FR2822161A1

FR2822161A1 - Cellule et animal transgenique modelisant les reponses humaines allergiques mediees par les ige, et leurs utilisations

Info

Publication number: FR2822161A1
Application number: FR0103520A
Authority: FR
Inventors: Alexandre Fraichard; Yacine Cherifi; Kader Thiam
Original assignee: Genoway SA
Current assignee: Genoway SA
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2001-03-15
Publication date: 2002-09-20
Anticipated expiration: 2021-03-15
Also published as: CA2440859A1; EP1368466A2; WO2002074071A2; WO2002074071A3; FR2822161B1; US20040154044A1; AU2002249328A1

Abstract

L'invention se rapporte à une cellule animale non humaine transgénique, caractérisée en ce qu'elle exprime au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines IgE (Fc epsilon R) et une séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde des IgE dont au moins tout ou partie du fragment Fc est d'origine humaine, et caractérisée en ce que le gène murin codant pour la chaîne Fc epsilon R homologue à ladite chaîne Fc epsilon R du récepteur humain est inactif. L'invention concerne l'animal transgénique correspondant ainsi que le procédé pour la compréhension des éléments physiopathologiques impliqués dans les mécanismes d'hypersensibilité immédiate et/ ou inflammatoire. L'invention porte également sur un procédé de criblage de composés actifs envers les interactions entre les IgE humaines et leurs récepteurs.

Description

La présente invention concerne le domaine de la biologie, et plus particulièrement le domaine de la transgenèse animale. L'invention se rapporte à une cellule animale non humaine transgénique, caractérisée en ce qu'elle exprime au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des

récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines IgE (FcSR) et une séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde des IgE dont au moins tout ou partie du fragment Fc est d'origine humaine, et caractérisée en ce que le gène murin codant pour la chaîne FEUER homologue à ladite chaîne FcSR du récepteur humain est inactif. L'invention concerne l'animal transgénique correspondant ainsi que le procédé pour mettre en évidence un allergène. L'invention porte également sur un procédé de criblage d'un composé pour la compréhension des éléments physiopathologiques impliqués dans les mécanismes d'hypersensibilité immédiate.

Les allergies et les manifestations cliniques qui leur sont associées constituent un problème croissant de santé publique notamment dans les pays occidentaux. La réaction allergique est une réaction d'hypersensibilité survenant immédiatement après le contact avec un antigène (allergène) lors d'une seconde exposition à cet antigène. Cette réaction d'hypersensibilité n'est que la conséquence d'une expression inadéquate des réponses immunitaires de l'organisme aboutissant à des réactions inflammatoires et à des lésions tissulaires.

Coombs et Gell ont défini quatre types d'hypersensibilité (I, II, III et IV) ; l'hypersensibilité de type I, ou immédiate, correspond à la réaction allergique. Les manifestations cliniques de l'hypersensibilité de type I, encore appelées atopies, comprennent par exemple l'asthme, la rhinite, l'eczéma, le rhume des foins, l'urticaire.

L'hypersensibilité de type I est liée à une réponse des immunoglobulines IgE contre des antigènes sans toxicité propre, comme le pollen par exemple.

Une cascade d'événements se déroule entre le premier contact de la muqueuse avec l'allergène et l'apparition des symptômes allergiques liés au deuxième contact avec le même allergène. Tout d'abord, on assiste à une libération localisée d'IgE au site d'entrée de l'allergène dans l'organisme, telles que les muqueuses et/ou ganglions lymphatiques régionaux.

La production d'IgE par les cellules B implique la participation de cellules présentant l'antigène (CPAg), de cellules T helper et la stimulation des cellules B productrices d'IgE. Les IgE produites localement sensibilisent les mastocytes environnants ; l'interaction entre les immunoglobulines IgE et les mastocytes et les basophiles via leur récepteur cellulaire F, sR constitue le premier événement dans la réponse allergique. Les mastocytes ainsi activés relarguent des médiateurs tels par exemple l'histamine, l'héparine, les leucotriènes qui produisent directement les symptômes allergiques (Ishizaka, 1989). Les IgE produites en excès passent dans la circulation où elles sensibilisent les basophiles circulants puis les mastocytes tissulaires de l'organisme entier. Les taux

sériques d'IgE sont souvent élevés dans les maladies allergiques et considérablement augmentés dans les parasitoses. En dehors des mastocytes et des basophiles, un certain nombre d'autres cellules portant des récepteurs pour l'extrémité Fc des IgE (F, FR) interviennent dans les mécanismes d'hypersensibilité immédiate chez l'homme. Ainsi, le nombre de monocytes circulants possédant des FEUER est également plus élevé chez certains atopiques, particulièrement les porteurs d'eczéma atopique sévère ; ces monocytes lorsqu'ils sont armés avec des IgE deviennent potentiellement cytotoxiques. De même, les macrophages alvéolaires peuvent être sensibilisés par des IgE et, en présence d'allergènes, libérer des enzymes. Ces phénomènes sont susceptibles de jouer un rôle important dans les maladies allergiques respiratoires. Les éosinophiles et les plaquettes portent aussi des FEUER. Lorsqu'elles sont sensibilisées par des IgE, ces cellules voient considérablement augmenter leurs propriétés cytotoxiques vis-à-vis de certains parasites, parmi lesquels les schistosomes. Les cellules de Langerhans expriment également les récepteurs aux IgE. En revanche, chez l'animal et notamment la souris, seulement deux types cellulaires semblent impliqués dans les mécanismes d'hypersensibilité immédiate ; il s'agit des mastocytes et des basophiles.

Ces différentes cellules sensibilisées par des complexes immuns comprenant des IgE, assurent des fonctions importantes chez les malades allergiques, d'autant qu'elles renferment toutes sortes de médiateurs pharmacologiquement actifs susceptibles de stimuler ou de contrôler les réactions allergiques.

Quand les IgE sont fixées sur les FEUER des mastocytes, des basophiles, des éosinophiles, la dégranulation peut être déclenchée par le pontage des IgE, entraînant

celui des FcSR. Les agents immunologiques déclenchant l'activation par les F, sR perturbent la membrane mastocytaire, ce qui provoque l'entrée dans la cellules des ions calcium essentiels à la dégranulation. L'entrée d'ions calcium a essentiellement deux conséquences : premièrement, la libération de médiateurs préformés, dont le principal est l'histamine et dans lesquels on trouve également l'héparine, des

enzymes protéolytiques telles que la triptase et la ss- glucosaminidase et des facteurs chimiotactiques et activateurs tels le CFA, le NCF et le PAF et, deuxièmement, l'induction de la synthèse de médiateurs néoformés à partir de l'acide arachidonique conduisant à la production de prostaglandine et locotriène. Ces médiateurs agissent directement sur les tissus environnants et au niveau des poumons, provoquant une broncho-constriction immédiate, un oedème muqueux et une hypersécrétion qui conduisent à la crise d'asthme.

Il existe différents types de récepteurs aux IgE dans les mastocytes : (i) un récepteur tétramérique constitué de deux chaînes a et deux chaînes ss, de haute affinité aux IgE (FcsRI) qui lie l'immunoglobuline IgE monomérique (Kinet, 1992 ; Metzger, 1992), et (ii) deux récepteurs ayant également une faible affinité aux IgG (FcyRII et FcyRIII) qui lient tous les deux des complexes immuns IgG et IgE (Takizawa et al., 1992). Le

rôle central de F, SRI dans la réaction allergique a été mise en évidence par Dombrowic et al. (1993).

La réponse allergique chez les mammifères constitue un phénomène complexe qui résulte de l'action d'un ou plusieurs allergènes, d'une pluralité de gènes codant pour des protéines structurales et/ou fonctionnelles.

Bien que des progrès récents aient été réalisés dans la compréhension des cascades et chemins métaboliques conduisant aux manifestations allergiques, le phénomène allergique demeure relativement incompris ce qui rend difficile le développement de traitements préventifs et/ou curatifs tels par exemple le développement des inhibiteurs des récepteurs aux IgE.

Il existe donc un besoin urgent de trouver des inhibiteurs efficaces de la réponse allergique. Jusqu'à présent la découverte de ces inhibiteurs a été rendue difficile par le manque de modèles in vitro et in vivo de criblage de tels composés. Bien que le modèle in vivo présente l'avantage de mettre en évidence les altérations systémiques au niveau d'un animal entier, l'utilisation d'animaux tels que les souris par exemple pour étudier la réponse allergique humaine reste d'un intérêt limité car un tel modèle ne reproduit qu'imparfaitement le mécanisme de la réaction d'hypersensibilité immédiate de type I de l'homme ; en effet, chez la souris les récepteurs aux IgE sont exprimés uniquement dans les mastocytes et les basophiles alors que chez l'homme, leur expression est détectée dans les mastocytes, les basophiles, les éosinophiles, les monocytes, les cellules de Langerhans. Pour pallier ces inconvénients des souris transgéniques exprimant le récepteur humain FeRI ont

été créées. Ainsi, Dombrowic et al. (1993) ont montré qu'une souris Knock-out (KO) pour la chaîne a du récepteur FERI n'est pas capable de développer une anaphylaxie passive, mais que la réponse anaphylactique peut être reconstruite dans des souris obtenues à partir de cellules souches embryonnaires (ES) Knockout (KO) pour la chaîne a du récepteur F, ERI murin et exprimant la chaîne alpha du Fc#RI humain. Le modèle développé par Dombrowic et al. présente néanmoins un certain nombre de limitations car (i) l'intégration de la séquence ADN de la chaîne a du F, SRI humain est réalisée de manière aléatoire ce qui peut affecter l'expression d'autres gènes, (ii) le transgène est présent sous forme multicopie (environ 300) ce qui peut également affecter le taux d'expression du récepteur et la régulation de son expression, et enfin (iii) la haute affinité de récepteur F, SRI aux IgE peut ne pas répondre aux mêmes stimuli que son homologue murin. Egalement, la demande WO 95 15376 suggère d'utiliser une souris dont le récepteur humain FSRI est humanisé afin de cribler des molécules candidates qui inhibent la réponse allergique. Bien que cette demande de brevet suggère de remplacer par ciblage génique dans les

cellules souches-embryonnaires (cellules ES) le gène murin FcSRI par son équivalent humain, cette demande ne présente aucune donnée expérimentale tendant à démontrer que les inventeurs aient réussi à obtenir de telles souris transgéniques. De même, le système suggéré dans la demande WO 95 13376 présente le désavantage de ne pas reproduire l'ensemble des

paramètres de l'interaction récepteur-IgE. En effet, dans ce système, l'immunoglobuline E est d'origine murine ; une telle immunoglobuline ne présente pas la même affinité pour son récepteur que son équivalent humain. De ce fait, un tel modèle, s'il existait, ne reproduirait qu'imparfaitement la situation humaine.

