FR2821085A1 - Nouvelles metalloproteases possedant des domaines thrombospondine et compositions d'acides nucleiques les codant - Google Patents

Abstract

L'invention concerne de nouvelles métalloprotéases possédant un ou des domaines thrombospondine (protéines MPTS) et des polypeptides qui leur sont liés, ainsi que des compositions d'acides nucléiques codant pour ces protéines. Les compositions de polypeptide et d'acides nudéiques de l'invention trouvent une utilisation dans toutes sortes d'applications, notamment des applications diagnostiques, des applications de sélection d'agents thérapeutiques, ainsi que des applications thérapeutiques pour toutes sortes de maladies différentes. L'invention a également trait à des procédés pour traiter des maladies associées à l'activité agrécanase, par exemple des pathologies caractérisées par la présense de produits de clivage de l'agrécane, telles que la polyarthrite rhumatoïde et l'arthrose.

Description

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L'invention se rapporte à des protéases, en particulier des métalloprotéases comportant des domaines thrombospondine.

La structure de la matrice d'un cartilage, en poids sec du tissu, comprend 70% de collagène et 20-30% de protéoglycanes. Le constituant protéo-glycane confère une flexibilité mécanique aux tissus porteurs et confère au cartilage des propriétés viscoélastiques. Sa perte conduit à des

lésions structurelles rapides, telles que celles que l'on trouve le plus fréquemment dans les maladies articulaires arthritiques et les lésions articulaires.

L'agrécane est un protéoglycane majeur du cartilage. L'agrécane est une grosse protéine de 210 kDa et possède trois domaines globulaires : les domai-nes Gl, G2 et G3. Les domaines G1 et G2 de la protéine sont plus proches de l'extrémité amino de la protéine et leur domaine interglobulaire intervenant possède des sites sensibles à la protéolyse. La région située entre G2 et G3 est fortement glycosylée et reliée à des oligosaccharides et à des glycosamino-glycanes (GAC) pour former le protéoglycane mature. Dans le cartilage arthritique, on observe des fragments de la partie centrale de la protéine de 55 kDa qui sont, pense-t-on, le résultat d'un clivage de la

partie centrale de la protéine dans le domaine interglobulaire entre G1 et G2, entre l'asparagine 341 et la phénylalanine 342. Ce clivage peut être réalisé par de nombreuses métalloprotéinases de matrice, par exemple MMP-1,-2,-3,-7,-8,-9 et-13. De plus, des fragments d'agrécane de 60 kDa portant une extrémité COOH de l'acide glutamique sont aussi identifiés et sont un signe qu'il existe un site de clivage entre l'acide glutamique 373 et l'alanine 374. Les métalloprotéinases de matrice sont incapables de clivage à ce site. L'activité endopeptidase unique en son genre, responsable de ce clivage, a été appelée"agrécanase".

Le domaine G1 de la partie centrale de la protéine forme un complexe ternaire stable par liaison à l'acide hyaluronique et à des protéines de liaison dans la matrice. Tout clivage enzymatique dans cette région déstabilise la structure de la matrice du cartilage, conduit à la perte de l'agrécane qui est le protéoglycane majeur et expose le collagène de type II aux collagénases, provoquant une perte de cartilage et le développement, par voie de consé-

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quence, d'une maladie articulaire. Étant donné que tout un éventail de médicaments anti-arthritiques ne ciblent pas l'agrécanase et sont incapables de bloquer le clivage de l'agrécane, le site de l'agrécanase joue un rôle clé dans la dégradation protéolytique de l'agrécane.

C'est pour cette raison que l'agrécanase est considéré comme étant une cible médicamenteuse importante pour l'arthrite. Les fragments d'agrécane libérés dans le liquide synovial sont les éléments détectables en premier dans le développement de la polyarthrite rhumatoïde et de l'arthrose. La recherche pour cette protéase a été intense. Malgré les efforts de découverte considé-rables, l'identification de l'agrécanase humaine est demeurée vague.

On s'intéresse par conséquent beaucoup à l'identification de l'agrécanase humaine, ainsi qu'au gène codant pour cette activité.

Les références suivantes concernent ce domaine. Les brevets U. S. 5 872 209 et 5 427 954, et les documents WO 99/09000 ; WO 9es55643 ; WO 98/51665 et WO 97/18207.

Comme autres références, on peut citer : Abbasdale,"Cloning and Characterization of ADAMTS11, an aggrecanase from the ADAMTS family", J. Biot. Chem. (août 1999) 274 : 23443-50 ; Arner et al.,"Generation and Characterization of Aggrecanase. A soluble, cartilage-derived aggrecandegrading activity", J. Biot. Chem. (5 mars 1999) 274 (10) : 6594-6601 ; Armer et al.,"Cytokine-induced cartilage proteoglycan degradation is mediated by aggrecanase", Osteoarthritis Cartilage (mai 1998) 6 (3) : 214-28, Billington et al.,"An aggrecan-degrading activity associated with chondrocyte membranes", Biochem. J. (15 novembre 1998) 336 (Pt 1) : 207-12 ; Buttner et al.,

"Membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MPP) cleaves the recombinant aggrecan substrate ragglmut at the'aggrecanase'and the MMP sites. Characterization of MT1-MMP catabolic activities on the interglobular domain of aggrecan", Biochem. J. (1er juillet 1998) 333 (Pt

Il 1) : 159-65 ; Flannery et al., Expression of ADAMTS homologues in articular cartilage", Biochem. Biophys. Res. Commun. (juittet 1999) 260 : 318-22 ; Hurskainen et al., "ADAM-TS5, ADAM-TS6 and ADAM-TS7, Novel members of a New Family of Zinc Metalloproteases", J. Biot. Chem. (septembre 1999)

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274 : 25555-25563 ; Hugues et al.,"Differential expression of aggrecanase and matrix metallo-proteinase activity in chondrocytes isolated from bovine and porcine articular cartilage", J. Biol. Chem. (13 novembre 1998) 273 (46) : 30576-82 ; Ilic et al.,"Characterization of aggrecan retained and

lost from the extracellular matrix of articular cartilage. Involvement of carboxyl-terminal processing in the catabolism of aggrecan", J. Biol. Chem.

(10 juillet 1998) 273 (28) : 17451-8 ; Kuno et al.,"ADAMTS-1 is an active metalloproteinase associated with the extracellular matrix", J. Biol. Chem.

(juin 1999) 274 : 18821-6 ; Kuno et al.,"ADAMTS-1 protein anchors at the extracellular matrix through the thrombo-spondin type I motifs and its spacing region", J. Biol. Chem. (mai 1998) 273 : 13912-7 ; Kuno et aL, "The exon/intron organization and chromosomal mapping of the mouse ADAMTS- 1 gene encoding an ADAM family protein with TSP motifs", Genomics (décembre 1997) 46 : 466-71 ; Kuno et al.,"Molecular cloning of a gene encoding a new type of metalloproteinase-disintegrin family protein with thombospondin motifs as an inflammation associated gene", J. Biol. Chem.

(janvier 1997) 272 : 556-62 ; Sandy et aL, "Chondrocyte-mediated catabolism of aggrecan : aggrecanase-dependent cleavage induced by interleukin-1 or retinoic acid can be inhibited by glucosamin", Biochem. J.

(octobre 1998) 335 (Pt 1) : 59-66 ; Tang & Hong,"ADAMTS : a novel family of proteases with ADAM protease domain and thrombosponding 1 repeat", FEBS Lett. (février 1999) 445 : 223-5 ; Tortorella et at.,"Purification and cloning of aggrecanase-1 : a member of the ADAMTS family of proteins", Science (juin 1999) 284 : 1664-6 ; Vankemmelbeke et al.,"Coincubation of bovine synovial or capsular tissue with cartilage generates a soluble 'Aggrecanase'activity", Biochem. Biophys. Res. Commun (19 février 1999) 255 (3) : 686-91 ; et Vasquez et al.,"METH-1, a human ortholog of ADAMTS- 1 and METH-2 are members of a new family of proteins with angioinhibitory activity", J. Biot. Chem. (août 1999) 274 : 23349-57.

La présente invention concerne de nouvelles métalloprotéases possédant un ou des domaines thrombospondine (protéines MPTS) et les polypeptides qui leur sont apparentés, ainsi que des compositions d'acides nucléiques codant pour ces protéines ou polypeptids. Les compositions de polypeptides et d'acides nucléiques faisant l'objet de l'invention trouvent un

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emploi dans toutes sortes d'applications, notamment des applications diagnostiques, des applications de sélection d'agents thérapeutiques, ainsi que des applications thérapeutiques pour toutes sortes de maladies différentes. L'invention a trait aussi à des procédés de traitement de maladies associées à l'activité agrécanase, par exemple des maladies associées à la présence de produits de clivage d'agrécane, telles que la polyarthrite rhumatoïde et l'arthrose.

On présente maintenant une brève description des Figures.

- La Figure 1A fournit la séquence d'un acide nucléique qui code pour
MPTS-15, une protéine MPTS de la présente invention. La Figure 1B donne la séquence d'acides aminés de MPTS-15. La Figure 1C donne un alignement de la séquence d'acides aminés de la présente MPTS-15 avec la séquence d'acides aminés de ADAMTS-6, une séquence décrite dans Hurskainen et al., J. Biol. Chem. (septembre 1999) 274 : 25555-
25563.

- La Figure 2A donne la séquence d'un acide nucléique qui code pour
MPTS-10, une protéine MPTS de la présente invention. La Figure 2B donne la séquence d'acides aminés de MPTS-10.

- La Figure 3A donne la séquence d'un acide nucléique qui code pour
MPTS-19, une protéine MPTS de la présente invention. La Figure 3B donne la séquence d'acides aminés de MPTS-19.

- La Figure 4A donne la séquence d'un acide nucléique qui code pour

MPTS-20, une protéine MPTS de la présente invention. La Figure 4B donne la séquence d'acides aminés de MPTS-20.

On décrit maintenant de nouvelles protéines MPTS et des polypeptides qui leur sont liés, ainsi que de compositions d'acides nucléiques codant pour ces protéines et polypeptids. Les présentes compositions de polypeptides et/ou d'acides nucléiques trouvent un emploi dans toutes sortes d'applications différentes, notamment des applications de recherche, de diagnostic, et de sélection/découverte/préparation d'agents thérapeutiques.

Il est également décrit des procédés de traitement de maladies associées à la fonction MPTS, notam-ment l'agrécanase, par exemple de maladies

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caractérisées par la présence de produits de clivage d'agrécane, telles que la polyarthrite rhumatoïde et l'arthrose.

Il est décrit de nouvelles métalloprotéases comportant un ou des domaines thrombospondine (connues aussi sous le nom de protéines MPTS, protéines ADAMTS ou protéines agrécanases), ainsi que des compositions de poly-peptides qui leur sont liées. L'expression composition de

polypeptides, telle qu'elle est employée ici, désigne à la fois la protéine entière, et des parties ou des fragments de celle-ci. Cette expression englobe aussi les variantes de la protéine humaine naturelle, lorsque ces variantes sont homologues ou essen-tiellement semblables à la protéine naturelle, telle qu'elle est décrite en plus amples détails ci-dessous. Dans la description qui suit de la présente invention, le terme"MPTS"est utilisé pour désigner non seulement les protéines MPTS humaines spécifiques décrites ici (à savoir MPTS-10, MPTS-15, MPTS-19 et MPTS-20), mais aussi leurs homologues, exprimés dans des espèces non humaines, par exemple les souris, les rats et d'autres espèces de mammifères.

Les protéines MPTS humaines spécifiques présentant un intérêt sont MPTS-15, MPTS-10, MPTS-19 et MPTS-20. MPTS-15 possède une séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 1B et identifiée par SEQ ID NO : 01.

MPTS-10 possède une séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 2B et identifiée par SEQ ID NO : 03. MPTS-19 possède une séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 3B et identifiée par SEQ ID NO : 05. MPTS-

20 possède une séquence d'acides aminés représentée sur la Figure 4B et identifiée par SEQ ID NO : 07. Les protéines MPTS faisant l'objet de l'invention ont un poids moléculaire basé sur leur séquence d'acides aminés d'au moins environ 90 kDa, le poids moléculaire basé sur la séquence d'acides aminés pouvant être sensiblement plus élevé dans certains modes de réalisation. Le vrai poids moléculaire des protéines MPTS faisant l'objet de l'invention peut varier sous l'effet de la glycosylation et/ou d'autres modifications post-traductionnelles.

La présente invention a aussi pour objet des compositions de polypeptides MPTS. L'expression composition de polypeptides, telle qu'elle est employée ici, désigne à la fois les protéines entières et des parties ou

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fragments de celles-ci. Cette expression englobe aussi les variantes des protéines humaines naturelles, lorsque ces variantes sont homologues ou essentiellement semblables à la protéine naturelle, que la protéine naturelle soit la protéine humaine, la protéine de souris, ou la protéine d'une espèce quelconque qui exprime naturellement une protéine MPTS, habituellement une espèce de mammifère. Une protéine homologue candidat est essentiellement analogue à une protéine MPTS de la présente invention et est donc une protéine MPTS de la présente invention, si la protéine candidat possède une séquence possédant au moins environ 35%, habituellement au moins environ 45%, et mieux encore au moins environ 60%, d'identité de séquence avec une protéine MPTS, selon une détermination faite avec l'algorithme en grappes MegAlign, DNAstar (1998), décrit dans D. G. Higgins et P. M. Sharp,"Alignements de séquences multiples rapides et sensibles sur un micro-ordinateur" (1989) CABIOS, 5 : 151-153. (Les paramètres utilisés sont ktuple 1, gpa penalty 3, windows 5 et diagonals saved 5. ) Dans la description suivante de la présente invention, l'expression"protéine MPTS"est utilisée pour désigner non seulement les protéines MPTS humaines, mais aussi leurs homologues exprimés dans des espèces non humaines, par exemple les espèces souris, rats et autres mammifères.

L'invention a également pour objet des protéines MPTS qui sont sensible-ment identiques aux protéines décrites, où sensiblement identique signifie que la protéine possède une identité de séquences par rapport à la séquence d'une des protéines décrites d'au moins environ 60%, habituellement d'au moins environ 65% et mieux encore d'au moins environ 70%. Dans de nombreux modes de réalisation préférés, l'identité de séquence est d'au moins environ 90%, habituellement d'au moins environ 95% et mieux encore d'au moins environ 99%, sur toute la longueur de la protéine.

Dans de nombreux modes de réalisation, les protéines de la présente invention sont des enzymes, en particulier des protéinases et plus particulière-ment des métalloprotéinases. Les protéines de ce mode de réalisation de la présente invention sont caractérisées par le fait qu'elles possèdent une activité agrécanase. En tant que telles, les présentes

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protéines sont capables de couper l'agrécane dans un domaine interglobulaire, en particulier entre les domaines Gl et G2 et plus particulièrement au niveau de la liaison Glu373-Ala374 de l'agrécane humain, pour produire un produit de clivage ayant une séquence N-terminale de ARGSVIL.

