FR2831185A1 - Procede et kit de conversion de vecteurs hybrides de clonage en phase solide et procede de clonage de sequences nucleotidiques d'interet en faisant application - Google Patents

Abstract

L'invention concerne le clonage de séquences nucléotidiques d'intérêt, dans lequel intervient un procédé de conversion en masse de vecteurs hybrides de clonage appartenant à un système binaire à vecteur/ souche cellulaire compétente (bactérie) de conversion. Le but de l'invention est d'améliorer la conversion de ces vecteurs hybrides de clonage (par exemple phagemides) en termes de facilité de mise en oeuvre, de vitesse d'exécution et de rendement de conversion. Le procédé consiste : - à faire se multiplier sur un milieu de culture des bactéries infectées par des vecteurs hybrides de clonage, porteurs des séquences d'intérêt à cloner de façon à obtenir des plages de lyse, - à mettre en oeuvre un filtre en nitrocellulose ensemencé avec des bactéries de conversion et séché, - à collecter de manière simultanée des vecteurs hybrides de clonage contenus dans les plages de lyse du milieu solide de multiplication, au moyen du support solide ensemencé avec des bactéries de conversion, - et à mettre en culture ce support solide comprenant les phagemides et les bactéries de conversion sur un milieu sélectif permettant la sélection et l'isolement de bactéries de conversion contenant des clones de vecteurs hybrides convertis en plasmides porteurs des séquences d'intérêt. L'invention concerne également les kits de conversion et de construction de bases de données dans lesquels on met en oeuvre le procédé sus-visé.

Description

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Procédé et kit de conversion de vecteurs hybrides de clonage en phase solide et procédé de clonage de séquences nucléotidiques d'intérêt en faisant application
Le domaine de l'invention est celui du clonage de séquences nucléotidiques d'intérêt, notamment à des fins de purification, d'amplification et/ou de production de banques nucléotidiques, ces banques pouvant être composées e. g. de séquences génomiques, de séquences d'ADNc ou de séquences synthétiques.

Plus précisément, la présente invention porte sur un procédé de conversion en masse (en phase solide ou pâteuse) de vecteurs hybrides de clonage appartenant à un système binaire vecteur/souche cellulaire compétente (de préférence bactérienne) de conversion.

La présente invention concerne également les procédés de clonage et de sous- clonage "automatique" de séquences nucléotidiques intégrées dans des vecteurs hybrides de clonage appartenant à un système binaire vecteur hybride/bactérie de conversion.

Pour finir, la présente invention a pour objet les kits contenant notamment les vecteurs hybrides de clonage et les supports solides, pré-ensemencés ou non par les bactéries de conversion, permettant la conversion en masse.

Le clonage consiste à insérer un fragment d'ADN d'intérêt dans un vecteur, et à multiplier ce vecteur dans une souche cellulaire compétente telle qu'une souche bactérienne, de levure ou de tout autre organisme permettant la multiplication de ce vecteur. La culture de ces cellules, puis l'extraction et la purification des vecteurs, permettent de produire des quantités quasi illimitées du fragment d'ADN cloné.

Ces procédés de clonage sont notamment appliqués :

* pour purifier une ou plusieurs séquences nucléotidiques d'intérêt * ou pour construire des banques nucléotidiques, composées par exemple, de séquences génomiques, de séquences d'ADNc ou de séquences synthétiques.

Un vecteur de clonage doit pouvoir intégrer des séquences nucléotidiques d'intérêt, se répliquer dans une souche bactérienne compétente, et être aisément détecté et isolé dans une cellule hôte. Les vecteurs couramment employés, par l'homme de l'art, pour la production de banques nucléotidiques sont principalement des vecteurs de type phage et cosmide (Sambrook et al., 1989 : toutes les références bibliographiques en italiques citées dans le présent exposé sont définies plus en détail dans un récapitulatif ci-après). Bien que ces vecteurs présentent des caractéristiques intéressantes pour le clonage, leur utilisation présente malgré tout certaines limites (Sambrook et al., 1989 ; Meese et al., 1990). En effet, les banques nucléotidiques produites dans les vecteurs de type phage peuvent être criblées rapidement, mais sont source d'inconvénients quant à l'analyse et au sous-clonage de l'insert nucléotidique. Concernant les banques construites dans les vecteurs de type

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cosmide, les procédés de criblage et de purification de clones spécifiques sont peu efficaces et nécessitent un investissement en temps important.

Pour faciliter l'isolement et la caractérisation d'une séquence d'intérêt intégrée dans le génome de ces vecteurs, une procédure de sous-clonage est souvent mise en place.

Cette technique de sous-clonage consiste à transférer, par des techniques de biologie moléculaire, la séquence d'intérêt dans un second vecteur plus fonctionnel, ce second vecteur étant en général de type plasmidique. Traditionnellement, le sous-clonage est obtenu par le procédé comprenant notamment les étapes suivantes : l'excision de la région nucléotidique clonée dans le vecteur de clonage initial

(en général un vecteur phage k) à l'aide des enzymes de restriction adaptées, puis par l'insertion de cette séquence nucléotidique dans une autre famille de vecteur plus facilement analysable, préférentiellement de type plasmidique.

Ce procédé de sous-clonage est un procédé techniquement difficile et long, et dont le rendement est très variable. L'obtention de vecteurs permettant un sous-clonage plus simple avec un rendement élevé, est donc une constante préoccupation.

Pour aller dans ce sens, il a ainsi été proposé une classe de vecteurs fortement appréciée pour la production de banques nucléotidiques, à savoir les hybrides "phage/plasmide"encore appelés vecteurs hybrides de clonage. Ces hybrides sont des constructions de phages comportant une région plasmidique pouvant être excisée par un

système moléculaire de recombinaison site spécifique, l'ADN cloné étant intégré au niveau de ladite région plasmidique. Ce type de vecteur hybride permet alors un sousclonage de la séquence d'intérêt de manière "automatique". L'insert initialement intégré dans une structure de caractéristique phage est transformé, après excision et circularisation de la région plasmidique par un processus de biologie moléculaire, en une structure plasmide fonctionnelle (figure 1 annexée). Cette figure illustre les étapes a. et b. de conversion d'un vecteur de type phage : a. Insertion de l'ADNc cloné dans le site de multiclonage b. Conversion du vecteur hybride de clonage par excision de la région plasmidique contenant l'ADNc cloné.

Les matériels c. à 1. mis en oeuvre dans ces étapes sont : c. Vecteur hybride de clonage de type phagemide d. Site de recombinaison spécifique LoxP e. Région plasmidique f. Site de multiclonage g. Bras gauche du vecteur phagemide

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h. Bras droit du vecteur phagemide i. Insert ADNc j. Plasmide obtenu par conversion k. Séquence d'intérêt ADN
1. Site de recombinaison homologue LoxP Cette"conversion"d'un vecteur de caractéristique phage en un vecteur de caractéristique plasmidique nécessite l'excision de la région plasmidique initialement intégrée dans le vecteur. Dans l'état de l'art, le mécanisme moléculaire utilisé pour obtenir une excision de la séquence plasmidique est en général un système de recombinaison site spécifique, et encore préférentiellement le mécanisme moléculaire de type Cre/Lox tel que décrit dans le brevet US-B-4,959, 317.