Pour pallier les inconvénients des modèles d'études et de criblage d'inhibiteurs de la réaction allergique de l'art antérieur, et afin d'accélérer la découvertes d'inhibiteurs efficaces des réactions allergiques, les inventeurs se proposent de fournir une cellule animale, non humaine, transgénique, caractérisée en ce qu'elle exprime au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines et une séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline dont au moins tout ou partie du fragment Fc est d'origine humaine, et caractérisée en ce que le gène animal codant pour la chaîne homologue à la dite chaîne du récepteur humain est inactif. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cellule animale, non humaine, transgénique exprime au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins

une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines IgE (FeER) et une séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline IgE dont au moins tout ou partie du

fragment Fc est d'origine humaine, et est caractérisée en ce que le gène animal codant pour la chaîne F, FR homologue à la dite chaîne FcSR du récepteur humain est inactif.

Par inactivation dudit gène, ou gène inactif, on entend désigner un gène dont l'expression est nulle ou fortement inhibée dans la dite cellule. Cette absence d'expression ou cette forte inhibition se traduit soit par une absence ou une quantité négligeable de transcrits ARN correspondants dans la cellule, soit par la présence de transcrit tronqué, soit par une absence ou une quantité négligeable de la protéine correspondante, soit par une protéine correspondante tronquée et/ou inactive, c'est-à-dire dépourvue d'activité biologique.

Par récepteur FcE7R, on entend désigner tous les récepteurs cellulaires participant au mécanisme d'hypersensibilité immédiate et susceptibles de lier les immunoglobulines E par leur fragment Fc. Parmi les récepteurs FEUER, il convient de citer Fc#RI (Kinet, 1992 ; Metzger, 1992), FcyRII, FcyRIII (Takizawa et al., 1992), FcRII/CD23 (Conrad, 1990), Mac 2 (CPB35, EPB) (Cherayil et al., 1989 ; Fnigeri et al., 1992 ; Truong et al., 1993).

Par chaîne du récepteur, on entend désigner la sous-unité ou une des sous-unités du récepteur au fragment Fc des IgE lorsque ledit récepteur est monomérique, respectivement multimérique. De préférence, la chaîne du récepteur humain selon l'invention, qui est exprimée, est la chaîne qui code pour le site de liaison du récepteur au fragment Fc. De préférence, le récepteur au fragment Fc des

immunoglobulines E est le récepteur FcERI. Le récepteur F, CRI est un complexe tétramérique d'une chaîne a, une

chaîne ss et de deux chaînes y liées par un pont disulfure (Kinet, 1992 ; Metzger, 1992). Seul le complexe tétramérique totalement assemblé est exprimé à la surface cellulaire (Blank et al., 1989). Selon la présente invention, ladite chaîne du récepteur F'PI est choisie parmi la chaîne a, la chaîne p, la chaîne y. De préférence, il s'agit de la chaîne a, car celleci contient entièrement le site de liaison du récepteur au fragment Fc. En effet, une souris dont le gène codant pour la chaîne a du FccRI a été inactivé de

manière homozygote n'exprime pas F, CRI au niveau de la surface cellulaire (WO 95 15376). Alternativement, ladite chaîne du récepteur FERI est la chaîne ss qui est remplacée par la chaîne P humaine (Kuster et al., 1992). Selon un autre mode de réalisation, ladite chaîne du récepteur Fc#RI est la chaîne y qui est remplacée par la chaîne y humaine. Néanmoins, selon un autre mode de réalisation de l'invention, il peut être avantageux d'exprimer au moins une, au moins deux, au moins trois, ou les quatre chaînes humaines du complexe Fc#RI à la place de leurs homologues murins.

L'immunoglobuline E ou IgE est une immunoglobuline dont la concentration sérique est très faible. La chaîne s a un point moléculaire élevé (72,5 kDa) et comprend environ 550 acides aminés répartis en quatre domaines constants (C#l, Cg2, Cg3, Cg4). Le clivage enzymatique de l'IgE par la papaïne libère un fragment 5S d'un poids moléculaire d'environ 98 kDa

correspondant au fragment Fc. Ce fragment Fc comprend

la plupart des déterminants spécifiques de la molécule d'IgE. L'IgE selon l'invention comprend au moins tout ou partie d'un fragment Fc humain. De préférence, Je transgène selon l'invention correspond aux régions CL3, Cg4 du fragment Fc de l'IgE. Facultativement, la totalité du fragment Fc de l'IgE est d'origine humaine ou l'IgE selon l'invention est humaine.

L'invention peut être réalisée dans n'importe quelle cellule de mammifère compétente pour la recombinaison homologue. De préférence, il s'agit de cellules de rongeurs, notamment de souris, de rat, de hamster, de cobaye. De préférence, il s'agit de cellules de souris. Alternativement, il s'agit de

cellules de primates, à l'exception de l'homme, tels que les singes, chimpanzés, macaques, babouins. Il pneu également s'agir de cellules de bovins, de caprins, d'ovins, de porcins, notamment de mini-porcs, d'équidés notamment de chevaux, de lagomorphes, notamment de lapins.

Les cellules selon l'invention correspondent à toutes les cellules animales, de préférence de mammifères, à l'exception des cellules humaines. Des exemples de cellules de mammifères compétentes pour la recombinaison comprennent donc les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales ainsi que les cellules habituellement cultivées en laboratoire telles les cellules Hela, les cellules CHO ( Chinese Hamster Ovary ) par exemple.

Les cellules selon l'invention peuvent être définies fonctionnellement comme étant capables de réaliser la recombinaison homologue du ou des

fragment (s) d'ADN exogène qui contient au moins une, de préférence deux, région (s) ayant des homologies de séquences avec une séquence d'ADN cellulaire endogène.

De telles cellules contiennent naturellement des recombinases endogènes ou ont été génétiquement modifiées pour en contenir ou pour contenir les composés nécessaires pour réaliser la recombinaison de l'ADN.

De manière préférée, parmi les cellules selon l'invention, il convient de citer tous les types

cellulaires exprimant naturellement le récepteur liant la portion Fc des IgE (FER) et/ou exprimant les immunoglobulines IgE, telles par exemple les cellules du système immunitaire ou certaines cellules neuronales. Parmi les cellules du système immunitaire, il convient de citer de manière non exhaustive, les lymphocytes T, les cellules NK, les cellules K, les lymphocytes B, les mastocytes, les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les plaquettes, les monocytes des cellules dendritiques, les cellules de Langerhans. Certaines de ces cellules expriment des récepteurs FsR ayant une affinité particulièrement élevée (kA = 1010M-1) : il s'agit des mastocytes et des basophiles. D'autres cellules telles les monocytes, macrophages, éosinophiles, ainsi que les plaquettes exprimant le fragment Fc#R, expriment le fragment F, ER avec une affinité beaucoup plus faible (kA = 10M). Il convient également de citer les cellules qui dans certaines conditions de culture, ou après différenciation ou manipulation génétique sont capables d'exprimer le

récepteur liant la portion Fc des IgE (FcR) et/ou exprimant les immunoglobulines IgE. On peut citer les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches neuronales, les cellules souches embryonnaires totipotentes (cellules ES) ou pluripotentes. Ces cellules souches peuvent se différencier en une cellule exprimant les transgènes selon l'invention telles par exemple les cellules du système immunitaire ou les cellules neuronales. Par cellules souches, on entend désigner tous les types de cellules indifférenciées multipotentes ou pluripotentes, cultivables in vitro de façon prolongée sans perdre leurs caractéristiques, et qui sont susceptibles de se différencier en un ou plusieurs types cellulaires lorsqu'elles sont placées dans des conditions de culture définies. Ainsi, lorsque la cellule selon l'invention est une cellule ES ou une cellule hématopoïétique, on peut envisager d'induire Ja différenciation de celle-ci en différents types cellulaires susceptibles d'exprimer les transgènes, tels par exemple les lymphocytes T, les cellules NK, les cellules K, les lymphocytes B, les mastocytes, les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les plaquettes, les monocytes des cellules dendritiques, les cellules de Langerhans. Lorsqu'il est nécessaire d'employer des cellules souches embryonnaires (ES), pour la production de l'animal transgénique selon l'invention par exemple, une lignée cellulaire de cellules ES peut être enpjoyée ou des cellules embryonnaires peuvent être obtenues fraîchement à partir d'un hôte animal selon l'invention, en général d'une souris, d'un rat, d'un hamster, d'un cobaye. De telles cellules sont cultivées

sur une couche de fibroblastes nourriciers appropriés ou sur de la gélatine en présence de facteurs de croissance appropriés tels que du facteur inhibiteur de leucémie (LIF pour LeuTcemj. a Jnhjjb-t-mg'Factor ).

