FR2838750A1

FR2838750A1 - Proteines insecticides photorhabdus luminescens

Info

Publication number: FR2838750A1
Application number: FR0204799A
Authority: FR
Inventors: Eric Duchaud; Frank Kunst; Philippe Glaser; Carmen Buchrieser; Lionel Frangeul; Farid Chetouani; Christophe Rusniok; Sead Taourit; Le Roux Christina Nelsen; Noel Boemare
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Aventis CropScience SA; Institut Pasteur
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Bayer CropScience SA; Institut Pasteur
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2003-10-24
Also published as: WO2003087144A3; AU2003262177A8; AU2003262177A1; WO2003087144A2

Abstract

L'invention concerne notamment des séquences nucléotidiques isolées de Photorhabdus luminescens, des toxines codées par lesdites séquences, des procédés d'obtendon de telles toxines, des compositions comprenant de telles toxines destinées à la lutte contre des insectes ravageurs des cultures ou nuisibles (car vecteurs de maladies) pour l'homme et les animaux, des plantes transformées exprimant de telles toxines.

Description

L'invention concerne notamment des séquences nucléotidiques isolées de Photorhabdus luminescens, des toxines codées par lesdites séquences, des procédés d'obtention de telles toxines, des compositions comprenant de telles toxines destinées à la lutte contre des insectes ravageurs des cultures ou nuisibles (car vecteurs de maladies) pour l'homme et les animaux, des plantes transformées exprimant de telles toxines.

Il existe un très grand nombre d'agents insecticides chimiques destinés à lutter contre les insectes. Toutefois, certains des produits existants posent des problèmes de sélectivité contre telle ou telle catégorie d'insectes et de résistance contre ces substances.

De très nombreux types d'insectes sont à l'origine de graves dégâts sur les plantes de grande culture, notamment céréalières, florales, fruitières. Différentes techniques alternatives ont été développées, en particulier la lutte biologique par d'autres insectes ou par des agents biologiques tels que des bactéries capables de produire des toxines insecticides. On connaît également des plantes transgéniques exprimant de telles toxines insecticides.

Par exemple le document WO 99/54472 décrit des toxines insecticides isolées de Xenorhabdus nematophilus, et des séquences nucléotidiques codant pour de telles toxines.

Le document US 6 281 413 décrit des toxines insecticides isolées de Photorhabdus luminescens. Photorhabdus luminescens est une bactérie entomopathogène, commensale intestinale d'un nématode du genre Heterorhabditis. Ces nématodes colonisent les larves d'insectes qu'ils détruisent et sur lesquelles ils se développent.

Il existe toujours un besoin important de trouver des toxines efficaces contre les insectes nuisibles, en particulier contre des diptères (moustiques notamment) et des lépidoptères. L'invention vise à obtenir des plantes et/ou des compositions contenant de telles toxines capables d'inactiver ou de détruire des insectes ravageurs des plantes cultivées ou des insectes nuisibles vecteurs d'agents pathogènes pour l'homme, les animaux ou les plantes. L'invention vise également l'utilisation de

telles toxines, pour des traitements-préventifs ou curatifs- des cultures contre des ravageurs.

A cet effet, les inventeurs ont réussi à identifier à l'aide d'une banque de BAC (chromosome artificiel bactérien), préparée à partir de Photorhabdus luminescens, des séquences nucléotidiques codant pour des toxines insecticides particulièrement efficaces contre des diptères, notamment les espèces de moustiques Aedes aegypti, Culex pipiens, Anopheles gambiae et Anopheles stephensie, et des lépidoptères notamment du genre Plutella.

A cet effet l'invention a pour objet selon un premier aspect une séquence nucléotidique isolée de Photorhabdus luminescens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.

La séquence SEQ ID N 2 correspond aux nucléotides nt 8113 à nt 8514 de la séquence SEQ ID N 1 qui est la séquence nucléotidique d'un BAC, désigné BAC 1A2, déposé le 12 juillet 2001 à la CNCM sous le numéro 1-2699. Le BAC1A2 est un fragment d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens subsp.laumondii, souche TT01 (Fischer-Le Saux M. et al. 1998. Appl. Environ. Microbiol., vol 64, 4246), cloné dans le vecteur pBeloBAC11(Kim V.J. et al. 1996. Genomics, vol 34, 213) dans la bactérie E .coli DH10B TH (Calvin N. M. and Hanawalt P. C, 1998, J.

Bacteriol., 170, 2796).

La séquence SEQ ID N 4 correspond aux nucléotides nt 8544 à nt 9803 de la séquence SEQ ID N 1de ce BAC 1 A2.

L'invention concerne également les séquences nucléotidiques choisies parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70% d'identité avec
SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie en a) ou b) ; d) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), b) ou c), d'au moins 10, de préférence au moins 20 paires de base ;

e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c) , d) ou e) ; ladite séquence codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.

Dans le présent document, on utilisera l'expression séquence nucléotidique à expression insecticide pour désigner ces séquences nucléotidiques SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, et les séquences variants définies en a) à f).

La séquence SEQ ID n 2 correspond à un cadre ouvert de lecture désigné ORF1 et code pour la protéine de 133 acides aminés de séquence SEQ ID N 3.

La séquence SEQ ID N 4 correspond à un cadre ouvert de lecture désigné ORF2 et code pour la protéine de 419 acides aminés de séquence SEQ ID N 5.

Les séquences SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 se distinguent nettement de l'art antérieur. Aucune similarité significative n'a été identifiée, en utilisant par exemple le programme BESTFIT connu de l'homme du métier, entre ces séquences et les séquences SEQ ID N 12,13,14 du document US 6 281 413.

Seule une faible similarité (toujours inférieure à 50%) entre la séquence SEQ ID N 3, et les protéines codées par l'ORF 1 du document W099/54472 (SEQ ID N 2, SEQ ID N 5, SEQ ID N 9, SEQ ID N 13) a été notée.

De même, seule une faible similarité (toujours inférieure à 50%) entre la séquence SEQ ID N 5, et les protéines codées par l'ORF 2 du document W099/54472 (SEQ ID N 3, SEQ ID N 7, SEQ ID N 11, SEQ ID N 14) a été notée.

Par l'expression activité insecticide ou composé actif contre des insectes , on entend que les toxines sont capables de lutter contre des insectes, en les tuant ou en les inactivant par exemple par une baisse ou une perte d'appétit vis-à-vis des plantes d'intérêt cultivées. Le résultat est typiquement la destruction, ou la baisse de croissance et/ou de la reproduction de l'insecte nuisible cible. Par insecticide , on entend également biopesticide .

La liste d'insectes ci-dessus (diptères, notamment les espèces de moustiques du appartenant au genres Aedes, Culex, Anopheles, et lépidoptères notamment Plutella) n'est pas exhaustive : l'efficacité insecticide des séquences selon l'invention sur d'autres insectes peut être criblée sans effort excessif par l'homme du métier,

maintenant que sont connus le BAC 1 A2 et le protocole de test d'activité biologique, notamment à l'aide des techniques appropriées présentées dans la description détaillée, en particulier des exemples 2 et 3. Des tests semblables, utilisant par exemple une autre espèce d'insecte cible, permettent également de mesurer ladite activité insecticide.

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel, et sont naturels ou artificiels.

Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère des séquences nucléotidiques comprenant SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 (en particulier qui diffère des séquences SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4) par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues possèdent une activité insecticide telle que décrite précédemment. De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 70,75 % des séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, de préférence au moins 80, 85 %, de préférence encore au moins 90,92, 95, 98,99%.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après leur meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans le document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics : A trends Guide, 1998 :5 : 7-9, notamment les algorithmes de Karlin et Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modifié dans Karlin et Altschul (1993)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877. pourra utiliser en particulier les programmes : -BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucleotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.

25(17) :3389-3402), -FASTA (Altschul S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410), -Clustal W (Thompson, J. D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 4673-80), -BESTFIT.

L'algorithme BLAST est décrit en détail sur le site du NCBI http :ww.ncbi.nih.gov.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire d'une séquence codant pour une toxine insecticide, dans des conditions stringentes. On utilisera par exemple les conditions suivantes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20mM, pH 7,5) contenant 5X SSC (IX SSC correspond à une solution 0.15M NaCl + 0. 015 M de citrate de sodium), 50% de formamide, 7% de sodium dodecyl sulfate (SDS), 10X de solution de Denhardt's, 5% de dextran sulfate et 1% d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (par exemple 42 C pour une sonde de taille supérieure à 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2X SSC + 2% SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0.1X SSC + 0.1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0.1X SSC + 0. 1% SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille supérieur à 100 nucléotides.

Les conditions d'hybridations de fortes stringences décrites ci-dessus peuvent être adaptées par l'homme du métier pour les polynucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon les enseignements appropriés connus de l'homme du métier, notamment décrit dans Sambrook et al., (1989, Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. CSH, N. Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions et dans Ausubel et al., Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N.Y.)

