FR2826977A1 - Procede et systeme de detection de desequilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (fish) sur des noyaux cellulaires en interphases - Google Patents

Abstract

Procédé de détection de déséquilibre chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, comprenant les phases suivantes :- une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts, - une révélation de chaque sonde par un fluorochrome différent, - une mesure de signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, cette mesure étant effectuée d'une part au sein d'une population cellulaire témoin et d'autre part au sein d'une population cellulaire soumise à détection,- un calcul du rapport entre les signaux correspondant respectivement à chacune des sondes, ce calcul de rapport étant effectué d'une part sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence, et d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise à détection,- une comparaison du rapport de fluorescence correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et - un traitement du résultat de cette comparaison pour détecter un déséquilibre inter-chromosomique.

Description

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Procédé et système de détection de déséquilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH) sur des noyaux cellulaires en interphase La présente invention concerne un procédé de détection de déséquilibre interchromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH) sur des noyaux cellulaires en interphase. Elle vise également un système mettant en oeuvre ce procédé.

Les déséquilibres chromosomiques constitutionnels les plus récurrents que l'on retrouve chez les nouveau-nés concernent les chromosomes 21,18, 13 et les chromosomes sexuels. La trisomie 21 (syndrome de Down) est l'anomalie la plus récurrente : environ 1,7 enfant sur 1000 est atteint (Stoll et al, 1998).

Le nombre de cas de trisomie 21 augmente avec l'âge de la mère, en particulier après 35 ans, et un examen prénatal est conseillé en cas de maternité tardive. Il existe une tendance actuelle à la maternité tardive : le pourcentage de femmes ayant un enfant à plus de 35 ans est passé de 8 % à 19 % en quatre ans (Stoll et al, 1994). On peut estimer que ce pourcentage va encore augmenter, mais dès à présent, le nombre de naissances en France étant de 750.000 par an, le besoin de tests de la trisomie 21 est, potentiellement, de l'ordre de 150.000 par an.

Depuis les années 70, le diagnostic prénatal après amniocentèse est généralement réalisé en utilisant la cytogénétique classique, qui permet d'établir les caryotypes sur chromosomes métaphasiques, et ainsi de détecter un nombre anormal de chromosomes. Le délai d'attente entre le moment du prélèvement et le résultat du diagnostic relativement long (2 semaines) constitue l'inconvénient principal de cette technique. En outre, l'obtention de métaphases exploitables n'est pas assurée dans 100 % des cas (1% d'échecs) et de faux négatifs peuvent apparaître à cause de la présence de cellules maternelles (Verma et al, 1998).

Plus récemment, l'hybridation in situ sur des sondes fluorescentes (FISH) a permis de travailler directement sur noyaux interphasiques sans avoir recours à la culture cellulaire. Cette technique consiste à marquer des chromosomes ou des régions chromosomiques à l'aide de sondes fluorescentes et à compter les signaux, c'est-àdire les chromosomes émettant des signaux fluorescents (Pierluigi et al, 1996 ; Steinborn et al, 1996 ; Wei et al, 1997 ; Eiben et al, 1999). On peut ainsi obtenir des résultats dans un temps assez court (quelques jours), et l'analyse peut être réalisée sur un petit nombre de cellules prélevées (quelques centaines) alors que la mise en culture cellulaire nécessite un nombre de cellules plus élevé (à partir de quelques

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dizaines de milliers).

Différents types de sondes ont été utilisés pour ces études : des sondes couvrant la région centromérique ou des régions du bras long du chromosome 21 (cosmides, YAC) (Soloviev et al, 1995, Van Opstad et al, 1995 ; Pierluigi et al, 1996 ; Steinborn et al, 1996). Le marquage partiel du chromosome 21 avec ces sondes permet d'évaluer le nombre de copies. Il faut donc procéder à un comptage des signaux, manuel ou automatique, pour détecter les cellules ayant trois signaux correspondant au chromosome 21.

