FR2818982A1 - Inhibiteur specifique du systeme ubiquitine-proteasome et applications therapeutiques correspondantes - Google Patents
Inhibiteur specifique du systeme ubiquitine-proteasome et applications therapeutiques correspondantes Download PDFInfo
- Publication number
- FR2818982A1 FR2818982A1 FR0017358A FR0017358A FR2818982A1 FR 2818982 A1 FR2818982 A1 FR 2818982A1 FR 0017358 A FR0017358 A FR 0017358A FR 0017358 A FR0017358 A FR 0017358A FR 2818982 A1 FR2818982 A1 FR 2818982A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- ubiquitin
- specific inhibitor
- inhibitor according
- inhibitor
- proteasome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims abstract description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 claims description 10
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 claims description 6
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims description 4
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 4
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 12
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 4
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 2
- FMYKJLXRRQTBOR-BZSNNMDCSA-N acetylleucyl-leucyl-norleucinal Chemical compound CCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(C)=O FMYKJLXRRQTBOR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 108010091545 acetylleucyl-leucyl-norleucinal Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- ZPLVYYNMRMBNGE-UHFFFAOYSA-N Eponemycin Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CO)C(=O)NC(CC(C)=C)C(=O)C1(CO)CO1 ZPLVYYNMRMBNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- DAQAKHDKYAWHCG-UHFFFAOYSA-N Lactacystin Natural products CC(=O)NC(C(O)=O)CSC(=O)C1(C(O)C(C)C)NC(=O)C(C)C1O DAQAKHDKYAWHCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000012275 Ubiquitin domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002897 Ubiquitin domains Proteins 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZPLVYYNMRMBNGE-TWOQFEAHSA-N eponemycin Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)=C)C(=O)[C@@]1(CO)CO1 ZPLVYYNMRMBNGE-TWOQFEAHSA-N 0.000 description 1
- 108700002672 epoxomicin Proteins 0.000 description 1
- DOGIDQKFVLKMLQ-JTHVHQAWSA-N epoxomicin Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N(C)C(C)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)[C@@]1(C)CO1 DOGIDQKFVLKMLQ-JTHVHQAWSA-N 0.000 description 1
- 230000031376 exit from mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- DAQAKHDKYAWHCG-RWTHQLGUSA-N lactacystin Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CSC(=O)[C@]1([C@@H](O)C(C)C)NC(=O)[C@H](C)[C@@H]1O DAQAKHDKYAWHCG-RWTHQLGUSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006663 ubiquitin-proteasome pathway Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Psychology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
L'invention concerne un inhibiteur spécifique du système ubiquitine-protéasome caractérisé en ce qu'il est constitué par la fusion d'au moins une molécule d'ubiquitine mutée présentant un acide aminé en position 48 qui n'est pas la lysine, ladite molécule d'ubiquitine mutée étant destinée à agir comme un terminateur de chaîne de polyubiquitination, et d'au moins un module d'incorporation cellulaire permettant la pénétration dudit inhibiteur dans une cellule.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
Inhibiteur spécifique du système ubiquitine-protéasome et applications thérapeutiques correspondantes.
L'invention concerne le domaine de la biochimie, ainsi que le domaine pharmaceutique.
Plus précisément, l'invention concerne un nouvel inhibiteur du système ubiquitine-protéasome.
La mise en route des principaux progammes cellulaires, comme la reprise de division, la sortie de mitose, l'entrée en apoptose, en meïose, la différenciation cellulaire, la réponse immunitaire, etc., est contrôlée par la dégradation spécifique de protéines cellulaires régulatrices. La dégradation protéique spécifique est principalement assurée dans la cellule par un système multimoléculaire complexe : la voie"ubiquitine-protéasome". Dans ce système, les protéines conjuguées (liées de manière covalente) à des chaînes de polyubiquitine par des enzymes ubiquitine-ligases, sont spécifiquement dégradées par le complexe protéolytique protéasome 26S. Des déréglements de ce système seraient à l'origine de grandes pathologies, comme le cancer ou les dégénérescences tissulaires.
Selon l'état de la technique la démonstration la plus simple qu'une protéine donnée est dégradée par le protéasome 26S consiste à vérifier si la concentration de cette protéine augmente dans les cellules traitées par un inhibiteur de protéasome Un tel inhibiteur inhibe l'activité protéolytique de type trypsique ou chymotrypsique du protéasome. Les inhibiteurs de protéasomes connues appartiennent à plusieurs classes de molécules : des di ou tripeptides modifiés, des peptides aldéhydes, N-acétyl-leucyl-leucyl-norleucinal (ALLN), ou des composés non peptidiques naturels issus de micro-organismes comme la lactacystine et ses dérivés, les agents anti-tumoraux contenant de l'époxyketone (epoxomicine, eponemycine) etc...
Toutefois, ce test soufre de deux inconvénients majeurs.
En premier lieu, il ne prouve pas directement que la protéine en question est une cible de conjugaison d'ubiquitine.