Par fragment nucléotidique , on entend d'une part tout fragment d' une séquence nucléotidique comprenant SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 (en particulier tout fragment de SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4), ou tout fragment de séquences homologues à ces séquences, lesdits fragments codant pour un peptide à activité insecticide telle que définie précédemment. Ces fragments nucléotidiques présentent au moins 10 nucléotides, de préférence au moins 10,15, 30,45, 75,150, 300 nucléotides consécutifs de la séquence dont ils sont issus. Ces fragments nucléotidiques codent pour des peptides présentant une activité insecticide de préférence d'au moins 10, 20, 30, 50, 80,90%, voire plus de 100%, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5 codées par les séquences à expression insecticide SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4. Pour tester cette activité insecticide, l'homme du métier dispose notamment de la méthode présentée dans les exemples détaillés décrits ci-après. Le présent document enseigne ainsi à l'homme du métier d'utiliser également les fragments ou les homologues définis précédemment, notamment d'utiliser les éléments fonctionnels de ces séquences qui déterminent l'expression insecticide, et donc de ne pas utiliser nécessairement les éléments non essentiels à cette expression.

L'invention concerne ainsi selon un aspect les séquences nucléotidiques qui comprennent au moins un tel fragment et ont une activité insecticide.

Par fragments représentatifs selon l'invention on entend également des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. Ces procédés peuvent faire intervenir des techniques d'amplification du type PCR (décrite par exemple dans le document US 4,683,202) ou PCR like, comme par exemple les techniques connues de l'homme du métier SDA (Strand Displacement Amplification), TAS (Transcription-based Amplification System), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) LCR (Ligase Chain Reaction). Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant au moins 8 bases, de préférence au moins 10,15, 30 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible.

De telles sondes seront en particulier utilisables dans des programmes de sélection assistée par marqueur, par exemple pour suivre l'intégration du gène de la toxine

dans la plante transformée. Pour cela au moins une de ces sondes est marquée, par exemple par un isotope radioactif, puis mise en contact avec de l'ADN génomique de la plante, préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de la sonde marquée à l'ADN en question.

Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue typiquement par mutagénèse selon des techniques appropriées, et comportant des modifications par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, ou les séquences variantes (séquences nucléotidiques définies a) à e) précédemment). Ces modifications peuvent entraîner selon une variante préférée une augmentation du niveau d'expression insecticide. On peut par exemple utiliser la mutagenèse dirigée site spécifique, décrite dans Upender et al., 1995, Biotechniques 18(1):29-30, ou des techniques de mutagénèse du type DNA shuffling décrite dans le document US 5 605 793. On peut par exemple obtenir des séquences mutées de SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, par délétions, et cribler des mutants actifs pour identifier des régions toutes particulièrement associées au niveau d'activité insecticide.

L'invention concerne selon un autre aspect un polypeptide insecticide codé par une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment.

L'invention concerne également les polypeptides choisis parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins
80 %, de préférence au moins 85 %, 87 %, 90 %, 95 % , 97 % 98 %, 99 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15,20, 23,25, 30,40, 50,100 amino-acides consécutifs d'un polypeptide défini en a), ou b); d) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a), b), ou c) ; ledit polypeptide ayant une activité insecticide telle que décrite précédemment.

On emploie dans ce texte indifféremment le terme polypeptide insecticide ou toxine insecticide pour désigner un polypeptide selon l'invention ayant une activité insecticide telle que décrite précédemment. Le terme polypeptide est utilisé pour désigner également une protéine ou un peptide.

De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 après alignement optimal. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d' identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.

Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimum 10 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 15,20, 25,30, 40,50, 100 amino-acides consécutifs. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention.

Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés équivalents .

L'expression acide aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles souhaitées, en l'occurrence n'entraînant pas une perte de l'activité insecticide. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s' appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides

mutés pouvant exister naturellement, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides. Un polypeptide variant, un polypeptide homologue ou un fragment de polypeptide selon l'invention possède au moins 10 %, de préférence au moins 20,30, 50, 80 , 90%, voire plus de 100,120, 150%, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5.

L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides tels que décrits précédemment.

Dans le présent document, les expressions isolé et purifié se réfèrent à un niveau de pureté réalisable en utilisant les connaissances actuelles de l'homme du métier.

Les molécules selon l'invention n'ont pas besoin d'être absolument pures (c'est à dire ne contenant absolument aucune molécules autres que des macromolécules cellulaires), mais devraient être suffisamment pures de sorte que l'homme du métier identifie qu'elles ne sont plus présentes dans l'environnement dans lequel elles ont été initialement trouvées (le milieu cellulaire).

L'invention concerne selon un autre aspect une cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle dans la plante transformée à une séquence nucléotidique selon l'invention codant pour une toxine insecticide, et à région de terminaison de la transcription. La préparation d'une cassette d'expression ADN peut être réalisée de différentes manières appropriées par l'homme du métier.

Par exemple, au moins une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que définie précédemment, peut être clonée en aval du promoteur en utilisant des enzymes de restriction pour assurer son insertion dans une orientation appropriée au regard du promoteur de manière qu'il soit exprimé. Une fois cette séquence d'intérêt liée opérationnellement au promoteur, la cassette d'expression ainsi formée peut être clonée dans un plasmide ou autre vecteur. La séquence promoteur contrôle la transcription en un ARN messager fonctionnel codant pour une protéine insecticide.

La cassette d'expression peut être chimérique ou naturelle, mais typiquement elle est hétérologue vis-à-vis de l'hôte, ce qui implique l'introduction dans l'hôte par une transformation. On connaît un grand nombre de promoteurs de plantes, rappelés notamment dans le document W001/70778. On peut utiliser un promoteur constitutif

ou inductible, un promoteur spécifique d'un tissu, d'un organe, d'un stade de développement, par exemple spécifique du phloème afin de lutter contre des insectes qui prélèvent la sève élaborée.

Selon un mode de réalisation l'expression du gène d'intérêt est régulée, en plus de par la séquence promoteur, par l'utilisation de séquences appropriées capables de renforcer l'activité de cette séquence promoteur, telles que des introns, par exemple l'intron de l'actine 1 ou 2, l'intron DSV de la mosaïque jaune du tabac (Morris et al.

(1992), Virology, 187 :633), des séquences enhancers , par exemple certains éléments du promoteur CaMV35S et de gènes de l'octopine synthase (US 5 290 924), des séquences leaders (typiquement des séquences situées entre le site d'initiation de la transcription et le début de la séquence codante, en particulier des séquences leader consensus qui stabilisent l'ARNm et empêchent une initiation inappropriée de la transcription), par exemple le leader EMCV (Leroy-Stein et al., 1989, PNAS USA, 86 : 6126-6130), le leader TMV (Gallie et al., 1989, Molecular Biology of RNA, pages 237-256). Parmi les séquences terminateurs, on peut citer le terminateur nos (Bevan et al.,1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), et le terminateur de gène d'histone (EPO 633 317).

Selon une variante, la cassette d'expression contient des séquences d'adressage subcellulaire, en particulier une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion de la protéine, ou une séquence codant pour un peptide de transit adressant la toxine dans les chloroplastes (par exemple le peptide de transit optimisé décrit dans le document EP 0 508 909).

Selon un autre aspect l'invention concerne un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une cassette d'expression telle que décrite précédemment. Selon une réalisation le vecteur est un type virus et comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'invention, liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié.

Selon un autre aspect l'invention concerne une cellule hôte transformée avec les séquences nucléiques décrites ci-dessus.

Selon un autre aspect l'invention concerne une cellule hôte comprenant une telle cassette d'expression. Typiquement l'organisme hôte est une bactérie, une levure, une cellule de plante, un champignon.

Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide mettant en #uvre au moins un vecteur ou une cellule tels que décrits précédemment. L'invention concerne aussi un polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par ce procédé.

Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide synthétique utilisant une séquence d'acides aminés d'un polypeptide insecticide tel que défini précédemment.

Selon un autre aspect l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique, d'un vecteur, d'une cellule hôte tels que décrit précédemment pour la biosynthèse de polypeptides insecticides. Le terme une fait bien entendu référence à au moins une .

Selon un autre aspect l'invention concerne les séquences nucléotidiques selon l'invention, enregistrées sur un support, dénommé support d'enregistrement, dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et l'exploitation desdites séquences.

On pourra préférer parmi ces supports des supports lisibles par un ordinateur, tels que les supports magnétiques, optiques, électriques ou hybrides comme par exemple les disquettes ou disques floppy , les CD ROM ou les cassettes d'enregistrement.

Selon un autre aspect l'invention concerne les cellules végétales transformées par un vecteur tel que défini précédemment, à l'aide d'un tel hôte cellulaire susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques promoteur initialement contenues dans le génome du vecteur utilisé.

La transformation des plantes peut être obtenue par différentes techniques appropriées connues de l'homme du métier, notamment rappelées dans les références : Ed. DUNOD Physiologie végétale, Tome 2 Développement Heller, Esnault et Lance, 2000, Methods of Molecular Biology : Plantgene transfer and expression protocols, Hansen et al., 1999, Recent advances in the transformation of plants, Trends in plant science, vol 4, n 6, 226, S.B.Gelvin, The introduction and expression of transgenes in plants, Current opinion in biotechnology, 1998,227, Hellens et al., 2000, Trends in plant science, vol 5, n 10, A guide to Agrobacterium binary Ti Vectors, 446, Franken et al., Recombinant proteins from transgenic plants, Current opinion in biotechnology, 8 :411-416, et al., 1998, Insect-resistant

transgenic plants, Tibtech, vol 16,168, Michelmore. M, 2000, Genomic approaches to plant disease résistance, Current opinion in biotechnology, 3:125-131.

