FR2828209A1

FR2828209A1 - Acides nucleiques codant de nouvelles proteines a domaine hect, leurs utilisations en diagnostics et en therapie

Info

Publication number: FR2828209A1
Application number: FR0110364A
Authority: FR
Inventors: Dominique Thomas; Bruno Sargueil; Frederic Scaerou
Original assignee: Cytomics Systems
Current assignee: Cytomics Systems
Priority date: 2001-08-01
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2003-02-07
Also published as: WO2003012102A2; WO2003012102A3

Abstract

La présente invention a pour objet de nouvelles protéines à domaine HECT et de nouveaux substrats des protéines à domaine HECT. Elle a pour objet les méthodes de criblage mises au point pour identifier les substrats des nouvelles protéines à domaine HECT et pour identifier les petites molécules et drogues qui modulent l'interaction etlou l'activité des protéines à domaine HECT et de leurs substrats.

Description

L'invention se rapporte au domaine de l'ubiquitination des protéines, et plus particulièrement au domaine du contrôle et du diagnostic de l'ubiquitination des protéines.

ART ANTERIEUR 11 est depuis longtemps établi que la durée de vie des protéines cellulaires est extrêmement variable. Cette instabilité constitutive ou régulée de certaines protéines (en général des protéines régulatrices), permet aux cellules d'en contrôler étroitement et d'en modifier rapidement les niveaux.

Les mécanismes de dégradation des protéines sont donc extrêmement spécifiques, et le niveau intra-cellulaire d'une protéine donnée peut être ajusté précisément aux besoins de la cellule, par un équilibre entre ses taux de synthèse et de dégradation.

Ce n'est que très récemment par contre qu'il a été établi que la majeure partie de la protéolyse intra-cellulaire est assurée chez les eucaryotes par une machinerie très sophistiquée, le système Ubiquitine (Ub) Iprotéasome, qui utilise l'Ub pour marquer les protéines à dégrader et le protéasome comme enzyme protéolytique. Cette voie implique une cascade de réactions qui conduisent, dans un premier temps, au marquage des protéines à détruire par un polypeptide, constitué de 76 acides aminés, appelé ubiquitine. L'ajout de plusieurs molécules d'ubiquitine cible alors la protéine ainsi modifiée vers le protéasome où elle est détruite. Cette voie s'avère être la voie privilégiée de la dégradation de la plupart des protéines à courte durée de vie chez l'ensemble des organismes eucaryotes. Un grand nombre des protéines dont la stabilité est régulée par la voie ubiquitineprotéasome assurent des fonctions régulatrices dans la cellule (des régulateurs du cycle cellulaire, comme les cyclines, par exemple, des facteurs de transcription, des récepteurs etc....). Le système ubiquitineprotéasome est donc un système régulateur important des cellules eucaryotes qui contrôle la concentration cellulaire de protéines clés par leur dégradation sélective.

La voie ubiquitine-protéasome
L'ubiquitination régule un grand nombre de fonctions cellulaires critiques, le plus fréquemment en déterminant la dégradation sélective de certaines protéines clés par le protéasome. La progression du cycle cellulaire (Koepp DM et aL, 1999), l'induction de la réponse inflammatoire (Ghosh S, et al., 1998), la présentation antigénique (Rock KL et Goldberg AL., 1999) notamment sont quelques uns des nombreux processus régulés par la voie ubiquitine protéasome. Il n'est pas étonnant de constater qu'une dérégulation de la protéolyse dépendante de l'ubiquitine a été identifiée comme une cause du cancer (Joazeiro CAP et al., 1999 ; Bigneil GR et al., 2000) et de plusieurs maladies héréditaires (Shimura H et al., 2000 ; Matsuura T et al., 1997). La dégradation n'est pas la seule issue possible pour des protéines liées à l'ubiquitine ; i'ubiquitination régule aussi certains processus par des mécanismes qui ne semblent pas nécessiter de protéolyse. Ces processus incluent notamment l'initiation de la réponse inflammatoire (Deng L et al., 2000) et le fonctionnement de certains facteurs de transcritption (Kaiser P et al., 2000). Parmi les protéines concernées par l'ubiquitination, on trouve notamment p27, p53, p300, les cyclines, E2F, STAT-1, c-Myc, c-Jun, IKB, NFKB et la ss-caténine.

La voie ubiquitine conduit à l'attachement covalent d'une chaîne d'ubiquitine aux substrats cibles qui sont ensuite dégradés par un complexe multiprotéique, le protéasome, au sein duquel sont associées de nombreuses activités protéasiques. L'ubiquitination de la protéine cible est un mécanisme en trois étapes qui implique en générale trois classes d'enzymes. L'ubiquitine est d'abord activée dans sa partie C-terminale par la formation d'un lien thioester avec une enzyme d'activation de l'ubiquitine, l'enzyme E1. Ensuite, i'ubiquitine est transférée aux résidus cystéine actifs d'une des nombreuses enzymes de conjugaison de l'ubiquitine (Ubc ou E2).

Le transfert final de l'ubiquitine aux résidus lysine de la protéine cible se produit par une réaction qui requiert ou non une protéine ligase de l'ubiquitine (E3) (Hochstrasser, 1996). Les enzymes E3 ont pour principale fonction de reconnaître le substrat mais ces enzymes catalysent parfois la formation d'un lien peptidique entre l'ubiquitine et un résidu lysine du

substrat. La répétition de l'action de ces trois enzymes conduit à la formation d'une chaîne de polyubiquitine. La protéine polyubiquitinée est alors adressée vers le protéasome où elle est dégradée. Alors que le facteur E1 est commun à toutes les voies de dégradation et ne sert qu'à activer l'ubiquitine, la sélectivité du processus de dégradation est assurée par l'ubiquitine ligase E3, qui interagit à la fois avec E2 et avec le substrat (Hershko A. et al., 1983).

Il existe donc un besoin dans l'état de la technique pour l'isolement et la caractérisation de nouvelles protéines à domaine HECT, qui constituent des cibles privilégiées de composés thérapeutiques utilisables pour la prévention ou le traitement des pathologies dans lesquelles ces protéines sont impliquées, notamment les pathologies qui ont été indiquées ci-dessus.

Les ubtguitine-ngases : les enzymes à domaine HECT
Les ubiquitine-ligases ou E3 sont les déterminants centraux de la spécificité de l'ubiquitination. Bien que cette propriété soit clairement établie, il s'est avéré difficile de comprendre la catalyse dépendante des E3 au niveau moléculaire. Dans la plupart des cas, le substrat, t'ubiquitine et l'enzyme qui porte i'ubiquitine (E2) doivent tous être présents au niveau du centre réactionnel. En conséquence, en plus de contribuer au transfert chimique de l'ubiquitine aux résidus lysine, l'enzyme E3 doit également coordonner le positionnement des différents acteurs protéiques au niveau de son site actif.

Les enzymes E3 connues à l'heure actuelle sont des membres de deux familles protéiques : les E3 à domaine HECT et les E3 à RING finger.

Les domaines catalytiques de ces deux familles ne sont apparentés ni en séquence ni en structure (néanmoins certaines E2 interagissent bien avec des E3 des deux familles).

Récemment, il est devenu clair que la plupart des E3 ont en commun un élément structural particulier, le RING (Really Interesting New Gene) finger (Lorick KL et al., 1999 ; Deshaies RJ, 1999). Les 70 acides aminés du RING finger présentent un espacement distinct des résidus cystéine et

histidine dont le rôle est d'assurer la fixation de deux ions zinc qui stabilisent la structure globulaire caractéristique (Borden KLB, 2000). Dans certains cas bien documentés, l'E3 à domaine RING est une sous-unité d'un complexe multiprotéique. C'est le cas notamment pour les complexes SCF, APC et VCB (Deshaies RJ, 1999 ; Tyers M et Jorgensen P, 2000). Les complexes SCF et VCB contiennent une protéine à domaine RING désignée Rbx1, et l'APC contient la protéine APC11. Cependant, dans ces cas particuliers, les enzymes E3 ne semblent pas jouer un rôle dans la reconnaissance du substrat, ce rôle étant assuré par d'autres protéines du complexe multiprotéique, comme les protéines à boîte F dans les complexes SCF (S : Skp1 ; C : Cdc53 ou culline ; F : protéine contenant une boîte F). Certaines protéines à RING finger fonctionnent également de manière autonome comme la protéine c-Cbl impliquée dans la dégradation des récepteurs de l'EGF (epidermal growth factor) ou de PDGF (platelet derived growth factor) (Joazeiro CAP and Weissman AM, 2000) ou la protéine Mdm2 responsable principalement de la dégradation de p53 par le protéasome (Haupt Y et al., 1997).