En plus des protéines décrites ci-dessus, la présente invention a également pour objet des homologues ou des protéines (ou leurs fragments) d'autres espèces, à savoir d'autres espèces animales ou végétales, où ces homologues ou protéines peuvent provenir d'un éventail de différents types d'espèces, habi-tuellement de mammifères, par exemple de rongeurs, tels que la souris, le rat ; d'animaux domestiques, par exemple du cheval, de la vache, du chien, du chat ; et d'êtres humains. Par homologue, on entend une protéine possédant au moins environ 35%, habituellement au moins environ 40% et mieux encore au moins environ 60%, d'identité de séquence d'acides aminés avec une des protéines MPTS humaines spécifiques identifiées ci-dessus (à savoir avec une protéine ayant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 01, 03,05 ou 07), où l'identité de la séquence est déterminée de la manière décrite ci-dessus.

Les protéines de la présente invention sont présentes dans un environnement qui n'existe pas à l'état naturel, par exemple sont séparées de leur environnement naturel. Dans certains modes de réalisation, les protéines de l'invention sont présentes dans une composition qui est enrichie en protéine en question par rapport à son environnement existant à l'état naturel. Par exemple, l'invention a trait à une protéine purifiée, où

purifiée signifie que la protéine est présente dans une composition essentiellement dépourvue de protéines qui ne sont pas des MPTS, essentiellement dépourvue signifiant que moins de 90%, habituellement moins de 60%, et mieux encore moins de 50%, de la composition sont constitués de protéines qui ne sont pas des MPTS. Les protéines de la présente invention peuvent aussi être présentes sous forme d'isolat, ce qui signifie que la protéine est essentiellement dépourvue d'autres protéines et d'autres molécules biologiques existant à l'état naturel, telles que les oligosaccharides, les polynucléotides et leurs fragments, et analogues,

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l'expression"essentiellement dépourvue", dans ce cas, signifiant que moins de 70%, habituellement moins de 60% et mieux encore moins de 50%, de la composition contenant la protéine isolée sont constitués d'une autre molécule biologique existant à l'état naturel. Dans certains modes de réalisation, les protéines sont présentes sous forme sensiblement pure, l'expression"forme essentiellement pure"signifiant une pureté d'au moins 95%, habituellement d'au moins 97% et mieux encore d'au moins 99%.

En plus des protéines existant à l'état naturel, des polypeptides qui sont des variations des protéines existant à l'état naturel sont également prévus, par exemple des polypeptides MPTS. Par polypeptide MPTS, on entend une séquence d'acides aminés codée par un cadre de lecture ouvert (ORF) du gène codant pour la MPTS, décrite en plus amples détails cidessous, y compris la protéine entière et ses fragments, en particulier des fragments ayant une activité biologique et/ou des fragments correspondant aux domaines fonctionnels, par exemple au domaine protéase, au domaine thrombo-spondine, et analogues ; et y compris les fusions des présents polypeptides à d'autres protéines ou à des parties de celles-ci. Les fragments en question ont typiquement une longueur d'au moins environ 10 aa, habituellement d'au moins environ 50 aa, et peuvent atteindre une longueur de 300 aa ou plus, mais ne dépasseront pas habituellement environ 1 000 aa de long, le fragment possédant un segment d'acides aminés identique à la protéine de l'invention d'au moins environ 10 aa et habituellement d'au moins environ 15 aa et, dans de nombreux modes de réalisation, d'au moins environ 50 aa de long. Lorsque le fragment est un fragment de MPTS-15, il renferme de préférence au moins une partie substantielle du domaine protéase de la protéine de type sauvage, la quantité substantielle étant d'au moins 50%, habituellement d'au moins

60% et mieux encore d'au moins 70%, de la séquence de ce domaine de la protéine MPTS-15. Par exemple, le fragment de MPTS-15 contient généralement une séquence qui, lorsqu'elle est alignée avec la séquence de résidus issus du domaine protéase de la séquence de type sauvage, présente une identité avec la région alignée de la séquence de type sauvage de ce domaine d'au moins environ 50%, habituellement d'au moins environ 60% et mieux encore d'au moins environ 70%, le pourcentage d'identité

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pouvant, dans de nombreux modes de réalisation, être bien plus élevé, par exemple de 75,80, 85,90 ou 95%, voire plus, par exemple de 99%.

Les protéines et les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus à partir de sources existant à l'état naturel ou être produits par synthèse. Par exemple, les protéines peuvent être dérivées de sources biologiques

exprimant les protéines, telles que les synoviocytes, les chondrocytes, le cartilage, et analogues. Les présentes protéines peuvent aussi être dérivées de moyens de synthèse, par exemple en exprimant un gène recombinant codant pour la protéine en question dans un hôte approprié, comme décrit en plus amples détails ci-dessous. On peut employer tout procédé de purification de protéines approprié, des méthodologies appropriées de

purification des protéines étant décrites dans le Guide to Protein Purification (sous la direction de Deuthser) (Academic Press, 1990). Par exemple, un Iysat peut être préparé à partir de la source d'origine, par exemple les chondrocytes ou l'hôte d'expression, et purifié par HPLC, chromatographie d'exclusion, électrophorèse sur gel, chromatographie d'affinité, et analogues.

L'invention concerne aussi des compositions d'acides nucléiques codant pour les protéines MPTS ou leurs fragments, ainsi que les homologues de MPTS de la présente invention. Par composition d'acides nucléiques, on entend une composition comprenant une séquence d'ADN possédant un cadre de lecture ouvert codant pour un polypeptide MPTS de la présente invention, à savoir un gène mpts, et capable, dans des conditions appropriées, d'être exprimée par MPTS. Ce terme englobe aussi les acides nucléiques qui sont homologues ou essentiellement analogues ou identiques aux acides nucléiques codant pour les protéines MPTS.

L'invention a donc pour objet des gènes codant pour les protéines MPTS humaines de la présente invention et leurs homologues. Le gène de MPTS15 humain est représenté sur la Figure 1A, où la séquence représentée sur la Figure 1A est identifiée par SEQ ID NO : 02, ci-dessous. Le gène de MPTS10 humain est représenté sur la Figure 2A, où la séquence représentée sur la Figure 2A est identifiée par SEQ ID NO : 04, ci-dessous. Le gène de MPTS19 humain est représenté sur la Figure 3A, où la séquence

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représentée sur la Figure 3A est identifiée par SEQ ID NO : 06, ci-dessous. Le gène de MPTS20 humain est représenté sur la Figure 4A, où la séquence représentée sur la Figure 4A est identifiée par SEQ ID NO : 08, ci-dessous.

La source de gènes homologues peut être toute espèce, par exemple une espèce de primates, en particulier l'homme ; des rongeurs, tels que le rat et la souris, des canins, des félins, des bovins, des ovins, des équins, de la levure, des nématodes, etc. Entre les espèces de mammifères, par exemple l'homme et la souris, les homologues ont une similitude de séquence substantielle, par exemple au moins 75% d'identité séquentielle, habituellement au moins 90%, mieux encore au moins 95%, entre les séquences nucléotidiques. La similitude de séquence est calculée sur la base d'une séquence de référence, qui peut être un sous-ensemble d'une séquence plus grande, telle qu'un motif conservé, une région codante, une région adjacente, etc. Une séquence de référence aura habituellement au moins environ 18 nt de long, mieux encore au moins environ 30 nt de long,

et peut s'étendre sur la séquence complète qui fait l'objet de la comparaison. Les algorithmes de l'analyse d'une séquence sont connus dans la technique, tels que BLAST, décrit dans Altschul et al. (1990), Mol Siol 215 : 403-410 (en utilisant les paramètres par défaut, à savoir w=4 et T=17). Les séquences de la présente invention sont essentielles pour reconnaître les protéines apparentées et homologues de MPTS, notamment de l'agrécanase, et les acides nucléiques codant pour celles-ci, dans les recherches dans les bases de données. Dans certains modes de réalisation, ceux qui présentent un intérêt particulier sont les acides nucléiques ayant essentielle-ment la même longueur que les acides nucléiques identifiés par SEQ ID NO : 02,04, 06 et 08 et qui ont une identité séquentielle vis-à-vis d'une de ces séquences d'au moins environ 90%, habituellement d'au moins environ 95% et mieux encore d'au moins environ 99%, sur toute la longueur de l'acide nucléique.

Les acides nucléiques codant pour les protéines et les polypeptides de la présente invention peuvent être un ADNc ou un ADN génomique ou un de leurs fragments. L'expression"gène de MPTS"entend désigner le cadre de lecture ouvert codant pour les protéines et polypeptides MPTS

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spécifiques, et les introns, ainsi que les séquences nucléotidiques non codantes adjacentes en 5'et en 3'impliquées dans la régulation de l'expression, jusqu'à environ 20 kb au-delà de la région codante, mais éventuellement plus loin dans les deux directions. Le gène peut être introduit dans un vecteur approprié pour la con-servation extrachromosomique ou pour l'intégration dans le génome d'un hôte.

Le terme"ADNc", tel qu'il est utilisé ici, entend inclure tous les acides nucléiques qui partagent l'arrangement des éléments séquentiels que l'on trouve dans les espèces ARNm matures natives, les éléments séquentiels étant les exons et les régions non codantes en 5'et en 3'. Normalement, les espèces ARNm ont des exons contigus, les introns intervenant, lorsqu'ils sont présents, étant éliminés par épissage d'ARN nucléaire, pour créer un cadre de lecture ouvert continu codant pour une protéine MPTS.

Une séquence génomique présentant un intérêt comprend l'acide nucléique présent entre le codon d'initiation et le codon d'arrêt, comme défini dans les séquences énumérées, y compris tous les introns qui sont normale-ment présents dans un chromosome natif. Elle peut en outre renfermer les régions non traduites en 5'et en 3'que l'on trouve dans l'ARNm mature. Elle peut par ailleurs renfermer des séquences régulatrices de la transcription et de la traduction spécifiques, telles que des promoteurs, des amplificateurs, etc., comprenant environ 1 kb, mais éventuellement plus, d'ADN génomique adjacent à l'extrémité 5'ou 3'de la région transcrite. L'ADN génomique peut être isolé sous forme de fragment de 100 kpb ou plus petit, et être essentiel-lement dépourvu de séquence chromosomique adjacente. L'ADN génomique adjacent à la région codante, soit en 3'soit en 5', ou les séquences régulatrices internes que l'on trouve parfois dans les introns, contiennent des séquences nécessaires à l'expression convenable d'un tissu et à l'expression spécifique d'un stade.

Les compositions d'acides nucléiques de la présente invention peuvent coder pour tout ou partir de la protéine MPTS faisant l'objet de l'invention.

Les fragments bicaténaires ou monocaténaires peuvent être obtenus à partir de la séquence d'ADN par synthèse chimique d'oligonucléotides conformément à des procédés classiques, par digestion par enzyme de

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restriction, par amplification ACP, etc. Pour la plupart, les fragments d'ADN seront d'au moins 15 nt, habituellement d'au moins 18 ou 25 nt, et peuvent être d'au moins environ 50 nt.

Les gènes faisant l'objet de l'invention sont isolés et obtenus pratiquement purs, généralement sous une forme autre qu'un chromosome intact.

Habituellement, l'ADN sera obtenu essentiellement sans autres séquences d'acides nucléiques qui ne contiennent pas de séquence de gène de MPTS ou de fragment de celui-ci, avec une pureté généralement d'au moins environ 50%, habituellement d'au moins environ 90%, et est typiquement "recombinant", à savoir flanqué d'un ou plusieurs nucléotides avec lequel il n'est pas normalement associé sur un chromosome existant à l'état naturel.

En plus de tous les emplois décrits en plus amples détails dans les paragraphes suivants, les compositions d'acides nucléiques de l'invention trouvent un emploi dans la préparation de tout ou partie des polypeptides MPTS, comme décrit ci-dessus. Le polynucléotide faisant l'objet de l'invention (par exemple un polynucléotide ayant une séquence SEQ ID N : 02,04, 06 ou 08), lADNc correspondant ou le gène entier est utilisé pour exprimer un produit génique partiel ou complet. Les produits d'assemblage de poly-nucléotides ayant une séquence SEQ ID NO : 02,04, 06 ou 08 peuvent être produits par synthèse. En variante, un assemblage en une seule étape d'un gène et d'un plasmide entier à partir d'un grand nombre d'oligodésoxy-ribonucléotides est décrit, par exemple, par Stemmer

et ai., Gene (Amsterdam) (1995) 164 (1) : 49-53. Dans ce procédé, il est décrit un assemblage APC (la synthèse de longues séquences d'ADN à partir d'un grand nombre d'oligodésoxyribonucléotides (oligo)). Le procédé est dérivé d'un réarrangement de l'ADN (Stemmer, Nature (1994) 370 : 389-391) et ne s'appuie pas sur l'ADN ligase, mais s'appuie au contraire sur l'ADN poly-mérase pour assembler des fragments d'ADN de plus en plus longs au cours du procédé d'assemblage. Les produits d'assemblage polynucléotidiques appro-priés sont purifiés à l'aide de techniques d'ADN recombinant standard, telles que décrites, par exemple, dans Sambrook et

al., Molekular Ob/ ? .' Z. o//y/ ?/K/ < ? 2 < (1989), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, et les réglementations actuelles

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décrites dans les Directives pour la Recherche en ADN recombinant de l'Institut National de la Santé (NIH) du Ministère de la santé américain (HHS).

Pour produire en quantité les molécules de polynucléotide comprenant une séquence polynucléotidique de la présente invention, on place la molécule dans un vecteur. On emploie des vecteurs viraux et des vecteurs non viraux, notamment des plasmides. Le choix du plasmide dépendra du

type de cellule dans lequel on souhaite la propagation et du but de la propagation. Certains vecteurs sont utiles pour amplifier et produire de grandes quantités de la séquence d'ADN souhaitée. D'autres vecteurs conviennent pour l'expression dans des cellules en culture. D'autres vecteurs encore conviennent pour le transfert et l'expression dans des cellules dans un animal ou un individu entier. Le choix du vecteur approprié fait partie des compétences de l'homme du métier. Beaucoup de ces vecteurs sont disponibles dans le commerce. Le polynucléotide partiel ou entier est inséré dans un vecteur typiquement au moyen d'une liaison à l'ADN ligase sur un site d'enzyme de restriction coupé dans le vecteur. En variante, la séquence nucléotidique souhaitée peut être insérée par recombinaison homologue in vivo. Typiquement, on attache pour cela des

régions d'homologie au vecteur sur les flancs de la séquence nucléo-tidique souhaitée. Les régions d'homologie sont ajoutées par soudure des oligonucléotides, ou par amplification en chaîne par polymérase (APC) à l'aide d'amorces comprenant à la fois la région d'homologie et une partie de la séquence nucléotidique souhaitée, par exemple.