Le terme transformation fait référence à une manipulation génétique de cellules végétales susceptibles d'être transformées tels que des cellules de cals, d'embryons, des cellules en suspension dans des cultures (cultures issues par exemple de cals, d'embryons, de tissus de feuilles, d'inflorescences jeunes, d'anthères) des plantes. Le terme "transgénique" ou "transformée" en référence à une cellule de plante, une partie de plante, fait référence à ces éléments comprenant un segment d'ADN (de manière préférée une séquence nucléotidique ou une cassette d'expression selon l'invention) présélectionné isolé purifié qui a été introduit dans ledit élément par une méthode de transformation génétique.

On citera notamment : la transformation de protoplastes, les techniques biolistiques ou de bombardement de microprojectiles, la transformation à l'aide de bactéries notamment d'Agrobacterium ou de vecteurs viraux, des procédés directement in planta.

Dans le cas d'une transformation de protoplastes, les protoplastes sont typiquement isolés, soit mécaniquement, soit par voie enzymatique pour séparer les parois cellulaires. Les protoplastes sont obtenus typiquement à partir de lignées cellulaires de cals obtenus d'embryons immatures, d'inflorescences immatures, de mésocotyles, d'anthères. Les protoplastes peuvent être transformés par Agrobacterium ou par insertion directe d'ADN facilitée par un traitement au polyéthylène glycol ou par électroporation (Lazzeri, Methods Mol Biol., 49:95-106,1995). Dans certaines espèces, on peut isoler les protoplastes de mésophylles, méthode qui permet d'obtenir des résultats indépendants du génotype.

Parmi les méthodes biolistiques rappelées dans Finer et al., T. Particle bombardmentmediated transformation, Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol.

240, on pourra utiliser notamment le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt, en particulier en utilisant un canon à particules de tungstène ou d'or .

On pourra préférer aux méthodes biolistiques des méthodes agrolistiques décrites dans Hansen et al. Agrolistic transformation of plant cells : intégration of T-strands

generated in planta. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93 : 14978-14983, notamment afin d'intégrer un faible nombre de copies du transgène.

De nombreuses techniques de transformation utilisant Agrobacterium sont utilisables, telles que celles décrites dans le document Zupan, J. et al. (2000) The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants : a feast of fondamental insights. Plant J. 23 :11-28, US 6 037 522, US 6 265 538. La transformation par Agrobacterium tumefaciens peut être effectuée pour des Dicotylédones (tabac, pomme de terre) et des Monocotylédones (blé, orge, sorgho, maïs, riz notamment) mêmes si ces dernières ne sont généralement pas leur hôte naturel. On utilisera notamment des techniques connues pour le blé (McCormac et al., Euphytica, vol 99(1) : 17-25,1998), le maïs (Ishidia et al., 1996, Nat Biotechnol.,14(6) :745-750,1996).

En outre, dans la mesure où l'intégration des gènes se fait essentiellement au hasard dans le génome, on observe souvent une variabilité entre les plantes transgéniques.

On cherchera à obtenir de préférence des transformants comprenant une copie unique du transgène, ségrégée comme un caractère mendélien avec une expression uniforme d'une génération à la suivante. On recherche ainsi une expression stable du transgène avec un niveau d'expression souhaité.

L'homme du métier connaît un grand nombre de plasmides utilisables dans le cadre de l'invention, rappelés notamment dans le document Trends in plant science oct 2000 vol 5 n 10 p 446, et adaptera les conditions de transformation au plasmide utilisé. On pourra par exemple utiliser de manière préférée, certains plasmides Ti binaires, tels que pBIN19, pMON, pGREEN, dont la séquence accessible permet la définition de cartes de restriction précise.

La transformation dite in planta, décrite notamment dans Bechtold et al.,1993, In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C. R. Acad. Sci, Paris, Life Sciences 316, 1194-1199, et Clough et al, 1998, Floral dip : simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16,735-743, a l'avantage de ne pas nécessiter d'étape de culture de tissus. Le transgène est introduit dans des plantes intactes sous forme d'ADN nu ou par Agrobacterium, généralement au stade de la formation du zygote.

Les techniques et les agents pour sélectionner les cellules végétales et/ou les tissus végétaux incorporant des séquences nucléotidiques marqueurs associées au gène d'intérêt sont également bien connues de l'homme de métier, et comprennent, de manière non exclusive, l'utilisation de gènes marqueurs tels que des gènes conférant des résistances à un antibiotique ou à des herbicides, ou de systèmes de sélection positive, cités par exemple dans Gelvin 1998, en particulier le système basé sur une sélection sur mannose, en présence du gène de sélection de la MPI (Mannose-6phosphate isomérase) (Hansen et Wright, 1999), ou de systèmes de sélection couplés à l'élimination des gènes marqueurs après sélection (Ebinuma et al., 1997). Enfin, les plantes transformées peuvent également être sélectionnées par criblage PCR en l'absence de gènes marqueurs de sélection (McGarvey et Kaper, 1991).

Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine insecticide selon l'invention dans ses tissus, comprenant l'introduction d'une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression. Ladite cassette est intégrée de manière stable dans le génome.

Selon une réalisation le procédé comprend en outre l'identification et la sélection des cellules transformées capables de régénérer des plantes exprimant des toxines insecticides par rapport à une plante non transformée.

La sélection de produits de la transformation, c'est-à-dire résultant immédiatement du processus de transformation, et des plantes transgéniques en résultant, peut être réalisée de différentes manières. Les techniques de croissance de cultures de plantes sont connues de l'homme du métier, par exemple dans Mcormick, 1986, Plant Cell Reports, 5,80-84. L'ADN recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique selon l'invention est transmis au cours d'un cycle de reproduction de la plante transgénique à sa descendance de manière à être exprimé dans les plantes de la descendance. L'invention concerne donc également les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines contenant les séquences d'acide nucléique selon l'invention décrites précédemment. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes

entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules et analogues sont également dans le cadre de l'invention.

Les tissus, parties de plantes, plantes ou graines, sont résistants aux insectes.

L'invention inclut les plantes transgéniques fertiles obtenues ainsi que leur descendance et le produit de cette descendance. Les plantes transgéniques hybrides, obtenues par le croisement d'au moins une plante selon l'invention avec une autre, font aussi partie de l'invention. Les plantes transgéniques selon l'invention comprennent notamment une plante transgénique TO ou RO, c'est-à-dire la première plante générée à partir de cellules de plantes transformées, la plante transgénique Tl ou RI c'est-à-dire la première génération de descendance, et les plantes de la descendance de générations suivantes obtenues qui comprennent et expriment l'ADN recombinant. Par exemple, on procédera selon les étapes suivantes : - obtention de plantes parentes d'une première lignée, et d'une deuxième lignée (lignée donneuse comprenant un transgène selon l'invention) - pollinisation de fleurs du premier parent par le pollen du deuxième parent - récolte des graines produites par le premier parent.

On peut effectuer des backcross afin d'obtenir l'introgression de l'ADN insecticide d'intérêt.

Pour confirmer la présence de la cassette d'expression, et en particulier du gène de toxine d'intérêt selon l'invention dans les plantes régénérées, on peut utiliser un grand nombre de techniques appropriées, par exemple l'analyse PCR ou des techniques d'hybridation Southern blot, pour déterminer la structure de l'ADN recombinant, la détection de l'ARN transcrit à partir de l'ADN du gène d'intérêt exprimé dans des cellules de plantes transformées, des techniques de repérage de la production de protéines codées par le gène d'intérêt, telles que l'électrophorèse de protéines sur gel, des techniques Western blot.

Les plantes transformées selon les méthodes décrites peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, la pomme de terre, le pois, le soja, le tabac, le colza, la tomate, le tournesol, le coton,

le riz, le haricot, le chou-fleur, le brocoli, la laitue, le radis, le céleri, l'épinard, l'oignon, l'ail, la carotte, la pomme, la poire, le melon, la cerise, la pêche, l'abricot, la framboise, la fraise, l'ananas, l'avocat, la banane, la canne à sucre.

L'homme du métier sera en outre capable d'augmenter le niveau de production par les plantes transformées en augmentant le contenu en base GC des séquences codantes. En outre l'homme du métier utilisera des séquences le cas échéant modifiées pour obtenir une expression appropriée selon qu'il s'agisse de plantes monocotylédones ou dicotylédones.

Selon un autre aspect l'invention a pour objet une composition pour la lutte contre des insectes nuisibles ainsi que des procédés mettant en #uvre de telles compositions, ces compositions comprenant au moins une toxine insecticide ou composé insecticide selon l'invention telle que décrite précédemment.

Par composition insecticide, on entend une composition phytosanitaire ou pharmaceutique comprenant comme matière active une quantité efficace de toxine insecticide selon l'invention. Dans l'utilisation pour la protection de cultures, les compositions seront typiquement en association avec un support solide ou liquide, acceptable en agriculture et/ou un agent tensioactif également acceptable en agriculture. Dans le domaine pharmaceutique, les moustiques étant vecteurs de maladies pour l'homme et les animaux, les compositions pharmaceutiques comprendront les transporteurs pharmaceutiquement acceptables appropriés associés à la toxine insecticide. De tels transporteurs sont connus de l'homme du métier, par exemple décrits dans le document US 5 877 322.