Au sens de la présente invention, on entend désigner par transgénique une cellule comportant un transgène. On entend désigner par transgène ou par séquence d'acides nucléiques exogène ou par gène exogène, ou par séquence nucléotidique, du matériel génétique qui a été ou qui va être inséré artificiellement dans le génome d'un mammifère, particulièrement dans une cellule de mammifère cultivée in vitro ou dans une cellule de mammifère vivant ou qui va se maintenir dans la dite cellule sous forme épisomale. De manière préférée, la séquence nuclétidique selon la présente invention comprend au moins une séquence susceptible d'être transcrite ou transcrite et traduite en protéine. Le transgène peut être cloné dans un vecteur de clonage qui permet d'en assurer sa propagation dans une cellule hôte, et/ou facultativement dans un vecteur d'expression pour assurer l'expression du transgène. Les technologies de l'ADN recombinant utilisées pour la construction du vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention sont celles connues et communément utilisées par les hommes de l'art. Les techniques standard sont utilisées pour le clonage, l'isolement de l'ADN, l'amplification, et la purification ; les réactions enzymatiques impliquant l'ADN ligase, l'ADN polymérase, les endonucléases de restriction sont effectuées selon les recommandations du fabricant. Ces techniques et les autres sont généralement réalisées selon Sambrook et

al. (1989). Les vecteurs incluent des plasmides, les cosmides, les phagemides, les bactériophaces, les rétrovirus et autres virus animaux, les chromosoms artificiels, tels les YAC, BAC, HAC et autres vecteurs analogues.

Les méthodes pour générer des cellules transgéniques selon l'invention sont bien connues de l'homme de l'art (Gordon et al., 1989). Diverses techniques pour transfecter des cellules de mammifères ont été décrites (pour revue, voir Keon et al. 1 1990).

Le transgène selon l'invention, facultativement ccmpris dans un vecteur linéarisé ou non, ou sous la forme d'un fragment de vecteur, peut être introduit dans la cellule hôte par des méthodes standard telles que par exemple la micro-injection dans le noyau (US 4 873 191), la transfection par précipitation au phosphate des

calcium, la lipofection, l'électroporation (LO, 1983), le choc thermique, la transformation avec des polymères cationiques (PEG, polybrène, DEAE-Dextran...), l'infection virale (Van der Putten et al., 1935), le sperme (Lavitrano et al., 1989).

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cellule transgénique selon l'lnventicn est obtenue par ciblage génique ( gene targeting ) du ou des transgène (s) au niveau d'une ou des séquences du génome de la cellule hôte. Plus précisément, le transgène est inséré de manière stable par recombinaison homologue au niveau de séquences homologues dans le génome de la cellule hôte. Lorsqu'il s'agit d'obtenir une cellule transgénique en vue de produire un animal transgénique, la cellule hôte est de

préférence une cellule souche embryonnaire (cellule ES) (Thompson et al., 1989).

Le ciblage génique représente la modification dirigée d'un locus chromosomique par recombinaison homologue avec une séquence d'ADN exogène ayant une homologie de séquence avec la séquence endogène cibléc.

On distingue différents types de ciblage génétique.

Ainsi le ciblage génique peut être utilisé pour modifier, , l'expression d'un ou de plusieurs gène (s) endogène (s), ou pour remplacer un gène endogène par un gène exogène, ou pour placer un gène exogène sous le contrôle d'éléments de régulation de l'expression génique de gène endogène particulier qui reste actif.

Dans ce cas, il le ciblage génique est appelé Knockin (KI). Alternativement, le ciblage génique peut être utilisé pour diminuer ou annihiler l'expression d'un ou plusieurs gènes. Il s'agit alors de ciblage génique appelé Knock-out (KO) (voir Bol key et a~l. 1 1989).

Pour réaliser la recombinaison homologue il est nécessaire que le transgène contiennent au moins une séquence d'ADN comprenant au moins une portion du gène ciblé, avec éventuellement les modifications génétiques désirées, et également des régions d'ADN d'homologie avec le locus cible, de préférence au nombre de deux, situé de part et d'autre de la portion du gène cible. Par régions d'ADN d'homologies ou séquences d'ADN homologues ou substantiellement homologues , on entend désigner deux séquences d'ADN qui, après un alignement optimal et après comparaison, sont identiques pour environ au moins environ 75% des nucléotides, au moins environ 80% des nucléotides, habituellement au moins

environ 90% à 95% des nucléotides et, de manière plus préférée, au moins environ 98 à 99, 5% des nucléotides.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur

longueur. On entend désigner par"meilleur alignement 11 ou"alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux

séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 85 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 %, 98 %-et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 85 %, de préférence au moins 90 , 95 , 98 % et 99 % d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence.

La longueur des régions d'homologie est partiellement dépendante du degré d'homologie. Ceci est dû au fait qu'une diminution de la quantité d'homologle résulte dans une diminution de la fréquence de recombinaison homologue. Si des régions de non homologie existent entre les portions de séquences homologues, il est préférable que cette non homologie ne s'étale pas sur toute la portion de séquence homologue mais plutôt dans des portions discrètes. Dans

tous les cas, plus le degré d'homologie est faible, plus la région d'homologie doit être longue pour faciliter la recombinaison homologue. Bien que aussi peu que 14 pb homologue à 100% soient suffisantes pour réaliser la recombinaison homologue dans les bactéries, des portions de séquences homologues plus longues sont préférées, en général. Ces portions font au moins 250

pb, 500 pb, 750 pb, 1 000 pb, 1500 pb, 1750 pb, de préférence au moins 2 000 pb pour chaque portion de séquence homologue. Selon l'invention, les fragments d'ADN sont de n'importe quelle taille. La taille minimale requise est subordonnée à la nécessité d'avcir au moins une région d'homologie suffisamment longue pour faciliter la recombinaison homologue. Les fragments d'ADN ont une taille d'au moins environ 2 kb, de manière préférée d'au moins environ 3 kb, 5 kb, 6 kb.

Le transgène n'est pas limité à une séquence particulière d'ADN. La séquence d'ADN peut être d'une origine purement synthétique (par exemple réalisée en routine à partir d'un synthétiseur d'ADN), ou peut dériver de séquences d'ARNm par reverse transcription, ou peut dériver directement de séquences d'ADN génomique. Lorsque la séquence d'ADN dérive de séquences d'ARN par reverse transcription, celle-ci peut contenir ou non tout ou partie de séquences non codantes telles les introns, selon que la molécule d'ARN correspondante a ou non subi, partiellement ou totalement, un épissage. De préférence, l'ADN utilisé pour réaliser la recombinaison homologue comprend de l'ADN génomique plutôt que de l'ADNc. En effet, d'importantes séquences cis-régulatrices présentes dans

les introns, les régions distales, les régions promotrices peuvent être présentes. Les séquences dérivant d'ADN génomique codent généralement au moins pour une portion de gène mais peuvent alternativement coder pour des régions non transcrites ou des régions d'un locus génétique non réarrangé telles que les loci des immunoglobulines ou du récepteur des cellules T.

Généralement, les séquences d'ADN génomique incluent une séquence codant pour un transcrit d'ARN. De préférence, le transcrit d'ARN code pour un polypeptide. De préférence, il s'agit de tout ou partie du fragment Fc des immunoglobulines, de préférence les IgE, ou une chaîne des récéepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines, de préférence F, FR.

Le transgène selon l'invention peut contenir des séquences de régulation appropriées pour diriger et contrôler l'expression desdits polypeptides dans le ou les type (s) cellulaire (s) approprié (s). De manière préférée, les transgènes sont dépourvus des séquences de régulation nécessaires pour diriger et contrôler l'expression dans un ou des type (s) cellulaire (s) approprié (s) ; les transgènes sont placés après recombinaison homologue sous le contrôle des séquences

animales endogènes de régulation de l'expression du gène animal qui est de préférence inactivé par l'événement de recombinaison homologue et l'intégration du gène humain. Alternativement, l'expression de l'un des transgènes peut être placée sous le contrôle de séquences exogènes humaines de régulation et l'autre sous le contrôle de séquences murines endogènes de régulation.

Le transgène peut être aussi petit que quelques centaines de paires de bases d'ADNe ou aussi large qu'une centaine de milliers de paires de bases d'un locus génique comprenant la séquence codante exoniqueintronique et les séquences de régulation nécessaires à l'obtention d'une expression contrôlée de manière spatio-temporelle. De préférence, le segment d'ADN recombiné a une taille comprise entre 2,5 kb et 1 000 kb. Quoi qu'il en soit, les segments d'ADN recombinés peuvent être inférieurs à 2,5 kb et supérieurs à 1 000 kb.

Le transgène ou la séquence d'ADN de la présente

invention est de préférence sous forme native, c'est-àdire dérivée directement d'une séquence d'ADN exogène naturellement présente dans une cellule animale. Cette séquence d'ADN sous forme native peut être modifiée par exemple par insertion de sites de restriction nécessaires au clonage et/ou par insertion de sites de recombinaison site-spécifiques (séquences lox et flp).

Alternativement, la séquence d'ADN de la présente invention peut avoir été créée artificiellement in vitro par les techniques de l'ADN recombinant, en associant par exemple des portions d'ADN génomique et d'ADNc. Il s'agit là de séquences d'ADN chimérique.

La séquence d'ADN selon l'invention, sous forme native ou chimérique, peut être mutée en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier. Ainsi, la séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines, de préférence une IgE, et la séquence nucléotidique codant pour tout ou partie de la chaîne lourde des immunoglobulines, de préférence une IgE,

peuvent être altérés dans leur séquence codante ou non codante. Le gène introduit peut ainsi être un gène de type sauvage présentant un polymorphisme naturel ou une séquence manipulée génétiquement, par exemple ayant des délétions, substitutions ou insertions dans les régions codantes ou non codantes. Pour les séquences codantes, ces mutations peuvent affecter la séquence d'acides aminés. Ainsi, la séquence d'ADN codant pour tout ou partie du fragment Fc humain des IgE utilisé pour réaliser la recombinaison homologue peut être obtenue

par mutagenèse dirigée du fragment Fc murin correspondant.

Lorsque le gène introduit est une séquence codante, il est en général lié de manière opérationnelle à des éléments contrôlant l'expression génique. Une séquence nucléique est liée de manière opérationnelle lorsqu'elle est placée dans une relation fonctionnelle avec une autre séquence d'acide nucléique. Par exemple, un promoteur ou un activateur ( enhancer ) est lié de manière opérationnelle à une séquence codante, s'il affecte la transcription de ladite séquence codante.