Les procédés de conversion, appliquant ce mécanisme moléculaire Cre/Lox, sont rencontrés notamment dans les systèmes binaires phagemide/souche bactérienne de

conversion (Palazzolo et al., 1990 ; Elledge et al, 1991). La région plasmidique du vecteur phagemide est comprise entre deux sites Lox. La conversion de vecteur ou l'excision et la circularisation de la région plasmidique, est obtenue par infection par ledit vecteur d'une souche bactérienne dite de"conversion"comportant une activité enzymatique Cre, telle la lignée BM25.8 (Palazzolo et al., 1990).

Il existe des kits commerciaux comportant un système binaire vecteur hybride de clonage/souche bactérienne de conversion et facilitant grandement cette étape de sousclonage. On peut notamment citer le kit"SMART cDNA Library Construction Kit"de ClontechTM.

Ces kits de construction de banques contiennent généralement :

un vecteur phagemide pouvant être converti (ì"TriplEx2TM, Clontech ; SCREENM ou BlueSTAR, Novagen), et une bactérie de conversion comportant une activité Cre et capable d'exciser la région plasmidique du phagemide, telle la souche BM25.8 (Palazzolo et al.,
1990).

Dans ce type de kit, les vecteurs hybrides de clonage comportant la ou les séquences clonées sont initialement multipliés dans une souche bactérienne adaptée sur un milieu de culture gélosé. La multiplication des vecteurs hybrides de clonage permet alors l'obtention de plages de lyse, chaque plage de lyse correspondant à un vecteur contenant une séquence clonée différente. Chaque plage de lyse est alors récupérée individuellement puis mise en contact en milieu liquide avec les bactéries de conversion. Au final, chaque milieu comporte des bactéries de conversion transformées par la construction provenant de la banque nucléotidique dans un vecteur de type plasmidique.

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Les kits utilisant cette procédure de conversion en milieu liquide, bien que faisant gagner un certain temps, présentent toujours certains inconvénients : - le nombre de manipulations (une par clone) pour aboutir au sous-clonage reste important, - le temps de manipulation augmente avec le nombre des vecteurs hybrides à convertir, nombre qui peut devenir important lorsque l'homme du métier travaille sur une banque ADNc ou génomique, - le rendement de conversion est relativement faible (10 à 20% d'après le manuel

BlueSTARM Vector System et XSCREENTM Vector Manual, Novagen), les séquences plus courtes sont sur-représentées en raison d'un biais d'amplification, les inserts dont l'expression est toxique pour dans la bactérie de conversion, ne peuvent pas être convertis en plasmides et sont perdus.

Malgré les nombreux problèmes posés par les procédés de conversion en milieu liquide, l'homme du métier utilise toujours, faute de mieux, ce procédé pour le sousclonage automatique de banques nucléotidiques.

Dans ces circonstances, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir un procédé permettant d'améliorer la conversion des vecteurs hybrides de clonage, notamment en termes de facilité de mise en oeuvre et de vitesse d'exécution, ainsi que de rendement de conversion.

Un autre objectif essentiel de la présente invention est de proposer un procédé de sous-clonage de vecteurs hybrides de clonage simple rapide et performant et permettant en outre de résoudre le problème particulier des inserts de séquences nucléotidiques à cloner, exprimant une toxicité dans les bactéries de conversion, ce qui coupe court au processus de réplication des séquences considérées.

Un autre objectif essentiel de la présente invention est de proposer un procédé de clonage de séquences nucléotidiques d'intérêt, faisant intervenir des vecteurs hybrides de clonage que l'on multiplie dans des cellules cultivées sur milieu de croissance gélifié, que l'on convertit puis que l'on sous-clone correctement à des cadences quasi industrielles.

Un autre objectif essentiel de la présente invention est de proposer un kit de clonage de séquences nucléotidiques d'intérêt et/ou de construction de banques génomiques, qui comporte un système binaire : vecteur hybride de clonage/souche bactérienne de conversion et qui soit simple, économique, rapide et performant.

Ces objectifs, parmi d'autres, sont atteints par l'invention, qui concerne tout d'abord, un procédé de conversion de vecteurs hybrides de clonage au moyen d'au moins une souche cellulaire compétente de conversion, caractérisé en ce que cette conversion est réalisée en masse, au moins en partie sur au moins un support solide.

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Il est du mérite des inventeurs d'avoir trouvé de manière tout à fait surprenante et inattendue, que la simplification du procédé passe par un travail en phase solide de manière à garantir une ségrégation entre les lignées de clonage.

Au sens de l'invention, le qualitatif"solide"englobe plusieurs états solides de dureté variable : solide stricto sensu, semi-solide, gélifié ou pâteux. En tout état de cause, cela correspond à des états non liquides de la matière impropres à une trop grande circulation et diffusion de liquides tels que des solutions suspensions aqueuses, de façon à éviter les mélanges des populations d'entités biologiques.

Il s'ensuit que selon une caractéristique préférée de l'invention, on fait en sorte que les flux internes de liquides soient inexistants ou limités, de manière à éviter les échanges de matière entre les zones différenciées du milieu comprenant des séquences nucléotidiques distinctes à cloner cl à cn, Ce procédé de conversion de vecteurs hybrides de clonage permet d'améliorer de façon significative, aussi bien qualitativement que quantitativement, le procédé de conversion individuelle (clone par clone) en milieu liquide, traditionnellement appliqué dans les kits commerciaux.

Par"procédé de conversion", on entend un procédé automatique, de préférence un processus de biologie moléculaire, permettant l'excision, dans un vecteur initial, d'un sous-vecteur et la transformation de ce sous-vecteur, en un vecteur converti plus facilement exploitable (de préférence un plasmide).

Par"vecteur", on entend une construction nucléotidique, rencontrée conventionnellement dans le génie génétique, et choisie de préférence parmi la famille des plasmides, cosmides, bactériophages ou virus.

Un vecteur hybride de clonage est obtenu par des techniques de génie génétique connues de l'homme du métier (Sambrook et al., 1989). Pour la synthèse de vecteurs hybrides de clonage, il est également possible de prendre en compte les demandes de brevets WO 88/05085, US 5286636, US 5851808 et WO 01/04288.

Dans le présent exposé, un"vecteur hybride de clonage"est un vecteur initial, dans le génome duquel est intégrée une autre séquence vecteur pouvant être excisée et transformée en un autre vecteur fonctionnel, par exemple par circularisation. On parlera de vecteur de sous-clonage pour le vecteur excisé du vecteur hybride de clonage et transformé lors de la conversion.

Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le vecteur hybride de clonage est un vecteur phagemide. Ce vecteur correspond alors à un vecteur hybride de clonage de caractéristique phage comportant un vecteur de sous-clonage de type plasmidique, intégré dans son génome.

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Suivant des alternatives, le vecteur hybride de clonage pourrait être, non plus un virus mais par exemple un plasmide propagé par une bactérie ou une levure, ou une simple molécule d'ADN.

La conversion du vecteur hybride de clonage est obtenue automatiquement par l'intégration dudit vecteur dans une souche bactérienne de conversion adaptée. On dit que le vecteur hybride de clonage et la souche bactérienne de conversion constituent un système binaire vecteur/souche bactérienne de conversion adaptée car la conversion du vecteur hybride nécessite l'utilisation d'une souche bactérienne adéquate. On entend donc par système binaire un système comportant un vecteur hybride de clonage tel que décrit précédemment, et une souche bactérienne adaptée comportant la ou les activités enzymatiques permettant l'excision et la circularisation du vecteur de sous-clonage.