Au sein des différentes variantes de compositions insecticides pour la protection des cultures selon la présente invention, le composé insecticide est mis en #uvre dans des quantités efficaces mais non phytotoxiques. Par quantité efficace et non phytotoxique, on entend une quantité de matière active suffisante pour permettre le contrôle ou la destruction des insectes présents ou susceptibles d'apparaître sur les cultures, et n'entraînant pour lesdites cultures aucun symptôme notable de phytotoxicité. Une telle quantité est susceptible de varier dans de larges limites selon l'insecte à combattre, le type de culture, les conditions climatiques, et les composés compris dans la composition insecticide selon l'invention. Cette quantité peut

aisément être déterminée par des essais systématiques au champ, à la portée de l'homme du métier.

Selon une réalisation, une composition insecticide comprend au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment.

Pour leur emploi dans la pratique, les différentes compositions insecticides selon l'invention sont typiquement associées à un support, solide ou liquide, utilisable dans le domaine de l'agriculture, et éventuellement à au moins un agent tensioactif et/ou un ou plusieurs agents auxiliaires.

En particulier, comme supports, sont utilisables les supports inertes et usuels ; de même que, comme agents tensioactifs, sont utilisables les agents tensioactifs usuels dans le domaine de la mise en formulation de compositions destinées à des usages en agriculture, notamment pour le traitement ou la protection des cultures.

Les compositions insecticides selon l'invention comprennent typiquement entre 0,00001 et 100%, de préférence entre 0,001 et 80%, de composé insecticide. Les proportions et pourcentages employées ou décrits dans ce texte sont des proportions ou pourcentages en poids.

Par le terme support, dans le présent exposé, on désigne une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle la matière active est associée pour faciliter son application, notamment sur la plante, ou encore sur des graines ou sur le sol. Ce support est donc généralement inerte et il doit être acceptable en agriculture, notamment par la plante traitée. Le support éventuellement mis en #uvre pour la formulation de compositions selon l'invention peut être solide ou liquide.

Comme exemples de supports solides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner les silicates naturels ou synthétiques, les résines, les cires, les poudres fines ou les granules d'argile, notamment d'argile kaolinique, de terre de diatomées, de bentonite ou d'argile acide, l'oxyde de silicium hydraté synthétique, les talcs, les céramiques, d'autres minéraux dont la séricite, le quartz, le soufre, le charbon actif, le carbonate de calcium, la silice hydratée, ou encore les engrais industriels comme le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'urée ou le chlorure d'ammonium.

Comme exemples de supports liquides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner l'eau, les alcools et notamment le

méthanol ou l'éthanol, les cétones et notamment l'acétone, la méthyléthylcétone ou la cyclohéxanone, les fractions de pétrole, les hydrocarbures aromatiques dont le benzène, le toluène, le xylène, l'éthylbenzène ou le méthylnaphtalène, les hydrocarbures non aromatiques dont l'hexane, le cyclohexane, le kérosène ou le gazole, le gaz liquéfié, les esters dont l'acétate d'éthyle et l'acétate de butyle, les nitriles dont l'acétonitrile et l'isobutyronitrile, les éthers dont l'éther diisopropylique ou le dioxanne, les amides dont le N,N-diméthylformamide ou le N,Ndiméthylacétamide, les hydrocarbures halogénées dont le dichlorométhane, le trichloroéthane ou le tétrachlorure de carbone, le diméthylsulfoxyde, les huiles végétales dont l'huile de soja ou l'huile de coton.

L'agent tensioactif peut être un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique On peut, par exemple, citer des sels d'acides polyacryliques, des sels d'acides lignosulfoniques, des sels d'acides phénolsulfoniques ou naphtalènesulfoniques, des polycondensats d'oxyde d'éthylène sur des alcools gras ou sur des acides gras ou sur des amines grasses, des phénols substitués, notamment des alkylphénols ou des arylphénols, des sels d'esters d'acides sulfosucciniques, des dérivés de la taurine, notamment des alkyltaurates, des esters phosphoriques d'alcools ou de phénols polyoxyéthylés ; on peut tout particulièrement citer les sels d'alkylsulfonates, les alkylarylsulfonates, les éthers alkylaryliques, leurs dérivés polyoxyéthyléniques, les polyéthylèneglycoléthers, les esters de polyalcools, les dérivés de sucres, alcools et autres.

La présence d'au moins un agent tensioactif est généralement appropriée lorsque au moins une des matières actives et/ou le support inerte ne sont pas solubles, notamment dans l'eau, dans le cas où l'agent vecteur de l'application est l'eau.

Les compositions insecticides selon l'invention peuvent également contenir toute sorte d'autres ingrédients ou agents tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des agents épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des agents stabilisants dont le phosphate acide d'isopropyle, le 2,6-ditert-butyl-4-méthylphénol, le 2-tert-butyl-4-méthoxyphénol et le 3-tert-butyl-4méthoxyphénol, des huiles végétales ou minérales, des acides gras ou leurs esters, des agents séquestrants, des agents dispersants dont la caséine, la gélatine, des

saccharides et notamment la poudre d'amidon, la gomme arabique, certains dérivés de la cellulose ou l'acide alginique, des dérivés de la lignine, la bentonite, des polymères synthétiques solubles dans l'eau, notamment l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les acides polyacryliques, etc., ainsi que d'autres matières actives connues pour leurs propriétés pesticides, notamment insecticides ou fongicides ; ou pour leurs propriétés favorisant la croissance des plantes, notamment des engrais ; ou pour leurs propriétés régulatrices de la croissance des plantes ou des insectes.

Plus généralement le composé insecticide peut être associé à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation, particulièrement la mise en formulation de produits ou compositions destinées à des usages ou à des utilisations en agriculture ou en hygiène publique.

Ainsi, les compositions selon l'invention peuvent prendre la forme d'assez nombreuses formulations parmi lesquelles on peut citer les solutions huileuses, les concentrés émulsionnables, les poudres mouillables, les formulations fluides et notamment les suspensions aqueuses ou les émulsions aqueuses, les granulés, les poudres, les aérosols, les formulations pour nébulisation notamment les formulations pour brumisation, les formulations à très bas volume, les pâtes, les émulsions, les suspensions concentrées, de même que d'éventuels mélanges, associations ou combinaisons de ces différentes formes.

Le plus souvent, pour les formulations de type poudres pour poudrage ou dispersion, la teneur en composé insecticide peut aller jusqu'à 100%; de même, pour les formulations sous forme de granulés, notamment ceux obtenus par extrusion, par compactage, par imprégnation d'un support granulé, par granulation à partir d'une poudre, la teneur en composé insecticide dans ces granulés est le plus souvent comprise entre 0,5 et 80%.

Les compositions insecticides selon l'invention, dites compositions concentrées, comprenant un composé insecticide qui sont sous forme de concentrés émulsionnables ou solubles comprennent le plus souvent de 25 à 100% de matières actives, les émulsions ou solutions prêtes à l'application contenant, quant à elles, de 0,00001à 20% de matières actives.

Selon une réalisation, la matière active A est combinée le cas échéant à au moins une autre matière active ou composé insecticide issue de Photorhabdus luminescens ou d'autres microorganismes.

En plus du solvant, les concentrés émulsionnables peuvent contenir, lorsque c'est nécessaire, 2 à 20% d'additifs appropriés tels les agents stabilisants, les agents tensioactifs, les agents de pénétration, les inhibiteurs de corrosion, les colorants ou les adhésifs précédemment cités.

Les compositions insecticides selon l'invention sous forme de suspensions concentrées, également applicables en pulvérisation, sont préparées de manière à obtenir un produit fluide, stable, ne se déposant pas ; elles contiennent habituellement de 2 à 75% de matière active, de 0,5 à 15% d'agents tensioactifs, de 0,1 à 10% d'agents thixotropes, de 0 à 10% d'additifs appropriés, comme des agents anti-mousse, des agents inhibiteurs de corrosion, des agents stabilisants, des agents de pénétration et des adhésifs ; et, comme support, de l'eau ou un liquide organique dans lequel la, ou les, matière active est peu ou pas soluble, ou encore des mélanges de plusieurs de ces solvants, organiques ou non.

Certaines matières organiques solides ou des sels minéraux peuvent être dissous dans le support pour freiner ou interdire la sédimentation ; ou bien encore de telles matières peuvent être employées comme agents antigels pour l'eau.

Les compositions insecticides selon l'invention qui prennent la forme de poudres mouillables ou à pulvériser sont habituellement préparées de sorte qu'elles contiennent de 20 à 95% de matières actives.

Par ailleurs, elles contiennent habituellement, outre un support solide, de 0 à 5% d'un agent mouillant, de 3 à 10% d'un agent dispersant, et, le cas échéant, de 0 à 10% d'un ou plusieurs agents stabilisants et/ou autres additifs, comme des agents de pénétration, des adhésifs, ou des agents anti-mottants, colorants, etc.

Pour obtenir ces poudres à pulvériser ou poudres mouillables, sont intimement mélangées la ou les matières actives dans des mélangeurs appropriés avec les substances additionnelles, et on les broie avec des moulins ou autres broyeurs appropriés. On obtient alors des poudres à pulvériser dont la mouillabilité et la mise en suspension sont particulièrement avantageuses.

On peut les mettre en suspension avec de l'eau à toute concentration désirée.

Plutôt que des poudres mouillables, on peut réaliser des compositions insecticides selon l'invention qui soient sous forme de pâtes.