Pour l'expression, on peut employer une cassette ou un système d'expression. Le produit génique codé par un polynucléotide de l'invention est exprimé dans un système d'expression commode quelconque, notamment, par exemple, un système bactérien, de levure, d'insecte, d'amphibien et de mammifère. Des vecteurs et des cellules hôtes appropriés sont décrits dans le brevet U. S. nO 5 654 173. Dans le vecteur d'expression, un polynucléotide codant pour la MPTS, par exemple tel que présenté dans SEQ ID N : 02,04, 06 et 08, est lié à une séquence régulatrice selon les besoins pour obtenir les propriétés d'expression souhaitées. Parmi ces

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séquences, on peut citer les promoteurs (fixés à l'extrémité 5'du brin sens ou à l'extrémité 3'du brin antisens), les amplificateurs, les terminateurs, les opérateurs, les répresseurs et les inducteurs. Les promoteurs peuvent être régulés ou constitutifs. Dans certains cas, il peut être souhaitable d'utiliser des promoteurs actifs condi-tionnellement, tels que des promoteurs spécifiques d'un tissu ou spécifiques d'un stade de développement. Ceux-ci sont liés à la séquence nucléotidique souhaitée à l'aide des techniques décrites ci-dessus pour la liaison à des vecteurs. On peut utiliser toute technique bien connue dans le domaine. En d'autres termes, le vecteur d'expression apportera une région d'initiation de la transcription et de la traduction, qui peut être inductible ou constitutive, dans laquelle la région codante est liée en opération sous le contrôle transcriptionnel de la région d'initiation de la transcription, et une région d'arrêt de la transcription et de la traduction. Ces régions de contrôle peuvent être natives pour le gène de MPTS en question, ou bien dérivées de sources exogènes.

Les vecteurs d'expression ont généralement des sites de restriction appropriés situés près de la séquence promoteur pour permettre l'insertion de séquences d'acides nucléiques codant pour des protéines hétérologues. Un marqueur sélectionnable opérant dans l'hôte d'expression peut être présent. Des vecteurs d'expression peuvent être utilisés pour la production de protéines de fusion, le peptide de fusion exogène apportant une

fonctionnalité supplémentaire, à savoir un accroissement de la synthèse des protéines, une stabilité, une réactivité avec des antisérums définis, un marqueur enzymatique, par exemple la ss-galactosidase, etc.

On peut préparer des cassettes d'expression comprenant une région d'initiation de la transcription, le gène ou son fragment, et une région d'arrêt de la transcription. Ce qui est particulièrement intéressant, c'est l'emploi de séquences permettant l'expression d'épitopes ou de domaines fonctionnels, habituellement d'au moins environ 8 acides aminés de long, mieux encore d'au moins environ 15 acides aminés de long, à environ 25 acides aminés, et jusqu'au cadre de lecture ouvert complet du gène. Après l'introduction de l'ADN, les cellules contenant le produit d'assemblage

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peuvent être sélec-tionnées au moyen d'un marqueur sélectionnable, les cellules étendues puis utilisées pour l'expression.

Les protéines et polypeptides MPTS peuvent être exprimés dans des procaryotes ou des eucaryotes conformément à des voies classiques,

suivant le but de l'expression. Pour la production à grande échelle de la protéine, on peut utiliser comme cellules hôtes de l'expression un organisme unicellulaire, cerevisiae, des cellules d'insectes unicellulaire, tel que E, coll, S. subtilis en combinaison avec des vecteurs de baculovirus, ou des cellules d'un organisme supérieur tel que les vertébrés, en particulier les mammifères, par exemple les cellules COS 7, HEK 293, CHO, les ovocytes Xenopus, etc.

Dans certains cas, il est souhaitable d'exprimer le gène dans des cellules eucaryotes, où la protéine exprimée bénéficiera du repliement natif et de modifications post-transcriptionnelles. De petits peptides peuvent aussi être synthétisés au laboratoire. Les polypeptides qui sont des sous-ensembles de la séquence complète de la protéine peuvent être utilisés pour identifier et étudier les parties de la protéines importantes pour la fonction.

Parmi les systèmes d'expression spécifiques présentant un intérêt, on peut citer les systèmes d'expression dérivés de bactéries, de levure, de cellules d'insectes et de cellules de mammifères. La suite présente des systèmes représentatifs de chacune de ces catégories.

Bactéries : Parmi les systèmes d'expression dans les bactéries, on peut citer ceux décrits dans Chang et al., Nature (1978) 275 : 615 ; Goeddel et al.,

Nature (1979) 281 : 544 ; Goeddel et at.,/ < ?/c/1 < / ? . (1980) 8 : 4057 ; EP 0 036 776 ; brevet U. S. n 4 551 433 ; DeBoer et aL, Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA) (1983) 80 : 21-25 ; et Siebenlist et al., Zell (1980) 20 : 269.

Levure : Parmi les systèmes d'expression dans les levures, on peut citer ceux décrits dans Hinnen et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978)

75 : 1929 ; Ito et al., J. Bacterio/ (1983) 153 : 163 ; Kurtz et at.,/ Sol. (1986) 6 : 142 ; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25 : 141 ; Gleeson et al., J. Gen. Microb/. (1986) 132 : 3459 ; Roggenkamp et ai., Mol Gen. Genes (1986) 202 : 302 ; Das et a !., 7. & ? c/yo/. (1984) 158 : 1165 ; De Louvencourt et al., 7 acm (1983) 154-737 ; Van den Berg et al., BiojTechn%gy (1990) 8 : 135 ; Kunze et aL, J, Basic Microbiol. (1985)

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25 : 141 ; Gregg et al., MOI Cell. Biol (1985) 5 : 3376 ; brevet U. S. nO 4 837 148 et 4 929 555 ; Beach et Nurse, Nature (1981) 300 : 706 ; Davidow et al., Curr. Gene. (1985) 10 : 380 ; Gaillartin et al., Curr. Genet. (1985) 10 : 49, Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112 : 284-289 ; Tilburn et al., Gene (1983) 26 : 205-221 ; Yelton et al., Pr c. / Ac Sci, (USA) (1984) 81 : 1470-1474 ; Kelly et Hynes, EMBO J. (1985) 4 : 475479 ; EP 0 244 234 ; et WO 91/00357.

Cellules d'insectes : L'expression de gènes hétérologues dans les insectes est réalisée de la manière décrite dans le brevet U. S. nO 4 745 051 ; Friesen et al."Régulation de l'expression d'un gène de baculovirus", dans : The Molecular Biology Of Baculoviruses (1986) (directeur de publication W. Doerfler) ; EP 0 127 839 ; EP 0 155 476. et Vlak et a).,. 7. 6ë-/7. /-o/. (1988) 69 : 765-776 ; Miller et al. Ann. Rev. Microbio !. (1988) 42 : 177 ; Carbonell et al., Gene (1988) 73 : 409 ; Maeda et al., Nature (1985) 315 : 592-594 ; Lebacq-Verheyden et al., C io/. (1988) 8 : 3129 ; Smith et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82 : 8844 ; Miyajima et al., Gene (1987) 58 : 273 ; et Martin et aL, DNA (1988) 7/99. De nombreuses souches baculovirales et de nombreux variants, et les cellules hôtes d'insectes permissives correspondantes tirées d'hôtes, sont décrits dans Luchow et al., BiojTechn%gy (1988) 6 : 47-55, Miller et a !., Generic Engineering (1986) 8 : 277-279 et Maeda et aL, Nature (1985) 315 : 592-594.

Cellules de mammifères : L'expression chez les mammifères est réalisée de la manière décrite dans Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4 : 761, Gorman et a !., c.//1 (USA) (1982) 7 : 6777, Boshart et ai., Ce/ (1985) 41 : 521 et brevet U. S. nO 4 399 216. D'autres caractéristiques de l'expres-sion chez les mammifères sont facilitées, comme décrit dans Ham et Wallace, Meth. Enz. (1979) 58 : 44, Barnes et Sato, /7 < ?/. /oc/7 < ?/77. (1980) 102 : 255, les brevets U. S. nO 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655, WO 90/103430, WO 87/00195, et le document U. S. RE 30 985.

Lorsqu'on utilise l'une quelconque des cellules hôtes ci-dessus, ou d'autres cellules ou organismes hôtes appropriés, pour répliquer et/ou exprimer les polynucléotides ou les acides nucléiques de l'invention, l'acide nucléique répliqué résultant, l'ARN, la protéine exprimée ou le polypeptide

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exprimé entre dans le cadre de l'invention en tant que produit de la cellule ou de l'organisme hôte. Le produit est récupéré par tout moyen approprié connu dans la technique.

Une fois que le gène correspondant à un polynucléotide sélectionné est identifié, son expression peut être régulée dans la cellule de laquelle le gène est natif. Par exemple, un gène endogène d'une cellule peut être régulé par une séquence régulatrice exogène, comme décrit dans le brevet U. S. nu 5641670.

Les présentes compositions de polypeptides et d'acides nucléiques trouvent un emploi dans toutes sortes d'applications différentes, y compris des applications générales, des applications diagnostiques et des applications de sélection/découverte/préparation d'agents thérapeutiques, ainsi que dans des compositions thérapeutiques et des procédés pour les employer.

Les présentes compositions d'acides nucléiques trouvent un emploi dans toutes sortes d'applications générales. Parmi les applications générales présen-tant un intérêt, on peut citer : l'identification d'homologues de MPTS ; comme source de nouveaux éléments promoteurs ; l'identification de facteurs régulateurs de l'expression des MPTS ; comme sondes et amorces dans les applications d'hybridation, par exemple l'APC l'identification de schémas d'expression dans les prélèvements biologiques ; la préparation de modèles cellulaires ou animaux pour la fonction des MPTS ; la préparation de modèles in vitro pour la fonction des MPTS ; etc.

Les homologues des présents gènes peuvent être identifiés par de nombreux procédés. Un fragment de l'ADNc procuré peut être utilisé comme sonde d'hybridation contre une banque d'ADNc de l'organisme cible présen-tant un intérêt, où l'on utilise des conditions peu rigoureuses. La sonde peut être un grand fragment, ou une ou plusieurs courtes amorces dégénérées. Les acides nucléiques ayant une similitude de séquence sont détectés par hybridation dans des conditions peu rigoureuses, par exemple à SOOC et 6xSSC (chlorure de sodium 0,9 M/citrate de sodium 0,09 M) et restent liés lorsqu'ils sont soumis à un lavage à 55 C dans lxSSC (chlorure de sodium 0,15 M/citrate de sodium 0,015 M). L'identité séquentielle peut

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être déterminée par hybridation dans des conditions rigoureuses, par exemple à 500C ou plus et O, lxSSC (chlorure de sodium 15 mM/citrate de sodium 0,15 mM). Les acides nucléiques ayant une région d'identité substantielle avec les séquences procurées, par exemple des variants alléliques, des versions du gène modifiées, génétiquement, etc., se lient aux séquences procurées dans des conditions d'hybridation rigoureuses. En utilisant des sondes, en particulier des sondes marquées de séquences d'ADN, on peut isoler des homologues ou des gènes apparentés.

On peut tirer parti de la séquence de la région adjacente en 5'pour les éléments promoteurs, notamment les sites de liaison amplificateurs, qui permettent une régulation du développement dans les tissus où le gène de MPTS faisant l'objet de l'invention est exprimé. L'expression spécifique d'un tissu est utile pour déterminer le schéma d'expression, et pour fournir des promoteurs imitant le schéma d'expression natif. Les polymorphismes se produisant dans la nature, dans la région promoteur, sont utiles pour déterminer les variations naturelles de l'expression, en particulier celles pouvant être associées à une maladie.

En variante, des mutations peuvent être introduites dans la région promoteur pour déterminer l'effet de l'altération de l'expression dans des

systèmes définis expérimentalement. Des procédés pour identifier des motifs d'ADN spécifiques impliqués dans la liaison de facteurs de transcription sont connus dans la technique, par exemple la similitude de séquence avec des motifs de liaison connus, les études de ralentissement sur gel, etc. A titre d'exemples, voir Blackwell et al. (1995), Mol. Med. 1 : 194-205 ; Mortiock et al. (1966), Genome Res. 6 : 327-333 ; et Joulin et Richard-Foy (1995), Er. 3. Biochem. 232 : 620-626.

Les séquences régulatrices peuvent être utilisées pour identifier les

séquences agissant en cis nécessaires à la régulation de la transcription ou de la traduction de l'expression du gène de MPTS, en particulier dans différents tissus ou différents stades de développement, et pour identifier les séquences agissant en cis et les facteurs agissant en trans qui régulent ou servent de médiateur à l'expression du gène de MPTS. De telles régions de contrôle de la transcription ou de la traduction peuvent être liées en

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opération à un gène de MPTS afin de promouvoir l'expression des MPTS de type sauvage ou altérées ou d'autres protéines présentant un intérêt dans les cellules cultivées, ou dans les tissus embryonnaires, foetaux ou adultes, et en thérapie génique.

Les petits fragments d'ADN sont utiles comme amorces pour l'APC, sondes de détection pour l'hybridation, etc. Les plus grands fragments d'ADN, à savoir de plus de 100 nt, sont utiles pour la production du polypeptide codé, comme décrit dans le paragraphe précédent. Pour une utilisation dans les réactions d'amplification géométriques, telles que l'APC géométrique, on utilisera une paire d'amorces. La composition exacte des séquences de l'amorce n'est pas déterminante pour l'invention, mais, pour la plupart des applications, les amorces s'hybrideront à la présente séquence dans des condi-tions rigoureuses, comme il est connu dans la technique. Il est préférable de choisir une paire d'amorces qui engendrera un produit d'amplification d'au moins environ 50 nt, de préférence d'au moins environ 100 nt. Les algo-rithmes pour la sélection de séquences d'amorce sont généralement connus, et sont disponibles dans des progiciels du commerce. Les amorces d'amplification s'hybrident aux brins complémentaires de l'ADN, et servent d'amorces de l'un envers l'autre.