Les protéines à domaine HECT (pour"Homologous to E6-AP Carboxyl-Terminus") sont caractérisées par un motif d'environ 350 acides aminés contenant un résidu cystéine très conservé qui forme un intermédiaire thiol ester essentiel pendant la catalyse. Au niveau structural, les protéines à domaine HECT sont des protéines de grande taille constituées de nombreux domaines de liaison. Certaines comportent des domaines C2 (Ca2+lIipid binding domain) et des domaines WW (répétition de 35-40 acides aminés de deux résidus tryptophane) en plus du domaine HECT. Les domaines WW sont soupconnés intervenir dans la reconnaissance du substrat (Pirozzi G. et al., 1997). De nombreuses protéines HECT contiennent des domaines WW. Il a été suggéré que in vivo ces protéines peuvent ineragir avec diverses autres protéines par l'intermédiaire de ce domaine (Harvey KF et Kumar S., 1999). Un domaine régulateur de la condensation des chromosomes a également été trouvée dans certaines de ces protéines (RCC).

La propriété d'un de ces domaines HECT fut d'abord révélée grâce à l'étude de la dégradation conditionnelle du suppresseur de tumeur p53. Quand les

cellules sont infectées par des formes oncogéniques des papillomavirus humains (HPV), p53 est sélectivement dégradée par une protéolyse dépendante de la voie ubiquitine protéasome. Des études biochimiques ont révélées que la reconnaissance de p53 pour une dégradation induite par le virus dépendait du produit du gène E6 de HPV et d'une protéine cellulaire de 100 kDa environ, E6-AP (E6-Associated Protein). E6 et E6-AP forment un complexe qui fonctionne comme une E3 spécifique de p53 (Scheffner M., 1993). Le tiers terminal de la séquence de E6-AP est identique à 35-45% à de nombreuses autres protéines dans les banques de données (Huibregtse JM, 1995).

Dans les bases de données de mammifères notamment, on peut trouver de nombreuses protéines HECT potentielles, mais la grande majorité d'entre elles ne sont pas caractérisées fonctionnellement. A part E6-AP, la protéine E3 à domaine HECT la mieux caractérisée est l'enzyme de levure Rsp5. Rsp5 a été impliquée dans l'ubiquitination de divers types de substrats très différents. Rsp5 reconnaît un ensemble de perméases et récepteurs membranaires dont l'ubiquitination dépend dans certains cas d'un signal produit par la phosphorylation du substrat. Ces substrats sont ensuite endocytés. Rsp5 a aussi des substrats solubles dont Rpb1, la grande sousunité de l'ARN polymérase H. L'ubiquitination conduit dans ce cas à la protéolyse. Les propriétés de Rsp5 sont conservées chez les eucaryotes supérieurs. La protéine humaine Rpb1 est reconnue par Nedd4, l'orthologue murin/humain de Rsp5 (Beaudenon SL et al., 1999).

La plupart des protéines a domaine HECT sont vraisemblablement des E3 ou des composants de complexes multiprotéiques contenant des activités de type E3. A l'heure actuelle, peu d'informations sont disponibles sur les fonctions possibles des E3 à domaine HECT.

Ces découvertes suggèrent qu'un vaste répertoire de E3 a été établi en rassemblant divers domaines d'interaction protéique avec seulement deux motifs catalytiques. En dépit de ce progrès cependant, et malgré la détermination récente de la structure de deux complexes E2-E3 (Huang L et al., 1999 ; Zheng N et al., 2000) qui montrent comment les différents intervenants peuvent dans certains cas s'aligner au niveau du site actif de l'E3, de nombreuses questions, mécanistiques notamment, restent posées.

Les pathologies associées aux ubiquitine ligase E3
Le système ubiquitine est impliqué dans la pathologie de nombreuses maladies génétiques humaines dont les syndromes d'Angelman et de Liddle. Le syndrome d'Angelman est un défaut rare et héréditaire se traduisant par un retard mental associé à une mutation de la protéine à domaine HECT, E3 (Kishino, T et al ;, 1997 ; Matsuura, T. et al., 1997). Le syndrome de Liddle impliquant l'ubiquitine ligase à domaine HECT, Nedd4, est une forme rare et héréditaire d'hypertension causée par la délétion de régions du canal sodique épithélial (ENaC) qui le cible pour la dégradation dépendante de l'ubiquitine (Staub 0 et al., 1996). Cela se traduit par une hyperactivité de ce canal. L'accumulation de produits conjugués à l'ubiquitine est aussi une des caractéristiques de nombreuses maladies neurologiques comme la maladie d'Alzheimer (Checler F et aL, 2000). Cette accumulation est en fait une conséquence des tentatives avortées de la cellule pour se débarasser de protéines abimées ou anormales. Une protéolyse accélérée a également été associée à une atrophie des muscles squelettiques (Wing S. et aL, 1995).

Les cancers se développent quand les cellules se multiplient trop rapidement. La prolifération cellulaire dépend d'un équilibre entre les signaux négatifs et les signaux positifs. Quand les signaux positifs sont supérieurs ou que les signaux négatifs sont absents, les cellules se multiplient trop rapidement et le cancer se développe. Normalement, les cellules contrôlent précisément la quantité d'une protéine donnée et éliminent l'excès ou toute protéine non requise. Pour ce faire, la cellule marque spécifiquement ces protéines indésirables avec une longue chaîne d'ubiquitine. Ces molécules sont alors reconnues et détruites par le protéasome. Cependant, cette machinerie s'enraille dans les tumeurs conduisant à l'accumulation excessive de signaux positifs (protéines oncogéniques), ou à la dégradation anormale de régulateurs négatifs (suppresseurs de tumeurs). En conséquence, en l'absence de suppresseurs de tumeur ou en présence d'un excès d'oncogènes, les cellules se multiplient sans cesse, formant des tumeurs (pour revue, voir Ciechanover, 1998). Ainsi, les dégradations anormales par la voie ubiquitine du suppresseur de tumeur p53 et de l'oncogène putatif ss- caténine ont été corrélées au développement de tumeurs, suggérant que

certains gènes codant des enzymes d'ubiquitination pourraient être mutés dans les tumeurs.

La dégradation non contrôlée de certains régulateurs du cycle cellulaire a été observée dans certaines tumeurs, il est donc possible qu'une ubiquitine ligase fonctionnant mal soit la cause de ces dégradations altérées de régulateurs du cycle. Ainsi, la surexpression de Mdm2, une ubiquitine ligase, induit une diminution notable de la quantité de son substrat, le suppresseur de tumeur p53.

Vu l'importance des voies de signalisation auxquelles ils participent, les complexes E3 constituent des cibles attractives de criblage pharmacologique. D'ores et déjà, il a été établi que le disfonctionnement de la voie de dégradation des protéines ubiquitine-protéasome est clairement impliqué dans de nombreuses pathologies de nature extrêmement variée : les cancers, les maladies génétiques, la maladie de parkinson, la maladie d'Alzheimer, les syndromes inflammatoires et les infections virales.

La caractérisation d'agents chimiques capables de moduler l'activité de reconnaissance et d'ubiquitination des ubiquitine-ligases E3 est donc susceptible de permettre la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques humaines dans de nombreuses aires thérapeutiques comme le cancer, l'inflammation, les infections virales, bactériennes et fongiques, les syndromes inflammatoires, les pathologies cardio-vasculaires et neurodégénératives.

SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet de nouvelles protéines à domaine HECT et de nouveaux substrats des protéines à domaine HECT. Elle a pour objet les méthodes de criblage mises au point pour identifier les substrats des nouvelles protéines à domaine HECT et pour identifier les petites molécules et drogues qui modulent l'interaction et/ou l'activité des protéines à domaine HECT et de leurs substrats. Les méthodes de criblage de cette invention peuvent être utilisées pour identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés dans des protocoles et pour le traitement de diverses pathologies, incluant cancer, inflammations, pathologies cardio-vasculaires, maladies neuro-dégénératives, infections virales, bactériennes et fongiques.

Cette invention englobe l'utilisation des nucléotides codant ces nouvelles

protéines à domaine HECT, les protéines à domaine HECT et les peptides dérivants de ces protéines, les vecteurs permettant l'expression de ces protéines chez des bactéries, champignons, insectes, plantes et organismes mammifères ainsi que les animaux chez lesquels les gènes codant ces protéines à domaine HECT auront été inactivés.

Un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID ? 11, ou pour un fragment ou un variant du polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID D ? 11.

Selon l'invention, le fragment du polypeptide à domaine HECT comprend ou consiste en le peptide définissant le domaine HECT stricto sensu d'un polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID ? 11.

Selon l'invention, un fragment du polypeptide à domaine HECT comprend ou consiste en un polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N011 dans lequel a été délétée la séquence en acides aminés du domaine HECT stricto sensu.

Un acide nucléique tel que défini ci-dessus peut en outre être caractérisé en ce que le polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide est fusionné avec un polypeptide hétérologue, par exemple un marqueur détectable ou la protéine GAL4.

L'invention est également relative à des vecteurs recombinants, de clonage ou d'expression, contenant un acide nucléique selon l'invention, le cas échéant sous le contrôle d'une séquence régulatrice permettant son expression dans une cellule hôte choisie.