Les conditions et modalités de réalisation et d'utilisation de ces pâtes sont similaires à celles des poudres mouillables ou à pulvériser.

Comme cela a déjà été dit, les dispersions et émulsions aqueuses, par exemple les compositions insecticides obtenues en diluant à l'aide d'eau une poudre mouillable ou un concentré émulsionnable selon l'invention, sont comprises dans le cadre général de la présente invention.

Les émulsions peuvent être du type eau-dans-l'huile ou huile-dans-l'eau et elles peuvent avoir une consistance épaisse ou assez épaisse.

De manière plus générale, les compositions selon l'invention peuvent prendre de nombreuses formes de formulations ; ainsi on peut employer ces compositions comprenant un composé insecticide en générateur d'aérosol ; appât (prêt à l'emploi) ; concentré pour préparation d'appâts ; appât en stoc ; suspension de capsules ; produit pour nébulisation a froid ; poudre pour poudrage ; concentré émulsionnable ; émulsion de type aqueux/aqueuse ; émulsion de type huileux/inverse ; granulé encapsulé ; granulé fin ; concentrée pour traitement de semences ; gaz comprimé ; produit générateur de gaz ; sur grain ; appât granulé ; granulé ; produit pour nébulisation a chaud ; macrogranulé ; microgranulé ; poudre à disperser dans l'huile ; suspension concentrée diluable dans l'huile ; liquide miscible dans l'huile ; pâte ; bâtonnet à usage agropharmaceutique ; appât en plaquette ; poudre pour traitement de semences à sec ; appât sur brisures ; semences traitées ou enrobées ; bougie fumigène ; cartouche fumigène ; fumigène ; granulé fumigène ; bâtonnet fumigène ; comprimé fumigène ; boite fumigène ; concentré soluble ; poudre soluble ; liquide pour traitement de semences ; suspension concentrée (= concentré fluidifiable) ; de piste ; liquide pour application à très bas volume ; suspension pour application à très bas volume ; produit diffuseur de vapeur ; granulés ou comprimés à disperser dans l'eau ; poudre mouillable pour traitement humide ; granulés ou comprimés solubles dans l'eau ; poudre soluble pour traitement de semences ; poudre mouillable.

De nombreux exemples (notamment A à E) de compositions insecticides décrits dans le document FR2 805 971 peuvent être utilisées avec les toxines selon l'invention.

Par ailleurs, l'invention concerne un procédé de lutte contre des insectes comprenant l'application sur des plantes infectées par lesdits insectes d'une quantité efficace sur le plan insecticide d'une composition insecticide telle que décrite précédemment ou de vecteurs recombinants tels que décrits précédemment.

L'invention concerne également un procédé d'obtention de toxines insecticides comprenant : - l'obtention d'au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment, - la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'invention conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes ; - la collecte de toxines produites.

L'invention concerne également une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM sous la référence plbac 1 a2 CNCM 1-2699.

D'autres avantages de l'invention apparaîtront lors de la description détaillée qui suit.

On décrit la démarche globale utilisée pour l'obtention d'une banque de BAC testés ensuite pour leur activité entomotoxique, puis les modes opératoires de manière détaillée.

Dans un premier temps, la totalité de la séquence du génome de la bactérie entomopathogène Photorhabdus luminescens, souche TT01 a été identifiée (à l'exception de deux régions de séquences ambiguës). Plusieurs banques de fragments d'ADN génomique ont été construites selon des procédés décrits (L. Frangeul et al., 1999. Microbiology 145,2625-2634) et introduites par transformation chez Escherichia coli DH10B : une banque de petite taille (1 à 2 kb), une de taille moyenne (5 à 20 kb) et une banque BAC contenant des fragments de grande taille (50 kb en moyenne). L'approche choisie, de type "shotgun", implique le séquençage de fragments aléatoires de petite taille. Ces fragments ont été ensuite assemblés à l'aide des logiciels Phred et Phrap (développés par P. Green, Université de Washington) pour obtenir des séquences contiguës (contigs). Les extrémités séquencées de fragments de la banque de taille moyenne et celles de la banque BAC, et le séquençage de produits de PCR combinatoire, ont permis de relier ces

séquences contiguës et d'obtenir la séquence génomique, sous forme d'un contig de 5,7 Mb. Pour identifier des BAC présentant une activité insecticide, les inventeurs ont procédé en parallèle à deux méthodes.

Selon une première méthode, les inventeurs ont identifié par des recherches de similitude "in silico", à partir des séquences génomiques, des gènes potentiellement responsables d'une activité entomotoxique.

Selon une deuxième méthode, la banque BAC contenant des fragments d'ADN de Photorhabdus a été criblée en totalité afin d'identifier des clones d'Escherichia coli possédant une activité insecticide. Cette banque, construite à l'aide du vecteur pBeloBACl 1, a été déposée (CNCM n 1-2478) le 12 juillet 2001.

Les inventeurs ont ainsi réussi à identifier un clone, désigné BAC1A2, ayant une activité entomotoxique.

On décrit maintenant de manière détaillée les modes opératoires utilisés pour le séquençage et l'analyse du génome de Photorhabdus luminescens en particulier du BAC1A2 (EXEMPLE 1), et les tests d'activité entomopathogène sur les larves notamment d'Aedes (EXEMPLE 2), de Culex (EXEMPLE 3), de Plutella (EXEMPLE 4).

EXEMPLE 1 : séquençage et analyse du génome de Photorhabdus luminescens Les inventeurs ont utilisé l'ADN de la souche TT01 de Photorhabdus luminescens pour entreprendre le séquençage de son génome dont la taille est de 5,7 millions de paires de bases. Différentes banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens ont été construites à ces fins. A partir de clones de ces différentes banques 65 000 lectures de séquences d'environ 500 paires de bases de qualité ont été réalisées - correspondant à une couverture de 7 fois la longueur du génome-, couvrant ainsi environ 98-99 % de ce génome avec des séquences non redondantes.

L'assemblage de ces séquences à l'aide d'outils informatiques (Ewing B. et al., 1998. Genome Res. 8,175-185; Ewing B. & Green P. 1998. Genome Res. 8 , 186- 194 ; Gordon et al. 1998. Genome Res. 8, 195-202 ; Contigs-Tool-Box, L. Frangeul et al., Résultats non publiés, Laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes, Institut Pasteur, Paris) a permis d'obtenir environ 450 contigs (séquences contiguës), le but final étant de relier ces contigs pour obtenir un contig

de 5 681 324 paires de base correspondant à la séquence génomique totale de Photorhabdus luminescens.

Les contigs obtenus ont été reliés à l'aide de différentes techniques brièvement résumées ci-dessous : - A l'aide de vecteurs à bas nombre de copies a été construit un "échafaudage" couvrant la totalité du génome. Afin de réaliser celui-ci, les inventeurs ont utilisé des banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens en particulier une banque construite à l'aide de vecteurs BAC (une copie par cellule) dont les tailles moyennes des fragments d'ADN insérés sont d'environ 50 kb. Le séquençage des extrémités de ces fragments permet la prédiction des liens entre contigs adjacents.

- La comparaison des extrémités des contigs obtenus avec le génome "témoin" d'une bactérie phylogénétiquement proche (Escherichia coli), dont la séquence est connue, a été utilisée pour prédire des liens entre contigs adjacents dans le génome étudié (Photorhabdus).

- Différentes techniques de PCR (PCR combinatoire, reverse PCR, la technique de "marche sur le chromosome") ont ensuite été utilisées pour combler les brèches entre contigs adjacents.

La banque d'ADN génomique a été obtenue dans le vecteur bactérien (pBeloBAC11, California Institute of Technology) selon les étapes suivantes : Etape 1 : culture bactérienne et moulage des bouchons - Ensemencement de 10 ml d'eau peptonée le soir avec une colonie unique de Photorhabdus luminescens, souche TT01 ; - Incuber une nuit avec agitation à 37 C ; - Mesure de la densité optique à 600 nm ; - Prélever un volume de culture contenant 2.109 bactéries sachant qu'une unité de DO équivaut à 5.108 bactéries/ml ; - Equilibrer chaque tube en ajoutant de l'eau peptonée stérile pour obtenir un volume final de 10 ml ; - Centrifuger les bactéries à 4 C pendant 20 min à 4000 rpm ; - Eliminer le surnageant et rependre le culot dans 5 ml de tampon de lavage ( 1 M NaCI, 1 OmM Tris-HCl pH = 7.6) ;