Pour que la conversion puisse avoir lieu, le vecteur de clonage doit pouvoir pénétrer dans la souche de conversion. Les vecteurs hybrides de clonage de type viral peuvent investir la souche bactérienne de conversion par infection.

Des modes de transfert biologique par reproduction sexuée, tels la conjugaison, sont adaptés dès lors que le vecteur de clonage est propagé par une levure ou une bactérie. La transfection sera utilisée dans le cas où on utilise une simple molécule d'ADN.

Dans le cas où l'on a affaire à des phagemides, leur conversion automatique repose sur des mécanismes de biologie moléculaire, et préférentiellement des procédés de recombinaison. Le vecteur de sous-clonage (phagemide) doit préférentiellement être encadré par deux sites de recombinaison permettant son excision et sa circularisation lorsque le vecteur hybride de clonage est intégré dans une souche bactérienne de conversion adaptée. Ces sites de recombinaison sont notamment de type Cre/Lox tel que décrit dans le brevet US4959317 (Du Pont, 1987), ou de type RecE/T et Rec alpha/béta tel que décrit dans le brevet WO 01/04288 (Europe Molecular Biology Laboratory, 1999).

Dans un mode de réalisation de l'invention, ces sites de recombinaison sont par exemple de type site spécifique de recombinaison, et plus particulièrement encore de type Cre/Lox. Le vecteur hybride de clonage comporte alors deux sites spécifiques de recombinaison Lox encadrant le vecteur de sous-clonage, ce qui permet l'excision de ce vecteur et l'obtention d'un vecteur de sous-clonage fonctionnel.

La souche bactérienne de conversion employée dans ce système binaire exprime alors une activité enzymatique Cre et, de préférence encore la souche est choisie parmi la lignée BM25.8 (Palazzolo et al., 1990). Parmi les vecteurs hybrides de clonage utilisés dans les kits commerciaux, on peut citer le phagemide ATriplEx2TM de Clontech, ou les vecteurs hybrides de clonage ASCREENTM et ABlueSTARTM de Novagen (Doherty et al., 1993).

On peut également citer les vecteurs hybrides de clonage pouvant être obtenus par le

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brevet WO 88/05085. L'homme du métier est capable de choisir le vecteur phagemide qui lui est connu, et adapté à l'application recherchée par celui-ci.

Ces vecteurs présentent notamment l'avantage de posséder un fort pouvoir de réplication. Dans ces conditions, la multiplication des vecteurs hybrides de clonage s'opère en les mettant en contact avec une souche bactérienne adaptée, c'est à dire sensible auxdits vecteurs viraux. De préférence, la souche bactérienne est la souche XLI-Blue (Bullock et al., 1987). Dans un milieu semi-solide, les bactéries XLI-Blue transfectées conduisent à la formation de plages de lyse, chaque plage de lyse correspondant à un clone de phagemide.

Préférentiellement, ces vecteurs de clonage et de sous-clonage contiennent des sites de multi-clonage. Par sites de multi-clonage , on entend une région comportant une succession de sites de restriction unique dans la séquence nucléotidique de ces vecteurs.

Ces sites de multi-clonage permettent l'insertion de séquences nucléotidiques d'intérêt dans un site déterminé tout en utilisant l'enzyme de restriction la plus adaptée. On peut

citer pour exemple les sites de restriction Sau3A I, BamH I, Xho I.

Mais avant de procéder à la conversion, il importe que les vecteurs hybrides de clonage et leurs contenus, à savoir les diverses séquences nucléotidiques d'intérêt CI à cn, aient proliféré, de façon cloisonnée.

Ainsi, conformément à l'invention et préalablement à la conversion : - on fait se multiplier des vecteurs hybrides de clonage V ci à Vcn qui correspondent à des séquences nucléotidiques d'intérêt à cloner cl à Cn, au moyen d'au moins une souche cellulaire compétente, de préférence au moins une bactérie de mutiplication, cultivée dans et/ou sur au moins un milieu solide de multiplication, - et on collecte simultanément, dans et/ou sur ce milieu solide de multiplication, au moyen d'au moins un support solide, les vecteurs hybrides de clonage Vci à Vcn multipliés.

Dans le mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, interviennent notamment comme moyens matériels essentiels :

au moins un support solide, avantageusement sous forme de feuille, au moins un milieu solide, pour la culture de cellules (e. g bactéries) de multiplication porteuses (de préférence infectées par) des vecteurs hybrides de clonage comprenant des séquences nucléotidiques distinctes à cloner ci à cn, * au moins un milieu solide pour la culture de cellules (e. g bactéries) de conversion porteuses (de préférence infectées par) des vecteurs hybrides de clonage issus du milieu de multiplication.

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De préférence, on utilise le même support solide pour la collecte des vecteurs hybrides de clonage Vel à Vcn multipliés et pour la conversion. Ce support solide (e. g. une feuille) est dans ce cas ensemencé avec des cellules (de préférence bactéries) de conversion. Cela correspond au protocole opératoire intéressant donné ci-après : multiplication sur au moins un milieu solide de culture, de bactéries comprenant (de préférence infectées par) des vecteurs hybrides de clonage porteurs des séquences nucléotidiques d'intérêt ci à Cn à cloner, de façon à obtenir une pluralité de plages de lyse correspondant chacune à une séquence d'intérêt à cloner Cx, mise en oeuvre d'au moins un support solide ensemencé avec des bactéries de conversion, collecte simultanée des vecteurs hybrides de clonage contenus dans les différentes plages de lyse du milieu solide (e. g. gélifié) de multiplication, au moyen d'un support solide ensemencé avec des bactéries de conversion, mise en culture de ce (ou ces) support (s) solide (s), comprenant les vecteurs hybrides de clonage et les bactéries de conversion, sur au moins un milieu sélectif solide (e. g. gélifié ou pâteux) permettant la sélection et l'isolement de colonies de bactéries de conversion contenant des clones de vecteurs hybrides convertis en plasmides porteurs des séquences d'intérêt cl à cn.

Les colonies bactériennes comportant les vecteurs hybrides convertis se forment avantageusement sur le support solide de conversion. Chaque colonie formée sur le support solide provient d'un clone bactérien ayant intégré un vecteur hybride de clonage. Ces colonies constituées par les bactéries de conversion, qui ont proliféré et qui ainsi ont multiplié les vecteurs hybrides de clonage sous une forme convertie.

Le milieu de culture de multiplication solide contenant les vecteurs hybrides de clonage , est un milieu de culture gélifié, par exemple gélosé, permettant le maintien ou la multiplication dudit vecteur. Dans le mode préféré de réalisation, à savoir celui où le vecteur est de type phagemide, le procédé suivant peut être mis en oeuvre : - le vecteur hybride de clonage est mis en contact en milieu liquide avec la souche bactérienne pouvant être infectée par ce vecteur et permettant sa multiplication ; après un temps de contact déterminé, le mélange vecteur hybride de clonage/souche bactérienne est dilué dans un milieu liquide à chaud (42 C) se transformant en milieu semi-solide à froid tel que le milieu LB/agar 0,7% ; - le milieu de culture gélosé présente une certaine densité de plage de lyse, chaque plage de lyse correspondant à un clone du vecteur hybride de clonage d'intérêt.