Concernant les séquences régulatrices de la transcription, lié de manière opérationnelle signifie que les séquences d'ADN liées sont contigues, et lorsqu'il s'agit de lier deux régions codantes pour des protéines, contiguës et en phase de lecture. Pour les séquences de switch des immunoglobulines, lié de manière opérationnelle signifie que les séquences sont capables d'effectuer le switch de recombinaison.

Lorsque les cellules ont été transformées par le transgène, elles peuvent être cultivées in vitro ou

bien être utilisées pour produire des animaux transgéniques. Après transformation, les cellules sont ensemencées sur une couche nourricière et/ou dans un milieu approprié. Les cellules contenant la construction peuvent être détectées en utilisant un milieu sélectif. Après un temps suffisant pour laisser les colonies pousser, celles-ci sont récupérées et analysées pour déterminer si un événement de recombinaison homologue et/ou une intégration de la construction s'est produite. Pour réaliser le criblage des clones ayant satisfait à la recombinaison homologue, des marqueurs positifs et négatifs, encore appelés gènes de sélection, peuvent être insérés dans le vecteur de recombinaison homologue. Différents systèmes de sélection des cellules ayant réalisé l'événement de recombinaison homologue ont été décrits ; il convient de citer le premier système décrit qui utilise des vecteurs de sélection positif/négatif (Mansour et al., 1988 ; Capecchi, 1989).

Par gène de sélection, on entend désigner un gène qui permet aux cellules qui le possèdent d'être sélectionnées spécifiquement pour ou contre la présence d'un agent sélectif correspondant. Pour illustrer ce propos, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif qui permet à une cellule hôte d'être sélectionnée positivement en présence de l'antibiotique correspondant. Une variété de marqueurs positifs et négatifs sont connus de l'homme du métier (pour revue voir brevet US 5 627 059). Ce gène de sélection peut se trouver soit à l'intérieur ou à l'extérieur du transgène linéarisé. Lorsque le gène de sélection se

trouve à l'intérieur du transgène, c'est-à-dire entre les extrémités 5'et 3'du transgène, celui-ci peut être présent sous la forme d'une entité gémque distincte du gène rapporteur selon l'invention. Dans ce cas, le gène de sélection est lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler son expression ; alternativement le gène de sélection peut être mis sous le contrôle des séquences de régulation de l'expression dudit gène rapporteur.

Ces séquences, connues de l'homme du métier, correspondent notamment aux séquences promotrices, facultativement aux séquences activatrices et aux signaux de terminaison de la transcription.

Facultativement, le gène de sélection peut constituer un gène de fusion avec le gène rapporteur. Ledit gène de fusion est alors lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler l'expression dudit gène de fusion. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le gène de sélection est situé aux extrémités 5'ou 3'du transgène de sorte que si un événement de recombinaison homologue se produit le gène de sélection n'est pas intégré dans l'ADN génomique cellulaire ; dans ce cas le gène de sélection est un gène de sélection négatif (pour revue voir brevet US 5 627 059).

Ledit gène de sélection positive selon l'invention est de préférence choisi parmi les gènes de résistance aux antibiotiques. Parmi les antibiotiques, il convient de citer de manière non exhaustive la néomycine, la tétracycline, l'ampicilline, la kanamycine, la phléomycine, la bléomycine, l'hygromycine, le chloramphénicol, la carbénicilline, la généticine, la

puromycine. Les gènes de résistance correspondant à ces antibiotiques sont connus de l'homme du métier ; à titre d'exemple, le gène de la néomycine rend les cellules résistantes à la présence de l'antibiotique G4518dans le milieu de culture. Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène HisD, l'agent sélectif correspondant étant l'histidinol. Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène de la guaninephosphoribosyl-transférase (GpT), l'agent sélectif correspondant étant la xanthine. Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène de l'hypoxanthine-phosphoribosyl-transférase (HPRT), l'agent sélectif correspondant étant l'hypoxanthine.

Ledit gène de sélection négative selon l'invention est de préférence choisi parmi le gène de la 6thioxanthine ou thymidine kinase (TK) (Mzoz et al.,

1993), les gènes codant pour des toxines bactériennes ou virales telles par exemple l'exotoxine A de Pseudomonas, la toxine diphtérique (DTA), la toxine cholérique, la toxine anthrox de Bacillus, la toxine

Pertussis, la toxine Shiga de Shigella, la toxine apparentée à la toxine Shiga, les toxines dEscherchja coli, la colicine A, la d-endotoxine. On peut également citer le cytochrome p450 de rat et la cyclophosphophamide (Wei et al., 1994), la purine nucleoside phosphorylase d'Escherichia coli (E. coli) et la 6-methylpurine déoxyribonucléoside (Sorscher et al., 1994), les cytosines déaminases (Cdase) ou uracil phosphoribosyl transférase (UPRTase) qui peuvent être utilisées avec la 5-fluorocytosine (5-FC).

Le ou les marqueurs de sélection utilisés pour permettre d'identifier les événements de recombinaison homologue peuvent affecter par la suite l'expression génique, et peuvent être éliminés, si nécessaire, par la mise en oeuvre de recombinases site-spécifiques telle la recombinase Cre spécifique des sites Lox (Sauer, 1994 ; Rajewsky et al., 1996 ; Sauer, 1998) ou FLP spécifique des sites FRT (Kilby et al., 1993,,.

Les colonies positives, c'est-à-dire contenant des cellules dans lesquelles au moins un événement de recombinaison homologue s'est produit sont identifiées par une analyse par Southern Blotting et/ou par des techniques de PCR. Le taux d'expression, dans les cellules isolées ou les cellules de l'animal transgénique selon l'invention, de l'ARNm correspondant au transgène peut également être déterminé par des techniques comprenant l'analyse par Northern blotting, l'analyse par hybridation in situ, par RT-PCR.

Egalement les cellules ou tissus animaux exprimant le transgène peuvent être identifiés en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine rapporteuse.

Les cellules positives peuvent ensuite être utilisées pour réaliser les manipulations sur l'embryon et notamment l'injection des cellules modifiées par recombinaison homologue dans les blastocystes. Pour ce qui concerne la souris, les blastocystes sont obtenus à partir de femelles superovulées de 4 à 6 semaines. Les cellules sont trypsinées et les cellules modifiées sont injectées dans le blastocell d'un blastocyste. Après l'injection, les blastocystes sont introduits dans la corne utérine de femelles pseudo-gestantes. On laisse ensuite les femelles aller jusqu'à leur terme et les

portées résultantes sont analysées pour déterminer la présence de cellules mutantes possédant la construction. L'analyse du génotype ou d'un phénotype différent entre les cellules de l'embryon nouveau-né et les cellules du blastocyste ou des cellules ES permet de détecter les nouveau-nés chimériques. Les embryons chimériques sont ensuite élevés jusqu'à l'âge adulte.

Les chimères ou animaux chimériques, sont des animaux dans lesquels seule une sous-population de cellules possède un génome altéré. Les animaux chimériques présentant le gène ou les gènes modifiés, sont on général croisés entre eux ou avec un animal de type sauvage afin d'obtenir une descendance hétérozygote ou homozygote. Les hétérozygotes mâles et femelles sont ensuite croisés pour générer des animaux homozygotes. A moins qu'il ne soit indiqué, l'animal transgénique selon l'invention comprend des changements stables de la séquence nucléotidique des cellules de la lignée germinale.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule transgénique non humaine selon l'invention peut servir de cellule donneuse de noyau dans le cadre d'un transfert de noyau ou transfert nucléaire. Par transfert nucléaire, on entend désigner le transfert de noyau d'une cellule vivante donneuse de vertébré, d'un organisme adulte ou au stade foetal, dans le cytoplasme d'une cellule receveuse énucléée de la même espèce ou d'une espèce différente. Le noyau transféré est reprogrammé pour diriger le développement des embryons clonés qui peuvent ensuite être transférés dans des femelles porteuses pour produire les foetus et les nouveau-nés, ou utilisés pour produire des cellules de

la masse cellulaire interne en culture. Différentes techniques de clonage nucléaire sont susceptibles d'être utilisées ; parmi celles-ci, il convient-de citer de manière non exhaustive celles qui font l'objet des demandes de brevet WO 95 17500, WO 97 07668, WO 97 07669, WO 98 30683, WO 99 01163, WO 99 3/143.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au

fragment Fc, de préférence F, cR, et/ou tout ou partie du fragment Fc humain de la chaîne lourde des immunoglobulines, de préférence les immunoglobulines IgE, est intégrée de manière stable dans le génome de ladite cellule. Cette intégration dans le géncme de ladite cellule du dit ou des dit gène (s) humain () codant pour une des chaînes d'un récepteur humain au fragment Fc des immunoglobulines, de préférence le récepteur FcSR, et/ou l'intégration de tout ou partie

du fragment Fc humain de la chaîne lcurde des immunoglobulines, de préférence les immunoglobulines IgE, est réalisée par recombinaison homologue et constitue un Knock-in ; il est réalisé au niveau dudit ou desdits gènes animal (animaux) homologue (s) audit ou audits gène (s) humain (s) codant respectivement pour une des chaînes des récepteurs au fragment Fc des immunoglobulines, de préférence le récepteur Er pour tout ou partie de la séquence nucléotidique codant

pour le fragment Fc de la chaîne lourde des immunoglobulines, de préférence les immunoglobulines IgE, ladite intégration provoquant l'inactivation dudit gène animal homologue correspondant.

La séquence nucléotidique qui code pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines, de préférence Fc : sR, est liée de manière opérationnelle à des séquences de régulation de l'expression, lesdites séquences contrôlant l'expression de la dite séquence dans la cellule ; de préférence, il s'agit des séquences animales endogènes de régulation de la transcription du gène homologue codant pour la ou les chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines. Alternativement, il s'agit des séquences humaines endogènes de régulation de l'expression du gène homologue codant pour la ou les chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunogmobulines.