Centrifuger les bactéries à 4 C pendant 20 min à 4000 rpm ; - Jeter le surnageant et reprendre le culot dans 1ml de TE IX ; - Faire fondre l'agarose low melting point et le conserver à 55 C ; - Préparer les moules pour la réalisation des bouchons en fermant un côté avec du parafilm et en les mettant sur glace ; - Mélanger dans un tube eppendorf de 2 ml, 1 ml du culot repris dans 1ml de TE IX et 1 ml de l'agarose low melting point à 55 C ; - Bien homogénéiser le mélange et déposer 100 [il par moule. Laisser les bouchons 10 min sur la glace ; - Préparer la solution de Protéinase K. Pour une barrette de bouchon, préparer 5 ml de solution 0.5M EDTA/0.5% N-lauryl sarcosine avec 2mg/ml de la Protéinase K dans un tube falcon de 30 ml ( la Protéinase K doit être ajoutée juste avant l'utilisation) ; - Incubation overnight à 55 C sans agitation dans un bain sec ou un bain-marie ; - Sortir les tubes contenant les bouchons de l'étuve et les placer 15 min dans la glace ; - Ouvrir le tube et mettre l'égouttoir pour éliminer la solution de Protéinase K sans perdre les bouchons ; - Préparer la solution de PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride) en ajoutant 10 l PMSF/Isopropanol ( décongelé pendant 30 min à 55 C) dans 10 ml TE IX (préparée juste avant l'utilisation car le PMSF perd vite son activité en solution aqueuse) ; - Ajouter 5 ml de la solution PMSF/TE IX par tube et incuber 30 min a 55 C ; - Placer les bouchons pendant 15 min sur la glace ; - Ouvrir le tube et mettre l'égouttoir pour éliminer la solution de PMSF/TE IX; - Laver les bouchons en ajoutant 10 ml de TE IX pendant 20 min à température ambiante ; - Ouvrir le tube et mettre l'égouttoir pour éliminer le TE IX sans perdre les bouchons ; - Laver les bouchons encore 2 fois de la même façon avec TE IX ; - Pour la conservation des bouchons, vider les tubes et ajouter 10 ml d'ETDA 0.5 M pH 8 ; conservation à 4 C pendant plusieurs mois ;

- Si les bouchons sont utilisés tout de suite pour la restriction, on les conserve dans la solution de TE IX à 4 C pendant la nuit.

Etape 2 : digestion partielle de l'ADN dans des morceaux d'agarose - les morceaux d'agarose sont lavés trois fois pendant 15 minutes à température ambiante dans une solution de TE (lx) sous agitation modérée ; - on équilibre les morceaux d'agarose deux fois dans 300 III d'un tampon de digestion Hind III (lx) (Boehringer ou Biolabs) pendant 30 minutes à température ambiante ; - on enlève le tampon de digestion et on ajoute un tampon de digestion Hind III glacé (1 ml par morceau d'agarose) contenant 20 U de Hind III (Boehringer ou Biolabs) ; - on incube pendant deux heures dans de la glace ; - on transfère les morceaux d'agarose dans un bain-marie à 37 C et on incube pendant 10 minutes à 30 minutes (en fonction de l'ADN contenu dans les morceaux d'agarose) ; et - on arrête la digestion par addition de 100 III d'une solution d'EDTA 250 mM (pH 8).

Etape 3 : de la taille
Séparation de l'ADN partiellement digéré réalisée par PFGE au moyen de l'appareillage CHEF DRIII (Bio-Rad) : - gel d'agarose à 1% LMP dans un tampon Tris-acétate-EDTA (lx) à 13 C ; - inverser le courant chaque 3 à 15 secondes à 6 V/cm pendant 16 heures ; - charger au moins deux morceaux d'agarose et le marqueur ; - colorer le marqueur et une ligne ou une partie de la ligne pour vérifier la digestion partielle ; - exciser les bandes (partie non colorée) de différentes tailles (i. e. de 50 à 100 kb et de 150 à 250 kb) ; - les bandes d'agarose peuvent être stockées à 4 C dans une solution de TE.

Etape 4 : Préparation du vecteur

- isolement de pBeloBACl 11 par la méthode au chlorure de césium ; - digestion par Hind III ; - déphosphorylation avec CIP (Calf Intestine Phosphatase).

Etape 5 : ligation et transformation - les banques d'agarose contenant l'ADN sont fondues à 60 C pendant 10 minutes ; - on équilibre la solution fondue d'agarose/ADN pendant 15 minutes à 45 C ; - on ajoute de la gélase (Epicentre Technologies), à raison d'1 U pour 100 l de bande de gel (ne pas ajouter de tampon de digestion qui provoque certains problèmes au moment de la ligation) ; - on effectue la digestion pendant 1 heure à 45 C ; - on effectue la ligation dans 50 l d'une solution contenant pBeloBACII (2 l), de la ligase T4 (1 l à 1:10), un tampon T4 lOx (5ul), et la solution d'ADN/agarose (42 l), incubation 20 heures à 16 C ; - on chauffe le milieu de ligation pendant 15 minutes à 65 C ; - on dialyse le milieu de ligation contre un tampon Tris-EDTA en utilisant des membranes Millipore de taille de pore VS 0,025 mM ; - 1 ou 2 l de la solution de ligation sont introduites par électroporation dans les cellules E. coli DH10B (Gibco BRL) en utilisant des cuvettes d'électroporation de largeur 2 mm avec les réglages suivants 2,5 kV, 25 F et 200 Q ; - après électroporation on resuspend les cellules dans 600 III de milieu SOC ou NYZ puis on incube pendant 45 minutes à 37 C sous agitation ; - on étale 10 et 100 III de chaque suspension cellulaire dans un milieu agar LB contenant du chloramphénicol (12,5 ug/ml), X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- P -D-galactoside ; 50 ug/ml) et de l'IPTG (isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside ; 25 g/ml) ; et - on incube les boîtes ainsi obtenues pendant la nuit.

- la taille de l'insert moyen est de l'ordre de 50 kb.

Etape 6 : de l'ADN plasmidique et séquençage des inserts.

L'extraction de l'ADN plasmidique a été effectuée par la technique de lyse alcaline en plaques 24 puits.

Le séquençage des inserts des clones a été effectué par le KIT PE Big Dye selon les conditions préconisées par le fabricant en utilisant les oligonucléotides spécifiques de chaque vecteur.

Les réactions sont ensuite introduites dans le thermocycleur afin de subir 35 cycles composés des trois étapes suivantes : -Dénaturation 10 secondes à 96 C, -Hybridation 10 secondes à 50 C, -Élongation 4 minutes à 56 C.

On réalise ensuite une précipitation à l'éthanol à 76 % durant 20 minutes à température ambiante.

Les plaques sont ensuite centrifugées 35 minutes à 2200g puis égouttées sur papier absorbant puis centrifugées retournées sur du papier absorbant pendant 1 minute à 500g afin de ne laisser aucune trace d'éthanol.

Les culots d'ADN sont ensuite : - soit repris dans une solution de formamide-EDTA-bleu dextrane, puis dénaturés pendant 2 minutes à 96 C ; les plaques sont ensuite immédiatement mises dans la glace, un aliquot étant alors déposé sur gel d'acrylamide d'un séquenceur automatique PE-377 ; - soit repris dans une solution d'EDTA 0,3mM ; un aliquot étant alors automatiquement déposé dans un séquenceur automatique PE-3700.

Etape 7 : cartographie des clones BAC sur le génome de Photorhabdus luminescens Connaissant la presque totalité de la séquence du génome de la bactérie Photorhabdus luminescens, ainsi que les séquences des extrémités des inserts des clones des différentes librairies, les inventeurs ont effectué une cartographie permettant de positionner l'ensemble de ces clones sur le génome.

EXEMPLE 2 : tests d'activité entomopathogène sur les larves d'Aèdes, menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment.

1) Protocole utilisé

Pour le criblage de la banque de BACs, le test comprend tout d'abord deux étapes : Etape 1 : Les BACs sont cultivés dans des plaques comprenant 96 puits fermés par un parafilm dans un milieu LB (Luria-Bertani)/chloramphénicol à 12 ug/ml une nuit à 37 C, sous agitation à 250 rpm. Volume : 200 ul/puits.

Etape 2 :
Le jour suivant les plaques sont centrifugées à 1100 g pendant 10 minutes et le LB (qui est toxique pour les larves Aedes) est aspiré. 200 l d'eau stérile sont alors ajoutés.

Les bactéries peuvent alors se fixer et une mesure est effectuée de DO 595.

De même pour le criblage de BACs individuels, le test comprend deux premières étapes.

Etape 1 : Dans ce cas, la culture de BACs en flacon est effectuée sur LB/chloramphénicol la nuit jusqu'à ce que le log de la DO 595 soit d'au moins 1.

Etape 2 : Les bactéries sont alors centrifugées 10 minutes à 5000 rpm et le culot est lavé à l'eau distillée et à nouveau centrifugé. Les bactéries sont alors remises en suspension dans l'eau et échantillonnées en trois exemplaires (ou plus), dans des plaques de 96 puits.

Une série de dilution dans l'eau peut être effectuée pour évaluer l'activité potentielle de ces échantillons. La concentration maximale peut entraîner une D0595 de 1 (aller à l'étape 3).

L'évaluation d'activité peut être effectuée également sur des échantillons des bactéries congelées secs. Dans ce cas, les bactéries sont mises en culture, lavées à l'eau stérile, remises en suspension dans un petit volume d'eau et congelées.

Etape 3 : Suite à ces étapes 1 et 2, variant selon le type de criblage, on procède à l'étape 3.

Les #ufs d'Aedes aegypti sont agités dans l'eau pendant deux minutes ce qui entraîne leur éclosion. Environ 45 minutes après les larves nouvellement écloses sont

réparties dans chaque puit. Chaque puit comprend 10 lde cette solution de larves contenant 5 à 10 larves. La structure de la pipette est adaptée en conséquence.

Les variations dans le nombre de larves par puit n'est pas déterminant puisque si le BAC est toxique, les larves sont tuées et les bactéries ne sont pas détruites.