Plusieurs études montrent la faisabilité technique de l'hybridation in situ sur les cellules fétales. Cependant, il y a peu d'études qui donnent des résultats de comparaison directe entre la technique FISH et le diagnostic par cytogénétique classique (Pierluigi et al, 1996 ; Steinborn et al, 1996 ; Wei et al, 1997 ; Eiben, et al, 1999 ; Thein et al, 2000). Les auteurs de ces études évoquent des concordances de 97-100% entre les deux approches, mais soulignent également les difficultés d'interprétation des résultats en FISH interphasique. Ces difficultés sont essentiellement liées à la nécessité d'un opérateur humain qui reconnaît et compte les signaux fluorescents. Or, la variabilité certaine entre différents opérateurs et surtout la signification statistique du nombre de noyaux avec un nombre anormal de signaux posent des problèmes en matière de diagnostic. La variabilité interobservateur vient des différents critères de définition d'un'spot' (c'est-à-dire du signal fluorescent), par exemple sa taille, son intensité, sa texture, mais également du fait que les spots se trouvent souvent dans différents plans focaux, selon l'axe vertical Z dans le noyau. Les résultats peuvent donc différer de manière significative en fonction de ces critères, qui eux-mêmes dépendent de la préparation de l'échantillon dans chaque laboratoire. Un biais important est constitué par l' établissement du cut-off , c'est-à-dire de la valeur du seuil de positivité à partir de laquelle l'échantillon est considéré comme anormal (Ruangvutilert et al, 2000). Cette valeur est difficile à établir, car le pourcentage de noyaux ayant trois signaux dans les cas témoins peut varier entre 10 et 20% des noyaux analysés. Ce chiffre varie en fonction des études car le nombre de cellules analysées peut varier lui-même de 50 à 200, ce qui explique cette variabilité statistique. De plus, il peut être important pour l'interprétation médicale de ce test de connaître de façon fiable la valeur de la proportion de noyaux portant une anomalie de nombre de chromosomes (mosaïque).

Le but de la présente invention est de proposer un procédé de détection automatisé qui, par sa conception même, élimine ainsi les difficultés liées à la lecture par un

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opérateur humain, et procure une solution aux problèmes concernant la variabilité de la préparation des échantillons, qui jusqu'à présent, en affectaient l'analyse.

Cet objectif est atteint avec un procédé de détection, utilisant un système informatisé, de déséquilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH) sur des noyaux cellulaires en interphase, comprenant les phases suivantes : - une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts, - une révélation de chaque sonde par un fluorochrome différent, - une mesure de signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, cette mesure étant effectuée, d'une part, au sein d'une population cellulaire témoin et, d'autre part, au sein d'une population cellulaire soumise à détection, - un calcul du rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, ce calcul de rapport étant effectué, d'une part, sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence et, d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise à détection, - une comparaison du rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et - un traitement du résultat de cette comparaison pour détecter un déséquilibre interchromosomique.

La mesure des deux signaux correspondant respectivement à chaque sonde est avantageusement effectuée par cytométrie d'image. Les deux sondes peuvent par exemple être révélées respectivement par un fluorochrome vert et par un fluorochrome rouge.

On a ainsi développé une approche par cytométrie d'image qui associe les avantages de l'analyse par FISH sur noyaux interphasiques à ceux d'une lecture des signaux rapide, précise, quantitative et objective, car indépendante de l'opérateur. Cette approche consiste à utiliser des peintures chromosomiques ou de régions chromosomiques pour le chromosome 21, d'une part, et, par exemple, pour le chromosome 20 ou le chromosome 22, d'autre part. Les chromosomes 20 ou 22 sont pris comme référence car le signal d'hybridation obtenu avec une peinture du chromosome 21 est comparable à celui obtenu avec une peinture du chromosome 20 ou du chromosome 22 qui sont de taille voisine. En fait, on propose de détecter un déséquilibre inter-chromosomique dans les cellules fétales, provenant de liquide amniotique ou du sang maternel, à la place d'une détection du nombre de copies du chromosome analysé :

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- après hybridation in situ des sondes pour le chromosome 21 et 22 (par exemple), chaque sonde est révélée par un fluorochrome différent (en vert et en rouge) ; - à l'aide d'un système informatisé de cytométrie d'image, les intensités de chaque sonde sont mesurées sur un minimum de quelques centaines (par exemple, 500) noyaux au sein d'une population cellulaire témoin et d'une population à tester ; - le calcul du rapport entre les deux signaux permet, en le comparant au cas normal de référence, de déterminer la présence d'un chromosome 21 surnuméraire. Le déséquilibre inter-chromosomique serait de 1,5 dans le cas d'une trisomie.