Elle concerne aussi des cellules hôtes recombinantes dans lesquelles a été artificiellement inséré un acide nucléique ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet un polypeptide à domaine HECT comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID ? 11, un fragment ou un variant de ce polypeptide, ainsi que des anticorps dirigés contre ce polypeptide ou encore le fragment ou le variant de celui-ci..

Elle est également relative à des procédés de criblages cellulaires ou cellulaires de composés candidats interagissant avec un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus.

Elle concerne aussi des procédés de criblages de composés candidats modulant la force de l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT selon l'invention et une protéine substrat, ainsi que des procédés de criblage de composés candidats capables d'inhiber ou d'activer l'activité ubiquitine ligase de la protéine à domaine HECT spécifiée par le polypeptide considéré.

Elle a encore pour objet une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique ou d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles..

Elle concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

DEFINITIONS GENERALES
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984) et AUSUBEL et al. (1994).

De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.

Le terme" isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé

du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.

Le terme"purifié"ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.

Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.

Aux fins de la présente description, l'expression" séquence nucléotidique"peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression"séquence nucléotidique"englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Les termes"acide nucléique","polynucléotide","oligonucléotide"ou encore"séquence nucléotidique"englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.

Le terme"nucléotide"désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04064.

Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant"complémentaire"d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.

Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 95% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 95%, de préférence au moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99, 1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.

Le"pourcentage d'identité"entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des"gaps") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.

Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides comparés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.

De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.

Un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les"variants"d'un acide nucléique selon l'invention.

Par"variant"d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.

En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique" variant" sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques

très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant.

Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant.

De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.

De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.

Par"fragment"d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12,15, 18,20, 25,30, 35,40, 45,50, 60,100, 150,200, 300,400, 500,1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendue limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.

Par fragment d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention, on entend un fragment polypeptidique d'une longueur réduite par rapport au polypeptide de référence, le fragment polypeptidique possédant une séquence en acides aminés identique à la séquence en acides aminés du polypeptide de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention possèdent au moins 5,10, 15, 20,25, 30,40, 50,60, 100,120, 130,140, 150,160, 170,180, 190,200, 210, 220,230, 240,250, 260,270, 280,290, 300,310, 320,330, 340,350, 360,

370,380, ou 390 acides aminés consécutifs d'un polypeptide à domaine HECT de référence
Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes :

Préhybridation : mêmes conditions que pour l'hybridation durée : 1 nuit.

Hybridation :
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)

5 x Denhardt's (0. 2% PVP, 0. 2% Ficoll, 0. 2% SAB) 100 ug/mt ADN de sperme de saumon
0.1% SDS durée : 1 nuit.

Lavages :
2 x SSC, 0.1% SDS 10 min 650C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.1 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C.

Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation :
Tm= 81,5 + 0,41 (% G+C) +16,6 Log (concentration en cations)-0, 63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9. 62).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en-dessous de Tm.

Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites sont mises en oeuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique de 20 bases de longueur et peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.

Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).

En particulier, il faut prendre en compte que le niveau et la spécificité d'hybridation dépendent de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en base de la sonde ou de l'amorce, les paires de bases G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologue entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants, tels que des agents favorisant la rupture de liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'incubation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils

accroissent les concentrations effectives de la sonde ou de l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre l'alignement des séquences d'acides aminés correspondant au domaine HECT des différentes protéines selon l'invention.

La figure 2 est une représentation schématique des protéines à domaine HECT. Les domaines putatifs d'interaction protéine-protéine sont représentés. La double barre oblique indique que les ADNs complémentaires correspondant sont incomplets en 5'et/ou en 3'. Dans la légende, HECT signifie Homologous to E6-AP Carboxyl-Terminus, WW signifie domaine avec deux résidus Trp conservés, C2 signifie motif de liaison de Ca2+ ou de certains types de lipides, RCC1 signifie Regulator of Chromosome Condensation, IQ signifie petit motif de liaison de la calmoduline avec des résidus lle et Gin et RING signifie un motif de type doigt de zinc.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention de nouveaux polypeptides à domaine HECT impliqués dans l'ubiquitination des protéines cellulaires, étape importante dans la voie de dégradation des protéines.

La caractérisation de ces nouveaux polypeptides à domaine HECT selon l'invention rend possible la mise au point de nouveaux outils diagnostiques pour la détection d'altérations dans l'activité biologique des ubiquitine ligase à domaine HECT et de nouveaux outils thérapeutiques destinés à prévenir ou corriger ces altérations dans l'activité biologique des ubiquitine ligases à domaine HECT.

Les nouveaux polypeptides à domaine HECT selon l'invention sont les polypeptides suivants : - le polypeptide HECT9 de séquence en acides aminés SEQ ID N01 ; - le polypeptide HECT17de séquence en acides aminés SEQ ID D ? 2 ; - le polypeptide HECT18 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 3 ; - le polypeptide HECT19 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 4 ;

- le polypeptide HECT20 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 5 ; - le polypeptide HECT21 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 6 ; - le polypeptide HECT22de séquence en acides aminés SEQ ID ? 7 ; - le polypeptide HECT23 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 8 ; - le polypeptide HECT24 de séquence en acides aminés SEQ ID N 9 ; - le polypeptide HECT25 de séquence en acides aminés SEQ ID N010 ; - le polypeptide HECT26 de séquence en acides aminés SEQ ID N011 ;
Le polypeptide HECT9 possède une homologie de séquence avec la protéine Pub1 de S. pombe.

Les polypeptides HECT17, HECT18, HECT19, HECT20, HECT21, HECT22, HECT23, HECT24, HECT25, HECT26 possèdent des homologies avec des protéines référencées dans la base de données SMART.

Un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID ? 11, ou pour un fragment ou un variant du polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID ? 11.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le polypeptide à domaine HECT codé par un acide nucléique tel que défini ci-dessus consiste en une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID ? 11, ou pour un variant ou un fragment de ce polypeptide.

De préférence, un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT selon l'invention comprend un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 12 à SEQ ID N 22, ainsi que les séquences nucléotidiques qui en sont dérivées et qui comprennent le cadre de lecture ouvert contenu dans les séquences SEQ ID D ? 12 à SEQ ID N022.

Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes : - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 21 jusqu'au nucléotide en position 4775 de la séquence SEQ ID N 12 (hect9) ;

- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 4891 de la séquence SEQ ID N 13 (hect17) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2066 jusqu'au nucléotide en position 3754 de la séquence SEQ ID N 14 (hect18) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 4860 de la séquence SEQ D ? 15 (ec9) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 304 jusqu'au nucléotide en position 3552 de la séquence SEQ ID N016 (hect20) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 472 jusqu'au nucléotide en position 2940 de la séquence SEQ ID N'17 (hect2l) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 172 jusqu'au nucléotide en position 801 de la séquence SEQ ID N 18 (hect22) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 201 jusqu'au nucléotide en position 1337 de la séquence SEQ ID N'19 (hect23) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 496 jusqu'au nucléotide en position 3339 de la séquence SEQ ID N020 (hect24) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 184 jusqu'au nucléotide en position 4899 de la séquence SEQ ID N 21 (hect25) ; - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 120 jusqu'au nucléotide en position 2237 de la séquence SEQ D N 22 (hect26) ;
Font également partie de l'invention les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour un polypeptide ayant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe des séquences SEQ D N 1 à SEQ ID N011 ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue ; b) un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi parmi les séquences SEQ D ? 12 à SEQ D N 22, ou un fragment ou un variant de ce dernier ; c) un acide nucléique ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N012 à SEQ ID N022 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N 12 à SEQ ID N'22, ou un fragment ou un variant de ce dernier.

L'invention concerne aussi un polypeptide comprenant le domaine HECT d'un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus. Elle est également relative à un polypeptide consistant en le domaine HECT d'un polypeptide selon l'invention.

Le domaine HECT d'un polypeptide selon l'invention est considéré comme un fragment d'un tel polypeptide aux fins de la présente description.