Etape 4 : On laisse les plaques à température ambiante et on mesure la DO 595 à différents moments après l'addition de larves d'Aedes, notamment à 24 heures et 48 heures. On voit à l'oeil nu si les larves se nourrissent de bactéries ou non. Généralement, l'altération de larves d'Aedes est constatée à environ 20 heures, la mort éventuelle entre 24 et 48 heures.

Etape 5 : mesure des résultats Comme contrôle positif on utilise des souches sauvages de Photorhabdus. Comme contrôles négatifs on utilise une souche E. coli DH10B (la souche utilisée pour les BACs) et un BAC témoin, c'est a dire la souche DH10B contenant le vecteur BAC sans fragment inséré.

2) Résultats Dans ces essais sur larves d'Aedes, dans lesquels ont nourrit les Aedes avec E. coli exprimant chaque clone de BAC, on a criblé la banque complète de BAC. Les inventeurs ont identifié un BAC positif. Les résultats ont été répétés avec ce BAC de nombreuses fois et sont reproductibles. Ce BAC, plaque 1 ligne A colonne 2, désigné BAC1A2, cause la paralysie et/ou la mort des larves d'Aedes. Les contrôles utilisés dans ces essais incluent : un clone aléatoire BAC qui n'exerce pas d'effet contre les larves d'Aedes, la souche E. coli DH10B (la souche dans laquelle la banque de BAC a été clonée), une souche sauvage type Photorhabdus luminescensTTO1.

Les inventeurs ont observé l'altération des larves dans le cas du BAC 1A2 environ 20 heures après que les plaques soient infectées avec les larves. Les différences sont particulièrement visibles au bout de 48 heures après l'infection. Les larves commencent par ralentir leurs mouvements puis n'ont plus l'air de se nourrir du milieu contenant les bactéries autant que dans les puits contenant le clone aléatoire

BAC et le DH10B. Les larves se couchent ensuite dans le fond du puits, ne nagent plus jusqu'à la surface pour prélever de l'air. L'activité constatée avec le BAC 1A2 est similaire à celle observée avec un échantillon de Photorhabdus sauvage, alors que la souche d'E. coli DH10B est inactive.

Dans les plaques de 96 puits utilisant Photorhabdus luminescens, on constate la mort de larves avec une D0595 pour les bactéries de 0,1 avant l'addition de larves d'Aedes. La mort est constatée également avec une DO de 0,5 pour le BAC 1A2.

Dans les essais sur moustiques, le pourcentage de mortalité a été de 100 % avec le Photorhabdus de type sauvage, et de l'ordre de 90 à 95 % pour le BAC 1A2.

En outre, des tests de sensibilité à la chaleur ont été effectués. Photorhabdus, BAC1A2 et Ecoli DH10B ont été chauffés à différentes températures pour déterminer l'activité insecticide restante. Pour cela, une culture de Photorhabdus d'une nuit a été collectée puis mise en suspension dans de l'eau stérile. Des échantillons de 1 ml ont été chauffés à 30 C, 40 C, 50 C, 60 C, 70 C, 80 C ou à 100 C pendant 15 minutes. Les résultats ont montré que les larves sont mortes lorsque Photorhabdus était chauffé à 70 C. Les larves ont survécu et ont absorbé les bactéries lorsque la température était de 80 C ou plus. L'ensemble des essais réalisés montre que la toxine insecticide sécrétée par Photorhabdus est stable jusqu'environ 60 C. Des essais sur le BAC 1A2 montrent également une stabilité jusqu'à 60 C, les larves meurent dans les puits contenant du BAC 1A2 qui étaient chauffés à 60 C.

Pour les échantillons contrôle DH10B et BAC aléatoire, des larves étaient capables de se nourrir de bactéries chauffées à toutes les températures testées. A l'inverse, les toxines obtenues par les inventeurs conservent leur activité insecticide typiquement plusieurs semaines stockés à environ 4 C.

Le clone BAC 1 A2 (dépôt CNCM 1-2699), dont la taille du fragment inséré est de 60131 pdb, comprend : - un ensemble de gènes similaires à des gènes isolés chez Escherichia coli (gènes de ménage) ; - le gène de séquence SEQ ID N 4, codant pour la protéine de séquence SEQ ID
N 5, qui possède une homologie avec un gène d'estérase d'hormone juvénile

de coléoptère, flanqué du gène de séquence SEQ ID N 2 codant pour la protéine de séquence SEQ ID N 3. De plus un gène, codant pour un régulateur transcriptionnel, jouxte cet opéron putatif. Ces gènes (SEQ ID N 4 et SEQ ID N 2) étant vraisemblablement responsables de l'activité entomotoxique observée les inventeurs ont tout d'abord restreint la séquence du BAC 1 A2 à une région contenant principalement les gènes SEQ ID N 4 et
SEQ ID N 2.

Les inventeurs ont en outre testé des sous-clones contenant les deux ORF du BAC 1A2 cités précédemment, à savoir l'ORFl codant à SEQ ID N 3 et l'ORF2 codant à SEQ ID N 5.

Plus précisément, deux sous-clones, plg16g1et plgl6el2, ont été transformés dans E. coli souche DH10B. Le clone plgl6gl, déposé à la CNCM sous le numéro 1-2698, est un fragment d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens, souche TT01 (Fischer - Le Saux M. et al. (1999) Int. J. Syst. Bacteriol., 49,1645-56), cloné dans le vecteur pSYX34 (Xu S . et Fomenkov A. (1994) - Biotechniques, vol 15,57) dans la bactérie E. coli XL10-Gold Kanr (Stratagene).

A partir d'échantillons congelés, on a mis en culture des bactéries Photorhabdus, BAC1A2, DH10B, plgl6gl et plg16e12. 200 l de chaque culture on été pipetés dans 12 puits d'une plaque de 96 puits. Des plaques ont été agitées pendant 10 minutes à 1000 rpm. Le surnageant a été éliminé. 200 l d'eau stérile ont été rajoutés dans chaque puit et les bactéries ont été remises en suspension. La DO 595 a été mesurée, chaque puit contenant environ 10 larves d'Aedes aegypti. Les deux clones, plgl6gl et plgl6el2 ont un effet insecticide sur les larves, qui est encore plus rapide et fort que l'effet de Photorhabdus et de BAC 1A2. Ce résultat est vraisemblablement lié au nombre de copie supérieur (5 copies par cellule) du vecteur pSYX34 en comparaison avec le vecteur pBELOBACll (1 copie par cellule). Les larves de contrôle (DH10B et eau) ne sont pas affectées et restent très actives. Les larves au contact de Photorhabdus ou du BAC 1A2 montrent un mouvement ralenti et restent dans le fond du puits. Les larves au contact des clones plg16g1et plg16e12 sont immobiles et semblent être mortes.

EXEMPLE 3 : d'activité entomopathogène sur les larves de Culex pipiens, menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment.

Les larves ont été préparées de manière analogue à celles d'Aedes.

Les inventeurs ont préparé : - un sous-clone (construction déposée à la CNCM sous le N 1-2752) contenant les gènes de séquence SEQ ID N 2 (ORF 1) et SEQ ID N 4 (ORF 2) : ces gènes ont été amplifiés par PCR et clonées à bout droit au site EcoRV du pBluescript SK. Ce plasmide est nommé pDIA700 clones n 10 (séquence vérifiée).

- un sous-clone (construction déposée a la CNCM sous le N 1-2753) contenant les gènes de séquences SEQ ID N 2 (ORF 1) et SEQ ID N 4 (ORF 2), avec délétion de la partie 3' du gène de séquence SEQ ID N 4 ; le plasmide pDIA700 (n 10) a été restreint par EcoRI pour éliminer le dernier tiers de SEQ ID N 4. Ce plasmide est nommé pDIA701.

Les résultats obtenus ont été les suivants, démontrant que l'ORF 2 est essentiel pour l'activité insecticide contre Culex pipiens.

Résultats sur larves de Culex pipiens

<tb>
<tb> Locus <SEP> 1
<tb> pDIA700/10 <SEP> pDIA701 <SEP> Témoin
<tb> ORF1 <SEP> + <SEP> ORF2 <SEP> ORF1+ORF2 <SEP> tr.3' <SEP> eau
<tb> 24 <SEP> h <SEP> DO <SEP> 2 <SEP> DO <SEP> 2
<tb> Replicat <SEP> 1 <SEP> Mortes <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> V <SEP> ivantes <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 11
<tb> Replicat <SEP> 2 <SEP> Mortes <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Vivantes <SEP> 0 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Total <SEP> Mortes <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Vivantes <SEP> 0 <SEP> 23 <SEP> 23
<tb> % <SEP> Mortalité <SEP> 100% <SEP> 0% <SEP> 0%
<tb> 48 <SEP> h
<tb> Replicat <SEP> 1 <SEP> Mortes <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> V <SEP> ivantes <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 11
<tb> Replicat <SEP> 2 <SEP> Mortes <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Vivantes <SEP> 0 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Total <SEP> Mortes <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Vivantes <SEP> 0 <SEP> 23 <SEP> 23
<tb> % <SEP> Mortalité <SEP> 100% <SEP> 0% <SEP> 0%
<tb>

D'autres séries de tests sur différentes espèces de moustiques ont démontré l'efficacité notamment chez Culex pipiens, Anopheles gambiae, Anopheles stephensie, résumée sur le tableau 1.