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La souche bactérienne permettant la multiplication du vecteur peut notamment être choisie parmi les souches XLl-Blue (Bullock et al., 1987), ERl647 (Wyman et al. 1986 ; Wertman et al. 1986 ; Raleigh et al. 1989 ; Doherty et al. 1993).

L'invention, dans son protocole préféré de réalisation, procède de l'idée surprenante d'intégrer la cellule hôte permettant la conversion du vecteur hybride de clonage sur le support solide de conversion.

Cette invention permet notamment la conversion simultanée de l'ensemble des vecteurs hybrides de clonage présents sur une même boîte de Pétri.

La voie privilégiée de conversion en masse sur support solide de l'invention permet de remédier aux inconvénients rencontrés par les procédés conventionnels de conversion en milieu liquide et notamment : - d'obtenir une conversion simultanée de plusieurs clones de vecteurs hybrides de clonage tout en diminuant le nombre d'étapes - d'améliorer le rendement de conversion - d'abolir le biais d'amplification - de permettre la sauvegarde des clones toxiques.

Ce procédé de conversion sur support solide de l'invention permet l'obtention directe de colonies bactériennes sur un support solide, chaque colonie contenant un vecteur hybride de clonage de la banque sous une forme convertie.

En termes de rendement de conversion, la comparaison entre les procédés connus de conversion en phase liquide et le procédé en masse ou en phase solide selon l'invention, peut se faire sur la base des données suivantes : - le procédé de conversion individuelle en phase liquide permet d'obtenir une centaine de conversion de vecteurs hybrides par jour et par manipulateur, sachant que chaque clone converti correspond alors à un carottage, une dilution en tube Eppendorfg, une culture liquide puis un étalement sur boîte ; - le procédé de conversion globalisée, en masse, sur support solide, selon l'invention, donne près de 12000 clones bactériens par manipulateur et par jour, ce qui correspond à la conversion d'autant de vecteurs hybrides de clonage, qui nécessite de ne manipuler que 40 boîtes et 40 membranes.

Ces résultats démontrent clairement les avantages de la technique de conversion en masse en phase solide de l'invention par rapport à la technique conventionnellement utilisée dans les kits de conversion en phase liquide.

De préférence, l'étape préalable d'ensemencement du support solide avec les bactéries de conversion, peut être effectuée de la façon suivante :

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l'ensemencement du support solide-de préférence sous forme de feuille-est réalisé par imprégnation-de préférence de toute la surface de la feuille de support solide-avec une suspension liquide contenant les bactéries de conversion, le support solide imprégné est séché avant de servir à la collecte des vecteurs hybrides de clonage.

Plus concrètement encore, l'imprégnation du support solide (e. g. de la feuille) est effectuée à l'aide de la suspension de bactéries de conversion sur l'une des faces de cette feuille de support solide. En fait, on dépose le volume requis (par exemple une goutte) de suspension de bactéries de conversion sur une surface, de préférence hydrophobe, et on applique sur ce volume de suspension l'une des faces de la feuille de support solide sur la suspension. La surface en question peut être une plaque en plastique ou en verre ou le couvercle d'une boite de pétri.

L'ensemencement d'une face déterminée du support solide permet notamment : a) de favoriser le contact cellules de conversion/vecteurs hybrides de clonage, en plaçant la face ensemencée vers le bas, lors de la collecte desdits vecteurs sur le milieu de multiplication ; b) de limiter la contamination du milieu de sélection gélifié (e. g. gélosé) et permettre une réplique sous forme de colonies bactériennes lors de la phase de conversion, en plaçant la face ensemencée vers le haut.

Après l'imprégnation, on procède à la récupération du support solide ensemencé par la souche bactérienne de conversion sur une face unique, et on effectue le séchage du support solide pré-ensemencé.

Avantageusement, le séchage de la feuille de support solide est réalisé à l'aide de papier absorbant, du type papier"Whatman"ou tout autre papier buvard convenable.

Comme autre moyen de séchage envisageable, on peut citer l'aspiration, le flux d'air ou gazeux, la lyophilisation.

S'agissant de la quantité de germes de conversion déposés sur le support solide, elle est déterminée par un taux volumique compris entre 5 et 20 III de suspension par cm2 de support solide, la suspension ayant une DO comprise entre 0,5 et 1,5, par exemple de 1 ; ce qui correspond à un nombre déterminé et suffisant de germes.

Dans la mesure où le support solide (e. g. la feuille) possède avantageusement une taille et une forme correspondant à celles de la surface sur laquelle la collecte est

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effectuée, il est important que l'imprégnation du support solide, soit aussi complète que possible.

De plus pour respecter l'un des fondements de l'invention, qui est l'absence de courants de liquides susceptibles de mettre à mal la ségrégation entre les différents clones, on doit veiller au séchage correct du support solide, après imprégnation.

Dans une variante du procédé selon l'invention, l'ensemencement du support solide (par exemple par imprégnation et séchage), peut être faite, non pas extemporanément à la collecte des vecteurs hybrides de clonage, mais de façon anticipée. Le support ensemencé est alors stocké dans des conditions telles qu'il demeure dans un bon état de conservation.

A cette fin, le support solide ensemencé peut éventuellement faire l'objet d'un traitement qui permet de conserver le support sous une forme pré-ensemencée pour une utilisation ultérieure. Les traitements permettant la conservation du support sont connus de l'homme du métier, et peuvent notamment être choisis parmi la lyophilisation ou la congélation.

Le support solide ainsi pré-ensemencé est ainsi prêt à l'emploi.

Pour la collecte des vecteurs hybrides de clonage, le support solide ensemencé est avantageusement déposé à la surface du milieu de culture de multiplication, puis l'ensemble est laissé à incuber, avantageusement de 1 à 180 min, plus spécialement de 15 à 120 min.

Après incubation et transfert des vecteurs hybrides de clonage sur le support solide, ce dernier est déposé à la surface du milieu de culture sélectif de conversion, puis l'ensemble est mis en culture dans des conditions appropriées.

Suivant une caractéristique intéressante de l'invention, la face d'imprégnation de la feuille de support solide est celle qui est mise au contact de la surface du milieu de culture de multiplication pour collecter les vecteurs hybrides de clonage à convertir, tandis que la face opposée de la feuille de support solide est celle qui est mise au contact de la surface du milieu de culture sélectif de conversion.

Il en résulte que les colonies de bactéries de conversion se forment sur la face supérieure du support solide posé sur le milieu de culture sélectif de conversion. Cela correspond à une modalité préférée, mais cela n'exclut pas les variantes dans lesquelles la face du support solide mise en contact avec le milieu de multiplication serait également celle appliquée à la surface du milieu de culture de conversion.

De même selon une autre variante, il pourrait être envisagé de ne mettre en oeuvre comme support solide que le milieu de culture de conversion, lequel serait pré-ensemencé sur sa surface avec les bactéries de conversion, comme décrit ci-dessus, puis cette dernière serait ensuite mise en contact avec le milieu de multiplication pour collecter les vecteurs hybrides de clonage multipliés.

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Il est apparu tout à fait opportun que le support solide utilisé, lorsqu'il consiste en un moyen distinct du milieu de culture de conversion, soit poreux (de préférence de porosité comprise entre 0,1 et 1 um), de manière à être perméable aux nutriments et absorbant. La biocompatibilité est aussi une spécification requise pour le support solide. En effet, il doit permettre l'ancrage des bactéries de conversion et des vecteurs hybrides de clonage, la croissance desdites bactéries de conversion (notamment sur un milieu de culture sélectif adapté) et, par ailleurs, le passage des nutriments destinés aux bactéries de conversion en croissance.