L'ADN peut aussi être utilisé pour identifier l'expression du gène dans un prélèvement biologique. La manière selon laquelle on sonde des cellules pour la présence de séquences nucléotidiques particulières, sous forme

d'ADN ou d'ARN génomique, est bien connue dans la littérature. Pour être bref, l'ADN ou l'ARNm est isolé d'un échantillon cellulaire. L'ARNm peut être amplifié par RT-PCR, en utilisant la transcriptase inverse pour former un brin d'ADN complémentaire, suivie d'une amplification avec réaction en chaîne par poly-mérase avec des amorces spécifiques des séquences d'ADN en question. En variante, l'échantillon d'ARNm est séparé par électrophorèse sur gel, transféré sur un support approprié, par exemple la nitrocellulose, le Nylon, etc., puis sondé avec un fragment de l'ADN en question comme sonde. D'autres tech-niques, telles que des dosages de soudure d'oligonucléotides, des hybridations in situ, et l'hybridation à des sondes d'ADN disposées en rangées sur une puce solide, peuvent aussi trouver une

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utilisation. La détection de l'hybridation de l'ARNm à la présente séquence est une indication de l'expression du gène de MPTS dans l'échantillon.

La séquence d'un gène de MPTS, y compris les régions promoteur et les régions codantes adjacentes, peut être mutée de diverses façons

connues dans la technique pour engendrer des modifications ciblées dans la force du promo-teur, la séquence de la protéine codée, etc. La séquence d'ADN ou le produit protéique d'une telle mutation sera habituellement essentiellement similaire aux séquences présentées dans la présente invention, à savoir différeront par au moins un nucléotide ou un acide aminé, respectivement, et peuvent différer par au moins deux, mais pas plus d'environ dix, nucléotides ou acides aminés. Les variations de séquence peuvent être des substitutions, des insertions, des délétions, ou une combinaison de celles-ci. Les délétions peuvent également inclure des modifications plus grandes, telles que des délétions d'un domaine ou exon.

Comme autres modifications présentant un intérêt, on peut citer le marquage par épitopes, par exemple avec le système FLAG, HA, etc. Pour des études de localisation subcellulaire, on peut utiliser des protéines de fusion avec des protéines fluorescentes vertes (GFP).

Les techniques de mutagenèse in vitro de gènes clonés sont connues.

On trouvera des exemples de protocoles pour la mutagenèse spécifique d'un site dans Gustin et al. (1993), Biotechniques 14 : 22 ; Barany (1985),

Gene 37 : 111-123 ; Colicelli et al. (1985),/o/ < ?/ ?. 6/7. 199/537-539 ; et Prentki et al. (1984), Gene 29 : 303-313. On trouvera des méthodes pour la mutagenèse spécifique d'un site dans Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp 15.3-15. 108 ; Weiner et al.

(1993), Gene 126 : 35-41 ; Sayers et al. (1992), Biotechniques 13 : 592-596 ; Jones et Winistorfer (1992), Biotechniques 12 : 528-530 ; Barton et al. (1990), Nucleic Acids Res. 18 : 7349-7355 ; Marotti et Tomich (1989), Gene

Anal. Tech. 6 : 67-70 ; et Zhu (1989), Anal Siochem, 177 : 120-124. De tels gènes mutés peuvent être utilisés pour étudier les relations structurefonction d'une protéine MPTS, ou bien pour altérer les propriétés de la protéine qui affectent sa fonction ou sa régulation.

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Les acides nucléiques faisant l'objet de l'invention peuvent être utilisés pour engendrer des animaux non humains transgéniques ou des modifications géniques spécifiques d'un site dans des lignées cellulaires. Les animaux transgéniques peuvent être créés par recombinaison homologue, où le locus endogène est altéré. En variante, un produit d'assemblage d'acides nucléiques est intégré au hasard dans le génome. Comme vecteurs pour une intégration stable, on peut citer les plasmides, les rétrovirus et d'autres virus d'animaux, les YAC, et analogues.

Les cellules ou animaux modifiés sont utiles dans l'étude de la fonction et de la régulation des MPTS. On s'intéresse à l'utilisation des gènes faisant l'objet de l'invention pour construire des modèles animaux transgéniques de pathologies liées aux MPTS, notamment les pathologies liées à l'agrécanase, par exemple les pathologies associées à l'activité agrécanase, telles que l'arthrite. Les modèles animaux transgéniques de la présente invention englobent donc des inactivations de gène de MPTS endogène dans lesquels

l'expression de la MPTS endogène est au moins réduite, sinon éliminée, ces animaux exprimant aussi typiquement un peptide MPTS de la présente invention, par exemple les protéines MPTS spécifiques de la présente invention ou un de leurs fragments. Là où un acide nucléique ayant une séquence que l'on trouve dans le gène de MPTS humain est introduit, l'acide nucléique introduit peut être une séquence complète ou partielle du gène de MPTS. Un marqueur détectable, tel que lack, peut être introduit dans le locus MPTS, où une régulation positive de l'expression du gène conduira à une modification facile à détecter du phénotype. On peut aussi prévoir l'expression du gène ou de variants du gène dans des cellules ou des tissus où il n'est pas normalement exprimé, à des niveaux qui ne sont pas normalement présents dans ces cellules ou tissus.

Les produits d'assemblage d'ADN pour la recombinaison homologue comprendront au moins une partie du gène de MPTS de la présente invention, le gène présentant la ou les modifications génétiques souhaitées et comprenant des régions d'homologie avec le locus cible. Les produits d'assemblage d'ADN pour l'intégration au hasard n'ont pas besoin d'inclure des régions d'homologie pour jouer le rote de médiateur de la

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recombinaison. Avantageusement, des marqueurs pour la sélection positive et la sélection négative sont inclus. Les procédés pour créer des cellules présentant des modifications géniques ciblées par recombinaison homologue sont connus dans la technique. On trouvera différentes techniques de transfection de cellules de mammifères dans Keown et al.

(1990), Meth Enzymo/. 185 : 527-537.

Pour les cellules souches embryonnaires (ES), une lignée de cellules ES peut être employée, ou bien les cellules embryonnaires peuvent être obtenues fraîches à partir d'un hôte, par exemple souris, rat, cobaye, etc.

Ces cellules sont cultivées sur une couche nourricière de fibroblastes appropriée ou cultivées en présence du facteur inhibant la leucémie (LIF). Lorsque les cellules ES ou embryonnaires ont été transformées, elles peuvent être utilisées pour produire des animaux transgéniques. Après transformation, les cellules sont cultivées sur une couche nourricière dans un milieu approprié. Les cellules contenant le produit d'assemblage peuvent être détectées grâce à l'emploi d'un milieu sélectif. Après suffisamment de temps pour que les colonies se développent, elles sont récoltées et analysées pour l'apparition d'une recombinaison homologue ou d'une intégration du produit d'assemblage. Les colonies qui sont positives peuvent être utilisées pour une manipulation embryonnaire et une injection dans des blastocytes. Les blastocytes sont obtenus sur des femelles en surovulation âgées de 4 à 6 semaines. Les cellules ES sont trypsinisées et les cellules modifiées sont injectées dans le blastocèle des blastocytes. Après l'injection, les blastocytes sont remis dans chaque trompe de Fallope des femelles faussement pleines. La grossesse des femelles est ensuite menée à terme et les petits qui naissent sont sélectionnés en fonction du produit d'assemblage. En prévoyant un phénotype différent des blastocytes et des cellules génétiquement modifiées, on peut facilement détecter une progéniture chimérique.

Les animaux chimériques sont sélectionnés en fonction de la présence

du gène modifié et les mâles et les femelles portant la modification sont accouplés pour produire une progéniture homozygote. Si les altérations géniques provo-quent une mortalité à un point du développement, on peut

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conserver les tissus ou les organes au titre de greffes ou de transplants allogéniques on congé-niques, ou en culture in vitro. Les animaux transgéniques peuvent être tout mammifère non humain, tels que des animaux de laboratoire, des animaux domestiques, etc. Les animaux transgéniques peuvent être utilisés dans des études fonctionnelles, des sélections de médicaments, etc., par exemple pour déterminer l'effet d'un médicament candidat sur l'activité agrécanase.

L'invention fournit aussi des procédés de diagnostic de maladies basés sur les niveaux observés d'une protéine MPTS ou le niveau d'expression du gène dans un prélèvement biologique présentant un intérêt. Les échantillons ou prélèvements, comme on l'entend ici, comprennent les liquides biologiques tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien, les

larmes, la salive, la lymphe, le liquide de dialyse, et analogues ; les liquides dérivés d'une culture d'organe ou d'une culture tissulaire ; et les liquides extraits de tissus physiologiques. Le terme inclut aussi les dérivés et fractions desdits liquides. Les cellules peuvent être dissociées, dans le cas de tissus solides, ou des sections tissulaires peuvent être analysées. En variante, un Iysat des cellules peut être préparé.

On dispose d'un certain nombre de procédés pour déterminer le niveau d'expression d'un gène ou d'une protéine dans un échantillon particulier. Le diagnostic peut être réalisé par un certain nombre de procédés pour déterminer l'absence ou la présence ou des quantités modifiées de MPTS normal ou anormal dans un prélèvement de patient. Par exemple, la détection peut faire appel à la coloration de cellules ou de coupes histologiques avec des anticorps marqués, réalisée selon des procédés classiques. Les cellules sont perméabilisées pour colorer les molécules cytoplasmiques. Les anticorps présentant un intérêt sont ajoutés à l'échantillon de cellules et incubés pendant une durée suffisante pour permettre la liaison à l'épitope, habituellement au moins environ 10 minutes. L'anticorps peut être marqué avec des radio-isotopes, des enzymes, des agents fluorescents, des agents chimioluminescents, ou d'autres marqueurs permettant la détection directe. En variante, on utilise un anticorps ou un réactif de second stade pour amplifier le signal. Ces

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réactifs sont bien connus dans la technique. Par exemple, on peut conjuguer l'anti-corps primaire à de la biotine, avec une addition d'avidine conjuguée à la per-oxydase de raifort comme réactif de second stade. En variante, l'anticorps secondaire est conjugué à un composé fluorescent, par exemple la fluores-céine, la rhodamine, le rouge Texas, etc. La détection finale fait appel à un substrat qui subit un changement de couleur en présence de peroxydase. L'absence ou la présence de liaison à l'anticorps peut être déterminée par différentes méthodes, notamment par cytométrie en flux des cellules disso-ciées, microscopie, radiographie, comptage à scintillation, etc.

En variante, on peut se focaliser sur l'expression du gène de MPTS.

Des études biochimiques peuvent été réalisées pour déterminer si un polymorphisme de séquence dans une ou des régions codant pour MPTS était associé à la maladie. Les polymorphismes associés à une maladie peuvent inclure la délétion ou le segmentation du gène, des mutations altérant le niveau d'expression, affectant l'activité de la protéine, etc.

Les changements dans la séquence promoteur ou amplificateur pouvant affecter les niveaux d'expression de la MPTS peuvent être comparés aux niveaux d'expression de l'allèle normal par différents procédés connus dans la technique. Parmi les procédés permettant de déterminer la force du promo-teur ou de l'amplificateur, on peut citer la quantification de la protéine naturelle exprimée ; l'insertion de l'élément de contrôle du variant dans un vecteur avec un gène raporteur tel que la p- galactosidase, la luciférase, le chloramphénicol, l'acétyltransférase, etc., qui permet une quantification pratique ; et analogue.

On dispose d'un certain nombre de procédés pour analyser les acides nucléiques afin de déterminer la présence d'une séquence spécifique, par exemple d'un polymorphisme associé à une maladie. Lorsqu'on dispose de grandes quantités d'ADN, on utilise directement l'ADN génomique. En variante, on clone la région présentant un intérêt dans un vecteur approprié et on la fait croître en quantité suffisante pour l'analyse. Les cellules exprimant une protéine MPTS peuvent être utilisées comme source d'ARNm, lequel peut être dosé directement ou soumis à une transcription inverse

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dans l'ADNc pour l'analyse. L'acide nucléique peut être amplifié par des techniques classiques, telles que l'amplification en chaîne par polymérase (APC), pour donner des quantités suffisantes pour l'analyse. L'utilisation de l'amplification en chaîne par polymérase est décrite dans Saiki et al. (1985), Science 239 : 487, et on trouvera un passage en revue des techniques dans Sambrook et aL, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pages 14.2-14. 33. En variante, on connaît dans la technique différents procédés qui font appel à la soudure d'oligonucléotides comme moyen de détection des polymorphismes, voir, par exemple, Riley et al. (1990), Nucl.

Acids Res. 18 : 2887-2890 ; et Delahunty et al. (1996), Am. J. Hum. Gene.

58 : 1239-1246.

Un marqueur détectable peut être incorporé dans une réaction

d'ampli-fication. Comme marqueurs appropriés, on peut citer les fluorochromes, par exemple l'isothiocyanate de fluroescéine (FITC), la rhodamine, le rouge Texas, la phycoérythrine, l'allophycocyanine, la 6carboxyfluorescéine (6-FAM), la 2', 7'-diméthoxy-4', 5'-dichlor-6- carboxyfluorescéine (JOE), la 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), la 6-carboxy- 2', 4', 7', 4, 7-hexachlorofluorescéine (HEX), la 5-carboxyfluorescéine (5-FAM) ou la N, N, N', N'-tétraméthyl-6-carboxy-rhodamine (TAMRA), les marqueurs radioactifs, par exemple 3P, 35S, 3H ; etc. Le marqueur peut être un système à deux étages, dans lequel l'ADN amplifié est conjugué à la biotine, aux haptènes, etc., ayant un partenaire de liaison de forte affinité, par

exemple l'avidine, les anticorps spécifiques, etc., où le partenaire de liaison est conjugué à un marqueur détectable. Le mar-queur peut être conjugué à une des amorces ou aux deux. En variante, le groupe de nucléotides utilisé dans l'amplification est marqué, de manière à incorporer le marqueur dans le produit d'amplification.

L'acide nucléique de l'échantillon par exemple le fragment amplifié ou cloné, est analysé par un procédé connu dans la technique parmi un grand nombre. L'acide nucléique peut être séquence par le procédé didésoxy ou d'autres, et la séquence de bases comparée à une séquence d'un gène de type sauvage. L'hybridation avec la séquence variant peut aussi être utilisée pour déterminer sa présence, par transfert d'ADN Southern, transfert en

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points, etc. Le schéma d'hybridation d'une séquence témoin et d'une séquence variant à une série de sondes oligonucléotidiques immobilisées sur un support solide, comme décrit dans US 5 445 934 ou dans WO 95/35 505, peut aussi être utilisé comme moyen pour détecter la présence de séquences variant. Une analyse de polymorphisme conformationnel à un seul brin (technique SSCP), une électrophorèse sur gel avec gradient dénaturant (DGGE) et une analyse hétéroduplex dans des matrices de gel sont utilisées pour détecter les change-ments de conformation créés par la

variation de la séquence d'ADN sous forme d'altérations de la mobilité par électrophorèse. En variante, lorsqu'un polymorphisme crée ou détruit un site de reconnaissance pour une endonucléase de restriction, l'échantillon est digéré avec cette endonucléase, et les produits fractionnés par taille pour déterminer si le fragment a été digéré. Le fractionnement est réalisé par électrophorèse sur gel ou électrophorèse capillaire, en particulier des gels d'acrylamide ou d'agarose.