Selon un mode préféré de réalisation, la séquence nucléotidique qui code pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline, de préférence une IgE, est le gène animal endogène, à l'exception de la séquence codant pour tout ou partie du fragment Fc de ladite immunoglobuline qui est d'origine humaine, ladite séquence codant pour tout ou partie du fragment Fc ayant été intégrée dans ledit gène par recombinaison homologue ( Knock-In ). Alternativement, la séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline est le gène humain codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline, ledit gène humain étant intégré par recombinaison homologue ( KnockIn ) dans le génome de ladite cellule, au niveau dudit gène animal homologue, ladite intégration provoquant l'inactivation dudit gène animal homologue.

La séquence nucléotidique qui code pour la chaîne lourde d'une IgE dont au moins tout ou partie du fragment Fc est d'origine humaine est liée de manière opérationnelle aux séquences endogènes animales de régulation de l'expression dudit gène de la chaîne lourde de l'IgE humaine, lesdites séquences contrôlant l'expression de ladite séquence nucléotidique dans ladite cellule. Alternativement, les séquences de régulation de l'expression sont les séquences endogènes humaines de régulation de la transcription dudit gène de la chaîne lourde des immunoglobulines humaines, de préférence les IgE humaines.

Selon un mode de réalisation, le gène exogène selon l'invention est dépourvu d'éléments de régulation de l'expression génique et est placé sous le contrôle des éléments endogènes de régulation de l'expression du gène cible. Ainsi, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le gène de la chaîne a du gène humain du récepteur F, SRI est placé dans une cellule murine sous le contrôle des éléments de régulaticn de l'expression du gène de la chaîne a du FeRI murin et dans la même cellule murine le gène de la chaîne lourde des IgE comportant tout ou partie du fragment F, d'origine humaine est placé sous le contrôle des éléments de régulation de l'expression du gène de la chaîne lourde des IgE murines.

Par éléments contrôlant l'expression génique, on entend désigner toutes les séquences d'ADN impllquées dans la régulation de l'expression génique c'est-à-dire essentiellement les séquences régulatrices de la transcription, de l'épissage, de la traduction. Parmi les séquences d'ADN régulatrices de la transcription,

il convient de citer la séquence promotrice minimale, les séquences amonts (par exemple, la boite SP1, l'IRE pour interferon responsive element > > ,...), les séquences activatrices ( enhancers ), éventuellement les séquences inhibitrices ( silencers ), les séquences insulateurs ( insulator ), les séquences d'épissage.

Les éléments contrôlant l'expression génique permettent soit une expression constitutive, ubiquitaire, inductible, spécifique d'un type cellulaire ( tissu-spécifique ) ou spécifique d'une étape du développement. Ces éléments peuvent être ou non hétérologues à l'organisme, ou être naturellement présents ou non dans le génome de l'organisme. Il est évident qu'en fonction du résultat recherché, l'homme du métier choisira et adaptera les éléments de régulation de l'expression des gènes. De manière préférée, les séquences régulatrices de l'expression, sont celles du gène exogène. Ainsi, selon le mode préféré de réalisation de l'invention, où la séquence codante exogène est la séquence codante humaine F, FRI, le promoteur et les autres séquences régulatrices dérivent du promoteur humain et des séquences régulatrices humaines du gène FcSRI.

Dans la cellule selon l'invention, la séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline est de préférence le gène animal endogène, à l'exception de la séquence codant pour tout ou partie du fragment Fc de ladite immunoglobuline qui est d'origine humaine, ladite séquence codant pour tout ou partie du fragment Fc ayant été intégrée dans ledit

gène par recombinaison homologue ( Knock-In ). De manière préférée, il s'agit d'une immunoglobuline IgE. Alternativement, la séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline est le gène humain codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline, ledit gène humain étant intégré par recombinaison homologue ( Knock-In ) dans le génome de ladite cellule, au niveau dudit gène animal homologue, ladite intégration provoquant l'inactivation dudit gène animal homologue. De manière préférée, il s'agit d'une immunoglobuline IgE.

La cellule transgénique et/ou l'animal transgénique non humain selon l'invention est obtenu en introduisant, simultanément ou de manière décalée dans le temps, au moins un transgène codant pour une chaîne du récepteur humain des immunoglobulines, de préférence de F, cR, et un transgène codant au moins pour le fragment Fc de la chaîne lourde des immuncglobullnes humaines, de préférence IgE, dans un zygote ou un embryon précoce de l'animal non humain. Facultativement, il peut être intéressant d'introduire un transgène codant pour tout ou partie de la chaîne légère des immunoglobulines humaines, de préférence IgE. L'introduction de ces différents transgènes dans la cellule selon l'invention peut être réalisée simultanément ou de manière décalée dans le temps.

Selon un mode préféré de réalisation, la cellule double transgénique selon l'invention peut être obtenue directement par introduction simultanée des fragments d'ADN nécessaires à la recombinaison homologue dans ladite cellule en utilisant des méthodes favorisant la co-transformation de molécules d'ADN multiples. Les

cellules sont alors sélectionnées pour le double événement de recombinaison attendu en utilisant un système de sélection adapté. Alternativement, la cellule double transgénique selon l'invention peut être obtenue en réalisant les événements de recombinaiscn homologue séparément et de manière décalée dans le temps. Ainsi, la cellule, après introduction d'un premier vecteur de recombinaison homologue, est sélectionnée pour le premier événement de recombinaison homologue, en utilisant un système de sélection adaptée ; cette cellule nouvellement transgénique est ensuite transformée avec un second vecteur de recombinaison homologue, puis sélectionnée pour le second événement de recombinaison homologue en utilisant un système de sélection identique ou différent. Facultativement, cette cellule double transgénique peut ensuite être transformée avec un troisième vecteur de recombinaison homologue, puis sélectionnée pour le troisième événement de recombinaison homologue en utilisant un système de sélection identique ou différent, et ainsi de suite.

Alternativement, la cellule double, triple ou multitransgénique selon l'invention peut être obtenue par croisement successif d'animaux simple transgéniques.

Par exemple, la cellule double transgénique peut être obtenue par croisement de deux animaux simples transgéniques homozygotes ; elle peut être obtenue par croisement puis sélection de deux animaux simples transgéniques hétérozygotes, ou par croisement et sélection d'un animal simple transgénique homozygote et d'un animal simple transgénique hétérozygote.

De manière préférée, ledit gène humain codant pour une des chaînes des récepteurs du gragment fc des immunoglobulines, de préférence Fc#R, et tout ou partie du fragment Fc humain de la chaîne lourde des immunoglobulines de préférence IgE, sont intégrés de manière stable dans le génome de ladite cellule. Par intégration de manière stable, on entend signifier l'insertion du transgène dans l'ADN génomique de la cellule selon l'invention. Le transgène ainsi inséré est ensuite transmis à la descendance cellulaire.

Ladite cellule et ledit animal peuvent être obtenus en utilisant différentes stratégies. De manière préférée, la stratégie consiste à réaliser le Knock- in de tout ou partie de la séquence codante peur le fragment constant Fc de la chaîne lourde des IgE. Le Knock-in peut concerner par exemple l'ensemble du fragment constant ou seulement la partie Cf, C ;. 4 du fragment Fc de l'IgE interagissant avec le récepteur

F, F, R. Selon un mode préféré de réalisation, seul le fragment Fc du gène murin codant pour la chaîne lourde des IgE est remplacée par ciblage génique (Knock-In) par le fragment Fc du gène humain de la chaîne lourde des IgE. Selon ce mode préféré de réalisation, l'immunoglobuline ou l'ensemble des immunoglobulines, de préférence des IgE, produit par la cellule ou respectivement par l'animal transgénique selon l'invention aura tout ou partie du fragment Fc humanisé. Un tel animal est capable de réarranger les segments des gènes des immunoglobulines humanisées, de préférence des IgE, pour produire une réponse anticorps primaire et capable de développer une réponse anticorps

secondaire par des mutations somatiques des gènes des immunoglobulines, de préférence IgE, réarrangés. Selon ce mode de réalisation préféré, le répertoire des chaînes lourdes des immunoglobulines, de préférence des IgE de l'animal transgénique selon l'invention correspond au répertoire naturel de l'animal. Un tel animal sera capable de réagir contre des allergènes murins .

Selon un second mode de réalisation, U peut être intéressant que la cellule ou l'animal selon l'invention exprime un répertoire de chaînes lourdes d'immunoglobulines humaines, de préférence de chaînes lourdes d'IgE humaines ou facultativement un répertoire d'immunoglobulines humaines, de préférence d'IgE humaines. Pour ce faire, il est nécessaire d'introduire le répertoire de chaînes lourdes d'immunoglobulines humaines ou des IgE humaines en lieu et place de celui de la souris. Différentes technologies peuvent ainsi être employées (voir par exemple EP 546 073, MO 95 15376). De manière préféré, l'animal exprime un répertoire d'immunoglobulines humaines et est donc susceptible de réagir contre des allergènes humains . Ainsi, la cellule selon l'invention comprend une séquence nucléotidique codant pour la chaîne loude des immunoglobulines et une séquence nucléotidique codant pour la chaîne légère des immunoglobulines, de préférence des IgE. Ces séquences nucléotidiqes se composent d'ADN génomique humain non réarrangé. Dans le cas de la chaîne lourde, le transgène contient la totalité ou une partie des membres de toutes les six familles VH connues (soit plusieurs centaines de segments VH possibles), les

segments D (douze segments), les segments J (quatre segments), ainsi que la région constante s (Bermaan et al., 1998). La lignée cellulaire transgénique ou la souris transgénique exprimant un tel transgène exprime correctement la chaîne lourde des immunoglobulines humains, de préférence IgE, ainsi qu'un large répertoire de régions variables pour déclencher une réponse immunitaire à la plupart des antigènes. Dans 1c cas de la chaîne légère, le transgène contient la totalité ou une partie des membres de toutes les familles VH connues, les segments J, ainsi que la région constante e. Alternativement, le transgène codant pour la chaîne lourde et facultativement la chaîne légère de l'immunoglobuline selon l'invention, de préférence IgE, peut être généré par recombinaison intracellulaire in vivo selon la technologie décrite dans EP 546 073.