Ainsi, fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence allant de l'acide aminé en position 1248 jusqu'à l'acide aminé en position 1585 de la séquence SEQ ID Nol ; b) la séquence allant de l'acide aminé en position 1259 jusqu'à l'acide aminé en position 1624 de la séquence SEQ ID N 2 ; c) la séquence allant de l'acide aminé en position 230 jusqu'à l'acide aminé en position 567 de la séquence SEQ D ? 3 ; d) la séquence allant de l'acide aminé en position 1153 jusqu'à l'acide aminé en position 1620 de la séquence SEQ ID N 4 ; e) la séquence allant de l'acide aminé en position 742 jusqu'à l'acide aminé en position 1083 de la séquence SEQ ID N05 ; f) la séquence allant de l'acide aminé en position 481 jusqu'à l'acide aminé en position 823 de la séquence SEQ D ? 6 ; g) la séquence allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 206 de la séquence SEQ D ? 7 ; h) la séquence allant de l'acide aminé en position 48 jusqu'à l'acide aminé en position 372 de la séquence SEQ D ? 8 ; i) la séquence allant de l'acide aminé en position 618 jusqu'à l'acide aminé en position 947 de la séquence SEQ ID N'g ; j) la séquence allant de l'acide aminé en position 1235 jusqu'à l'acide aminé en position 1572 de la séquence SEQ ID N 10 ; k) la séquence allant de l'acide aminé en position 373 jusqu'à l'acide aminé en position 694 de la séquence SEQ ID N011 ;

Pour obtenir une délétion totale ou partielle de la boîte HECT, l'homme du métier peut, par exemple, mettre en oeuvre une digestion enzymatique de l'acide nucléique codant le polypeptide considéré en utilisant les sites de restriction flanquants, par exemple selon la technique décrite par MRGOTTIN et al. (Margottin F. et al., 1998, Molecular cell, 1 : 565-574).

Les acides nucléiques codant un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus peuvent être facilement obtenus par l'homme du métier, par exemple à partir d'un échantillon d'ADN humain ou encore à partir d'une banque d'ADN humain, à l'aide d'amorces spécifiques de l'une des séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID N022, par exemple par amplification PCR.

Comme cela sera exposé plus loin dans la description, l'expression d'un variant d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention, dans lequel le domaine HECT a été complètement ou partiellement délétée, ou muté peut être recherchée dans le cas où l'on désire obtenir une diminution ou un blocage de la dégradation du substrat spécifique. Un tel variant d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention peut conserver sa capacité à interagir spécifiquement avec le substrat, mais n'est plus capable d'ubiquitiner ce substrat.

Selon un autre aspect, l'invention est donc aussi relative à un acide nucléique codant pour un variant d'un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus, dans la séquence duquel tout ou partie de la séquence du domaine HECT a été délétée.

Par délétion partielle du domaine HECT, on entend la suppression d'au moins 2, de préférence d'au moins 5,6, 7,8, 9,10, 12,14, 16,18, 20, 22,24, 26,30, 40,50, 60,70, 80,90, 100110, 120,130, 140,150, 160,170, 180,190, 200,210, 220,230, 240,250, 260,270, 280,290, 300,310, 320, 330,340 ou 350 acides aminés consécutifs de la séquence du domaine HECT d'un polypeptide selon l'invention, la longueur de la délétion étant limitée par la longueur en acides aminés d'un domaine HECT dans chacun des polypeptides à domaine HECT selon l'invention.

Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant pour un variant d'un polypeptide à domaine HECT dans la séquence duquel la séquence du domaine HECT a été complètement ou partiellement délétée est choisi parmi les acides nucléiques suivants :

a) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N012 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé

en position 1248 jusqu'à l'acide aminé en position 1585 de la séquence SEQ ID N012 ; b) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID ? 13 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1259 jusqu'à l'acide aminé en position 1624 de la séquence SEQ ID D ? 13 ; c) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N014 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 230 jusqu'à l'acide aminé en position 567 de la séquence SEQ ID N 14 ; d) un polypeptide comprenant la séquence SEO ID N015 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1153 jusqu'à l'acide aminé en position 1620 de la séquence SEQ ID N 15 ; e) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N016 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé

en position 742 jusqu'à l'acide aminé en position 1083 de la séquence SEQ ID N016 ; f) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N 17 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 481 jusqu'à l'acide aminé en position 823 de la séquence SEQ ID N017 ; g) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N 18 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 206 de la séquence SEQ ID N018 ; h) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N019 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 48 jusqu'à l'acide aminé en position 372 de la séquence SEQ ID N 19 ; i) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N020 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé

en position 618 jusqu'à l'acide aminé en position 947 de la séquence SEQ ID ? 20 ; j) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID ? 21 dans lequel a

été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1235 jusqu'à l'acide aminé en position 1572 de la séquence SEQ ID N021 ; k) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID ? 22 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 373 jusqu'à l'acide aminé en position 694 de la séquence SEQ ID ? 22 ;
Selon un autre mode de réalisation d'un acide nucléique selon l'invention, cet acide nucléique est caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide à domaine HECT, ou un variant ou un fragment de ce polypeptide, qui est fusionné avec un polypeptide hétérologue.

Par polypeptide hétérologue , on entend une séquence d'acides aminés qui n'est pas exprimée naturellement par la cellule sous une forme chimiquement liée à un polypeptide à domaine HECT tel que défini cidessus.

Selon un premier mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un polypeptide capable de se fixer sélectivement sur un support, tel que la glutathione S transferase ou GST, bine connue de l'homme du métier.

Selon un second mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un polypeptide détectable, par exemple un polypeptide fluorescent comme les protéines GFP et YFP, bien connues de l'homme du métier.

Selon un troisième mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un polypeptide accepteur ou donneur de fluorescence utilisable dans des systèmes de détection d'interactions par transfert d'énergie de fluorescence (ou FRET pour Fluorescence Résonance Energy Transfer ).

Selon un quatrième mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, pour une utilisation dans des systèmes de détection

d'interactions du type double-hybride bien connus de l'homme du métier.

Un tel polypeptide peut être, par exemple, la protéine GAL4 ou la protéine LexA.

Selon encore un autre aspect d'un acide nucléique selon l'invention, cet acide nucléique comprend un polynucléotide régulateur contrôlant l'expression du polypeptide à domaine HECT ou de son fragment ou variant, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue, dans une cellule hôte. Des exemples illustratifs de polynucléotides régulateurs préférés selon l'invention sont listés ci-dessous dans la partie descriptive des vecteurs recombinants préférés.

Fait aussi partie de l'invention tout acide nucléique dont la séquence est complémentaire à l'un des acides nucléiques tels que définis dans la présente description.

Vecteurs recombinants
Tout acide nucléique selon l'invention peut être inséré dans un vecteur à des fins de clonage ou à des fins d'expression.

L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant pur un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue et pour lequel ledit acide nucléique a été artificiellement inséré dans le vecteur.

Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour un polypeptide ayant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe des séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N011 ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue ; b) un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi parmi les séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID N022, ou un fragment ou un variant de ce dernier

c) un acide nucléique ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N012 à SEQ ID N022 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID N022, ou un fragment ou un variant de ce dernier.

Par"vecteur"au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.

Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.

Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.

Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des enhanceurs ; (2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.

En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.

A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.

Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.

De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par FULLER et al.

(1996).

Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223- 3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, ETATS-UNIS).

On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60. pQE9 (Qiagen), psi174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).

Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda.

Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.

Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par FLOTTE et al. (1992), SAMULSKI et ai. (1989), ou encore McLAUGHLIN BA et al. (1996).

Cellules hôtes recombinantes
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante qui a été artificiellement transfectée ou transformée par un acide nucléique ou par un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus.

De préférence, une cellule hôte recombinante selon l'invention est une cellule eucaryote, et de manière tout à fait préférée une cellule hôte recombinante humaine.

Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes : a) cellules hôtes procaryotes : souches d'Escherichia coli (souche DH5-a), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et
Staphylococus ;

b) cellules hôtes eucaryotes : cellules HeLa (ATCC N CCL2), cellules Cv 1 (ATCC N CCL70), cellules COS (ATCC N CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N CRL 1711), cellules CHO (ATCC N CCL-61) ou encore cellules 3T3 (ATCC N CRL-6361).

Polypeptides de l'invention
Selon un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N011, ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue..

L'invention est relative à un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue, caractérisé en ce qu'il est codé par un acide nucléique tel que défini dans la présente description.

L'invention concerne aussi un polypeptide comprenant au moins 15 acides aminés consécutifs d'une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID N'l à SEQ ID N 11, ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue.

L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 11, ou un fragment ou un variant de ce polypeptide.

De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.

L'invention concerne aussi un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1,2, 3,4, 5,10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence en acides aminés d'un polypeptide de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 11, ou encore d'un fragment ou d'un variant de ce dernier.

L'invention est également relative à un procédé pour la production de l'un des polypeptides de séquences SEQ D N 1 à SEQ ID N 11 ou d'un

fragment peptidique ou d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des Iysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.

Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art.

Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.

A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par HOUBEN WEYL (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a ; 1965b).

Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues" à l'un quelconque des polypeptides de séquences d'acides aminés SEQ ID N01 à SEQ ID ? 11, ou de leurs fragments ou variants.

De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence.

On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide

pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par KOCH (1977).

Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.

Font également partie de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (CO-CH2).

De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés. Ces polypeptides conserveront également leur capacité à reconnaître leur substrat spécifique et/ou partenaires potentiels avec lesquels ils se lient.

Anticorps
Les polypeptides selon l'invention, en particulier les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N01 à SEQ ID N011 ou les fragments et les variants de ces derniers ainsi que les peptides homologues peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps.