La sélection effectuée pour les mutations dans MPTS peut être basée sur les caractéristiques fonctionnelles ou antigéniques de la protéine. Les dosages par segmentation de la protéine sont utiles pour détecter les délétions susceptibles d'affecter l'activité biologique de la protéine. Divers dosages immunologiques conçus pour détecter des polymorphismes dans les protéines MPTS peuvent être utilisés dans la sélection. Lorsque de nombreuses mutations génétiques diverses conduisent à un phénotype de maladie particulier, les dosages des protéines fonctionnelles se sont révélés être des outils de sélection efficaces. L'activité de la protéine MPTS codée peut être déterminée par comparaison avec la protéine de type sauvage.

Les procédés de diagnostic de la présente invention dans lesquels le niveau d'expression du gène de MPTS présente un intérêt impliquent typique-ment une comparaison de l'abondance des acides nucléiques de MPTS d'un échantillon présentant un intérêt avec celle d'une valeur témoin pour déter-miner les différences relatives éventuelles, la différence pouvant être mesurée qualitativement et/ou quantitativement, ces différences étant ensuite liées à la présence ou à l'absence d'un schéma d'expression de gène de MPTS anormal. L'homme du métier connaît tout un éventail de procédés

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différents pour déterminer l'abondance des acides nucléiques dans un échantillon, et parmi les procédés particulièrement intéressants, on peut citer ceux décrits dans : Pietu et al., Genome Res, (juin 1996) 6 : 492-503 ; Zhao et al., Gene (24 avril 1995) 156 : 207-213 ; Soares, Curr, Spin.

Siotechnol. (octobre 1997) 8 : 542-546 ; Raval, J. Pharmacol Toxicol, Methods (novembre 1994) 32 : 125-127 ; Chalifour et a)., Anal. Biochem (1r février 1994) 216 : 299-304 ; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (décembre 1996) 6 : 225-230 ; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2 : 907 ; et McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143 : 298. Ceux qui présentent également un intérêt sont les procédés décrits dans WO 97/27 317, dont la description est incorporée ici à titre de référence.

Les présents polypeptides trouvent une utilisation dans différents dosages de sélection conçus pour identifier des agents thérapeutiques. On peut employer des dosages de sélection in vitro dans lesquels l'activité d'un polypeptide MPTS, par exemple l'activité agrécanase d'un polypeptide MPTS, est évaluée en pré-sence d'un agent thérapeutique candidat et comparée à un témoin, à savoir l'activité en l'absence de l'agent thérapeutique candidat. L'activité peut être déterminée de plusieurs manières différentes, l'activité pouvant être générale-ment déterminée comme étant la capacité à couper l'agrécane ou au moins un de ses fragments, ainsi qu'un polypeptide recombinant, qui contient le site de clivage de l'agrécanase, comme décrit ci-dessus. De tels dosages sont décrits dans le brevet U. S. n 5 872 209 et WO 99/05 921, ainsi que dans Armer et al., J. Biol. Chem. (mars 1999) 274 : 6594-6601.

Ce qui est aussi intéressant dans les dosages de sélection, ce sont les animaux transgéniques non humains qui expriment la MPTS fonctionnelle, ces animaux étant décrits ci-dessus. Dans de nombreux modes de réalisation, les animaux ne possèdent pas le gène de MPTS endogène correspondant. Lorsqu'on emploie ces animaux pour des applications de sélection, on admi-nistre un ou des composés étudiés à l'animal et on compare avec un témoin les changements de phénotype résultants, par

exemple la présence d'agrécane produit par clivage de la liaison Glu373Ala374.

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En variante, on peut mesurer l'activité de liaison de MPTS dans des modèles in vitro, dans lesquels on surveille les événements de liaison entre la MPTS et les agents modulateurs de MPTS candidats.

On peut inclure toutes sortes d'autres réactifs dans les dosages de sélection, suivant les protocoles de sélection particuliers employés. Parmi eux, on peut citer les réactifs comme les sels, les protéines neutres, par exemple l'albumine, les détergents, etc., qui sont utilisés pour faciliter une liaison protéine-protéine optimale et/ou réduire les interactions non spécifiques ou de fond. Des réactifs qui améliorent le rendement du dosage, tels que des inhibiteurs de protéase, des inhibiteurs de nucléase, des agents

antimicrobiens, etc., peuvent être utilisés.

On peut sélectionner par les procédés ci-dessus toutes sortes d'agents thérapeutiques candidats différents jouant le rôle d'agonistes ou d'antagonistes de MPTS. Les agents candidats englobent de nombreuses classes chimiques, bien qu'ils soient typiquement des molécules organiques, de préférence de petits composés organiques ayant un poids moléculaire supérieur à 50 et inférieur à environ 2 500 daltons. Les agents candidats comprennent des groupes fonctionnels nécessaires à l'interaction structurelle avec les protéines, en particulier les liaisons hydrogène, et comprennent typiquement au moins un groupe amine, carbonyle, hydroxyle ou carboxyle, de préférence au moins deux groupes chimiques fonctionnels.

Les agents candidats comprennent souvent des structures carbonées cycliques ou des structures hétérocycliques et/ou des structures aromatiques ou polyaromatiques substituées par un ou plusieurs des

groupes fonctionnels ci-dessus. On trouve aussi des agents candidats parmi les biomolécules, notamment les peptides, les saccharides, les acides gras, les stérodes, les purines, les pyrimidines, les dérivés, les analogues de structure, ou leurs combinaisons.

Les agents candidats sont obtenus auprès de toutes sortes de sources, notamment des banques de composés synthétiques ou naturels. Par exemple, on dispose de nombreux moyens pour la synthèse statistique et dirigée d'un grande diversité de composés organiques et de biomolécules, notamment l'expression d'oligonucléotides et d'oligopeptides randomisés. En

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variante, on dispose, ou on peut produire facilement, des banques de composés naturels sous forme d'extraits bactériens, fongiques, végétaux et animaux. De plus, des banques et des composés naturels ou produits par synthèse sont facilement modifiés par des moyens chimiques, physiques et biochimiques classiques, et peuvent être utilisés pour produire des banques combinatoires. Des agents pharmacologiques connus peuvent être soumis à des modifications chimiques dirigées ou statistiques, telles qu'acylation, alkylation, estérification, amidation, etc., pour produire des analogues de structure.

Dans de nombreux modes de réalisation, on s'intéresse particulièrement aux procédés de sélection qui identifient des agents modulant sélectivement, par exemple inhibant, l'enzyme MPTS de l'invention et pas d'autres protéases.

Les compositions d'acides nucléiques de la présente invention trouvent également un emploi comme agents thérapeutiques dans les cas où l'on souhaite renforcer une activité MPTS chez un hôte. Les gènes, fragments de gène ou les protéines codées ou fragments de protéine MPTS sont utiles en thérapie génique pour traiter des troubles associés à des défauts de MPTS, notamment des défauts d'agrécanase. Des vecteurs d'expression peuvent être utilisés pour introduire le gène dans une cellule. De tels vecteurs possèdent généralement des sites de restriction commodes situés près de la séquence promoteur pour permettre l'insertion de séquences d'acides nucléiques. On peut préparer des cassettes de transcription comprenant une région d'initiation de la transcription, le gène cible ou son fragment, et une région d'arrêt de la transcription. Les cassettes de transcription peuvent être introduites dans toutes sortes de vecteurs, par exemple plasmide ; rétrovirus, par exemple lenti-virus ; adénovirus ; et analogues, les vecteurs étant capables d'être conservés de façon transitoire ou stable dans les cellules, habituellement pendant une période d'au moins environ un jour, mieux encore pendant une période d'au moins environ plusieurs jours à plusieurs semaines.

Le gène ou la protéine peut être introduit dans des tissus ou des cellules hôtes par plusieurs voies différentes, notamment infection virale,

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micro-injection ou fusion de vésicules. Une injection par jet peut aussi être utilisée pour l'administration intramusculaire, comme décrit par Furth et al. (1992), Anal. Biochem. 205 : 365-368. L'ADN peut revêtir des microparticules d'or et être délivré en intradermique par un dispositif de

bombardement de particules, ou "pistolet à gènes", comme décrit dans la littérature (voir, par exemple, Tang et al. (1992), Nature 356 : 152-154), où des microprojectiles d'or sont revêtus de l'ADN, puis bombardés dans les cellules cutanées.

La présente invention a trait à des procédés de modulation de l'activité MPTS et, dans de nombreux modes de réalisation, agrécanase, dans une cellule, notamment à des procédés pour augmenter l'activité MPTS (par exemple des procédés de stimulation), ainsi qu'à des procédés pour réduire ou inhiber l'activité MPTS, par exemple des procédés pour arrêter ou limiter le clivage de l'agrécane. Dans ces procédés, une quantité efficace d'un agent modulateur est mise en contact avec la cellule.

L'invention concerne aussi des procédés de modulation, notamment stimulation et inhibition, de l'activité MPTS chez un hôte. Dans ces procédés, une quantité efficace d'agent actif modulant l'activité d'une protéine MPTS in vivo, par exemple où l'agent stimule ou inhibe habituellement l'activité MPTS cible, est administrée à l'hôte. L'agent actif peut être toutes sortes de compo-sés différents, notamment un composé à petite molécule, naturel ou synthétique, un anticorps, un fragment ou dérivé d'anticorps, une composition antisens, et analogues.

Dans certains modes de réalisation, on s'intéresse particulièrement à des agents réduisant l'activité MPTS, notamment des agents réduisant l'activité agrécanase, par exemple le clivage de l'agrécane, par au moins un facteur 10 environ, habituellement par au moins un facteur 20 environ et mieux encore par au moins un facteur 25 environ, la mesure étant faite par le dosage décrit dans Arner et al. (1999), cité ci-dessus. Dans beaucoup de modes de réalisa-tion, on s'intéresse particulièrement à l'emploi de composés qui réduisent l'activité agrécanase par au moins un facteur 100, comparé au témoin.

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On s'intéresse aussi à l'emploi d'agents qui, tout en réduisant l'activité MPTS, notamment agrécanase, ne réduisent pas essentiellement, voire pas du tout, l'activité d'autres protéinases. Ainsi, les agents dans ce mode de réalisation sont des inhibiteurs sélectifs de la MPTS. On considère qu'un agent est sélectif s'il permet de réduire l'activité agrécanase, mais sans réduire essentiellement l'activité d'au moins une autre protéinase,"sans essentielle-ment" signifiant une réduction de moins de 10 fois, habituellement une réduction de moins de 5 fois, et dans de nombreux cas

une réduction de moins de 1 fois, l'activité étant mesurée de la manière décrite dans Arner et al. (1999), cité ci-dessus.

Parmi les composés à petites molécules, naturels et synthétiques, présentant un intérêt, on peut citer de nombreuses classes chimiques, bien que typiquement il s'agisse de molécules organiques, de préférence de petits composés organiques ayant un poids moléculaire supérieur à 50 et inférieur à environ 2 500 daltons. Les agents candidats comprennent des groupes fonctionnels nécessaires à l'interaction structurelle avec les protéines, en particulier des liaisons hydrogène, et comprennent typiquement au moins un groupe amine, carbonyle, hydroxyle ou carboxyle, de préférence au moins deux groupes chimiques fonctionnels. Les agents candidats comprennent souvent des structures carbonées cycliques ou des structures hétérocycliques et/ou des structures aromatiques ou polyaromatiques substituées par un ou plusieurs des groupes fonctionnels ci-dessus. On trouve aussi des agents candidats parmi les biomolécules,

notamment les peptides, les saccharides, les acides gras, les stéroïdes, les purines, les pyrimidines, leurs dérivés, leurs analogues de structure, ou leurs combinaisons.

Des agents actifs intéressants également sont les anticorps qui au moins réduisent, sinon inhibent, l'activité MPTS cible, par exemple agrécanase, chez l'hôte. On obtient des anticorps appropriés en immunisant un animal hôte avec des peptides comprenant tout ou partie de la protéine cible, par exemple MPTS-15, MPTS-19 ou MPTS-20. Parmi les animaux

hôtes appropriés, on peut citer la souris, le rat, le mouton, la chèvre, le hamster, le lapin, etc. L'origine de l'immunogène protéique peut être une

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souris, un être humain, un rat, un singe, etc. L'animal hôte sera généralement une espèce différente de l'immunogène, par exemple un MPTS humain utilisé pour immuniser des souris, etc.

L'immunogène peut comprendre la protéine complète, ou des fragments ou dérivés de celle-ci. Les immunogènes préférés comprennent out ou partie de la MPTS, ces résidus contenant les modifications post-

traductionnelles, telles que la glycosylation, que l'on trouve sur la protéine cible native. Les immunogènes comprenant le domaine extracellulaire sont produits de plusieurs manières différentes connues dans la technique, par exemple l'expression de gènes clonés à l'aide de procédés de recombinaison classiques, isolement de HEC, etc.

Pour la préparation d'anticorps polyclonaux, la première étape est

l'immunisation de l'animal hôte avec la protéine cible, la protéine cible étant de préférence sous une forme essentiellement pure, comprenant moins d'environ 1% de contaminant. L'immunogène peut comprendre la protéine cible complète, des fragments ou des dérivés de celle-ci. Pour augmenter la réponse immunitaire de l'animal hôte, on peut combiner la protéine cible avec un adjuvant, les adjuvants appropriés comprenant l'alun, le dextrane, le sulfate, les gros anions polymères, les émulsions huile et eau, par exemple l'adjuvant de Freund, l'adjuvant complet de Freund, et analogues.

La protéine cible peut aussi être conjuguée à des protéines porteuses synthétiques ou à des antigènes synthétiques. Toutes sortes d'hôtes peuvent être immunisés pour produire les anticorps polyclonaux. Parmi ces

hôtes, on peut citer les lapins, les cobayes, les rongeurs, par exemple les souris, les rats, les moutons, les chèvres, et analogues. La protéine cible est administrée à l'hôte, habituellement par voie intradermique, la dose initiale étant suivie d'un ou plusieurs rappels supplémentaires, habituellement d'au moins deux. Après l'immunisation, le sang de l'hôte sera recueilli, puis le sérum séparé des globules rouges. L'Ig présente dans l'antisérum résultant peut être encore fractionnée avec des procédés connus, tels que le fractionnement au sel d'ammonium, la chromato-graphie DEAE, et analogues.