Tableau 1

<tb>
<tb> STADE <SEP> LI <SEP> LI-L2 <SEP> L1 <SEP> L1
<tb> Culex <SEP> pipiens <SEP> Aedes <SEP> aegypti <SEP> Anopheles <SEP> gambiae <SEP> Anophele <SEP> stephensie
<tb> 48H <SEP> 48H <SEP> 48H <SEP> 48H
<tb> Photorhabdus <SEP> 16 <SEP> vivantes <SEP> 40 <SEP> vivantes <SEP> 6 <SEP> vivantes <SEP> 15 <SEP> vivantes
<tb> 59 <SEP> mortes <SEP> /75 <SEP> 35 <SEP> mortes <SEP> /75 <SEP> 69 <SEP> mortes/75 <SEP> 60 <SEP> mortes <SEP> /75
<tb> 79% <SEP> 47% <SEP> 92% <SEP> 80%
<tb> Bac <SEP> 1 <SEP> A2 <SEP> 5 <SEP> vivantes <SEP> 44 <SEP> vivantes <SEP> 7 <SEP> vivantes <SEP> 6 <SEP> vivantes <SEP>
<tb> 70 <SEP> mortes <SEP> /75 <SEP> 31 <SEP> mortes <SEP> /75 <SEP> 68 <SEP> mortes/75 <SEP> 69 <SEP> mortes <SEP> / <SEP> 75 <SEP>
<tb> 93% <SEP> 41% <SEP> 91% <SEP> 92%
<tb> P18F1 <SEP> 44 <SEP> vivantes <SEP> 62 <SEP> vivantes <SEP> 39 <SEP> vivantes <SEP> 41 <SEP> vivantes
<tb> contrôle <SEP> 31 <SEP> mortes <SEP> /75 <SEP> 13 <SEP> mortes <SEP> / <SEP> 75 <SEP> 36 <SEP> mortes <SEP> / <SEP> 75 <SEP> 34 <SEP> mortes <SEP> / <SEP> 75 <SEP>
<tb> négatif <SEP> (sans <SEP> 41% <SEP> 17% <SEP> 48 <SEP> % <SEP> 45%
<tb> insert)
<tb>
EXEMPLE 4 : tests d'activité entomopathogène sur les larves de Plutella xylostella, menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment.

(i) Une série de tests a été effectuée selon le protocole suivant. Des bactéries (souche E. coli DH10B, contenant un plasmide pBeloBACll) ont été mises en culture une nuit dans 5 ml LB+chloramphenicol à 28 C sous agitation à 200 rpm. La D054o de chaque culture a été systématiquement prise. Chaque culture est diluée avec du LB jusqu'à obtenir une concentration de 5x107 bactéries/ml. Six feuilles (3 cm de diamètre) sont incubées dans une culture diluée pendant une heure avec 0,05 % Tween 20 (Sigma). Les feuilles traitées sont mises dans des plaques 6 puits et 5 larves sont placées dans chaque puits, soient 30 larves testées par clone. Chaque puits contient un support gélosé contenant 15 g/1 d'agar (Difco) et 1,5 g/1 d'antifongique (nipagine, Sigma).

De préférence, les larves utilisées pour ce test sont des larves en phase tardive du stade L2 (2eme stade larvaire), sélectionnées juste avant leur mue vers le stade L3. En

effet, les inventeurs ont observé que les larves étaient nettement plus sensibles à la bactérie à ce stade L2 et que les essais y étaient bien plus reproductibles.

Les essais ont été effectués à 28 C avec une photopériode de 11h : 13h (nuit : jour).

Après 2 jours, les feuilles traitées ont été remplacées par des feuilles non traitées. Le niveau de mortalité des larves a été observé à 48h, 72h et 144h après le contact des larves avec les feuilles traitées Des contrôles ont été utilisés pour les tests de criblage, incluant : Photorhabdus TT01, et/ou le BAC8dlO (contenant le locus te) comme contrôles positifs. Les contrôles négatifs correspondant aux constructions sans insert ont été utilisées de façon adéquate (pBeloBACll dans E. coli DH10B pour les clones BAC, pSYX34 dans E.coli XL10 pour le sous-clone plgl6gl, E.coli XLIBlue pour les sous-clones pDIA). Tous ces bio-essais ont été réalisés avec une souche de Plutella xylostella originaire de la Martinique.

Le taux de mortalité des larves a été corrigé par rapport au contrôle négatif à l'aide de l'équation Abbott (Abbott W. S., J. Econ. Entomol., 18 : 265-267).

Les inventeurs ont démontré selon une première série de tests l'activité insecticide du BAC1A2 contre des lépidoptères notamment Plutella xylostella, lorsque les larves étaient au stade larvaire tardif L2.

Clones <SEP> % <SEP> de <SEP> mortalité <SEP> ABBOTT
<tb> 48h <SEP> 72h <SEP> 144h
<tb> BAC <SEP> 1a02 <SEP> 30% <SEP> 50% <SEP> 58%
<tb> 26% <SEP> 26% <SEP> 26%
<tb> Plg <SEP> 16g1 <SEP> 43% <SEP> 58%pDIA700 <SEP> # <SEP> 96% <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb> pDIA701 <SEP> # <SEP> 12% <SEP> 12% <SEP> 23%
<tb>
* un % de mortalité Abbott supérieur à 20% est considéré comme significatif # la concentration d'antifongique (nipagine) utilisée dans le milieu gélosé (pour le support des feuilles) a été diminuée de 5 fois lors des bio-essais réalisés avec les sous-clones pDIA.

(ii) Une autre série de tests sur Plutella a démontré l'effet insecticide, en utilisant le protocole suivant.

Initialement trois doses de bactéries gelées ont été testées sur Plutella : 0,014 g/5ml, 0,007g/5ml et 0,035g/5ml d'eau. 150 /1 de bactéries ont été ajoutées à la surface d'une coupelle de Plutella. La coupelle a été placée dans une hotte pour séchage.

Une fois les coupelles séchées, chacune est infestée par 10 larves de Plutella (âgées de 4 jours). On observe : - 100% de mortalité dans tous les traitements par Photorhabdus ; - 95% de mortalité pour le traitement à 0,0014g/5ml de BAC 1A2 ; - 90% de mortalité pour le traitement à 0,007g/5ml de BAC 1 A2 ; - une certaine mortalité pour le contrôle DH10B avec 42% pour le traitement
0,014g/5ml.

Ainsi, la souche sauvage de Photorhabdus a un effet insecticide fort sur les larves de Plutella. L'effet obtenu avec le BAC 1A2 est significativement supérieur par rapport au contrôle.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.

2. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70% d'identité avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie en a) ou b) ; d) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), b) ou c), d'au moins 10 paires de base ; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c),d) ou e) ; ladite séquence codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.

3. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2.

4. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique choisie parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins 80 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ;

c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), ou b) ; d) un polypeptide variant de polypeptides de séquences d'acides aminés défini en a), b), ou c).

5. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide selon la revendication 3 ou 4.

6. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2,5 caractérisée en ce que la toxine est active contre des diptères, notamment les espèces de moustiques Aedes aegypti, Culex pipiens, Anopheles gambiae et

Anopheles stephensie, et/ou des lépidoptères notamment Plutella xylostella.

7. Cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle à une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1,2, 5 et 6.

8. Vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon la revendication 7 ou une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6.

9. Vecteur de type virus caractérisé en ce qu'il comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6 liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié.

10. Cellule hôte comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7.

11. Cellule hôte selon la revendication 10 caractérisée en qu'il s'agit d'une bactérie, d'une levure, d'une cellule de plante, d'un champignon.

12. Composition insecticide caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 4, ou une cellule hôte selon la revendication 10 ou 11 accompagnés d'un support approprié.

13. Procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine contre des insectes caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une cassette d'expression selon la revendication 7 dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression.

14. Plante ou partie de plante, comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7, les plantes ou parties de plantes étant transformées et résistantes aux insectes.

15. Plante ou partie de plante selon la revendication 14 présentant une augmentation de l'expression d'une toxine contre les insectes par rapport à une plante non transformée.

16. Plante ou partie de plante selon l'une quelconque des revendications 14 à 15 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une mono ou une dicotylédone, notamment le blé ou le maïs.

17. Procédé de lutte contre des insectes caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur des plantes infectées par lesdits insectes d'une quantité efficace sur le plan insecticide d'une composition insecticide selon la revendication 12 ou de vecteurs selon la revendication 8.

18. Procédé d'obtention de toxines insecticides caractérisé en ce qu'il comprend : - l'obtention d'au moins une cellule hôte selon la revendication 11 ; - la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1,2, 5 et 6 et conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes ;

- la collecte de toxines produites.

19. Procédé d'obtention d'une plante résistante aux insectes, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1,2, 5 et 6, l'expression de ladite séquence nucléotidique étant à un niveau suffisant pour agir contre les insectes.

20. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment ADN de Photorhabdus luminescens d'environ 60 kb désigné plBACIA2 déposé sous le numéro CNCM-2699, présent dans la souche

E. coli DH10B.

21. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle correspond à SEQ IDN 1.

22. Souche comprenant un vecteur selon la revendication 8, déposée à la CNCM sous la référence plbac 1 a2 CNCM 1-2699.

23. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1, 2,

5 et 6, d'un vecteur selon la revendication 8, d'une cellule selon la revendication 10 ou 11, pour la préparation d'un polypeptide insecticide.

24. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide insecticide selon la revendication 3 ou 4.