Les avantages du procédé de détection selon l'invention en comparaison avec les procédés de détection actuels sont les suivants : - du fait de l'utilisation de la technique FISH, le procédé de détection selon l'invention permet d'éviter tous les inconvénients liés à la culture cellulaire, et permet d'obtenir le résultat plus rapidement (en quelques jours) et sur un nombre de cellules qui est à la fois statistiquement significatif et non-contraignant pour des échantillons pauvres en cellules (entre 500 et quelques milliers de cellules).

Toutes les difficultés liées à la lecture par un opérateur humain disparaissent avec ce procédé, car l'analyse est effectuée automatiquement par un système informatisé. De plus, les problèmes concernant la variabilité de la préparation des échantillons n'affectent plus l'analyse. Un changement éventuel des conditions expérimentales ne changerait pas le rapport de fluorescence, car les deux signaux seront affectés de la même manière.

Il est possible de détecter la présence de deux populations au sein d'une population avec une meilleure fiabilité grâce à la meilleure précision statistique, du fait du plus grand nombre de noyaux qu'il est possible d'analyser rapidement. Ceci permet de distinguer des cas avec une contamination de cellules maternelles ou des cas mosaïques (cas où seule une fraction des cellules fétales montrent l'anomalie).

On détecte avec une meilleure fiabilité les cas particuliers comprenant des isochromosomes 21 ou encore des translocations t (21 ; 21) (Stoll et al, 1998), quelle que soit la nature du chromosome remanié. L'utilisation de peinture chromosomique montre une tache qui devrait doubler de taille et d'intensité. Cependant, une mesure par une caméra adaptée demeure plus précise compte tenu de la taille du signal.

Cette approche est susceptible d'être applicable sur les autres pathologies concernant les chromosomes 13,18 et les chromosomes sexuels.

Il est à noter que la technique FISH d'hybridation in situ de sondes fluorescentes a déjà été mise en oeuvre dans un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, qui est divulgué dans la

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demande de brevet publiée sous le numéro FR2783253. Dans ce procédé de détection, deux sondes marquées par deux fluorochromes différents et respectivement spécifiques du bras long et du bras court d'un chromosome sont hybridées sur ce chromosome.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé selon l'invention, la phase de mesure comprend une première étape d'acquisition, dans un plan de mesure défini, d'un nombre donné de champs de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé (plusieurs centaines ou milliers) de noyaux analysables.

L'étape d'acquisition comprend en outre une capture, à l'aide de filtrages successifs optiques à bande passante étroite, de plusieurs images correspondant, pour chaque champ d'observation, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple : 4,6-Diamidino-2phénylindole (DAPI) avec une fluorescence bleue, Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) avec une fluorescence verte et le Texas RedTM avec une fluorescence rouge), un stockage de ces images acquises et une superposition desdites images acquises et stockées.

Suivant un autre aspect de l'invention, il est proposé un système pour détecter des déséquilibres de domaines chromosomiques par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, mettant en oeuvre le procédé selon l'invention, comprenant : - des moyens pour réaliser une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts, - des moyens pour révéler chaque sonde par un fluorochrome différent, - un dispositif pour mesurer des signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, d'une part au sein d'une population cellulaire témoin et d'autre part au sein d'une population cellulaire soumise à détection, - des moyens pour calculer le rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, d'une part sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence, et d'autre part sur ladite population cellulaire soumise à détection, - des moyens pour comparer le rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et - des moyens pour traiter le résultat de cette comparaison en vue de détecter un déséquilibre inter-chromosomique.

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Le dispositif de cytométrie d'image comprend avantageusement : - des moyens de microscopie à multiple fluorescence appliqués à des populations cellulaires préalablement soumises à une hybridation in situ de différentes sondes fluorescentes, - des moyens pour acquérir des ensembles d'images produites par les moyens de microscopie à fluorescence, - des moyens pour stocker lesdites images acquises, et - des moyens pour analyser lesdites images acquises et stockées. les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition d'image coopèrent pour acquérir, dans un plan de mesure défini, un nombre donné de champs, de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé de noyaux analysables.

Dans une configuration préférée d'un système de détection selon l'invention, celui-ci comprend en outre des moyens de filtrage coopérant avec les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition pour acquérir plusieurs images correspondant, pour chaque champ, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple : DAPI, FITC (vert), Texas Red (rouge)).