Le support solide, qui est au moins en partie le siège de la conversion du vecteur de clonage, doit également posséder une résistance mécanique suffisante, c'est à dire être capable de résister à une série de manipulations effectuées par l'homme du métier. Il doit notamment ne pas se déchirer lorsqu'il est manipulé dans un état humidifié.

De plus, ce support ne doit pas limiter l'intégration des vecteurs de clonage dans les bactéries de conversion, et ne doit donc pas limiter le processus de conversion des vecteurs hybrides de clonage.

Ainsi, le matériau constitutif du support solide est, de préférence, sélectionné dans le groupe comprenant : - la cellulose et ses dérivés, de préférence la nitrocellulose, - le nylon et ses dérivés - les supports à base de silice ou de fibres de verre.

En pratique, le support solide est préférentiellement un filtre ou une membrane en nitrocellulose. Ce type de membrane a l'avantage d'être largement répandu, de permettre une bonne adsorption des micro-organismes, de posséder une bonne résistance à la manipulation, de permettre le passage de nutriments, d'être biocompatible et de ne pas interférer avec l'intégration des vecteurs dans les bactéries de conversion.

Par exemple, la membrane de nitrocellulose utilisée est une membrane de marque Shleicher & Schnell&commat; (Optitran&commat; dite 100% nitrocellulose) ou Amersham (S (membrane de nylon) de porosité moyenne 0,45 um.

Une autre caractéristique importante de l'invention tient en ce que l'on met en oeuvre au moins un marqueur de sélection dans le milieu de culture sélectif de conversion, de façon à repérer les bactéries de conversion ayant intégré et converti un vecteur hybride de clonage.

Ainsi, les vecteurs de clonages et de sous-clonages peuvent notamment contenir des gènes de sélection ou des gènes rapporteurs. L'homme de l'art utilisera le marqueur de sélection qu'il pensera le plus adapté. Parmi les gènes marqueurs couramment utilisés, on

peut citer notamment les gènes conférant une résistance aux antibiotiques tels que : - le gène npt II pour la résistance à la kamamycine (Bevan et al., 1983),

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- ou le gène hph pour la résistance à l'hygromycine (Gritz et al., 1983).

Il est également possible d'utiliser dans la construction du vecteur, un gène rapporteur qui permettra un"screening"simple et rapide des cellules ayant intégré dans leur génome une séquence hétérologue. Ce gène peut être notamment la luciférase, la GFP

(Gerdes et al., 1996), la ss-glucuronidase (Jefferson, 1987), ou le gène ccdB (Bernard P. et al, 1994).

Il s'ensuit que selon une caractéristique préférée de l'invention, ce marqueur est choisi dans le groupe comprenant :

un gène conférant une résistance aux antibiotiques, -un gène rapporteur choisi dans le groupe comprenant les gènes codant pour : la luciférase, la GFP, ou la ss-glucuronidase, le gène ccdB.

Le procédé de conversion sur support solide de l'invention permet donc la conversion de l'ensemble des vecteurs hybrides de clonage présent dans un milieu de culture solide, avantageusement gélosé, et cela en une seule manipulation. Ce procédé a également pour avantage, lors de l'utilisation de vecteur phagemide, de permettre l'obtention d'une réplique exacte de chaque plage de lyse sous forme d'une colonie bactérienne.

Selon un exemple, les micro-organismes du système binaire de conversion sont tels que décrits précédemment, à savoir un système binaire comprenant la souche bactérienne BM 25.8 et un phagemide. Le support solide quant à lui est préférentiellement un filtre de nitrocellulose.

Concernant les paramètres variables du protocole, et notamment les temps de contact du support solide avec les milieux de culture, la densité en microorganismes

(bactéries de conversion et vecteurs hybrides de clonage) sur les différents supports..., l'homme du métier peut être amené, en pratique, à procéder à certaines adaptations en s'appuyant sur les conditions optimales préférées selon l'invention et définies ci-dessus. Ces conditions optimales éventuellement adaptées, doivent permettre d'obtenir le meilleur rendement de conversion des vecteurs hybrides de clonage ainsi que le développement le plus important des micro-organismes de conversion sur le support solide.

Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne également un procédé de clonage de séquence (s) nucléotidique (s) d'intérêt, à l'aide de vecteurs hybrides de clonage de préférence de type phagemides, dans lequel : les séquence (s) nucléotidique (s) d'intérêt CI à Cn sont insérées dans des vecteurs hybrides de clonage Vcl à Vcn,

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des souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) comprenant (de préférence infectées par) ces vecteurs hybrides de clonage

Vc, à Vcn et sont mises en culture à des fins de multiplication, les vecteurs hybrides de clonage Vcl à Vcn multipliés sont mis en contact avec des souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) de conversion des inserts CI à Cn en plasmides, les souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) de conversion sont mises en culture, pour que la conversion s'opère et pour produire in fine des colonies de bactéries de conversion correspondant aux clones plasmidiques ci à cn, caractérisé en ce qu'il intègre le procédé de conversion tel que défini ci-dessus.

Par définition, un tel procédé de clonage inclut un module de sous-clonage automatique de séquences nucléotidiques. Aussi, l'invention vise, en outre, un procédé de sous-clonage automatique de séquences nucléotidiques, incorporant la conversion telle que définie supra.

Par"procédé de sous-clonage automatique", on entend un procédé consistant à transférer un polynucléotide d'intérêt initialement intégré dans un type de vecteur vers un autre type de vecteur. Ce procédé est dit automatique étant donné que ce vecteur hybride peut donner directement le vecteur de sous-clonage par excision et circularisation via un processus de recombinaison moléculaire.

Dans le cadre de vecteur hybride de clonage, la séquence nucléotidique d'intérêt doit être introduite dans le vecteur de sous-clonage pour que le sous-clonage automatique puisse avoir lieu. La séquence peut être unique ou faire partie d'une banque nucléotidique. Le ou les polynucléotides pourront alors être de type ADN génomique, complémentaire ou synthétique.

Le ou les polynucléotides d'intérêt seront introduits dans le vecteur hybride de clonage au niveau du site de multiclonage. L'homme du métier est capable de sélectionner les enzymes de restriction adaptées lui permettant l'intégration de la séquence hétérologue d'intérêt.

Dans le cadre de l'invention, le sous-clonage automatique est obtenu par la conversion du vecteur hybride de clonage, comportant au moins une séquence nucléotidique d'intérêt hétérologue, par la souche bactérienne de conversion adaptée.

Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, la conversion sur support solide utilise le matériel biologique et le support solide tels que décrits précédemment. Le vecteur de clonage du système binaire doit être tel que décrit précédemment dans l'invention, et de préférence être de type phagemide. Ce vecteur doit préférentiellement comporter au moins un site de multiclonage dans la région du vecteur de sous-clonage

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pour permettre l'insertion de la séquence nucléotidique d'intérêt. La conversion permet alors le sous-clonage automatique des séquences composant la banque nucléotidique dans des vecteurs plasmidiques. Le système de conversion automatique utilise de préférence le système de recombinaison site spécifique Cre/Lox. Comme décrit précédemment, le système binaire est composé d'un vecteur hybride de clonage de type phagemide contenant des sites Lox encadrant la région plasmidique, et d'une souche bactérienne de conversion BM 25.8. Le support solide quant à lui sera de préférence une membrane de nitrocellulose.