Par"anticorps"au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, Fab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.

Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975).

La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).

L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US No 4,946, 778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).

Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages RIDDER et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés REIMANN et al. (1997) ; LEGER et al., (1997).

Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'antigènes présents dans un échantillon.

Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, par exemple fluorescent ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Ainsi, la mention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus ; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.

L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic ou pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps tel que défini ci-dessus ; b) un réactif permettant la détection des complexes antigène/anticorps formés.

Sondes et amorces nucléotidiaues
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des

séquences nucléotidiques SEQ ID ? 12 à SEQ ID ? 22 sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID ? 22 ou encore d'un fragment ou d'un variant de cette dernière dans un échantillon.

Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins huit nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ D ? 12 à SEQ ID N022, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10,12, 15,18 ou 20 à 25,35, 40,50, 70, 80,100, 200,500, 1000,1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique

choisie parmi les séquences SEQ ID N012 à SEQ ID N022 ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15,18, 20,25, 35,40, 50,100, 200,500, 1000,1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N012 à SEQ ID N022, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide

nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID ? 22 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.

Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU N EP 0 707 592.

Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peuvent être marqués, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (P, 33p,, 3H, 35S,), des molécules fluorescentes (5bromodeoxyuridine, fluorescéine 1 acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5'ou 3' Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou encore dans des hybridations à l'ARN messager correspondant lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.

Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.

Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticles telles que des particules de latex.

En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ciavant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de : 1) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ; 2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.

Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 12 à SEQ ID ? 22 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.

Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les"puces à ADN". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US No 5,143, 854, dans les demandes PCT NO WO 90/150 70 et 92/10092.

Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N05, 412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995.

Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID N"22, ou encore un variant de celui-ci.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID N012 à SEQ ID N022 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de :

a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.

Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini cidessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.

L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID N022, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.

Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.

Procédés de cribla-ges Identification des partenaires ou des cibles des protéines à domaine HECT
L'invention concerne aussi des procédés de criblage de composés candidats interagissant avec un polypeptide à domaine HECT tel que défini dans la présente description.

La première étape vers l'utilisation des protéines à domaine HECT comme cible thérapeutique est l'identification des substrats ciblés pour la dégradation par ces composants. L'identification et la caractérisation de ces cibles peuvent notamment apporter des informations essentielles sur les mécanismes biologiques dans lesquels elles interviennent.

Les méthodes pour identifier les polypeptides qui interagissent avec les protéines à domaine HECT de la présente invention sont variées et comprennent les expériences de double hybride chez la levure ainsi que les méthodes de phage display ; ces méthodes présentent l'avantage que la séquence nucléique codant les peptides interactant est identifiée simultanément, au contraire d'autres méthodes plus biochimiques qui nécessitent un séquençage protéique.

Le double hybride chez la levure peut être utilisé pour cribler une banque d'expression d'ADNc de mammifères (humaines), où un ADNc est fusionné au domaine de liaison à l'ADN ou au domaine activateur de GAL4, et l'acide nucléique codant le peptide d'intérêt, comme la protéine cible, est fusionné également soit au domaine activateur soit au domaine de liaison a l'ADN de GAL4 respectivement (Gyuris et aL, 1993). Le double hybride a été développé afin de détecter des interactions protéine-protéine spécifiques. Un des aspects de la présente invention est d'utiliser une protéine pour détecter des interactants. Cette protéine, qui peut être une protéine à domaine HECT (tronquée ou non), est utilisée comme appât pour identifier un ou des substrats cible potentiels. Alternativement, des substrats cibles d'intérêt peuvent être utilisés pour identifier l'ubiquitine ligase ou le complexe ubiquitine ligase responsable de sa dégradation.

Le ou les polypeptides cibles peuvent également être identifiés par la technologie de"phage display". Une banque de"phage display"est une banque d'expression protéique construite dans un vecteur de type phagique qui exprime une collection de séquences protéiques clonées en fusion avec une protéine de la paroi du phage. Cette construction particulière permet l'expression da la protéine de fusion à l'extérieur de la particule phagique.

Cette disposition favorise donc l'interaction entre la protéine recombinante exposée au niveau de la paroi et une protéine ligand immobilisée. La protéine à domaine HECT est par exemple immobilisée sur une matrice solide et une solution contenant les phages est passée sur ce support. On analyse alors les phages retenus et la nature de la protéine qu'ils expriment.

Les partenaires cible d'une protéine à domaine HECT pourront également être identifiés de la manière suivante. Un peptide correspondant à une protéine à domaine HECT concernée par la présente invention ayant subi ou non des modifications post-traductionnelles est immobilisé sur une

résine, par exemple une résine activée NHS-sepharose&commat; (pharmacia). Un lysat cellulaire, par exemple de cellules HELA ou d'autres cellules appropriées est fractionné sur la colonne d'affinité préparée selon une méthode standard. Après lavage, les protéines retenues sur la colonne sont éluées en augmentant la force ionique des lavages ou par élution compétitive avec des peptides représentant le domaine HECT en partie ou dans son intégralité. Les protéines cellulaires sont ensuite identifiées par une ou l'autre des combinaisons de techniques mentionnées ci-dessous : fractionnement sur gel SDS PAGE, suivi ou non d'un western-blot, une fois purifiées du gel et éventuellement hydrolysées partiellement les protéines pourront être caractérisées plus avant en utilisant le micro-séquencage peptidique ou l'analyse par MALDI-TOF.

Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci- dessus avec au moins un composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit polypeptide et le ou les composé (s) candidat (s).

Le procédé de criblage ci-dessus peut en outre être caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) caractériser le ou les composé (s) candidat (s) ayant formé un complexe avec le polypeptide à domaine HECT.

Selon un premier mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus, le polypeptide à domaine HECT est préalablement immobilisé sur un support.

Selon un second mode de réalisation particulier, le ou les composé (s) candidat (s) sont initialement contenus dans le lysat cellulaire d'une culture de cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines.

Selon un troisième mode de réalisation, le composé candidat est le produit d'expression d'un phage constitutif d'une collection combinatoire de clones de phages ( phage display ).

L'invention est également relative à un procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

a) cultiver une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture approprié, de telle manière à ce que ladite cellule hôte produise un polypeptide à domaine HECT selon l'invention ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et d'autres composés produits par la cellule hôte.

Selon un mode particulier de réalisation du procédé de criblage cidessus, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il s'agit d'un système doublehybride dans lequel la cellule hôte transfectée à l'étape a) est transfectée avec un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide qui est fusionné avec un polypeptide hétérologue, ledit polypeptide hétérologue consistant en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, pour une utilisation dans des systèmes de détection d'interactions du type double-hybride bien connus de l'homme du métier. Un tel polypeptide peut être, par exemple, la protéine GAL4 ou la protéine LexA.

Selon ce même mode de réalisation particulier du procédé de criblage ci-dessus, la cellule hôte recombinante est en outre co-transfectée avec un acide nucléique codant le composé candidat sous une forme fusionnée avec le second partenaire protéique mentionné ci-dessus. De cette manière, l'interaction entre le polypeptide à domaine HECT, ou son fragment ou son variant, et le composé candidat est détecté par visualisation de l'activation ou au contraire de l'inhibition du gène rapporteur également contenu dans la cellule hôte recombinante co-transfectée.

L'invention concerne aussi un composé se liant à un polypeptide à domaine HECT tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par l'un des procédés de criblages ci-dessus.

Identification de composés qui modulent l'interaction des protéines à domaine HECT avec d'autres protéines
L'invention est également relative à des procédés de criblage de composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine cible spécifique, ou alternativement entre un polypeptide à domaine HECT et un ou plusieurs partenaires protéiques éventuels.

Une fois qu'un substrat d'une protéine à domaine HECT ou qu'une protéine capable d'interagir avec cette protéine à domaine HECT est identifiée, la recherche de modulateurs de l'interaction peut alors être entreprise. La présente invention présente des méthodes pour identifier des drogues qui sont soit des agonistes soit des antagonistes de la fonction cellulaire normale des protéines à domaine HECT, ou du rôle des protéines à domaine HECT dans la pathogenèse de la prolifération et/ou différenciation cellulaire normale ou anormale provoquée par l'ubiquitination d'une protéine par un processus dépendant d'une protéine à domaine HECT. Les tests évaluent l'habilité d'un composé à moduler l'association et/ou l'ubiquitination d'une protéine cible (cellulaire ou virale) par une protéine à domaine HECT. De tels modulateurs peuvent être utilisés par exemple dans le traitement de désordres prolifératifs ou différenciatifs, pour moduler l'apoptose et dans le traitement d'infections virales.