Enfin, l'animal selon l'invention peut exprimer de manière constitutionnelle ou inductible une unique immunoglobuline humanisée selon l'invention, de préférence une IgE, codée par un unique gène réarrangé.

Cette immunoglobuline, de préférence une IgE, étant dirigée contre un allergène particulier, l'animal transgénique constitue un modèle d'étude et de criblage d'inhibiteurs récepteurs au fragment Fc de l'immunoglobuline dirigé contre cet allergène spécifique.

Enfin, le gène humain ou humanisé codant pour une immunoglobuline IgE peut être un mini-gène. Par minigène, on entend désigner une séquence d'ADN, en général d'une taille inférieure à 150 kb, en général comprise

entre 25 et 100 kb et contenant au moins un segment variable V, un segment J, une région constante Cs et lorsqu'il s'agit d'un mini-gène de la chaîne lourde d'un segment D.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule est caractérisée en ce que ledit gène humain codant pour une immunoglobuline, de préférence une IgE, est présent sous forme épisomale dans ladite cellule, et en ce que ledit gène animal homologue est inactif dans ladite cellule. Selon ce mode de réalisation, ledit gène animal homologue est inactivé par recombinaison homologue ( Knock-out ).

Il peut être en outre intéressant de détecter instantanément si la cellule ou l'animal transgénique selon l'invention développe une réponse allergique suite à l'exposition à un ou plusieurs allergènes. C'est la raison pour laquelle la cellule selon l'invention se caractérise en ce que son génome contient en outre au moins un gène rapporteur lié de manière opérationnelle à une ou plusieurs séquences de régulation de l'expression inductible suite à une stimulation du récepteur FEUER et/ou à une stimulation de la synthèse d'IgE. La ou lesdites séquences de régulation de l'expression est ou sont choisies parmi le promoteur du gène CD23 ou du gène de l'interleukine 4 (kl-4) et tout autre gène dont l'expression est induite suite à une stimulation du récepteur FEUER et/ou une synthèse d'IgE. Selon un mode préféré de réalisation, la cellule transgénique peut être obtenue à partir d'un animal trangénique obtenu par croisement d'un animal transgénique dont le génome contient un gène rapporteur lié de manière opérationnelle à une ou

plusieurs séquences de régulation de l'expression inductible suite à une stimulation du récepteur Fe2R et/ou à une stimulation de la synthèse de IgE, et un animal trangénique présentant au moins une chaîne des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines, de préférence des IgE, et une séquence nucléotidique codant pour tout ou partie du fragment Fc humain des IgE. Cette animal trangénique est également un des objet de la présente invention. Alternativement, le gène rapporteur peut être présent sous forme épisomale dans un vecteur d'expression dans la dite cellule.

Il peut être en outre intéressant de détecter simultanément le type de polarisation de la réponse immune et/ou le type de fonction effectrice induite par un ou plusieurs allergènes. C'est la raison pour laquelle la présente invention se propose d'introduire en outre dans le génome de la présente cellule selon l'invention au moins un transgène codant au moins pour une protéine rapporteuse dont l'expression est corrélée à l'expression d'au moins une protéine naturellement produite par ladite cellule et spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune, notamment Thl et Th2, et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune. Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, la cellule selon l'invention comprend en outre un premier transgène codant pour une première protéine rapporteuse, ledit premier transgène étant intégré par recombinaison homologue ( Knock-In ) au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique d'un premier type de polarisation de la réponse immune, tel thl, sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit premier

transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène endogène ; et (ii) un second transgène codant pour une deuxième protéine rapporteuse, distincte de ladite première protéine rapporteuse, ledit second transgène étant intégré par recombinaison homologue ( KnockIn ) au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique d'un second type de polarisation de la réponse immune, tel Th2, sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit second transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène animal endogène. De manière préférée, cette cellule transgénique non-humaine se caractérise en ce que la

protéine spécifique du type Thl de polarisation de la réponse immune est 1/IFN-y, la protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est l'interleukine 4 (IL- 4), le dit premier transgène code pour la protéine rapporteuse GFP et le second transgène code pour la protéine rapporteuse RFP. Une telle cellule multitrangénique est de préférence obtenue à partir de cellules dérivées d'un animal multi-transgéniques obtenu par croisement successif d'animaux transgéniques.

On entend désigner par gène rapporteur, un gène qui permet aux cellules comportant ce gène d'être détectées de manière spécifique, -suite à l'expression de ce dernier, c'est-à-dire d'être distinguées des autres cellules qui ne portent pas ce gène marqueur. Ledit gène rapporteur selon l'invention code pour une protéine rapporteuse choisie de préférence dans le groupe composé des protéines auto-fluorescentes, telles que la protéine de fluorescence verte (GFP, pour Green Fluorescence'"Protein ), la protéine de

fluorescente verte augmentée (EGFP), la protéine de fluorescence jaune (YFP), la protéine de fluorescence bleue (BFP), la protéine de fluorescence rouge (RFP), ainsi que les variants de ces protéines de fluorescence obtenues par mutagenèse pour générer une fluorescence de couleur différente. Ledit gène rapporteur code également pour toute enzyme détectable de manière fluorescente, phosphorescente, ou visible par un procédé histochimique sur des cellules vivantes ou toutes autres méthodes d'analyse cellulaire, ou par microscopie. De façon non exhaustive, il convient de citer la ss-galactosidase (ss-GAL), la ss-glucuronidase (ss-GUS), la phosphatase alcaline, notamment la phosphatase alcaline placentaire (PLAP), la déshydrogénase alcoolique, notamment la déshydrogénase alcoolique de drosophile (ADH), la luciférase, notamment la Firefly Luciferase , la chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT), l'hormone de croissance (GH).

La présente invention porte également sur l'animal transgénique comprenant au moins une cellule selon l'invention. Par animal transgénique , on entend désigner un animal non humain, de préférence un mammifère choisi dans le groupe des rongeurs et notamment de la souris, du rat, du hamster, du cobaye.

La souris est particulièrement appréciée car son système immunitaire a été étudié en profondeur et notamment l'organisation génétique des loci des chaînes légères et lourdes des immunoglobulines. Cependant, le rat constitue une excellente alternative pour la modélisation des réactions d'hypersensibilité immédiate

et inflammatoire car la réponse physiologique est beaucoup plus pertinente chez le rat que chez la souris. Alternativement, l'animal transgénique est choisi parmi les animaux d'élevage et notamment les porcins, de manière préféré les mini-porcs, ovins, caprins, bovins, équidés, notamment le cheval et les lagomorphes notamment le lapin. l'animal transgénique peut également être un primate, notamment un singe, un babouin, un macaque, un chimpanzé, à l'exception de l'homme.

L'animal transgénique selon l'invention comprend au moins une cellule dont le génome comprend au moins une séquence d'acides nucléiques exogène, présente soit sous forme d'élément extra-chromosomal, soit intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique. De préférence, l'ensemble de ses cellules et notamment les cellules de la lignée germinale sont transgéniques.

Compte tenu des polymorphismes génétiques présents dans la population, il peut être intéressant pour analyser ou obtenir une réponse physiologique ou comportementale caractéristique que les animaux transgéniques selon l'invention, et notamment les souris transgéniques selon l'invention présentent des fonds génétiques différents. Ainsi, les souris selon l'invention peuvent être sélectionnées dans les lignées murines consanguines ( inbred ) 129Sv, 12901a, C57B16, BalB/C, DBA/2, mais également dans les lignées non consanguines ( outbred ) ou des lignées hybrides.

De préférence, l'animal selon l'invention se caractérise en ce qu'il exprime un répertoire d'immunoglobulines, de préférence IgE, fonctionnelles suite à une exposition à au moins un allergène,

lesdites IgE ayant au moins tout ou partie du fragment Fc d'origine humaine et/ou au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines, de préférence FccR.

C'est également un des objets de la présente invention de fournir un procédé in vitro de mise en évidence d'un allergène et/ou de détermination du pouvoir allergisant dudit allergène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (i) mise en contact dudit allergène avec une cellule selon l'invention, (ii) détermination si une réaction cellulaire d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire se produit, et (iii) facultativement, évaluation qualitative et/ou quantitative de la réaction allergique. Egalement, la présente invention vise à fournir un procédé in vivo de mise en évidence d'un allergène et/ou détermination du pouvoir allergisant dudit allergène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (i) mise en contact dudit allergène avec ledit animal selon l'invention, (ii) détermination si une réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire se produit, et (iii) facultativement, évaluation qualitative et/ou quantitative de la réaction allergique.

Par allergènes au sens de la présente invention, on entend désigner les composés capables d'induire une réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire. Parmi les allergènes, on peut citer de manière non exhaustive les allergènes dérivés du pollen, des champignons (Aspergillus, Candida, Alternaria,...), des bactéries (bactéries alimentaires, lactobactéries, etc...), des mites (Derjnat : ophagoides

pteronyssinusr Dermatophagoides farinae...), les allergènes dérivés des débris de peau animal, des féces et des cheveux (par exemple l'allergène de féin Fel dgl), les allergènes dérivés des insectes, des allergènes alimentaires (aufs, lait, viande, fruits de mer, haricots, céréales, fruits, légumes, chocolat,

yaourt,...), les allergènes des maisons (acariens, etc...), les allergènes des parasites (nématcdes, schistosomes, helminthes...), les mitogènes, les agents pathogènes, ou l'un de leurs constituants, d'origine virale, bactérienne, parasitaire, fcngique, mycoplasmique, les médicaments (par exemple, la pénicilline et l'insuline), les adjuvants, les vaccins et compositions vaccinales, les composés chimiques (tels par exemple les isocyanates, l'oxyde d'éthylène, le latex,...).

La mise en contact d'un allergène spécifique avec une cellule ou un animal selon l'invention peut se faire par diverses voies telles par exemple une infection classique par un microorganisme pathcgène, ou via un vecteur biologique de délivrance (moustique, tique, bactérie, virus et parasites ou agent commensale recombinant, ADN nu...), par inhalation, en aérosol, par la nourriture. Expérimentalement, l'allergène peut être mis en contact avec l'animal par une administration par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, contact cutané, par voie orale ou si il s'agit de culture de cellules, dans le milieu de culture.