Suivant une modalité singulière de l'invention, on effectue dans le cadre du clonage susvisé, un sous-clonage des éventuelles séquences toxiques hétérologues Ci vis-à-vis des souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) de conversion des inserts cl à Cn en plasmides, en mettant en oeuvre les étapes suivantes : * comparaison des plages de lyse du milieu de culture gélifié de multiplication et des colonies de bactéries de conversion correspondant aux clones plasmidiques cl à Cn et présentes sur le support solide (feuille) et/ou sur le milieu de culture de conversion, afin de repérer les éventuelles plages de lyse n'ayant pas leurs colonies de clonage correspondantes,

* isolement des vecteurs hybrides de clonage toxiques, * amplification des vecteurs hybrides de clonage toxiques, * extraction de l'ADN ou PCR, * puis séquençage direct de l'insert toxique Ci ou sous-clonage dans un vecteur vis à vis duquel l'insert n'est pas toxique, * récupération des clones de séquences toxiques Ct..

Le procédé de l'invention permet donc la conversion des clones toxiques, c'est-àdire des clones comportant un polynucléotide qui. s'il s'exprime dans la bactérie de conservation provoque une toxicité. En effet, par conversion en masse sur milieu solide comme cela est prévu conformément à l'invention, les vecteurs hybrides toxiques ne donnent pas de colonies bactériennes. Il est alors possible de récupérer les vecteurs hybrides non adsorbés sur le filtre pour utiliser un procédé de sous-clonage alternatif connu de l'homme du métier. Le procédé alternatif de sous-clonage peut être choisi parmi l'un des procédés de sous-clonage suivants : - amplification du phage et extraction de la séquence ADN d'intérêt du vecteur hybride de clonage, ou - réaction PCR et séquençage direct si seule une sonde est recherchée.

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L'invention a également pour objet un kit, en particulier pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini ci-dessus caractérisé en ce qu'il comporte notamment les éléments suivants :

* au moins un vecteur hybride de clonage, * au moins une souche bactérienne de conversion adaptée au vecteur hybride de clonage, sous forme de suspension prête à l'emploi et/ou sous forme d'inoculum permettant la préparation d'une suspension, * au moins un support solide pour les bactéries de conversion et permettant la collecte des vecteurs hybrides de clonage sur les plages de lyse du milieu de culture de multiplication, * et éventuellement des moyens de séchage du support solide après imprégnation.

Selon une variante, le kit est caractérisé en ce qu'il comporte notamment les éléments suivants : * au moins un vecteur hybride de clonage, * au moins un support solide stable au stockage-de préférence sous forme lyophilisée-pré-ensemencé avec au moins une souche bactérienne de conversion adaptée au vecteur hybride de clonage et permettant la collecte des vecteurs hybrides de clonage sur les plages de lyse du milieu de culture de multiplication,
Avantageusement, le support solide est une membrane de nitrocellulose, de préférence sensiblement de même forme et de mêmes dimensions que les surfaces du milieu de culture de multiplication et du milieu de culture de conversion, sur lesquelles elle est destinée à être déposée.

Sont concernés les kits de clonage de séquences nucléotidiques ou les kits de construction de banques nucléotidiques utilisant des vecteurs hybrides de clonage permettant un sous-clonage automatique des séquences nucléotidiques clonées. Ce kit va également autoriser le sous-clonage des séquences toxiques ne pouvant être obtenues par le procédé de conversion en milieu liquide habituellement employé par l'homme du métier.

Par support solide , on entend tout support solide tel que décrit précédemment et pouvant être utilisé dans le procédé de l'invention tel qu'une membrane de nitrocellulose.

On parle de support stockable pré-ensemencé pour désigner un support comportant des bactéries appartenant à la souche bactérienne de conversion, ledit support pouvant être conservé pour une période déterminée. Ces bactéries de conversion doivent pouvoir se

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multiplier après une période de latence sur le support solide. Les procédés permettant de conserver des bactéries sur un support solide, de préférence de type membrane de nitrocellulose, sont connus de l'homme du métier. L'homme du métier utilisera de préférence un procédé de lyophilisation, et potentiellement un procédé de congélation.

Selon un mode préféré de l'invention, le kit comprend un système binaire utilisant le procédé de recombinaison site spécifique Cre/Lox. De préférence encore le vecteur hybride phagemide est un vecteur ÂTriplEx2TM, ÂSCREENTM ou BlueSTAR et la membrane de nitrocellulose est pré-ensemencée avec la souche bactérienne de conversion BM25.8 (Palazzolo et al., 1990).

Optionnellement, le kit de conversion peut notamment contenir des milieux permettant la multiplication des bactéries (milieu LB, par exemple), un système d'encapsidation in-vitro dans le cas d'utilisation de vecteurs phages, une souche bactérienne compétente permettant la multiplication des vecteurs (E. coli XLI-Blue : Bullock et al., 1987 ; ER1647 : Wyman et al. 1986, Wertman et al. 1986, Raleigh et al.

1989, Doherty et al. 1993), des enzymes permettant l'intégration des inserts dans les vecteurs (enzymes de restrictions : Sau3A, BamH l, Xho 1..., DNA ligase), un milieu de sélection des souches bactériennes de conversion contenant le vecteur converti (LB/carbenicilline ou LB/ampicilline).

L'invention concerne également l'utilisation du kit, tel que décrit précédemment, pour améliorer le rendement de sous-clonage d'une ou plusieurs séquences différentes présentes dans des vecteurs hybrides de clonage. Par améliorer le rendement de sousclonage , on entend plus particulièrement la possibilité de réaliser un sous-clonage simultanément de l'ensemble des vecteurs hybrides de clonage présents dans une boite de culture. Ce type de kit permet aussi d'accroître le pourcentage de conversion des vecteurs hybrides de clonage sur support solide, en comparaison du procédé de conversion en milieu liquide.

L'invention concerne également l'utilisation de kit, tel que décrit précédemment, pour permettre le sous-clonage d'une ou plusieurs séquences toxiques pour les bactéries de conversion tel que décrit précédemment.

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Description des Figures

Fi, 1 : Cette figure illustre : o les étapes a. et b. de conversion d'un vecteur de type phage o les matériels c. à 1. mis en oeuvre dans ces étapes Fleure 2 :
Cette figure illustre les étapes composant le procédé de conversion d'un vecteur hybride de clonage de type plasmide sur un filtre.

Légende :
Etapes : a. Ensemencement d'une face du support solide de conversion b. Séchage modéré c. Mise en contact avec les plages de lyse d. Retournement de la membrane et mise sur la boîte avec antibiotique e. Mise en culture f. Obtention de colonies correspondant aux phages convertis
Matériels : g. filtre de nitrocellulose h. goutte d'une culture de bactéries de conversion i. support en matière plastique j. papier type Whatman k. boîte avec plages de lyse
1. stockage

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Exemples

Exemple 1 : Conversion d'un vecteur phac A fplEx2en plasmid 3TriplEx2'ur SMPPO Sû/ < /t ? M ) (matériel biologique provient du kit Clontech, SMARTTM Library Construction Kit : Triplex2, BM25.8)
Une banque primaire d'ADNc réalisée dans un phage TriplEx2, préalablement titrée, est étalée selon les protocoles recommandés par le fabricant du vecteur à une densité de 2-2, 2 pfu/cm2 et mise en culture une nuit (Clontech, SMARTTM cDNA Library Construction Kit, User Manual, 2000). Parallèlement, une préculture de la souche d'E. coli BM25.8 est réalisée à 31 C dans du LB + MgS04 10 mM également pendant une nuit. Il est important de s'assurer que l'humidité des boîtes de phage n'est pas trop importante sinon un séchage adéquat sera réalisé sous une hotte stérile.

Le lendemain, une culture de la souche BM25.8 est réalisée dans du LB + MgS04

10mM en comptant 15ul/cm2 de boîte à convertir et ceci jusqu'à une DO"" de 1 en partant d'une dilution au 1/40ème de la culture overnight. La culture est alors supplémentée en MgCl2 à 1M à raison de lOul/ml soit une concentration finale de 10mM.

Un filtre de nitrocellulose de taille adaptée est placé sur une goutte (15ul/cm2) de bactéries BM25.8 déposée sur une surface hydrophobe stérile (plastique souple ou couvercle de boîte de pétri par exemple). L'ensemble du filtre doit être imprégné lorsque cette étape est réalisée, le filtre est retourné et mis à sécher sur un papier de type Whatman (papier filtre). Cela prend quelques secondes et à la fin aucune trace de liquide ne doit être perceptible. Le filtre retourné (bactérie vers le bas) est placé sur la boîte portant les plages de lyse et incubé pendant 15 minutes à 31 C (peut-être prolongé jusqu'à 1 heure). Le filtre est alors enlevé par une extrémité, retourné ( phages vers le

haut) et placé sur une boîte de milieu contenant l'ampicilline à lOOg/mI minimum et mis en culture une nuit à 31 C. Le lendemain, chaque plage de lyse aura donné naissance à une colonie portant le plasmide correspondant. Chaque colonie peut alors être repiquée dans du milieu sélectif pour être stockée ou utilisée selon le besoin du manipulateur. Cette manipulation doit être réalisée dans les 3 à 4 semaines suivant la conversion, si la membrane est bien conservée à 4 C, pour éviter que les bactéries de conversion ne sèchent sur le support.

Chaque colonie peut être repiquée grâce à un cône de pipetman type Gilson jaune dans 1001il de milieu dans une plaque de microtitration pour culture et stockée sous forme de glycérol stock .

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Exemple 2 : Test de différents supports solides
Pour déterminer le support solide permettant un rendement optimal de conversion, différents supports solides ont été testés avec le protocole tel que décrit ci-dessus dans l'exemple 1. Ces supports sont : - du papier paillasse ; - du papier Whatman ; du papier filtre ; - membrane nylon Amershamg Hybond-N (porosité 0, 45 u. M) ; - membrane nitrocellulose Millipore (D (0, 45 M) ; - membrane de nitrocellulose Shleicher & Schuell# et Amersham (R) (0, 45 M).

La conversion présente un rendement optimal sur les membranes de nitrocellulose Schleicher & Schuell# (Optitran# dite 100% nitrocellulose) ou Amersham (R) de porosité 0, 45pu.

Exemple 3 : Préparation extemporané et conservation du support pré-ensemencé
2 ml de bactéries BM 25.8 sont cultivés à 31 C pendant une nuit jusqu'à une densité optique proche de 1. Cette suspension est ensuite utilisée pour l'ensemencement de membranes de nitrocellulose Schleicher & Schuell&commat;. Ces membranes sont pour finir préparées pour une conservation à long terme dans différentes conditions : séché et conservé à température ambiante ; - lyophilisé 5 minutes et conservé à 4 C ; - lyophilisé 20 minutes et conservé à 4 C.

Après 2 jours de stockage dans chacune des conditions, les filtres ont été remis en culture sur des boîtes : - LB agar pour le contrôle de survie des bactéries de conversion, - LB agar + ampicilline dans le procédé de conversion en masse.

Les membranes pré-ensemencées et conservées par lyophilisation permettent une conversion des vecteurs hybrides, alors que la membrane séchée et conservée à température ambiante est incapable de convertir les vecteurs hybrides de clonage.

La lyophilisation est adaptée pour la conservation, sur membrane, des bactéries de conversion BM 25.8.

Exemple 4 : Comparaison méthode en masse/méthode liquide Efficacité des différents types de conversion phase liquide/solide

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En phase liquide
1. La conversion individuelle est efficace à 100% mais très fastidieuse
2. La conversion sur le pull de phage peut faire gagner du temps mais l'efficacité est très faible : de l'ordre de 15 à 20%.

En phase solide sur filtre de nitrocellulose : l'efficacité est de l'ordre de 100%, chaque clone étant traité individuellement.

Rendement de la conversion simultanée de plusieurs clones/conversion individuelle
Conversion individuelle en phase liquide : on peut réaliser 100 clones par manipulateur et/jour sachant qu'il faut manipuler 100 tubes Eppendorf (g) et 100 boîtes.

Conversion en masse en phase solide : on peut réaliser raisonnablement 40 boites par manipulateur et/jour sachant qu'une boite présente 300 clones : cela fait 12 000 clones/jour.

Il faut donc manipuler 40 boites et 40 membranes.

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Références - Bernard P. et al. : "Positive selection vectors using the F plasmid ccdB killer gene".

(1994) Gene 148,71-74.

- Bevan et al. :
Nature, 1983, Vol 304, p 1184-187.

- Bullock et al. :
XL-1-Blue : a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection.

BioTechniques (1987) 5 : 376-379.

- Doherty et al : (1993) Gene 124,29-35.

- Elledge et al. :
Lambda YES : "a multifonctional cDNA expression vector for the isolation of gene for the complementation of yeast and Escherichia coli mutations", Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 88 (1991) 1731-1735).

- Gerdes et al. :
Green fluroescent protein : applications in cell biology.

- Gritz et al. :
Gene, 1983, Vol 25, p 179-188,1.

- Jefferson RA et al. :
GUS fusions : beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.

EMBO J. 1987 Dec. 20 ; 6 (13) : 3901-7.

- Meese et al. : (1990) Quick method for high yields of lambda bacteriophage DNA, Nucleic Acids
Res, 18,19-23.

- Palazzolo et al. : (1989) Phage lambda cDND cloning vectors for subtractive hydridization, fusion- protein synthesis and Cre-loxP automatic plasmid subcloning, Gene, 88 (1990) 25-36.

- Raleigh et al. :
Genetic and physical mapping ofthe mcrA (rglA) and mcrB (rglB) loci of Escherichia coli K-12.

Genetics. 1989 Jun ; 122 (2) : 279-96.

- Sambrook et al. : (1989) A laboratory manual 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY.

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- Whertman KF et al. :
Host/vector interactions which affect the viability of recombinant phage lambda clones.

Gene. 1986 ; 49 (2) : 253-62.

- Wyman AR et al. :
Factors which equalize the representation of genome segments in recombinant libraries.

Gene. 1986 ; 49 (2) : 263-71.

Claims (1)

1. REVENDICATIONS

   

   -l- Procédé de conversion de vecteurs hybrides de clonage au moyen d'au moins une souche cellulaire compétente de conversion, caractérisé en ce que cette conversion est réalisée en masse, au moins en partie sur au moins un support solide.