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Les anticorps monoclonaux sont produits par des techniques classiques. Généralement, les ganglions de la rate et/ou les ganglions lymphatiques d'un animal hôte immunisé procurent une source de cellules plasmatiques. Les cellules plasmatiques sont immortalisées par fusion avec des cellules de myélome pour produire des cellules d'hybridome. Le surnageant de culture des hybridomes individuels est criblé par des techniques standard pour identifier ceux produisant des anticorps avec la spécificité voulue. Parmi les animaux qui conviennent pour la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine humaine, on peut citer la souris, le rat, le hamster, etc. Pour diriger des anticorps contre la protéine de souris, l'animal sera généralement un hamster, un cobaye, un lapin, etc.

L'anticorps peut être séparé des surna-geants de cellules d'hybridome ou du liquide d'ascite par des techniques classiques, par exemple par chromatographie d'affinité employant la MPTS liée à un support insoluble, la protéine A Sepharose, etc. Par conséquent, un but de la présente invention est de fournir des anticorps monoclonaux se liant spécifiquement aux protéines MPTS de la présente invention, plus précisément des anticorps de ce type qui inhibent l'activité agrécanase et des anticorps de ce type qui sont des anticorps humains ou humanisés.

L'anticorps peut être produit sous la forme d'une seule chaîne, au lieu de la structure multimère normale. Des anticorps à une seule chaîne sont décrits dans Jost et al. (1994), J. B. C 269 : 26267-26273, et d'autres. Les séquences d'ADN codant pour la région variable de la chaîne lourde et la région variable de la chaîne légère sont soudées à une séquence intercalaire codant pour au moins 4 acides aminés parmi des acides aminés neutres de petite taille, notamment la glycine et/ou la sérine. La protéine codée par cette fusion permet d'assembler une région variable fonctionnelle conservant la spécificité et l'affinité de l'anticorps d'origine.

Pour l'utilisation in vivo, en particulier pour l'injection à des êtres humains, il est souhaitable de diminuer l'antigénicité de l'anticorps. Une réponse immunitaire d'un receveur contre l'agent bloquant diminuera potentiellement la durée d'efficacité du traitement. Les procédés d'humanisa-tion des anticorps sont connus dans la technique. L'anticorps

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humanisé peut être le produit d'un animal comportant des gènes humains transgéniques de région constante d'immunoglobuline (voir, par exemple, WO 90/10 077 et WO 90/04 036). En variante, l'anticorps auquel on s'intéresse peut être manipulé par des techniques d'ADN recombinant pour remplacer les domaines CH1, CH2, CH3, les domaine charnière et/ou le domaine d'ossature par la séquence humaine correspondante (voir WO 92/0290).

L'utilisation d'ADNc d'Ig pour la construction de gènes d'immunoglobulin chimériques est connue dans la technique (Liu et al. (1987) P. N, A, S. 84 : 3439 et (1987) J. Immunol 139 : 3521). L'ARNm est isolé d'un hybri-dome ou d'une autre cellule produisant l'anticorps et utilisé pour produire t'ADNc. L'ADNc en question peut être amplifié par l'amplification en

chaîne par polymérase avec des amorces spécifiques (brevets U. S. n 4 683 195 et 4 683 202). En variante, on prépare une banque que l'on crible pour isoler la séquence présentant un intérêt. La séquence d'ADN codant pour la région variable de l'anticorps est ensuite fusionnée à des séquences de région constante. On trouvera des séquences de gènes humains de régions constantes dans Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, publication N. I. H. nO 91-3242. On peut déjà se procurer des gènes humains de région C à partir de clones connus. Le choix de l'isotype sera guidé par les fonctions effectrices souhaitées, comme la fixation du complément, ou l'activité en cytotoxicité cellulaire dépendant de l'anticorps. Les isotypes préférés sont l'IgG1, l'IgG3 et l'IgG4. On peut utiliser l'une ou l'autre des régions constantes à chaîne légère humaines, kappa ou lambda. L'anticorps chimérique humanisé est ensuite exprimé par des procédés classiques.

Dans d'autres modes de réalisation encore, les anticorps peuvent être des anticorps entièrement humains. Par exemple, des anticorps xénogéniques qui sont identiques aux anticorps humains peuvent être employés. Par anticorps humains xénogéniques, on entend des anticorps qui sont identiques aux anticorps humains, à savoir qui sont des anticorps entièrement humains, sauf qu'ils sont produits à l'aide d'un hôte non

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1 1 1 1 1 humain qui a été manipulé génétiquement pour exprimer des anticorps humains, par exemple WO 98/50 433 ; WO 98/24 893 et WO 99/53 049.

Des fragments d'anticorps, tels que Fv, F (ab') 2 et Fab, peuvent être pré-parés par clivage de la protéine intacte, par exemple par clivage par protéase ou clivage chimique. En variante, un gène segmenté est conçu. Par exemple, un gène chimérique codant pour une partie du fragment F (ab') 2 contiendrait des séquences d'ADN codant pour le domaine CH1 et la région charnière de la chaîne H, suivies d'un codon d'arrêt de la traduction, pour conduire à la molécule segmentée.

Des séquences consensus des régions H et L J peuvent être utilisées pour concevoir des oligonucléotides à utiliser comme amorces pour introduire des sites de restriction utiles dans la région J pour permettre la soudure sub-séquente de segments de région V à des segments de région C humains. L'ADNc de région C peut être modifié par mutagenèse dirigée vers un site pour placer un site de restriction sur une position analogue dans la séquence humaine.

Comme vecteurs d'expression, on peut citer les plasmides, les rétrovirus, les YAC, les épisomes dérivés du virus Epstein-Barr, et analogues. Un vecteur commode est un vecteur codant pour une séquence d'immunoglobuline CH ou CL humaine complète, avec des sites de restriction appropriés manipulés pour que toute séquence VH ou VL puisse être facilement insérée et expri-mée. Dans ces vecteurs, l'épissage se fait habituellement entre le site donneur d'épissage dans la région J insérée et le site accepteur d'épissage précédant la région C humaine, et aussi au niveau des régions d'épissage qui apparaissent dans les exons CH humains.

La polyadénylation et l'arrêt de la transcription se font aux sites chromosomiques natifs en aval des régions codantes. L'anticorps chimérique résultant peut être relié à tout promoteur fort, y compris les longues répétitions terminales de rétrovirus, par exemple le promoteur jeune SV-40

(Okayama et al. (1983) Mo. Cell. Bio. 3 : 280), la longue répétition terminale du virus du sarcome Rous (Gorman et al. (1982) P. A. S. 79 : 6777), et la longue répétition terminale du virus des leucémies de la souris Moloney (Grosschedl etal. (1985) Cel 41 : 885) ; les promoteurs d'Ig natifs, etc.

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Dans d'autres modes de réalisation encore de l'invention, l'agent actif est un agent qui module, et généralement diminue ou abaisse, l'expression du gène codant pour la protéine cible dans l'hôte. Par exemple, on peut utiliser des molécules antisens pour abaisser l'expression de MPTS dans les cellules. Le réactif antisens peut être des oligonucléotides antisens (ODN), en particulier un ODN synthétique présentant des modifications chimiques par rapport aux acides nucléiques natifs, ou des produits d'assemblage d'acides nucléiques qui expriment sous forme d'ARN ces molécules antisens.

La séquence antisens est complémentaire de l'ARNm du gène ciblé et inhibe l'expression des produits géniques ciblés. Les molécules antisens inhibent l'expression du gène par divers mécanismes, par exemple en réduisant la quantité d'ARNm disponible pour la traduction, par activation de l'ARNase H, ou par empêchement stérique. On peut administrer une molécule antisens ou une combinaison de celles-ci, ladite combinaison pouvant comprendre de multiples séquences différentes.

Les molécules antisens peuvent être produites par expression de tout ou partir de la séquence génique cible dans un vecteur approprié, l'initiation de la transcription étant orientée de telle sorte qu'un brin antisens soit produit sous forme de molécule d'ARN. En variante, la molécule antisens est un oligonucléotide synthétique. Les oligonucléotides antisens feront généralement au moins environ 7, habituellement au moins environ 12, mieux encore au moins environ 20, nucléotides de long, et pas plus d'environ 500, habituel-lement pas plus d'environ 50, mieux encore pas plus d'environ 35, nucléotides de long, la longueur étant dictée par l'efficacité de l'inhibition, la spécificité, notamment l'absence de réactivité croisée, et analogues. On a découvert que les oligonucléotides courts, de 7 à 8 bases de long, pouvaient être des inhibiteurs puissants et sélectifs de l'expression génique (voir Wagner et al. (1996), Nature Biotechnol 14 : 840-844).

Une ou des régions spécifiques de la séquence d'ARNm à brin sens endogène sont choisies pour être complétées par la séquence antisens. Le choix d'une séquence spécifique pour l'oligonucléotide peut faire appel à un procédé empirique, où plusieurs séquences candidates font l'objet d'une analyse de l'inhibition de l'expression du gène cible dans un modèle in vitro

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ou dans un modèle animal. Une combinaison de séquences peut aussi être utilisée, où plusieurs régions de la séquence d'ARNm sont choisies pour la complémen-tation antisens.

Les oligonucléotides antisens peuvent être synthétisés par voie chimique par des procédés connus dans la technique (voir Wagner et al. (1993), cité ci-dessus, et Milligan et al., cité ci-dessus). Les oligonucléotides préférés sont modifiés par voie chimique à partir de la structure phosphodiester native, afin d'augmenter leur stabilité intracellulaire et leur

affinité de liaison. Un certain nombre de modifications ont été décrites dans la littérature, lesquelles altèrent la chimie de la chaîne principale, des sucres ou des bases hétérocycliques.

Parmi les changements utiles dans la chimie de la chaîne principale, on peut citer les phosphorothioates, les phosphorodithioates, où les deux atomes d'oxygène non pontants sont substitués par du soufre ; les phosphoramidites ; les phosphotriesters et boranophosphates d'alkyle.

Parmi les dérivés phosphate achiraux, on peut citer le 3'-0'-5'-S- phosphorothioate, le 3'-S-5'-0-phospho-rothioate, le 3'-CH2-5'-0- phosphonate et le 3'-NH-5'-O-phosphoroamidate. Les acides nucléiques

peptidiques remplacent la chaîne principale phosphodi-ester de ribose tout entière par une liaison peptidique. Des modifications des sucres sont également utilisées pour renforcer la stabilité et l'affinité. L'ano-mère a naturel du désoxyribose peut être utilisé, la base étant inversée par rapport à l'anomère ss naturel. Le 2'-OH du sucre ribose peut être modifié, pour former des sucres 2'-O-méthyle ou 2'-0-allyl, qui confèrent une résistance à la dégradation sans compromettre l'affinité. La modification des bases hétérocycliques doit maintenir un appariement correct des bases. Des substitutions utiles comprennent la désoxyuridine à la place de la désoxythymidine ; la 5-méthyl-2'-désocycytidine et la 5-bromo-2'-désoxycytidine à la place de la désoxycytidine. On a montré que la 5-propynyl-2'désoxyuridine et la 5-propynyl-2'-désoxycytidine augmentaient l'affinité et l'activité biolo-gique lorsqu'elles remplaçaient respectivement la désoxythymidine et la désoxy-cytidine.

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Comme alternative aux inhibiteurs antisens, on peut utiliser pour inhiber l'expression génique des composés d'acides nucléiques catalytiques, par exemple des ribozymes, des conjugués antisens, etc. Les ribozymes peuvent être synthétisés in vitro et administrés au patient, ou bien peuvent être codés sur un vecteur d'expression, à partir duquel le ribozyme est synthétisé dans la cellule ciblée (voir, par exemple, la demande de brevet international WO 95/23 225 et dans Beigelman et al. (1995), Nue !. Acíds Res. 23 : 4434-4442). Des exemples d'oligonucléotides ayant une activité catalytique sont décrits dans WO 95/06 764. Les conjugués d'ODN antisens avec un complexe métallique, par exemple le terpyridyl-Cu (II), capables de jouer le rôle de médiateurs de l'hydrolyse de l'ARNm, sont décrits dans

Bashkin et al. (1995), Appl Bíochem. Bíotechnol. 54 : 43-56.

Un objet de la présente invention est donc de fournir un procédé de modulation de l'activité MPTS chez un hôte, ledit procédé comprenant : l'administration d'une quantité efficace d'un agent modulateur de MPTS audit hôte ou, plus précisément, un procédé dans lequel l'agent modulateur est une petite molécule, un anticorps ou un acide nucléique.

Comme on l'a mentionné ci-dessus, une quantité efficace de l'agent actif est administrée à l'hôte, l'expression"quantité efficace"signifiant une dose suffisante pour produire un résultat recherché. Généralement, le résultat recherché est au moins une stimulation ou une réduction de l'activité MPTS, par exemple agrécanase, la mesure étant basée sur la production de produits de clivage de l'agrécane, comparée à un témoin.

Dans les présents procédés, le ou les agents actifs peuvent être administrés à l'hôte par tout moyen commode capable de se traduire par la modulation souhaitée de l'activité MPTS, par exemple la réduction souhaitée de la production de produits de clivage de l'agrécane. Ainsi, l'agent peut être incorporé dans toutes sortes de formulations destinées à l'administration thérapeutique. Plus particulièrement, les agents de la présente invention peuvent être formulés en compositions pharmaceutiques par combinaison avec des véhicules ou diluants pharmaceutiquement acceptables appropriés, et peuvent être formulés en préparations solides, semi-solides, liquides ou gazeuses, telles que comprimés, capsules,

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poudres, granulés, pommades, solutions, suppositoires, injections, produits à inhaler et aérosols.

En ce qui la concerne, l'administration des agents peut être réalisée par différentes voies, notamment par administration orale, buccale, rectale, paren-térale, intrapéritonéale, intradermique, transdermique, intratrachéale, etc.

Dans les formes d'administration pharmaceutiques, les agents peuvent être administrés sous forme de leurs sels pharmaceutiquement acceptables,

ou bien peuvent être aussi utilisés seuls ou en association appropriée, ainsi qu'en combinaison avec d'autres composés à activité pharmaceutique.

Pour les préparations orales, les agents peuvent être utilisés seuls ou en combinaison avec des additifs appropriés, pour produire des comprimés, des poudres, des grandes ou des capsules, par exemple avec des additifs classiques tels que la lactose, le mannitol, l'amidon de maïs ou de fécule de pomme de terre ; avec des liants, tels que la cellulose cristalline, les dérivés de la cellulose, la gomme arabique, l'amidon de maïs ou les gélatines ; avec des délitants tels que l'amidon de mais, la fécule de pomme de terre ou la carboxyméthyl-cellulose sodique ; avec des lubrifiants tels que le talc ou le stéarate de magnésium ; et, le cas échéant, avec des diluants, des agents tampons, des agents humidifiants, des conservateurs et des agents aromatisants.