La présente invention fournit également un procédé de criblage d'un composé qui module, de préférence inhibe, la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou

inflammatoire chez un homme. Ce procédé se caractérise en ce qu'il comprend les étapes de (a) mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un allergène responsable du déclenchement de la réaction d'hypersensibilité immédiate et/cu inflammatoire, et de manière simultanée ou décalée dans le temps avec ledit composé ; (b) mise en contact d'une cellule et/ou un animal selon l'invention avec ledit allergène de l'étape a) ; (c) détermination et évaluation qualitative, facultativement quantitative, si une réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire se produit puis comparaison desdites réactions d'hypersensibilité immédiate et/cu inflammatoire déclenchées en a) et b) ; puis (d) identification du composé qui module sélectivement

la réaction d'hypersensibilité immédiate inflammatoire.

Dans les procédés selon l'invention, ladite détermination et/ou évaluation de de ladite réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire est réalisée par mesure du taux d'IgE synthétisé par la cellule selon l'invention, et/ou par le taux d'IgE sérique de l'animal selon l'invention. Alternativement, et de manière préférée ladite détermination et/ou évaluation de la réaction allergique est réalisée par la détection et/ou la mesure du taux d'expression dudit gène reporter .

La présente invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant un composé modulant la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire et un véhicule pharmaceutiquement acceptable à titre de médicament pour le traitement

préventif et/ou curatif d'un homme ou d'un animal nécessitant un tel traitement, caractérisé en ce que l'aptitude dudit composé à inhiber ou activer sélectivement la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire est déterminée par (a) la mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un allergène responsable du déclenchement de la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire, et de manière simultanée ou décalée dans le temps avec ledit composé ; t. b) la mise en contact d'une cellule et/ou un allirr, selon l'invention avec ledit allergène de l'étape a) ; (c) la détermination et évaluation qualitative, facultativement quantitative, si une réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire se produit puis comparaison desdites réactions d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire déclenchées en a) et b) ; puis (d) l'identification du composé qui module sélectivement la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire. Par modulation de la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire on entend désigner une inhibition, une diminution mais également une activation. Les composés modulant la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire obtenus par le procédé de criblage et la composition selon l'invention de l'invention sont utilisés à titre de médicament pour le traitement de pathologies choisies dans le groupe composé de l'asthme, l'eczéma, le rhume des foins, l'urticaire, les allergies, la dermatite atopique, les maladies inflammatoires et chroniques de l'intestin (MICI) et/ou rectocoliques, telles par exemple la

maladie de Crohn, les maladies parasitaires dans lesquelles une réponse IgE est connue comme étant protectrice, notamment les maladies parasitaires helminthiques (infections par Schistosoma inansoni et Nippostrongylus filiaires). Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions pharmaceutiques et vaccinales, c'est-à-dire un diluant, vecteur

synthétique ou biologique, un agent de suspension telle une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par vole systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.

Leurs modes d'administration, posologies et formes

galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corpcrel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. Quand l'agent est un polypeptide, par exemple un anticorps, un antagoniste, un ligand, un polynucléotide, par exemple une composition antisens, un vecteur, par exemple un vecteur antisens, on peut l'introduire dans des tissus ou des cellules hôtes par un certain nombre de façons, incluant 11 infection virale, la micro-injection ou la fusion de vésicules.

On peut également utiliser l'injection par jet pour une administration intramusculaire.

La réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire est choisie parmi l'anaphylaxie

systémique, l'anaphylaxie cutanée, l'asthme, l'eczéma, la rhinite, la dermatite atopique, les maladies inflammatoires et'chroniques de l'intestin (MICI) et/ou rectocoliques, telles par exemple la maladie de Crohn, les maladies parasitaires dans lesquelles une réponse IgE est connue comme étant protectrice, notamment les maladies parasitaires helminthiques (infections par Schistosoma mansoni et Nippostrongylus filiaires), et les allergies alimentaires et les allergies à la poussière domestique.

Un autre objet de l'invention est d'utiliser une cellules ou un animal selon l'invention pour analyser et/ou l'étudier les mécanismes moléculaires, biologiques, biochimiques, physiologiques et/ou physiopathologiques de la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire. En utilisant les cellules ou animaux transgéniques selon l'invention, il est possible d'identifier des ligands ou des substrats qui modulent les interactions entre l'immunoglobuline E humaine et son récepteur FceR, de préférence FcsRI, impliqués dans les phénomènes d'hypersensibilité de type 1. Un grand nombre de tests peuvent être réalisés à cette fin qui incluent des tests de comportement, de détermination de la localisation des drogues après leur administration. En fonction du type de test que l'on veut développer, on utilise soit l'animal entier, soit des cellules dérivées dudit animal. Ces cellules peuvent être soit isolées fraîchement de l'animal ou peuvent être immortalisées en culture, soit en multipliant les passages, soit en transformant les cellules par des virus tels le virus SV40 ou le virus d'Epstein-Bahr.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après.

Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes.

EXEMPLES Matériels et méthodes 1.1. Humanisation de la chaîne a du gène murin FcaRI
La région codant les 5 exons du gène murin ou une partie de la région codante (exon IV par exemple) est remplacée, par recombinaison homologue, par son équivalent humain, hFceRI, décrit par Dombrowicz et al. (Dombrowicz et al., 1993). Les bras de recombinaison homologue sont clonés à partir de la séquence murine disponible dans les banques de données (Genbank NM 01084). Ces fragments sont associés au gène codant pour la chaine a du récepteur humain et aux gènes de sélection négative et positive (HPRT), ce dernier étant flanqué de sites loxP. Des sites enzymatiques uniques sont introduits afin de permettre la linéarisation du vecteur de recombinaison homologue ainsi que le criblage et la sélection des clones recombinants par la technique de PCR et/ou de Southern blot.

1.2. Humanisation du gène murin codant pour la région constante de l'IgE
L'expression de protéines recombinantes dans le baculovirus (Vangelista et al., 1999) a montré que la région constante Cs3 de l'IgE humaine correspondrait à la structure minimale nécessaire à l'interaction avec son récepteur de haute affinité, FceRI. Par conséquent et de la même façon que dans le paragraphe précédent,

la séquence génomique codant pour une partie ou la totalité de la région constante de l'IgE murine est remplacée, par recombinaison homologue, par une partie (cis3) ou la totalité de la région constante de l'IgE humaine.

1.3. Culture des cellules ES et électroporation
Les lignées cellulaires ENS et E14TG2a (Hooper et al. 1987) sont cultivées selon Koller et Smithies (Koller et Smithies, 1989). Les vecteurs de recombinaison homologue, préparés sous forme d'ADN plasmidique, sont amplifiés, purifiés et contrôlés selon les méthodes classiquement décrites (Sambrook J. et al. 1989). L'électroporation des cellules ES est effectuée dans du milieu de culture contenant 3nM de vecteur de recombinaison homologue linéarisé selon les conditions décrites précédemment. Les colonies transfectées sont sélectionnées grâce à la présence du marqueur de résistance positive/négative, HPRT.

L'événement de recombinaison homologue est enrichi de par la présence du marqueur de sélection négative (gène codant pour la Thymidine kinase ou pour la toxine de la diphtérie, sous-unité A). Les clones sélectionnés font l'objet d'une déletion du gène HPRT par transfection d'un vecteur d'expression de la recombinase Cre (Gu H et al., 1994). Les clones recombinants sont sélectionnés en présence de 6-TG.

1.4. Analyse par PCR et Southern blot

L'événement de recombinaison homologue est détecté par PCR et/ou Southern blot. Pour la PCR, les amorces sont localisées à l'extérieur du bras homologue court et dans le gène de résistance. Le signal du à l'amplification n'est détectable que dans les cas de recombinaison homologue. Dans les autres cas, aucun signal n'est décelable.

La structure des clones positifs après PCR est vérifiée par Southern blot. Les ADN extraits à partir des clones recombinants sont soumis à une ou plusieurs digestions enzymatiques et les transferts nucléiques sont hybridés à l'aide de deux sondes ; l'une étant externe au vecteur de recombinaison homologue, l'autre étant spécifique au marqueur de sélection positive. De la même façon, les clones ayant subi l'excision du gène HPRT font l'objet d'un criblage par PCR et par Southern blot. Dans ce cas, les amorces choisies sont situées de part et d'autre du marqueur de sélection. Les clones ayant subi l'action de la recombinase donnant un signal plus petit. Dans le cas du Southern blot, la sonde utilisée correspond à une portion du gène HPRT. Les clones positifs sont caractérisés par l'absence de signal.

1.5. Production de souris transgéniques
Les clones sélectionnés sont injectés dans des blastocystes de souris C57BL/6 afin de générer des souris chimères (Koller et Smithies, 1989). La présence des transgènes dans la descendance sera vérifiée par Southern blot à partir de queues de souris (Miller et al. 1988). Pour chaque modèle, des homozygotes

transgéniques sont réalisés par croisement des hétérozygotes.

Les deux modèles de souris transgéniques peuvent être réalisés à partir du même clone de cellules ES transfecté par les deux vecteurs de recombinaison homologue ou bien séparément et en parallèle.

REFERENCES

Berman et al. (1998) EMBO J. 7 : 727-738 Blank et al. (1989) Mol. Immunol. 26 : 107-114.

Bolkey et al. (1989) Ann. Rev. Genet. 23 : 199-225 Capecchi (1989) Science, 244 : 1288-1292 Cherayil et al. (1989) J. Exp. Med. 170 : 1959-1972.

Conrad (1990) Ann. Rev. Immunol. 8 : 623-645.

Dombrowicz et al. (1993) Cell 75 : 969-976.

Fnigeri et Liu (1992) J. Immunol. 148 : 861-867.

Gu et al. (1994) Science 265 : 103-106 Hooper et al. (1987) Nature 326 : 292-295.

Ishizaka (1989) Curr. Op. Immunol. 1 : 625-629.