Une variété de méthodologies est applicable à ces études. Les méthodologies qui permettent l'ubiquitination d'une protéine cible par une voie dépendante des protéines à domaine HECT incluent les systèmes cellulaires, utilisant par exemple des protéines purifiées ou des Iysats, ainsi que des systèmes cellulaires utilisant des cellules intactes (cellules de mammifères, humaines, d'insecte ou de levure). Des expériences de simple liaison peuvent aussi être utilisées pour détecter les agents qui empêchent l'ubiquitination en se liant par exemple au substrat ou à la protéine à domaine HECT. Les agents testés pour être des inhibiteurs peuvent être produits par des bactéries, des levures ou d'autres organismes (produits naturels) ou produits chimiquement (petites molécules nucléiques ou chimiques).

Dans de nombreux programmes de criblage de drogues qui testent des banques de composés, des criblages à haut débit (high throughput assays) sont préférables afin de maximiser le nombre de composés testés dans une même expérience.

Tests dans des systèmes cellulaires
Ces méthodes peuvent être utilisées pour identifier des composés capables d'interagir avec une protéine à domaine HECT ou un de ses partenaires pour modifier l'activité de la protéine à domaine HECT ou de son

partenaire. Un tel composé peut par exemple modifier la structure d'une protéine à domaine HECT ou de son partenaire et donc en affecter l'activité.

Ces tests peuvent également être utilisés pour identifier des composés qui modulent l'interaction de la protéine à domaine HECT et d'un partenaire de cette protéine. Un tel système a été utilisé pour reconstituer, par exemple, la polyubiquitination de la protéine p53 par E6-AP (Yabuki, N. et al., 1999).

Ces tests consistent essentiellement en un mélange réactionnel comprenant la protéine à domaine HECT, le composé à tester ou une banque de composés en présence ou non du partenaire de liaison. Les composés testés peuvent être un dérivé du partenaire de la protéine à domaine HECT, par exemple un peptide cible inactif, ou une petite molécule chimique ou nucléique (aptamères). Un exemple de criblage de cette invention pourrait consister à détecter la formation d'un complexe entre une protéine à domaine HECT de l'invention et un de ses partenaires en présence d'un composé ou d'une banque de composés. Pour la détection, la molécule peut être marquée avec un marqueur spécifique, et le ou les composés (s) par un marqueur différent. L'interaction du composé avec la protéine à domaine HECT ou le partenaire de la protéine à domaine HECT peut être détecté en déterminant le niveau des deux marquages après une étape d'incubation et de lavage. Si les deux marquages sont présents cela signifie qu'il y a eu interaction.

Une interaction entre deux molécules peut également être déterminée en utilisant l'analyse d'interaction biomoléculaire (BIA) en temps réel qui détecte la résonance plasmonique de surface, un phénomène optique. La détection dépend des changements dans la concentration de masse des macromolécules sur l'interface, et ne requiert aucun marquage préalable.

Une banque de composés à tester peut être immobilisée sur une surface sensible. Une solution contenant la protéine à domaine HECT ou un partenaire de cette protéine est alors versée en continue sur cette surface.

Un changement dans l'angle de résonance détectable grâce à un enregistrement des signaux indique qu'une interaction s'est produite. Cette technique est décrite dans le livre BlAtechnology de Pharmacia.

Un autre exemple d'expérience de criblage de la présente invention inclut les étapes de : (a) réaliser un mélange réactionnel comprenant, une protéine à domaine HECT, un partenaire de cette protéine, et un composé à

tester ; (b) détecter l'interaction entre la protéine à domaine HECT et son partenaire. Cette protéine à domaine HECT et son partenaire peuvent être produites par une technologie recombinante, être purifiées ou synthétisées chimiquement. Un changement statistique significatif (activation ou inhibition) dans l'interaction de la protéine à domaine HECT et de son partenaire en présence d'un composé indique un agoniste potentiel (mimétique ou activateur) ou antagoniste (inhibiteur). L'efficacité du composé peut être testée en effectuant des études de dose-réponse en utilisant différentes concentrations du composé.

La formation d'un complexe entre une protéine à domaine HECT et son partenaire peut être détectée par une variété de techniques. La modulation de la formation des complexes peut être quantifiée en utilisant par exemple des protéines marquées détectables grâce à un radiomarquage, un marquage fluorescent ou enzymatique.

Typiquement, il est souhaitable d'immobiliser la protéine à domaine HECT ou son partenaire pour faciliter la séparation des complexes des formes non complexées et faciliter l'automatisation de l'expérience. La liaison peut être réalisée dans des plaques de microtitration, des tubes à essais, des microtubes, toute vaisselle permettant de contenir les différents réactifs. Une protéine de fusion peut être produite qui permet la liaison de la, protéine à une matrice. Par exemple, des protéines de fusion à domaine HECT/GST (glutathione S transferase) peuvent être adsorbées sur des billes de sépharose qui sont ensuite mis en présence du partenaire marqué au 35S et du composé testé. Ce mélange est incubé dans des conditions favorables à la formation du complexe, des conditions physiologiques en terme de sel et de pH par exemple. Apres cette incubation, les billes sont lavées pour retirer tout matériel non fixé, la matrice immobilisée et la radioactivité déterminée directement (les billes sont placées dans du liquide à scintillation par exemple), ou dans le surnageant après dissociation des complexes. Les complexes peuvent également être dissociés de la matrice, séparés par une électrophorèse de type SDS-PAGE, et le niveau de protéine à domaine HECT ou de partenaire trouvé dans la fraction de bille quantifié sur gel en utilisant les techniques d'électrophorèse standard.

L'interaction entre deux molécules peut également être déterminée en utilisant la technique de FRET (Fluorescence résonance energy transfert). Le

principe est basé sur le fait que le transfert d'énergie qui se produit entre deux fluorophores quand ils sont proches ( < 10nm), et que le spectre d'émission du premier fluorophore (le donneur) recouvre le spectre d'excitation du second (l'accepteur). Une association étroite entre deux fluorophores adaptés et l'excitation du donneur, se traduit donc par une augmentation de la fluorescence de l'accepteur et/ou une diminution de la fluorescence du donneur par FRET (Herman, 1989). Cette technique peut notamment être appliquée à l'étude de l'interaction entre des protéines à domaine HECT et leurs substrats et être utilisée pour identifier des inhibiteurs ou des activateurs de l'interaction. Comme le FRET est une méthode spectroscopique non destructive pour mesurer les interactions moléculaires, elle peut se faire sur des cellules vivantes.

L'invention est donc aussi relative à un procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à boîte à domaine HECT et un partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci- dessus, une protéine partenaire et le composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine partenaire.

Test dans des systèmes cellulaires
L'invention fournit également des méthodes expérimentales cellulaires pour identifier des agents agonistes ou antagonistes modulant l'activité des protéines à domaine HECT. L'effet d'un composé sur l'expression d'un gène codant une protéine à domaine HECT peut être déterminé par des expériences de transfection en utilisant un gène rapporteur. Ce gène rapporteur peut être n'importe quel gène codant une protéine quantifiable, par exemple la luciférase ou le gène CAT. Le niveau d'expression de ce gène rapporteur est alors déterminé en présence ou en l'absence du composé. Des tests cellulaires utilisables pour détecter des inhibiteurs des activités ubiquitine ligase ont déjà été décrits qui utilisent des protéines fusionnées à la GFP comme substrats (Dantuma, N., 2000). Une approche similaire a également été utilisée pour étudier l'ubiquitination de c-jun en utilisant une protéine de fusion c-jun-ss-galactosidase (Treier, M. et al., 1994).

Le même principe pourra être utilisé pour étudier la protéolyse dépendante de l'ubiquitine de n'importe quelle protéine cellulaire en construisant la fusion appropriée.

Une autre application des méthodes cellulaires est le double hybride chez la levure (Gyuris et al., 1993), adapté à l'isolement de peptides naturels (provenant par exemple d'une banque d'expression d'ADNc), ou synthétiques (d'une banque d'expression de cadres de lecture au hasard), interagissant avec un polypeptide de l'invention. Ce polypeptide interactant peut ensuite être utilisé pour détecter une augmentation ou une diminution de son interaction avec la protéine à domaine HECT, permettant donc l'identification d'agonistes ou d'antagonistes.

Le système de conjugaison peut être effectué dans des cellules entières, tirant avantage des techniques de culture cellulaire. Par exemple, le système de conjugaison peut être constitué dans un système de cellules eucaryotes en culture, y compris les cellules de mammifères et de levure. Les avantages d'effectuer l'expérimentation dans une cellule intacte incluent la possibilité de détecter des inhibiteurs qui sont fonctionnels dans un environnement plus proche de celui que l'utilisation thérapeutique de l'inhibiteur nécessitera, incluant la capacité de l'agent de rentrer dans la cellule. De plus, certaines des expériences in vivo sont compatibles avec une analyse à grande échelle, comme cela est indiqué plus bas.

Les composants du système de conjugaison de l'ubiquitine peuvent être endogènes à la cellule sélectionnée pour effectuer l'expérience.