<Desc/Clms Page number 2>
En second lieu et surtout, il ne prouve pas vraiment que sa dégradation est assurée par le protéasome car la plupart des drogues appelées"inhibiteurs du protéasome"ne sont en réalité pas complètement spécifiques de cette protéase.
On sait par ailleurs que l'introduction d'ubiquitine mutante dépourvue de la lysine 48 permettant sa conjugaison interromp la polymérisation des chaînes d'ubiquitine et ainsi stabilise les substrats. Une telle stabilisation protéique par l'ubiquitine K48-substituée prouve que cette protéine est bien une cible non seulement du protéasome, mais plus précisément du système ubiquitineprotéasome.
On notera que la formation de chaînes de polyubiquitine peut impliquer plusieurs résidus lysine de l'ubiquitine (Kl l, K29, K48 et K63), mais que seules les chaînes multiubiquitine liées par la lysine 48 ont été montrées capables d'induire la dégradation protéique par le protéasome. Les substrats du système ubiquitine-protéasome ne sont donc dégradés par le protéasome que s'ils sont conjugués à des chaînes d'ubiquitines associées par des liaisons peptidiques G76K48. La substitution du résidu K48 de l'ubiquitine empêche la ligation d'autres monomères d'ubiquitine par liaison G76-K48, ce qui entraîne la terminaison des chaînes polyubiquitine. Donc, au delà d'une certaine concentration dans les cellules, l'ubiquitine K48-substitutée agit comme un inhibiteur specifique du système ubiquitine-protéasome et entraîne la stabilisation artificielle de ses susbstrats.
Toutefois, l'introduction d'ubiquitine mutée dans la cellule pose de nombreux problèmes puisqu'elle fait intervenir des techniques complexes comme l'utilisation de transgène ou la perméabilisation chimique membranaire. En pratique, l'usage de l'ubiquitine K48 substituée à jusqu'ici été réservé à des expériences de transfection cellulaire, ou à des tests d'ubiquitination in vitro ou en cellules perméabilisées par des solvants membranaires.
Le principal objectif de la présente invention est de proposer un nouvel inhibiteur du système ubiquitine-protéasome qui soit vraiment spécifique de ce système.
<Desc/Clms Page number 3>
Notamment, un objectif de la présente invention est de décrire un tel inhibiteur permettant de prouver qu'une protéine donnée est bien une cible non seulement du protéasome mais plus précisément du système ubiquitineprotéasome.
Encore un autre objectif de la présente invention est de proposer un tel inhibiteur qui puisse être utilisée sur cultures primaires et in vivo.
Ces objectifs sont atteints grâce à l'invention qui concerne un inhibiteur spécifique du système ubiquitine-protéasome caractérisé en ce qu'il est constitué par la fusion d'au moins une molécule d'ubiquitine mutée présentant un acide aminé en position 48 qui n'est pas la lysine, ladite molécule d'ubiquitine mutée étant destinée à agir comme un terminateur de chaîne de polyubiquitination, et d' au moins un module d'incorporation cellulaire permettant la pénétration dudit inhibiteur dans une cellule.
L'inhititeur spécifique du système ubiquitine-proteasome qui constitue l'invention distingue le présent produit des drogues anti-protéasome, qui peuvent inhiber des activités protéolytiques non reliées à l'ubiquitine.
Cet inhibiteur constitue un outil pour déterminer si la dégradation d'une protéine donnée est spécifiquement causée par le système ubiquitine-protéasome. La stabilisation expérimentale de protéines par un traitement avec des inhibiteurs de protéasome, est classiquement considérée comme une démonstration que ces protéines sont dégradées par le protéasome. Cependant, ce test n'indique pas si les protéines en question sont effectivement des cibles de ligation de l'ubiquitine. La stabilisation et la conjugaison d'une protéine par le présent produit constituent une démonstration que cette protéine implique bien la voie ubiquitine-protéasome.
Le module d'incorporation pourra être constitué différemment selon les modes de réalisation. Il assurera l'introduction de l'inhibiteur à l'intérieur des cellules et permettra de s'affranchir de manipulations compliquées devant être utilisées, selon l'état de la technique, comme l'introduction de transgènes dans les cellules ou la perméabilisation chimique membranaire.
On connaît dans l'état de la technique plusieurs molécules susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la présente invention pour constituer le module d'incorporation.
<Desc/Clms Page number 4>
Ainsi ce module pourra notamment être constitué par : - un peptide hydrophobe cell-permeable peptide import (CPPI) selon Lin et al. (J. Biol. chem. 270, ppl4255-14258, 1995), - un peptide dérivé du domaine de liaison à l'ADN de facteurs de transcription à homéoboîtes selon Derossi et al. (Trends Cell. Biol. 8, pp84-87, 1998), - la protéine Tat du virus du SIDA (HIV) selon Frankel and Pabo, (Cell 55, ppll89-1193) 1988 ; - la protéine VP22 du virus HSV-1, selon Elliott and O'Hare, 1997).
Lorsque le mécanisme d'action moléculaire de ces peptides naturels d'incorporation sera mieux compris, la conception raisonnée de nouveaux petptides de séquences artificielles possédant cette activité pourra également être envisagée.