P. Kamoun Appareils et Méthodes en Biochimie , 3ème
Ed. Médecine-Sciences Flammarion.

Keon et al. (1990) Methods and Enzymology 185 : 527-537.

Kinet (1992) Curr. Op. Immunol. 4 : 43-48.

Koller et Smithies (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. 86 :
8932-8935.

Kuster et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 : 12782-12787.

Mansour et al. (1988) Nature 336 : 348-352 Metzger (1992) Immunol. Rev. 125 : 37-48 Miller et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16 : 215.

Sambrook et al. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual second edition-Cold Spring Harbor
Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. USA.

Takizawa et al. (1992) J. Exp. Med. 176 : 469-475.

Truong et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23 : 3230-3235.

Vangelista et al. (1999) J. Clin. Inv. 103 : 1571-1578.

Claims

REVENDICATIONS

1. Cellule animale, non humaine, transgénique, caractérisée en ce qu'elle exprime au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc des immunoglobulines et une séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline dont au moins tout ou partie du fragment Fc est d'origine humaine, et caractérisée en ce que le gène animal codant pour la chaîne homologue à la dite chaîne du récepteur humain est inactif.

2. Cellule selon la revendication 1, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc est intégrée de manière stable dans le génome de ladite cellule.

3. Cellule selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'intégration de la dite séquence nucléotidique dans ledit génome est réalisée par recombinaison homologue ( Knock-In ) au niveau dudit gène animal homologue au gène humain codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc, ladite intégration provoquant l'inactivation dudit gène animal homologue.

4. Cellule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant pour au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment Fc est liée de manière opérationnelle à des séquences de régulation de l'expression, lesdites séquences contrôlant

l'expression la dite séquence nucléotidique dans ladite cellule.

5. Cellule selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline est

le gène animal endogène, à l'exception de la séquence codant pour tout ou partie du fragment Fc de ladite immunoglobuline qui est d'origine humaine, ladite séquence codant pour tout ou partie du fragment Fc ayant été intégrée dans ledit gène par recombinaison homologue ( Knock-In ).

6. Cellule selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline est le gène humain codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline, ledit gène humain étant intégré par recombinaison homologue ( Knock-In ) dans le génome de ladite cellule, au niveau dudit gène animal homologue, ladite intégration provoquant l'inactivation dudit gène animal homologue.

7. Cellule selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant pour la chaîne lourde d'une immunoglobuline IgE est présent sous forme épisomale dans ladite cellule, et en ce que le dit gène animal homologue est inactif dans ladite cellule.

8. Cellule selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit gène animal homologue est inactivé par recombinaison homologue ( Knock-Out) > ).

9. Cellule selon les revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite immunoglobuline est une

IgE et ledit récepteur humain au fragment Fc est un récepteur FEUER humain au fragment Fc des IgE.

10. Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique code pour un répertoire de chaînes lourdes d'immunoglobulines IgE.

11. Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant pour une immunoglobuline IgE humaine est un mini-gène.

12. Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant la chaîne lourde d'une IgE dont au moins tout ou partie du fragment Fc est d'origine humaine est liée de manière opérationnelle aux séquences endogènes animales de régulation de la transcription du gène de la chaîne lourde de l'IgE, lesdites séquences contrôlant l'expression dudit gène humain dans ladite cellule.

13. Cellule selon la revendication 9, caractérisée en ce que la dite séquence nucléotidique codant la chaîne lourde d'une IgE dont au moins tout ou partie du fragment Fc est d'origine humaine est liée de manière opérationnelle aux séquences endogènes humaines de régulation de la transcription dudit gène de la chaîne lourde de l'IgE humaine, lesdites séquences contrôlant l'expression dudit gène humain dans ladite cellule.

14. Cellule selon les revendications 9 à 13, caractérisée en ce que la partie du fragment Fc est composée des régions Cg3 et Cg4.

15. Cellule selon les revendications 9 à 14 caractérisée en ce que ledit récepteur FEUER est choisi parmi les récepteurs FcRI, Fc8RII et FcRIII.

16. Cellule selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit récepteur F, ER est le récepteur FcRI.

17. Cellule selon la revendication 16, caractérisée en ce que parmi les chaînes polypeptidiques composant le récepteur FCERI, au moins la chaîne a est d'origine humaine.

18. Cellule selon les revendications 1 à 17, caractérisée en ce que le génome de ladite cellule contient en outre au moins un gène rapporteur lié de manière opérationnelle à une ou plusieurs séquences de régulation de l'expression inductible suite à une stimulation du récepteur FEUER et/ou à une stimulation de la synthèse de IgE.

19. Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit gène rapporteur code pour une protéine autofluorescente choisie dans le groupe composé de la protéine de fluorescence verte (GFP), de la protéine de fluorescence verte augmentée (EGFP), de la protéine de la protéine de fluorescence rouge (RFP), de la protéine de la protéine de fluorescence bleue (BFP), de la protéine de fluorescence jaune (YFP) et des variants fluorescents de ces protéines.

20. Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit gène rapporteur code pour un enzyme détectable par un procédé histochimique.

21. Cellule selon la revendication 20, caractérisé en ce que ladite enzyme est choisie dans le groupe composé de la ss-galactosidase, de la ss-glucuronidase, de la phosphatase alcaline, de la déshydrogénase alcoolique, de la luciférase, de la chloramphénicolacétyl-transférase, de l'hormone de croissance.

22. Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce que ladite ou lesdites séquence (s) de régulation de l'expression est ou sont choisies parmi le promoteur du gène de l'interleukine 4 (Il-4), le promoteur du gène CD23, et le promoteur de tout autre gène dont l'expression est induite suite à une stimulation du récepteur FEUER et/ou à une stimulation de la synthèse d'IgE.

23. Cellule selon les revendications 1 à 22, choisie dans le groupe composé des cellules de souris, rat, hamster, cobaye, lapin, primates, porcin, ovin, caprin, bovin, cheval.

24. Cellule de souris selon la revendication 23.

25. Cellule selon les revendications 1 à 24, caractérisée en ce que ladite cellule est choisie parmi les cellules du système immunitaire, les cellules neuronales, les cellules souches embryonnaires, les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches neuronales.

26. Cellule selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite cellule du système immunitaire est choisie parmi les lymphocytes T, les cellules NK, les cellules K, les lymphocytes B, les mastocytes, les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les plaquettes, les monocytes des cellules dendritiques, les cellules de Langerhans.

27. Cellule souche selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite cellule souche est subséquemment différenciée en une cellule choisie parmi les cellules du système immunitaire selon la revendication 26 et les cellules neuronales.

28. Animal transgénique, non humain, comprenant au moins une cellule selon les revendications 1 à 27.

29. Animal selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi la souris, le rat, le hamster, le cobaye, le lapin, les primates, les porcins, les ovins, les caprins, les bovins, le cheval.

30. Animal selon la revendication 29, caractérisé en ce que l'animal est une souris.

31. Animal selon les revendications 28 à 30 caractérisé en ce qu'il exprime un répertoire d'immunoglobulines IgE fonctionnelles suite à une exposition à au moins un allergène, lesdites IgE ayant au moins tout ou partie du fragment Fc d'origine humaine et caractérisé en ce qu'il exprime au moins une des chaînes des récepteurs humains au fragment fc des immunoglobulines F, cR.

32. Procédé in vitro de mise en évidence d'un allergène et/ou de détermination du pouvoir allergisant dudit allergène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact dudit allergène avec une cellule selon l'une des revendications 1 à 27 ; b) détermination si une réaction cellulaire d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire se produit ; et c) facultativement, évaluation qualitative et/ou quantitative de ladite réaction cellulaire d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire.

33. Procédé in vivo de mise en évidence d'un allergène et/ou détermination du pouvoir allergisant

à 31 ; b) détermination si une réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire se produit ; et c) facultativement, évaluation qualitative et/ou quantitative de ladite réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire.

dudit allergène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact dudit allergène avec un dit animal selon l'une quelconque des revendications 28

34. Procédé de criblage d'un composé qui module la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire chez un homme, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) La mise en contact d'une cellule selon les revendications 1 à 27 et/ou d'un animal selon l'une des revendications 28 à 31 avec un allergène responsable du déclenchement de la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire, et de manière simultanée ou décalée dans le temps avec ledit composé ; b) la mise en contact d'une cellule selon les revendications 1 à 27 et/ou un animal selon l'une des revendications 28 à 31 avec ledit allergène de l'étape a) ; c) la détermination et évaluation qualitative, facultativement quantitative, si une réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire se produit puis comparaison desdites réactions d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire déclenchées en a) e-tn) ;

d) puis l'identification du composé qui module sélectivement la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire.

35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 à 34, caractérisé en ce que ladite détermination et/ou évaluation de ladite réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire est réalisée par mesure du taux d'IgE synthétisé par ladite cellule selon l'une des revendications 1 à 27, et/ou par le taux d'IgE sérique de l'animal selon l'une des revendications 28 à 31.

36. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 à 34, caractérisé en ce que ladite détermination et/ou évaluation de la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire est réalisée par la détection et/ou la mesure du taux d'expression d'un dit gène rapporteur.

37. Procédé selon les revendications 32 à 36, caractérisé en ce que ladite réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire est choisie parmi l'anaphylaxie systémique, l'anaphylaxie cutanée, l'asthme, l'eczéma, la rhinite, l'urticaire, le rhume des foins, la dermatite atopique, les maladies inflammatoires et chroniques de l'intestin (MICI) et/ou rectocoliques, les maladies parasitaires dans lesquelles une réponse IgE est connue comme étant protectrice, notamment les maladies parasitaires helminthiques (infections par Schistosoma mansoni et Nippostrongylus filiaires), l'allergie alimentaire, l'allergie à la poussière domestique.

38. Utilisation d'une cellule selon les revendications 1 à 27 et/ou d'un animal selon les

revendications 28 à 31 pour l'analyse et l'étude des mécanismes, moléculaires, biologiques, biochimiques, physiologiques et/ou physiopathologiques de la réaction d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire.