),1'element collecteur (40) comprenant une embouchure (42) positionnee sensiblement au niveau de la surface libre du liquide contenu dans l'enceinte (100), I'embouchure (42) etant maintenue en depression de sorte qu'elle absorbe un flux d'air qui entrane le film (30) de
surface du liquide via le pont liquide (51, 52).
2. Dispositif selon la revendication 1, caracterise en ce que I'element collecteur (40) est positionne sur un rebord (21) d'une paroi (11)
de l'enceinte (100), son embouchure (42) etant en retrait de la paroi (11) .
3. Dispositif selon la revendication 2, caracterise en ce qu'une portion du rebord (21) situee devant ['embouchure (42) de ['element
collecteur (40) est recouverte d'une substance hydrophile.
4. Dispositif selon l'une des revendications 2 ou 3, caracterise en ce
que ['embouchure est en retrait de la paroi (11) a une distance (d) comprise
entre 10 et 30,um.
5. Dispositif selon l'une des revendications qui precedent,
caracterise en ce que ltembouchure (42) de ['element collecteur (40) presente une forme allongee et s'etend longitudinalement le long du bord de
la paroi (11).
6. Dispositif selon la revendication 5, caracterise en ce que
l'ouverture (42) presente une longueur de l'ordre de 2 a 4 mm.
7. Dispositif selon l'une des revendications 5 ou 6, caracterise en ce
que l'ouverture (42) presente une hauteur de l'ordre de 0,15 a 0,30 mm.
8. Dispositif selon l'une des revendications qui precedent,
caracterise en ce que ['embouchure (42) presente une forme generale
rectang u la ire.
9. Dispositif selon l'une des revendications qui precedent,
caracterise en ce qu'il comprend plusieurs elements collecteurs (40)
positionnes le long des bords des parois (11, 12, 13) de l'enceinte (100).
10. Procede de regulation du niveau d'un liquide contenu dans une enceinte (100) destinee a recevoir des cellules (10), ladite enceinte (100) comportant au moins un conduit d'injection de liquide (121, 122, 123, 124, , 126), la surface du liquide contenu dans l'enceinte etant en contact libre avec ['air, caracterise en ce qu'on etablit avec la surface libre du liquide au moins un pont liquide (51, 52) et on aspire un flux d'air a proximite du pont liquide (51, 52), de sorte que ce flux d'air entrane le film de surface
(30) du liquide via le pont liquide (51, 52).
l
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