   - 2-Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait en sorte que les flux internes de liquides soient inexistants ou limités, de manière à éviter les échanges de matière entre les zones différenciées du milieu comprenant des séquences nucléotidiques distinctes à cloner cl à Cn.

   - 3-Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que, préalablement à la conversion : on fait se multiplier des vecteurs hybrides de clonage Vcl à Vcn qui correspondent à des séquences nucléotidiques d'intérêt à cloner cl à cn, au moyen d'au moins une souche cellulaire compétente, de préférence au moins une bactérie de mutiplication, cultivée dans et/ou sur au moins un milieu solide de multiplication, et on collecte simultanément, dans et/ou sur ce milieu solide de multiplication, au moyen d'au moins un support solide, les vecteurs hybrides de clonage Vcl à Vcn multipliés.

   - 4-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, l'on utilise le même support solide pour la collecte des vecteurs hybrides de clonage Vc à Vcn multipliés et pour la conversion.

   - 5-Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend notamment les étapes suivantes : multiplication sur au moins un milieu solide de culture, de bactéries comprenant (de préférence infectées par) des vecteurs hybrides de clonage porteurs des séquences nucléotidiques d'intérêt C à Cn à cloner, de façon à obtenir une pluralité de plages de lyse correspondant chacune à une séquence d'intérêt à cloner cx, mise en oeuvre d'au moins un support solide ensemencé avec des bactéries de conversion,

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   collecte simultanée des vecteurs hybrides de clonage contenus dans les différentes plages de lyse du milieu solide de multiplication, au moyen d'un support solide ensemencé avec des bactéries de conversion, mise en culture de ce (ou ces) support (s) solide (s), comprenant les vecteurs hybrides de clonage et les bactéries de conversion, sur au moins un milieu sélectif solide permettant la sélection et l'isolement de colonies de bactéries de conversion contenant des clones de vecteurs hybrides convertis en plasmides porteurs des séquences d'intérêt cl à cn.

   - 6-Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable d'ensemencement du support solide avec les bactéries de conversion.

   - 7-Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que : l'ensemencement du support solide-de préférence sous forme de feuilleest réalisé par imprégnation-de préférence de toute la surface de la feuille de support solide-avec une suspension liquide contenant les bactéries de conversion, le support solide imprégné est séché avant de servir à la collecte des phagemides.

   - 8-Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'imprégnation de la feuille de support solide est effectuée à l'aide de la suspension de bactéries de conversion sur l'une des faces de cette feuille de support solide, de préférence à raison de 5 à 20 ul/cm', la suspension ayant une DO comprise entre 0, 5 et 1, 5.

   - 9-Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'imprégnation est effectuée par dépôt du volume requis de suspension de bactéries de conversion sur une surface, de préférence hydrophobe, puis par application de l'une des faces de la feuille de support solide sur la suspension.

   - 10-Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que : pour la collecte des phagemides, le support solide ensemencé est déposé à la surface du milieu de culture de multiplication, puis l'ensemble est laissé à incuber-avantageusement de 1 à 180 min, plus spécialement de 15 à 120 min, après incubation et transfert des phagemides sur le support solide, ce dernier est déposé à la surface du milieu de culture sélectif de conversion, puis l'ensemble est mis en culture dans des conditions appropriées.

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   - 11-Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la face d'imprégnation de la feuille de support solide est celle qui est mise au contact de la surface du milieu de culture de multiplication pour collecter les phagemides à convertir, tandis que la face opposée de la feuille de support solide est celle qui est mise au contact de à la surface du milieu de culture sélectif de conversion.

   - 12-Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 11, caractérisé en ce que le support solide utilisé est poreux (de préférence de porosité comprise entre 0, 1 et 1 m), de manière à être perméable aux nutriments, absorbant, biocompatible, et de préférence sélectionné dans le groupe comprenant : - la cellulose et ses dérivés, de préférence la nitrocellulose, - le nylon et ses dérivés,

   

   les supports à base de silice ou de fibres de verre.

   - 13-Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 12, caractérisé en ce que le séchage de la feuille de support solide est réalisé à l'aide de papier absorbant.

   - 14-Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 13, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre au moins un marqueur de sélection dans le milieu de culture sélectif de conversion, de façon à repérer les bactéries de conversion ayant intégré et converti un phagemide ; ce marqueur étant choisi dans le groupe comprenant :

   

   un gène conférant une résistance aux antibiotiques, un gène rapporteur choisi dans le groupe comprenant les gènes codant pour : la luciférase, la GFP, ou la ss-glucuronidase le gène ccdB.

   - 15-Procédé de clonage de séquence (s) nucléotidique (s) d'intérêt, à l'aide de vecteurs hybrides de clonage de préférence de type phagemides, dans lequel : les séquence (s) nucléotidique (s) d'intérêt cl à Cn sont insérées dans des vecteurs hybrides de clonage VCI à Vcn, # des souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) comprenant (de préférence infectées par) ces vecteurs hybrides de clonage VCI à Vcn et sont mises en culture à des fins de multiplication, # les vecteurs hybrides de clonage Vc1 à Vcn multipliés sont mis en contact avec des souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) de conversion des inserts cl à Cn en plasmides, # les souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) de conversion sont mises en culture, pour que la conversion s'opère et pour

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   produire in fine des colonies de bactéries de conversion correspondant aux clones plasmidiques cl à cn, caractérisé en ce qu'il intègre le procédé de conversion selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.

   - 16-Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'on effectue un sousclonage des éventuelles séquences toxiques hétérologues ce vis à vis des souches cellulaires compétentes (de préférence des bactéries) de conversion des inserts CI à Cn en plasmides, en mettant en oeuvre les étapes suivantes : * comparaison des plages de lyse du milieu de culture gélifié de multiplication et des colonies de bactéries de conversion correspondant aux clones plasmidiques cl à Cn et présentes sur le support solide (feuille) et/ou sur le milieu de culture de conversion, afin de repérer les éventuelles plages de lyse n'ayant pas leurs colonies de clonage correspondantes, * isolement des vecteurs hybrides de clonage toxiques, * amplification des vecteurs hybrides de clonage toxiques, * extraction de l'ADN ou PCR, * puis séquençage direct de l'insert toxique Ci ou sous-clonage dans un vecteur vis à vis duquel l'insert n'est pas toxique, * récupération des clones de séquences toxiques ct.

   - 17-Kit en particulier pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte notamment les éléments suivants : * au moins un vecteur hybride de clonage, * au moins une souche bactérienne de conversion adaptée au vecteur hybride de clonage, sous forme de suspension prête à l'emploi et/ou sous forme d'inoculum permettant la préparation d'une suspension, * au moins un support solide pour les bactéries de conversion et permettant la collecte des vecteurs hybrides de clonage sur les plages de lyse du milieu de culture de multiplication, * et éventuellement des moyens de séchage du support solide après imprégnation.

   - 18-Kit en particulier pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte notamment les éléments suivants : * au moins un vecteur hybride de clonage,

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   * au moins un support solide stable au stockage-de préférence sous forme lyophilisée-pré-ensemencé avec au moins une souche bactérienne de conversion adaptée au vecteur hybride de clonage et permettant la collecte des vecteurs hybrides de clonage sur les plages de lyse du milieu de culture de multiplication.

   - 19-Kit selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que le support solide est une membrane de nitrocellulose, de préférence sensiblement de même forme et de mêmes dimensions que les surfaces du milieu de culture de multiplication et du milieu de culture de conversion, sur lesquelles elle est destinée à être déposée.