Les agents peuvent être formulés en préparations pour injection par dissolution, mise en suspension ou émulsification dans un solvant aqueux

ou non aqueux, tel que les huiles végétales et autres huiles semblables, les glycérides d'acides aliphatiques synthétiques, les esters d'acides aliphatiques supérieurs ou de propylèneglycol ; et, le cas échéant, avec des additifs classiques tels que les solubilisants, les agents isotoniques, les agents de suspension, les agents émulsifiants, les stabilisants et les conservateurs.

Les agents peuvent être utilisés dans des formulations en aérosol à administrer par inhalation. Les composés de la présente invention peuvent

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être formulés dans des propulseurs pressurisés acceptables, tels que le dichlorodi-fluorométhane, le propane, l'azote, et analogues.

Par ailleurs, les agents peuvent être mis sous forme de suppositoires par mélange avec toutes sortes de bases, telles que les bases émulsifiantes ou les bases soluble dans l'eau. Les composés de la présente invention peuvent être administrés par voie rectale en suppositoire. Le suppositoire peut contenir des véhicules tels que le beurre de cacao, les Carbowax et les polyéthylèneglycols, qui fondent à la température du corps, tout en étant solidifiés à la température ambiante.

On peut prévoir des formes d'administration unitaires par voie orale ou rectale telles que des sirops, des élixirs et des suspensions, dans lesquelles chaque dose, par exemple cuillerée à café, cuillerée à soupe, comprimé ou suppositoire, contient une quantité prédéterminée de la composition contenant un ou plusieurs inhibiteurs. De même, les formes d'administration unitaires destinées à l'injection ou à l'administration intraveineuse peuvent comprendre le ou les inhibiteurs dans une composition telle qu'en solution dans de l'eau stérile, du sérum physiologique ou un autre véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'expression"forme d'administration unitaire", telle qu'on l'emploie ici, désigne des doses physiquement discrètes appropriées pour servir de dose unitaire à des sujets humains ou animaux, chaque dose contenant une quantité prédéterminée de composés de la présente invention, calculée en quantité suffisante pour produire l'effet recherché, en association avec un diluant, un support ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les spécifications pour les nouvelles formes d'administration unitaires de la présente invention dépendent du composé particulier employé et de l'effet devant être obtenu, et de la pharmacodynamique associée à chaque composé dans l'hôte.

Le public a à sa disposition les excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des véhicules, des adjuvants, des supports ou des diluants. Par ailleurs, le public dispose également de substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables telles que les agents d'ajustement du pH

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et les agents tampons, les agents d'ajustement de la tonicité, les stabilisants, les agents mouillants, et analogues.

Lorsque l'agent est un polypeptide, un polynucléotide, un analogue ou un agent mimétique de ceux-ci, par exemple une composition antisens, il peut être introduit dans des tissus ou des cellules hôtes par un certain nombre de voies, notamment infection virale, microinjection, ou fusion de vésicules. L'injection par jet peut aussi être employée pour l'administration intra-musculaire, comme décrit par Furth et al. (1992), Anal. Biochem.

205 : 365-368. L'ADN peut revêtir des microparticules d'or et être délivré en intra-dermique par un dispositif de bombardement de particules, ou "pistolet à gènes", comme décrit dans la littérature (voir, par exemple, Tang et al. (1992), Nature 356 : 152-154), où des microprojectiles d'or sont revêtus de l'ADN thérapeutique, puis bombardés dans les cellules cutanées.

L'homme du métier appréciera facilement que les doses peuvent varier en fonction du composé spécifique, de la gravité des symptômes et de la sensibilité du sujet aux effets secondaires. Les doses préférées pour un composé donné sont faciles à déterminer pour l'homme de métier, par toutes sortes de moyens.

Les présents procédés trouvent une utilisation dans le traitement de toutes sortes de pathologies différentes faisant intervenir l'activité MPTS, notamment les pathologies faisant intervenir l'activité agrécanase. On s'intéresse en particulier à l'utilisation des présents procédés pour traiter les pathologies caractérisées par la présence de produits de clivage de l'agrécane, en particulier de produits de clivage de l'agrécane de 60 kDa possédant une extrémité N-terminale ARGS. Les maladies spécifiques qui sont caractérisées par la présence de tels procédés comprennent : la polyarthrite rhumatoïde, l'arthrose, l'arthrite infectieuse, l'arthrite goutteuse, le rhumatisme psoriasique, la spondylite, les festons des sportifs, les traumatismes articulaires, les maladies pulmonaires, les fibroses, et analogues.

Par traitement, on entend au moins une amélioration des symptômes associés à la pathologie dont souffre l'hôte, amélioration étant employé dans un sens large pour désigner au moins une réduction de l'ampleur d'un

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para-mètre, par exemple le symptôme associé à la pathologie en cours de traitement, tel que l'hyperphosphatémie. En ce qui le concerne, le traitement englobe aussi les cas où la pathologie, ou du moins les symptômes associés à celle-ci, est complètement inhibée, par exemple où son apparition est empêchée, ou stoppée, par exemple arrêtée, de telle sorte que l'hôte ne souffre plus de sa pathologie, ou au moins des symptômes qui caractérisent la pathologie.

Toutes sortes d'hôtes peuvent être traités conformément aux présents

procédés. Généralement, ces hôtes sont des"mammifères", ce terme étant utilisé de façon large pour décrire des organismes qui sont classés dans la famille des mammifères, y compris les ordres des carnivores (par exemple le chien et le chat), des rongeurs (par exemple la souris, le cobaye et le rat) et des primates (par exemple l'être humain, le chimpanzé et les singes). Dans de nombreux modes de réalisation, les hôtes seront des êtres humains.

Des trousses contenant des doses unitaires de l'agent actif, habituellement en doses orales ou injectables, sont prévues. Dans de telles trousses, en plus des récipients contenant les doses unitaires, on trouvera une notice informative décrivant l'utilisation et les bénéfices concomitants des médicaments dans le traitement d'une pathologie donnée. Les composés préférés et les doses unitaires préférées sont décrits ci-dessus.

Enfin, un objet de la présente invention concerne : (i) Un procédé de sélection pour identifier des agents modulateurs de
MPTS, ledit procédé comprenant : + la mise en contact de protéines MPTS, telles que définies ici, avec un substrat en présence d'un agent modulateur potentiel ; et + la détermination de l'effet dudit agent modulateur sur l'activité de ladite protéine ; (ii) le procédé défini en (i), dans lequel ledit substrat comprend une liaison glu-ala ; (iii) le procédé défini en (ii), dans lequel ledit substrat est un agrécane ou un fragment d'agrécane.

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Par ailleurs, la présente invention a également pour objet un procédé de traitement d'un hôte souffrant d'une maladie associée à l'activité MPTS, spécifiquement dans lequel ladite maladie est caractérisée par la présence de produits de clivage de l'agrécane, ledit procédé comprenant : - l'administration audit hôte d'un agent modulateur de MPTS, spécifique- ment un antagoniste, et l'utilisation d'un agent modulateur de MPTS, susceptible d'être obtenu, ou obtenu, par le procédé décrit ci-dessus, pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'une maladie associée à l'activité MPTS, spécifiquement dans laquelle ladite maladie est caractérisée par la présence de produits de clivage de l'agrécane, telle que l'arthrite.

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EXEMPLES
EXEMPLE 1
On a conçu une série d'acides nucléiques portant 699 gènes de métallo-protéinase connus et des EST nouveaux disponibles dans des bases de données publiques et privées. Ces séquences sur la série ont été sélectionnées par une recherche avec un ensemble de semences de séquences de protéines métallo-protéases connues de toutes espèces. Ces séquences de protéines ont été utilisées pour trouver des séquences correspondantes dans le nucléotide humain au niveau de la protéine (codon). Les séquences redondantes ont été éliminées, les séquences restantes assemblées et groupées, et l'ensemble unique de 699 séquences a été rangé.

La série résultante a été utilisée pour sélectionner des gènes exprimés dans des cultures primaires de chondrocytes. Un bon nombre de métalloprotéinases connues comme étant exprimées par ces cellules ont été identifiées. Cependant, un certain nombre d'EST pour des protéines nouvelles ont aussi été identifiés. En utilisant ces EST pour exploiter ensuite ces bases de données et des protocoles ACP, on a identifié quatre protéines MPTS humaines différentes, à savoir MPTS15, MPTS10, MPTS19 et MPTS20.

EXEMPLE 2
EXPRESSION DE MPTS-10
Un exemple d'un système d'expression de mpts-10 est le système de cellules de mammifère COS-7. La séquence nucléotidique qui code pour mpts-10, qui contient la séquence signal de la sécrétion, est soudée dans un plasmide pcDNA3.1 (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA). On combine 2 microgrammes du plasmide résultant avec de la lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Le mélange est ensuite ajouté à des cellules COS-7, qui sont cultivées dans des boîtes à 6 puits jusqu'à une densité d'environ 90% de confluence. Au bout de 6 heures, du milieu frais est ajouté aux cellules et, au bout de 24 heures, les cellules sont lavées et du milieu frais sans sérum contenant de l'agrécane de bovin (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) est ajouté. Les cellules sont incubées pendant

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48 heures supplé-mentaires. On recueille 500 jj ! de liquide de culture dans chaque puits, et on concentre dix fois. On ajoute ensuite 2 ! JI de chondroitinase ABS et de kératinase (10 ulml, Sigma, St. Louis, MO, USA), et on incube les échan-tillons pendant une nuit à 37 C. Les échantillons sont portés à ébullition dans du tampon de charge d'échantillon SDS-PAGE, soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et transférés sur une membrane en PVDF. On réalise ensuite un transfert de type Western fait avec un antisérum contre un néoépitope produit au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre exemple d'un système permettant l'expression de mpts-10 est le système d'expression à baculovirus. La séquence d'ADN qui contient la séquence codante pour mpts-10 (y compris les séquences qui codent pour la séquence du signal de sécrétion) et qui a été clonée dans le vecteur pcDNA3.1 est modifiée par ACP pour que la séquence codante et le codon d'arrêt de la traduction soient flanqués par Not 1 (côté N-terminal) et Sfi-1 (côté C-terminal). L'amorce utilisée pour l'extrémité N-terminale est GATCGCGGCCGCTATGGTGGACACGTGGCCTCTATGGCTCC et l'amorce pour l'extrémité C-terminale est TGAGGCCTTCAGGGCCGATCACTGTGCAGAGCACTCACCCCAT. Après amplification avec les procédés ACP standard, le fragment est digéré avec

Not 1 et Sfi-1. Le fragment digéré est soudé dans un vecteur PVL1392-U qui a aussi été digéré avec Not 1 et Sfi-1. PVL1392-U est une dérivation du plasmide de transfert du baculovirus, pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA), dans lequel le site de clonage multiple a été modifié pour contenir Not 1 et Sfi-1. Les saillies engendrées par la digestion avec Not 1 et Sfi-1 sont complémentaires des saillies engendrées dans l'ADN amplifié par ACP digéré par Not 1 et Sfi-1. L'ADN soudé est transformé dans des cellules bactériennes et un clone est choisi contenant le plasmide et la séquence de mpts-10 correcte. Ce plasmide est produit et purifié. La séquence de mpts- 10 est transférée dans un vecteur baculovirus par des techniques standard (Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, par David O'Reilly, Lois Miller et Verne Luchow, W. H. Freeman and Co., New York, USA). Cinq préparations virales purifiées sur plaques sont produites à partir de la préparation virale. Des cellules d'insectes Sf9 cultivées en suspension sont

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infectées avec chacune des préparations virales purifiées sur plaque, à une multiplicité de 0,5. Le liquide de culture est récolté à 3 jours après l'infection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St. Louis, MO, USA), à une concentration de 0, 1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite

incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 u/ml) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre procédé d'expression de mpts-10 est le système d'expression dans les drosophiles. Le fragment d'ADN contenant les séquences codant pour mpts-10 et flanqué de Not 1 et Sfi-1 ayant été engendré par ACP (voir ci-dessus) est cloné dans un plasmide Cmk 33. Cmk33 est un plasmide dérivé de pMK33/pMtHy (Li, Bin et al., B/chem. J. (1996) 313,57-64) de sorte que Not 1 et Sfi-1 se trouvent dans le site de clonage. Les saillies engendrées par la digestion de ce plasmide sont compatibles avec les saillies engendrées par l'ADN digéré contenant le fragment mpts-10 (voir cidessus). Un plasmide contenant la séquence correcte de mpts-10 est amplifié et purifié. Des cellules de drosophiles (S2) sont transformées avec

le plasmide par des techniques standard (Li, Bin et a !., oc/pe/T ?.. 7. (1996) 313,57-64). Le liquide de culture est recueilli 2 jours après la transfection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St. Louis, MO, USA), à une concentration de 0,1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 u/ml) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

EXEMPLE 3
EXPRESSION DE MPTS-15
Un exemple d'un système d'expression de mpts-15 est le système de cellules de mammifère COS-7. La séquence nucléotidique qui code pour mpts-15, qui contient la séquence signal de la sécrétion, est soudée dans

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un plasmide pcDNA3. 1 (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA). On combine 2 micro-grammes du plasmide résultant avec de la lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Le mélange est ensuite ajouté à des cellules COS-7, qui sont cultivées dans des boîtes à 6 puits jusqu'à une densité d'environ 90% de confluence. Au bout de 6 heures, du milieu frais est ajouté aux cellules et, au bout de 24 heures, les cellules sont lavées et du milieu frais sans sérum contenant de l'agrécane de bovin (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) est ajouté. Les cellules sont incubées pendant 48 heures supplémentaires. On recueille 500 u) de liquide de culture dans chaque puits, et on concentre dix fois. On ajoute ensuite 2 u) de chondroitinase ABS et de kératinase (10 u/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA), et on incube les échantillons pendant une nuit à 37 C. Les échantillons sont portés à ébullition dans du tampon de charge d'échantillon SDS-PAGE, soumis à une électrophorèse sur gel de polyacryl-amide et transférés sur une membrane en PVDF. On réalise ensuite un trans-fert de type Western fait avec un antisérum contre un néoépitope produit au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre exemple d'un système permettant l'expression de mpts-15 est le système d'expression à baculovirus. La séquence d'ADN qui contient la séquence codante pour mpts-15 (y compris les séquences qui codent pour la séquence du signal de sécrétion) et qui a été clonée dans le vecteur pcDNA3.1 est modifiée par ACP pour que la séquence codante et le codon d'arrêt de la traduction soient flanqués par Not 1 (côté N-terminal) et Sfi-1 (côté C-terminal). L'amorce utilisée pour l'extrémité N-terminale est GATCGCGGCCGCTATGGAAATTTTGTGGAAGACGTTG et l'amorce pour l'extrémité C-terminale est