Autrement, certains ou tous les composants peuvent provenir de sources exogènes. Par exemple, des protéines de fusion peuvent être introduites dans la cellule par des techniques recombinantes (comme l'utilisation d'un vecteur d'expression), ou en microinjectant dans la cellule la protéine de fusion elle-même ou l'ARNm codant cette protéine.

Dans tous les cas, la cellule n'est manipulée qu'après incubation avec un inhibiteur candidat afin de faciliter la détection de l'ubiquitination ou la dégradation de la cible. Comme décrit plus haut, pour des expériences réalisées avec des mélanges reconstitués de protéines ou des Iysats, l'efficacité du candidat inhibiteur est évaluée en mesurant des caractéristiques directes de la protéine cible, tel que le changement de poids moléculaire par des méthodes électrophorétiques, ou par détection dans un

test de liaison. Dans ce cas, la cellule doit être Iysée à la fin de l'incubation avec l'agent candidat, et le lysat manipulé dans une étape de détection de la même manière que précédemment.

, Dans ces expériences utilisant des cellules entières, l'utilisation d'un gène rapporteur peut également s'avérer judicieuse. Un gène rapporteur comprend tout gène qui exprime un produit détectable, sous forme d'ARN ou de protéine. Les gènes rapporteurs privilégiés sont ceux qui sont détectables directement. Ce gène rapporteur peut être inclus dans une construction sous la forme d'un gène de fusion avec la protéine cible d'intérêt.

Parmi les exemples variés de gènes rapporteurs, il y a le gène CAT (chloramphenicol acetyl transferase) (Alton et Vapnek, 1979), la luciferase, et d'autres systèmes de détection enzymatiques telles que la betagalactosidase, la luciférase bactérienne, la phosphatase alcaline, etc. Le produit du gène rapporteur est détecté par une activité intrinsèque associée avec ce produit. par exemple, le gène rapporteur peut coder le produit d'un gène avec une activité détectable par la couleur, la fluorescence, ou la luminescence. Le niveau d'expression du gène rapporteur est alors comparé au niveau d'expression dans la même cellule en l'absence du composé testé.

La moindre différence statistique ou d'un autre ordre indique que le composé a d'une manière ou d'une autre altéré l'activité de la ligase.

L'invention a également pour objet un procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) co-transfecter ou co-transformer une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 ou 12 avec un vecteur codant une protéine partenaire, dans un système double-hybride ; b) incuber la cellule hôte obtenue à l'étape a) avec le composé candidat à tester ; c) détecter les modifications dans l'interaction entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine partenaire.

L'invention est également relative à un composé modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus et une protéine partenaire, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu selon le procédé de criblage ci-dessus.

L'invention fournit donc des moyens pour stabiliser la cible d'une ubiquitine ligase in vivo en empêchant son ubiquitination et donc sa dégradation. En d'autres termes, ces inhibiteurs empêchent l'interaction de l'ubiquitine ligase avec un polypeptide cible. L'inhibiteur est une petite molécule. Le mécanisme d'inhibition peut être compétitif ou non compétitif, et le polypeptide cible peut être une protéine cellulaire, une protéine codée par un organisme pathogène.

Des inhibiteurs compétitifs efficaces peuvent par exemple empêcher l'interaction entre l'ubiquitine ligase et la protéine cible.

Des inhibiteurs non compétitifs peuvent comprendre par exemple des composés qui se lient à une région du polypeptide cible autre que la région d'interaction avec l'ubiquitine ligase et altèrent la structure de la région d'interaction. De tels non-compétiteurs allostériques présentent certains avantages, ils peuvent notamment fournir un très haut degré de spécificité de l'inhibition car ils ne seront pas capables de se lier à d'autres cibles de l'ubiquitine ligase.

Les inhibiteurs compétitifs des ubiquitine ligase peuvent mimer la structure polypeptidique de la région d'interaction de l'ubiquitine ligase ou de la cible. De tels inhibiteurs empêchent le recrutement du polypeptide cible par l'ubiquitine ligase. En fonction de la structure de l'inhibiteur, l'inhibition du recrutement peut être très spécifique de la cible ou affecter le recrutement d'autres polypeptides qui sont la cible de la même ubiquitine ligase. Par exemple, des inhibiteurs spécifiques peuvent mimer la structure WW de la séquence polypeptidique qui interagit avec la protéine cible. Ces inhibiteurs compétitifs des répétitions WW se lient à la protéine cible, empêchant ainsi son interaction avec les répétitions WW d'une protéine à domaine HECT.

D'une manière générale, les molécules recherchées seront des molécules capables d'inhiber ou d'activer l'activité ubiquitine ligase vis à vis de ses substrats grâce notamment à des essais fonctionnels permettant de visualiser in vivo ou in vitro cette activité ubiquitine ligase.

Compositions pharmaceutiques Utilisation thérapeutique des protéines à domaine HECT, de leurs dérivés et de leurs modulateurs

L'utilisation thérapeutique d'une protéine à domaine HECT ou d'un de ses dérivés peptidiques peut également être envisagée. Ainsi, les composés ou les méthodes qui augmentent l'activité d'une protéine à domaine HECT peuvent être utilisés dans le traitement de désordres prolifératifs. Les symptômes d'un cancer pourraient ainsi être atténués par l'utilisation d'un composé qui stimule l'activité d'une protéine à domaine HECT. Ainsi, une baisse de l'activité ou d'expression d'une protéine à domaine HECT dont le substrat est un régulateur positif du cycle cellulaire, comme un membre de la famille des cyclines, se traduira par une augmentation de la prolifération cellulaire. Dans ce cas, une augmentation du niveau d'expression ou d'activité de la protéine à domaine HECT pourrait permettre l'amélioration des symptômes
De la même façon, des composés qui diminuent ou inactivent une protéine à domaine HECT, peuvent être utilisés en thérapie pour améliorer les symptômes d'une maladie proliférative. Ainsi, si une protéine à domaine HECT responsable normalement de la dégradation d'un inhibiteur du cycle cellulaire devient trop active suite à une mutation, l'utilisation d'une drogue qui en limite l'activité pourrait s'avérer utile pour limiter certains symptômes de la maladie et notamment la prolifération cellulaire. Dans les cas ou une diminution de la dégradation du substrat est recherchée, l'expression d'un mutant dit AHECT de la protéine à domaine HECT est également une stratégie de choix pour bloquer la dégradation du substrat. Un mutant AHECT est un dérivé de la protéine à domaine HECT ne comprenant plus le motif HECT qui aura été délété. Un tel dérivé est capable d'interagir avec le substrat mais n'est plus capable de l'ubiquitiner. Dans ce cas, la surproduction du mutant AHECT empêche l'ubiquitination et la dégradation concomitante de ce substrat. On parle de stabilisation par protection (ou par"trapping").

Les agents thérapeutiques modulant l'activité des protéines à domaine HECT pourront être des acides nucléiques. Ils pourront agir soit d'euxmêmes comme par exemple des aptamères modulant une interaction, soir par l'intermédiaire de la protéine qu'ils codent comme par exemple des séquences codant pour un peptide servant d'inhibiteur compétitif. Il pourra également s'agir d'acides nucléiques non naturels comprenant des nucléotides modifiés. Dans tous les cas, ils devront être apportés dans la

cellule par un vecteur approprié dont la nature sera fonction des progrès des techniques de vectorisation. Il pourra s'agir par exemple de vecteurs d'expression et de pénétration viraux ou bactériens, de système de dispersion colloïdal ou de liposomes. Dans le cas d'acides nucléiques devant être exprimés, ils devront comprendre outre la séquence codante, toutes les séquences permettant l'expression dans les cellules hôtes visées.

* Les vecteurs viraux qui peuvent être utilisés pour introduire une séquence d'acide nucléique dans les cellules cibles d'un patient comprennent, sans y être limité, des dérivés des virus de la vaccine, de l'herpes ou de rétrovirus ou de l'adénovirus. Dans tous les cas, les vecteurs utilisés seront défectifs, c'est à dire non pathogène.

Les autres moyens d'introduire les acides nucléiques dans les cellules du patient sont les systèmes de dispersion colloïdal. Ceux ci incluent des complexes macromoléculaires, des nanocapsules, des microsphères, des billes, des systèmes mettant en jeux des émulsions de lipides dans l'eau, des micelles, et des liposomes. Dans le cas des liposomes par exemple, les acides nucléiques sont encapsulés dans une vésicule de membrane artificielle. Introduits dans l'organisme les liposomes fusionnent avec les cibles du patient et délivrent ainsi les acides nucléiques. Préférablement ces liposomes fusionneront préférentiellement avec des cellules spécifiques.

L'invention couvre les plantes ou animaux transgéniques contenant une ou plusieurs des protéines à domaine HECT présentées ici. Ces organismes transgéniques peuvent être obtenus en utilisant la séquence d'acide nucléique de l'invention. Ces organismes transgéniques peuvent être utilisés pour exprimer une protéine à domaine HECT entière ou tronquée, ou pour inactiver une protéine à domaine HECT (knock-out). Ces derniers organismes (souris trangéniques par exemple), mutants pour une protéine à domaine HECT, peuvent notamment être utilisés pour la recherche de drogues qui atténuent ou suppriment les effets de l'absence de la protéine.