Par ailleurs, les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition peuvent avantageusement coopérer pour acquérir dans un même plan d'étude des images correspondant à une population cellulaire témoin et des images correspondant à une population cellulaire soumise à détection.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de mise en oeuvre nullement limitatif, et des dessins annexés sur lesquels : la figure 1 illustre les phases principales du procédé de détection de déséquilibre chromosomique selon l'invention ; la figure 2 représente de façon schématique la structure d'un système de détection selon l'invention ; et la figure 3 est un organigramme représentatif des opérations de détection et de quantification réalisées sur les images acquises par le système de détection selon l'invention.

On va en premier lieu décrire, dans le cadre d'un exemple de mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention, les phases initiales de préparation et d'hybridation qui précèdent la phase de détection et de quantification, notamment en référence à la figure 1.

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Préparation des échantillons
Les échantillons à tester, actuellement issus de liquide amniotique, sont préparés comme pour une analyse cytogénétique classique sur lame, qu'il s'agisse de prélèvements mis en culture ou analysés directement. Cependant, pour améliorer l'analyse automatique des lames, l'utilisation d'une centrifugeuse à puits permettant l'étalement ponctuel sur lame (par exemple une cytospin TM) est recommandée pour un étalement plan des cellules. Ceci permet de réduire le nombre de cellules "hors focus"lors de la lecture automatique. L'étalement limité diminue également le temps d'acquisition des images.

Les échantillons amniotiques cultivés sont traités selon les protocoles de diagnostics prénataux classiques. Pour l'analyse des liquides en direct, un traitement à la pepsine est suivi d'un traitement avec milieu dissociant les amas de cellules. L'étalement est également fait à l'aide d'une centrifugeuse à puits. Les lames témoins peuvent être préparées à partir de liquides amniotiques normaux ou des fibroblastes normaux selon le même protocole. En outre, l'analyse peut également porter sur des échantillons sanguins. Dans le cas d'un prélèvement issu de sang périphérique maternel, la détection des cellules fétales est faite au préalable.

Préparation des sondes L'hybridation in situ peut être effectuée selon les protocoles habituels pour les peintures chromosomiques (Truong et al, 1998). Les lames sont d'abord incubées 15 minutes dans une solution saline 2SSC suivis d'un rinçage au tampon PBS, d'un traitement à la pepsine dans 0,01 N (4 ug/mt, SIGMA) HCI pendant 10 minutes. On arrête la digestion par un bain de PBS pendant 5 minutes, on fixe les lames pendant 10 minutes dans le Carnoy (Ethanol/Acide Acétique, 3 : 1 (VN)) et on sèche les lames à l'air.

La sonde est ensuite dénaturée pendant 10 minutes à 700C dans 70% Formamide (FLUKA) /2SSC à pH 7. L'ADN cible, c'est-à-dire les noyaux sur lames est dénaturé dans les mêmes conditions pendant 3 minutes. Les lames sont ensuite rincées au 2SSC et déshydratées dans une série de bains d'alcool. L'hybridation de la sonde est effectuée la nuit à 37 C. Les lavages post-hybridation sont effectués à 720C pendant 5 minutes dans du tampon 2SSC.

Dans le cas d'utilisation de sondes marquées à la digoxigénine ou à la biotine, la détection des sondes se fait par une utilisation d'anticorps couplés à des fluorochromes différents (vert et rouge).

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Dans le cas d'utilisation de sondes directement marquée avec des fluorochromes, on peut procéder tout de suite à la coloration des lames dans du DAPI (1 ug/ml, Molecular Probes) et au montage dans du p-phenyl-diamine.

Méthode de détection et quantification des siqnaux fluorescents des sondes
Le dispositif de cytométrie d'image 1, mis en oeuvre dans le système de détection de déséquilibre inter-chromosomique selon l'invention, comprend, en référence à la figure 2, une partie d'acquisition 10 incluant un microscope à fluorescence 2,3, une caméra CCD 5 refroidie noir et blanc permettant des temps d'intégration allant de 40 ms à 10 s, un dispositif (roue porte-filtre motorisée ou tourelle porte-filtre motorisée) permettant de changer automatiquement les spectres de lumière d'excitation et d'émission par les sondes fluorescentes 4 disposées entre la lampe et le microscope 3 et, éventuellement, entre le microscope 3 la caméra CCD 5, et une platine porte-lame échantillons motorisée en X et Y 13, automatiquement contrôlée par le dispositif 1 pour l'échantillonnage systématique, et une partie de contrôle et de traitement 14 constituée d'un ordinateur comprenant, en particulier, une carte d'acquisition d'images.

La mesure de fluorescence est décomposée en deux étapes : 1) Acquisition et stockage des images, après définition d'une région d'analyse sur la lame étudiée.

2) Analyse des images et exploitation des données qui en sont issues.

La première étape consiste à acquérir, dans les limites d'une surface définie, un nombre de champs donnés, à l'objectif permettant, par exemple, un grossissement de 40x, de manière à obtenir 500 à 1000 noyaux analysables. Les images sont acquises à l'aide d'une caméra CCD grâce aux filtres optiques interférentiels sélectifs. Pour chaque champ, trois plans images correspondant aux longueurs d'onde des différents fluorochromes (bleu, vert, rouge) sont stockés et superposés (figure 2). Des points de repères sont établis pour éviter que les des champs observés soient hors focus. Ainsi, on analyse les lames soumises à détection 11 et la lame témoin 12 dans les mêmes conditions (en particulier, même temps d'intégration et même gain de caméra).

Lors de la deuxième étape qui inclut la détection des noyaux et la quantification des signaux, on procède comme suit, en référence à la figure 3 : 1) Segmentation de chaque image et détection des noyaux à analyser, incluant une séparation de noyaux en amas, ainsi que l'exclusion des artéfacts par des critères de taille et de morphologie), permettant d'établir un masque des noyaux sur le plan

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de contre-coloration, par exemple en DAPI dans lequel les intensités de fluorescence sont mesurées.

2) Quantification de l'intensité intégrée à l'intérieur de chaque noyau pour chaque fluorochrome (rouge et vert), correspondant à la fluorescence émise par chacune des sondes utilisées, sans aucune hypothèse sur la forme et la localisation des signaux.

3) Quantification du niveau de fond pour chaque couleur et chaque champ en dehors des noyaux ; détermination du niveau de bruit le plus fréquent comme référence.

4) Soustraction du niveau de fond (valeur de référence) dans les noyaux pour chacune des sondes.

5) Calcul du rapport vert/rouge pour chaque noyau.

6) Représentation des données, par exemple sous forme d'histogramme ou de scatterplot (représentation bi-dimensionnelle des valeurs d'intensités des deux couleurs).

7) Détermination automatique de la moyenne et de l'écart-type des valeurs du rapport de fluorescence pour une population de noyaux choisie par analyse de clusters, c'est-à-dire par une méthode d'analyse de nuages de points et détermination des centres de gravité de ces nuages de points.

Le rapport de fluorescence est calculé pour chaque échantillon de la même manière et dans les mêmes conditions. Une trisomie 21 est ainsi détectée lorsque le rapport de fluorescence du malade normalisé par rapport à l'échantillon témoin est de 1,5.

Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention. Le procédé de détection selon l'invention peut ainsi être étendu à d'autres chromosomes : X, Y, 13 et 18 ou encore d'autres anomalies moins récurrentes.

Le système de détection est caractérisé en ce que : - le dispositif de cytométrie d'image comprend en outre des moyens pour détecter des noyaux et quantifier des signaux en fluorescence de multiple longueurs d'onde ; - les moyens de détection et de quantification sont agencés pour segmenter des noyaux à partir d'une analyse morphométrique et densitométrique, donnant lieu à la création d'un masque pour l'ensemble des champs d'un plan de mesure.

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Claims (29)

1. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de déséquilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, comprenant les phases suivantes : - une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts, - une révélation de chaque sonde par un fluorochrome différent, - une mesure de signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, cette mesure étant effectuée d'une part au sein d'une population cellulaire témoin et d'autre part au sein d'une population cellulaire soumise à détection, - un calcul du rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, ce calcul de rapport étant effectué d'une part, sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence, et d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise à détection, - une comparaison du rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et - un traitement du résultat de cette comparaison pour détecter un déséquilibre interchromosomique.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mesure des deux signaux correspondant respectivement à chaque sonde est effectuée par cytométrie d'image automatisée.
3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les deux sondes sont révélées respectivement par deux fluorochromes différents (par exemple un fluorochrome vert et un fluorochrome rouge).
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les signaux d'intensité de chaque sonde sont mesurés sur un nombre pouvant être défini par l'opérateur, par exemple de quelques centaines de noyaux.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la phase de mesure comprend une première étape d'acquisition, dans un plan de mesure défini, d'un nombre donné de champs de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé de noyaux

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   analysables.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape d'acquisition comprend en outre une acquisition, par des filtrages optiques successifs, de plusieurs images correspondant, pour chaque champ, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple le bleu pour la contre-coloration, le vert, et le rouge pour le marquage des sondes), un stockage desdites images acquises et une superposition desdites images acquises et stockées.
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que l'étape d'acquisition est effectuée dans des conditions d'acquisition sensiblement identiques pour une population cellulaire témoin et une population cellulaire soumise à détection.
8. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les acquisitions correspondant aux populations cellulaires respectivement témoin et soumises à détection sont effectuées sur deux champs inclus dans un même plan de mesure.
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la phase de mesure comprend en outre une seconde étape pour détecter des noyaux et quantifier des signaux d'intensité de fluorescence.
10. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comprend une segmentation des noyaux dans chaque champ inclus dans un plan de mesure.
11. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la segmentation des noyaux inclut une séparation de noyaux en amas.
12. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que la segmentation des noyaux inclut une élimination des artéfacts par des critères de morphologie et de taille.
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comporte une quantification de

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    l'intensité du signal de fluorescence intégrée à l'intérieur de chaque noyau pour chaque couleur correspondant à chaque sonde.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comporte en outre un calcul du niveau de fond pour chaque couleur en dehors des noyaux dans chacun des champs.
15. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comporte en outre une détermination du niveau de fond le plus fréquent comme valeur de référence de bruit et une correction par ladite valeur de référence de l'intensité de signal fluorescent quantifiée à l'intérieur de chaque noyau.
16. 16. Système pour détecter des déséquilibres chromosomiques par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant : - des moyens pour réaliser une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts, - des moyens pour révéler chaque sonde par un fluorochrome différent, - un dispositif pour mesurer des signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, d'une part au sein d'une population cellulaire témoin et, d'autre part, au sein d'une population cellulaire soumise à détection, - des moyens pour calculer le rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, d'une part sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence, et, d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise à détection, - des moyens pour comparer le rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et - des moyens pour traiter le résultat de cette comparaison en vue de détecter un déséquilibre inter-chromosomique, même en cas de mosaïque.
17. 17. Système de détection selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il inclut, au titre des moyens de mesure, un dispositif de cytométrie d'image.

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18. 18. Système de détection selon la revendication 17, caractérisé en ce que le dispositif de cytométrie d'image comprend : - des moyens de microscopie à fluorescence appliqués à des populations cellulaires préalablement soumises à une hybridation in situ de sondes fluorescentes, - des moyens pour acquérir des images produites par les moyens de microscopie à fluorescence, - des moyens pour stocker lesdites images acquises, et - des moyens pour analyser lesdites images acquises et stockées.
19. 19. Système de détection selon la revendication 18, caractérisé en ce que les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition d'image coopèrent pour acquérir, dans un plan de mesure défini, un nombre de champs, de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé de noyaux analysables.
20. 20. Système de détection selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de filtrage coopérant avec les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition pour acquérir plusieurs images correspondant, pour chaque champ, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple, le DAPI (bleu) pour la contre-coloration, le FITC (vert), le Texas Red (rouge) pour les sondes).
21. 21. Système de détection selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition coopèrent pour acquérir dans un même plan d'étude des images correspondant à une population cellulaire témoin et des images correspondant à une population cellulaire soumise à détection.
22. 22. Système de détection selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que le dispositif de cytométrie d'image comprend en outre des moyens pour détecter des noyaux et quantifier des signaux en fluorescence de multiple longueurs d'onde.
23. 23. Système de détection selon la revendication 22, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour segmenter des noyaux

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    à partir d'une analyse morphométrique et densitométrique, donnant lieu à la création d'un masque pour l'ensemble des champs d'un plan de mesure.
24. 24. Système de détection selon les revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour séparer les noyaux en amas.
25. 25. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour exclure des artéfacts par des critères de taille et de morphologie.
26. 26. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 25, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour quantifier l'intensité des signaux de fluorescence intégrée à l'intérieur de chaque noyau pour chaque couleur.
27. 27. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour calculer le niveau de fond pour chaque couleur en dehors des noyaux.
28. 28. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour déterminer le niveau de fond le plus fréquent comme valeur de référence de fond et pour soustraire ladite valeur de référence sur l'intensité quantifiée à l'intérieur de chaque noyau.
29. 29. Application du procédé de détection inter-chromosomique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, à des noyaux de cellules fétales circulant dans le sang maternel.