TGAGGCmCAGGGCCGA Tm AAAGCAAAGTITC (1 (1 GGT. Après amplification avec les procédés ACP standard, le fragment est digéré avec Not 1 et Sfi-1. Le fragment digéré est soudé dans un vecteur PVL1392-U qui a aussi été digéré avec Not 1 et Sfi-1. PVL1392-U est une dérivation du plasmide de transfert du baculovirus, pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA), dans lequel le site de clonage multiple a été modifié pour contenir

Not 1 et Sfi-1. Les saillies engendrées par la digestion avec Not 1 et Sfi-1 sont complémentaires des saillies engendrées dans l'ADN amplifié par ACP

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digéré par Not 1 et Sfi-1. L'ADN soudé est transformé dans des cellules bactériennes et un clone est choisi contenant le plasmide et la séquence de mpts-15 correcte. Ce plasmide est produit et purifié. La séquence de mpts- 15 est transférée dans un vecteur baculovirus par des techniques standard (Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual, par David O'Reilly, Lois Miller et Verne Luchow, W. H. Freeman and Co., New York, USA). Cinq préparations virales purifiées sur plaques sont produites à partir de la préparation virale. Des cellules d'insectes Sf9 cultivées en suspension sont infectées avec chacune des préparations virales purifiées sur plage, à une multiplicité de 0,5. Le liquide de culture est récolté à 3 jours après l'infection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St. Louis, MO, USA), à une concentration de 0,1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 u/ml) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre procédé d'expression de mpts-15 est le système d'expression dans les drosophiles. Le fragment d'ADN contenant les séquences codant pour mpts-15 et flanqué de Not 1 et Sfi-1 ayant été engendré par ACP (voir ci-dessus) est cloné dans un plasmide Cmk 33. Cmk33 est un plasmide dérivé de pMK33/pMtHy (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996) 313,57-64) de sorte que Not 1 et Sfi-1 se trouvent dans le site de clonage. Les saillies engendrées par la digestion de ce plasmide sont compatibles avec les saillies engendrées par l'ADN digéré par Not 1 et Sfi 1 contenant le fragment mpts-15 (voir ci-dessus). Un plasmide contenant la séquence correcte de mpts-15 est amplifié et purifié. Des cellules de drosophiles (S2) sont transformées avec le plasmide par des techniques standard (Li, Bin et

al., Biochem, J. (1996) 313, 57-64). Le liquide de culture est recueilli 2 jours après la transfection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St. Louis, MO, USA), à une concentration de 0,1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 u/ml) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés

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par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

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EXEMPLE 4 EXPRESSION DE MPTS-19
Un exemple d'un système d'expression de mpts-19 est le système de cellules de mammifère COS-7. La séquence nucléotidique qui code pour

mpts-19, qui contient la séquence signal de la sécrétion et le codon d'arrêt C-terminal, est soudée dans un plasmide pcDNA3.1 (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA). On combine 2 microgrammes du plasmide résultant avec de la lipo-fectamine (Life Technologies, Rocheville, MD, USA). Le mélange est ensuite ajouté à des cellules COS-7, qui sont cultivées dans des boîtes à 6 puits jusqu'à une densité d'environ 90% de confluence. Au bout de 6 heures, du milieu frais est ajouté aux cellules et, au bout de 24 heures, les cellules sont lavées et du milieu frais sans sérum contenant de l'agrécane de bovin (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) est ajouté. Les cellules sont incubées pendant 48 heures supplémentaires. On recueille 500 ! JI de liquide de culture dans chaque puits, et on concentre dix fois. On ajoute ensuite 2 pl de chondroitinase ABS et de kératinase (10 u/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA), et on incube les échantillons pendant une nuit à 37 C. Les échantillons sont portés à ébullition dans du tampon de charge d'échantillon SDS-PAGE, soumis à une électro-phorèse sur gel de polyacrylamide et transférés sur une membrane en PVDF. On réalise ensuite un transfert de type Western fait avec un antisérum contre un néoépitope produit au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre exemple d'un système permettant l'expression de mpts-19 est le système d'expression à baculovirus. La séquence d'ADN qui contient la séquence codante pour mpts-19 (y compris les séquences qui codent pour la séquence du signal de sécrétion) et qui a été clonée dans le vecteur pcDNA3.1 est modifiée par ACP pour que la séquence codante et le codon d'arrêt de la traduction soient flanqués par Not 1 (côté N-terminal) et Sfi-1 (côté C-terminal). L'amorce utilisée pour l'extrémité N-terminale est GATCGCGGCCGCTATGCCCGGCGGCCCCAGTCCCCG et l'amorce pour l'extrémité C-terminale est TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTCAGCGGCGGGCAACCCGCTG. Après amplification avec les procédés ACP standard, le fragment est digéré avec

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Not 1 et Sfi-1. Le fragment digéré est soudé dans un vecteur PVL1392-U qui a aussi été digéré avec Not 1 et Sfi-1. PVL1392-U est une dérivation du plasmide de transfert du baculovirus, pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA), dans lequel le site de clonage multiple a été modifié pour contenir Not 1 et Sfi-1. Les saillies engendrées par la digestion avec Not 1 et Sfi-1 sont complémentaires des saillies engendrées dans l'ADN amplifié par ACP digéré par Not 1 et Sfi-1. L'ADN soudé est transformé dans des cellules bactériennes et un clone est choisi contenant le plasmide et la séquence de mpts-19 correcte. Ce plasmide est produit et purifié. La séquence de mpts- 19 est transférée dans un vecteur baculovirus par des techniques standard

(Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual par David O'Reilly, Lois Miller et Verne Luchow, W. H. Freeman and Co., New York, USA). Cinq préparations virales purifiées sur plages sont produites à partir de la préparation virale. Des cellules d'insectes Sf9 cultivées en suspension sont infectées avec chacune des préparations virales purifiées sur plage, à une multiplicité de 0,5. Le liquide de culture est récolté 3 jours après l'infection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St. Louis, MO, USA), à une concentration de 0,1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 u/mt) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre procédé d'expression de mpts-19 est le système d'expression dans les drosophiles. Le fragment d'ADN contenant les séquences codant pour mpts-19 et flanqué de Not 1 et Sfi-1 ayant été engendré par ACP (voir ci-dessus) est cloné dans un plasmide Cmk 33. Cmk33 est un plasmide dérivé de pMK33/pMtHy (Li, Bin et ai., Biochem. J. (1996) 313,57-64) de sorte que Not 1 et Sfi-1 se trouvent dans le site de clonage. Les saillies engendrées par la digestion de ce plasmide avec Not 1 et Sfi 1 sont

compatibles avec les saillies engendrées par l'ADN digéré contenant le fragment mpts-19 (voir ci-dessus). Un plasmide contenant la séquence correcte de mpts-19 est amplifié et purifié. Des cellules de drosophiles (S2) sont transformées avec le plasmide par des techniques standard (Li, Bin et

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al., Biochem. J. (1996) 313, 57-64). Le liquide de culture est recueilli 2 jours après la transfection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St.

Louis, MO, USA), à une concentration de 0,1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 u/ml) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

EXEMPLE 5
EXPRESSION DE MPTS-20
Un exemple d'un système d'expression de mpts-20 est le système de cellules de mammifère COS-7. La séquence nucléotidique qui code pour mpts-10, qui contient la séquence signal de la sécrétion et le codon d'arrêt C-terminal, est soudée dans un plasmide pcDNA3.1 (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA). On combine 2 microgrammes du plasmide résultant avec de la lipofectamine (Life Technologies, Rockeville, MD, USA). Le mélange est ensuite ajouté à des cellules COS-7, qui sont cultivées dans des boîtes à 6 puits jusqu'à une densité d'environ 90% de confluence. Au bout de 6 heures, du milieu frais est ajouté aux cellules et, au bout de 24 heures, les cellules sont lavées et du milieu frais sans sérum contenant de l'agrécane de bovin (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) est ajouté. Les cellules sont incubées pendant 48 heures supplémentaires. On recueille 500 u ! de liquide de culture dans chaque puits, et on concentre dix fois. On ajoute ensuite 2 ul de chondroitinase ABS et de kératinase (10 u/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA), et on incube les échantillons pendant une nuit à 37 C. Les échantillons sont portés à ébullition dans du tampon de charge d'échantillon SDS-PAGE, soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et transférés sur une membrane en PVDF. On réalise ensuite un transfert de type Western fait avec un antisérum contre un néoépitope produit au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre exemple d'un système permettant l'expression de mpts-20 est le système d'expression à baculovirus. La séquence d'ADN qui contient

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la séquence codante pour mpts-20 (y compris les séquences qui codent ee pour la séquence du signal de sécrétion) et qui a été clonée dans le vecteur pcDNA3.1 est modifiée par ACP pour que la séquence codante et le codon d'arrêt de la traduction soient flanqués par Not 1 (côté N-terminal) et Sfi-1 (côté C-terminal). L'amorce utilisée pour l'extrémité N-terminale est GATCGCGGCCGCTGCGCTGTGATGAGTGTGCCTG et l'amorce pour l'extrémité C-terminale est TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTTATAAAGGCCTTGAGAAAACAG. Après amplification avec les procédés ACP standard, le fragment est digéré avec Not 1 et Sfi-1. Le fragment digéré est soudé dans un vecteur PVL1392-U qui a aussi été digéré avec Not 1 et Sfi-1. PVL1392-U est une dérivation du plasmide de transfert du baculovirus, pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA), dans lequel le site de clonage multiple a été modifié pour contenir Not 1 et Sfi-1. Les saillies engendrées par la digestion avec Not 1 et Sfi-1 sont complémentaires des saillies engendrées dans l'ADN amplifié par ACP digéré par Not 1 et Sfi-1. L'ADN soudé est transformé dans des cellules bactériennes et un clone est choisi contenant le plasmide et la séquence de mpts-20 correcte. Ce plasmide est produit et purifié. La séquence de mpts- 20 est transférée dans un vecteur baculovirus par des techniques standard

(Baculovirus Expression Vectors : A Laboratoty Manual, par David O'Reilly, Lois Miller et Verne Luchow, W. H. Freeman and Co., New York, USA). Cinq préparations virales purifiées sur plages sont produites à partir de la préparation virale. Des cellules d'insectes Sf9 cultivées en suspension sont infectées avec chacune des préparations virales purifiées sur plage, à une multiplicité de 0,5. Le liquide de culture est récolté 3 jours après l'infection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St. Louis, MO, USA), à une

concentration de 0, 1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 u/m !) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

Un autre procédé d'expression de mpts-20 est le système d'expression dans les drosophiles. Le fragment d'ADN contenant les séquences codant

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pour mpts-20 et flanqué de Not 1 et Sfi-1 ayant été engendré par ACP (voir ci-dessus) est cloné dans un plasmide Cmk 33. Cmk33 est un plasmide dérivé de pMK33/pMtHy (Li, Bin et aL, Diochem. @em. J. (1996) 313,57-64) de sorte que Not 1 et Sfi-1 se trouvent dans le site de clonage. Les saillies engendrées par la digestion de ce plasmide avec Not 1 et Sfi 1 sont compatibles avec les saillies engendrées par l'ADN digéré contenant le fragment mpts-20 (voir ci-dessus). Un plasmide contenant la séquence correcte de mpts-20 est amplifié et purifié. Des cellules de drosophiles (S2) sont transformées avec le plasmide par des techniques standard (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996) 313,57-64). Le liquide de culture est recueilli 2 jours après la transfection. Ces échantillons sont soumis à une analyse de l'activité agrécanase par incubation avec de l'agrécane de bovin (Sigma, St.

Louis, MO, USA), à une concentration de 0, 1 mg/ml. Les échantillons sont ensuite incubés avec à la fois de la chondroitinase ABC et de la kératinase (10 p/ml) à 37 C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite examinés par transfert de type Western avec un antisérum qui réagit avec un néoépitope engendré au moment du clivage de l'agrécane par l'agrécanase.

EXEMPLE 6
PURIFICATION DE mpts-10,15, 19 ET 20 :
Les mpts-10,15, 19 et 20 sont séparés du liquide de culture des systèmes d'expression décrits ci-dessus par des méthodes chromatographiques. Par exemple, le liquide de culture est ajusté en ce qui concerne son pH, filtré, puis chargé sur une colonne garnie de sulfopropylSepharose FF (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Après lavage avec un tampon constitué de 10 mM de Carl2, 0,1 M de Nacht et 0, 05% de Brij35 à un pH conduisant à la rétention des mpts sur la colonne, les mpts sont élués avec un gradient de NaCl de 0,1 M à 1,0 M. Les fractions issues de la colonne sont soumises à une analyse de la présence d'une activité agrécanase, comme décrit ci-dessus, et notées. Pour la purification, on peut aussi utiliser une colonne garnie de phényl-Sepharose ou de Sephacryl S-200.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Protéine MPTS choisie dans le groupe constitué par MPTS-15, MPTS-10, MPTS-19 et des protéines qui ont une séquence en acides aminés présentant une identité d'au moins 60 % avec SEQ ID NO 1,3 ou 5, caractérisée en ce que ladite protéine a une activité agrécanase.

2. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il possède une séquence codant

pour une protéine MPTS selon la revendication 1.

3. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il possède une séquence nucléotidique identique à ou présentant une identité d'au moins 90 % avec une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID ? : 2,4 et 6.

4. Protéine codée par un acide nucléique tel que défini dans la revendication 3 et présentant une activité agrécanase.

5. Cassette d'expression comprenant une région d'initiation de la transcription fonctionnelle dans un hôte d'expression, une séquence nucléotidique selon la revendication 2 ou 3 sous régulation de la transcription de ladite région d'initiation de la transcription, et une région d'arrêt de la transcription fonctionnelle dans ledit hôte d'expression.

6. Cellule comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5 en tant que partie d'un élément extrachromosomique ou intégrée dans le génome d'une cellule hôte sous l'effet de l'introduction de ladite cassette d'expression dans ladite cellule hôte.

7. Anticorps monoclonal se liant spécifiquement à une protéine MPTS selon la revendication 1.

8. Procédé de production d'une protéine MPTS, caractérisé en ce qu'il comprend : - la culture d'une cellule selon la revendication 6, ce qui permet d'exprimer ladite protéine ; et - l'isolement de ladite protéine pour la séparer des autres protéines.

9. Protéine MPTS selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est produite par le procédé de la revendication 8.

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10. Procédé de sélection pour identifier des agents modulateurs de MPTS, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact d'une protéine MPTS selon la revendication 1 avec un substrat en présence d'un agent modulateur potentiel ; et - la détermination de l'effet dudit agent modulateur sur l'activité de ladite protéine.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit substrat comprend une liaison glu-ala.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit substrat est l'agrécane ou un fragment d'agrécane.