Les méthodes pour obtenir de tels organismes transgéniques sont bien connues. Les souris knock-out par exemple sont obtenues par intégration homologue d'une construction dans une cellule souche embryonnaire de souris (cellule ES), construction qui code le gène à inactiver. La séquence de la construction est modifiée et idéalement permet l'intégration conjointe d'un marqueur de sélection positif (un gène de

résistance à la néomycine par exemple) au locus du gène à inactiver. Ces changements peuvent alors être introduits dans la lignée germinale de la souris pour générer des individus chimères. (pour détails voir, Doetschman et al., 1985)
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique selon l'invention ou d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

L'invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant une quantité efficace d'un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

Utilisation diagnostique des protéines à domaine HECT
Les régulateurs du cycle cellulaire sont souvent les produits des oncogènes ou des suppresseurs de tumeur. Les protéines à domaine HECT, en tant qu'ubiquitine ligases, pourraient en conséquence être les produits des oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs, en fonction des protéines régulatrices du cycle cellulaire dont elles régulent l'abondance. Les protéines à domaine HECT, ses analogues, dérivés et par voie de conséquence les séquences nucléiques des protéines à domaine HECT, ou les anticorps anti-protéines à domaine HECT peuvent donc avoir leur utilité dans le diagnostique. Les séquences nucléiques des nouvelles protéines à domaine HECT peuvent être utilisées pour détecter, pronostiquer ou

diagnostiquer des désordres tels que la tumorigénèse, les carcinomes, les adénomes, etc., par la recherche d'éventuelles mutations par exemple (délétions, changements dans la séquence,...). L'activité des ces ubiquitine ligases peut également être testée dans différentes pathologies afin de détecter un éventuel changement dans leur niveau d'expression et leur possible implication dans la pathologie considérée.

Les molécules de l'invention peuvent ainsi être utilisées dans des tests immunologiques utilisant des techniques tels que les immunoblots, l'immunohistochimie par radioisotope, les test ELISA (enzyme linked

immunosorbent assay), l'immunoprécipitation, les test d'immunodiffusion, les tests d'agglutination pour en nommer certains.

Les gènes des protéines à domaine HECT, leur séquence nucléique directe ou complémentaire peuvent aussi être utilisés dans des tests d'hybridation dans le but de détecter, de diagnostiquer des désordres ou maladies associés avec des changements dans l'expression ou l'activité des protéines à domaine HECT. Ces tests d'hybridation sont effectués en mettent en présence un échantillon contenant des acides nucléiques (comme une coupe de tissu) avec une sonde nucléique capable de s'hybrider à de l'ARN ou de l'ADN de protéine à domaine HECT dans des conditions favorables à l'hybridation.

Des maladies ou des désordres induisant la surprolifération cellulaire peuvent être diagnostiqués ou détectés (ou leur prédisposition) en recherchant des baisses d'expressions d'une protéine à domaine HECT ou de son ARN, ou de son activité (par exemple, l'activité ubiquitine ligase), ou en détectant des mutations dans l'ARN, l'ADN ou la séquence protéique d'une protéine à domaine HECT (par exemple, délétions, translocations) qui causent une diminution de l'expression ou de l'activité. Le niveau de protéine à domaine HECT peut être détecté par immunochimie, le niveau d'ARN par hybridation (northern blot, hybridation in situ). L'activité de la protéine à domaine HECT, peut être détectée en mesurant l'activité ubiquitine ligase E3. Les translocations, délétions et mutations ponctuelles dans les séquences nucléiques des protéines à domaine HECT peuvent être détectées par Southern blot, FISH, analyse RFLP, SSCP, PCR, séquençage, etc.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID Nol 1, ou pour un fragment ou un variant du polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 11.

2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés SEQ ID N01 à SEQ ID ? 11 ou pour un fragment ou un variant de ce polypeptide.

3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ! D ? 12 à SEQ ID N'22, ainsi que les séquences nucléotidiques qui en sont dérivées et qui comprennent le cadre de lecture ouvert contenu dans les séquences SEQ ID N 12 à SEQ ID ? 22.

4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le fragment du polypeptide à domaine HECT est choisi parmi les séquences en acides aminés suivantes : a) la séquence allant de l'acide aminé en position 1248 jusqu'à l'acide aminé en position 1585 de la séquence SEQ ID N01 ; b) la séquence allant de l'acide aminé en position 1259 jusqu'à l'acide aminé en position 1624 de la séquence SEQ ID N 2 ; c) la séquence allant de l'acide aminé en position 230 jusqu'à l'acide aminé en position 567 de la séquence SEQ ID N 3 ; d) la séquence allant de l'acide aminé en position 1153 jusqu'à l'acide aminé en position 1620 de la séquence SEQ ID N04 ; e) la séquence allant de l'acide aminé en position 742 jusqu'à l'acide aminé en position 1083 de la séquence SEQ ID N05 ;

f) la séquence allant de l'acide aminé en position 481 jusqu'à l'acide aminé en position 823 de la séquence SEQ D ? 6 ; g) la séquence allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 206 de la séquence SEQ D ? 7 ; h) la séquence allant de l'acide aminé en position 48 jusqu'à l'acide aminé en position 372 de la séquence SEQ D ? 8 ; i) la séquence allant de l'acide aminé en position 618 jusqu'à l'acide aminé en position 947 de la séquence SEQ ID D ? 9 ; j) la séquence allant de l'acide aminé en position 1235 jusqu'à l'acide aminé en position 1572 de la séquence SEQ ID ? 10 ; k) la séquence allant de l'acide aminé en position 373 jusqu'à l'acide aminé en position 694 de la séquence SEQ D ? 11 ;

5. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le variant du polypeptide à domaine HECT est un polypeptide à domaine HECT comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N011 et dans la séquence duquel la séquence du domaine HECT est totalement ou partiellement délétée.

6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le polypeptide à domaine HECT ou le fragment ou le variant du polypeptide à domaine HECT est fusionné avec un polypeptide hétérologue.

7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue consiste en un marqueur détectable.

8. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue consiste en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, pour une utilisation dans des systèmes de détection d'interactions du type double-hybride .

9. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide régulateur contrôlant l'expression du polypeptide à domaine HECT ou de son fragment ou variant, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue, dans une cellule hôte.

10. Vecteur recombinant dans lequel a été artificiellement inséré un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.

11. Cellule hôte recombinante qui a été artificiellement transfectée ou transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.

12. Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est une cellule eucaryote.

13. Polypeptide à domaine HECT, ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, le cas échéant fusionné avec un polypeptide hétérologue, caractérisé en ce qu'il est codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.

14. Polypeptide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID DN 1 à SEQ ID N 11.

15. Procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide selon l'une des revendications 13 ou

14 avec au moins un composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit polypeptide et le ou les composé (s) candidat (s).

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : c) caractériser le ou les composé (s) candidat (s) ayant formé un complexe avec le polypeptide à domaine HECT.

17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que le polypeptide à domaine HECT est immobilisé sur un support.

18. Procédé selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que le ou les composé (s) candidat (s) sont contenus dans le Iysat cellulaire d'une culture de cellules eucaryotes, de préférence de cellules humaines.

19. Procédé selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que le composé candidat est le produit d'expression d'un phage constitutif d'une collection combinatoire de clones de phages.

20. Procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 ou 12 dans un milieu de culture approprié, de telle manière à ce que ladite cellule hôte produise un polypeptide à domaine HECT selon l'une des revendications 13 ou 14 ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et d'autres composés produits par la cellule hôte.

21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un système double-hybride dans lequel : (i) la cellule hôte cultivée à l'étape a) est transfectée avec un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide qui est fusionné avec un polypeptide hétérologue, ledit polypeptide hétérologue consistant en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique,

a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, et (ii) la cellule hôte recombinante est en outre co-transfectée avec un acide nucléique codant le composé candidat sous une forme fusionnée avec le second partenaire protéique mentionné en (i).

22. Procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine cible ou un partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide à domaine HECT selon l'une des revendications 13 ou 14, une protéine cible ou un partenaire et le composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine cible ou le partenaire.

23. Procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine cible ou un partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) co-transfecter ou co-transformer une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 ou 12 avec un vecteur codant une protéine cible ou un partenaire, dans un système double-hybride ; b) incuber la cellule hôte obtenue à l'étape a) avec le composé candidat à tester ; c) détecter les modifications dans l'interaction entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine cible ou un partenaire.

24. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 13 ou 14.

25. Amorce nucléotidique hybridant avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.

26. Amorce nucléotidique selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID ? 22.

27. Sonde nucléotidique hybridant avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.

28. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 11 ou 12, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

29. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une des revendication 13 ou 14, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.