La fusion de l'ubiquitine mutée au module d'incorporation permet à l'inhibiteur selon l'invention d'être utilisé en cellules vivantes non transfectables (cultures primaires) et in vivo.
Préférentiellement, ledit polypeptide d'incorporation est un polypeptide tel que la pénétratine-1, appartenant à la famille des homéoboîtes citée ci-dessus.
Avantageusement ledit module d'incorporation est greffé à l'extrémité NH2 de ladite molécule d'ubiquitine.
Selon une variante de l'invention, ledit inhibiteur comprend de plus au moins un module d'étiquetage.
Un tel module d'étiquetage a pour fonction d'assurer deux fonctions, à savoir :-faciliter la purification du substrat, - détecter et/ou faciliter la purification des protéines intracellulaires substrats de ligation de l'ubiquitine, conjuguées au produit. La reconnaissance du produit à travers le module d'étiquetage plutôt que le module ubiquitine lui-même, évite toute confusion avec les molécules d'ubiquitine normales endogènes ainsi qu'avec les "domaines ubiquitine"rencontrés dans de nombreuses protéines cellulaires.
Cette propriété offre de nombreuses possibilités expérimentales : comme par exemple vérifier si une protéine candidate est bien ubiquitinée en cellules dans
<Desc/Clms Page number 5>
des conditions physiologiques données, ou bien d'identifier tous les substrats de ligation à l'ubiquitine dans des conditions physiologiques données.
On notera que l'intégration d'un tel module d'étiquetage dans l'inhibiteur n'est absolument pas obligatoire. Ainsi, si le module d'incorporation choisi est une molécule absente des cellules normales, il peut servir également de module d'étiquetage.
Préférentiellement, ce module d'étiquetage est un polypetide tel la polyhistidine.
Avantageusement ledit module d'étiquetage est greffé à l'extrémité NH2 de ladite molécule d'ubiquitine. On notera que la place respective des domaines d'incorporation et d'étiquetage n'est pas importante, du moment que le domaine de translocation fonctionne.
Le greffage du module d'incorporation cellulaire et du module d'étiquetage à l'extrémité NH2 de l'ubiquitine K48 substituée n'handicape pas son activité de conjugaison.
En plus de sa fonction de base d'inhibiteur du système ubiquitineprotéasome, cet inhibiteur constitue un outil très utile pour de nombreux protocoles expérimentaux d'étude de l'ubiquitination in vivo, et la recherche des protéines dégradées par le système ubiquitine-protéasome.
Cet inhibiteur pourra notamment être utilisé pour : - rechercher si une protéine candidate X est détruite ou non par le système ubiquitine-protéasome dans des cellules en culture ou dans l'organisme lors de l'induction d'une activité cellulaire particulière ; - rechercher des protéines sur la base de leur ubiquitination lors de l'induction d'une activité cellulaire.
Lorsque l'inhibiteur selon l'invention intégrera un module d'incorporation et un module d'étiquetage constitués tous les deux par des polypeptides, cet inhibiteur pourra être synthétisé comme une protéine dans des systèmes d'expression procaryotes ou eucaryotes appropriés. Une molécule similaire mais contenant la version sauvage de l'ubiquitine (K48 non substituée) devra alors être préférentiellement produite en parallèle afin de servir de témoin.
L'inhibiteur selon l'invention est applicable sur des cellules pas ou peu transfectables : certaines lignées cellulaires, cellules normales en culture primaire ou dans des organismes vivants. L'action du produit ne nécessite ni modification
<Desc/Clms Page number 6>
génétique des cellules, ni perméabilisation membranaire, ce qui élargit son champ d'application.
L'inhibiteur selon l'invention peut constituer un outil thérapeutique contre les pathologies liées au système ubiquitine-protéasome. Il est en effet raisonnable de penser que cet inhibiteur peut reproduire les effets cliniques des inhibiteurs avec une spécificité accrue pour le système ubiquitine. De nombreux exemples d'applications possibles des inhibiteurs du système ubiquitine protéasome sont donnés dans la littérature scientifique : agents anti-cancéreux, agents anti-inflammatoires, agents de traitement de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson...
On notera également que l'inhibiteur selon l'invention permet la détection, la purification et l'identification des protéines cellulaires substrats du système ubiquitine-protéasome dans des conditions physiologiques données, la ligation du présent produit sur des protéines par les ubiquitine-ligases induit à la fois leur stabilisation et leur étiquetage par des molécules exogènes. Ces étiquettes peuvent alors être utilisées comme des hameçons moléculaires pour révéler et/ou purifier sélectivement des protéines substrats. Les protéines ainsi purifiées peuvent ensuite être identifiées par des techniques de protéomique.
L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle présente seront plus facilement compris grâce à la description qui va suivre d'une mode de réalisation de celle-ci donnée en référence aux dessins, dans lesquels : - la figure 1 représente schématiquement un inhibiteur spécifique (I) du système ubiquitine protéasome selon la présente invention ;
- la figure 2 représente schématiquement une chaîne polyubiquitinique impliquée dans la reconnaissance par le protéasome 26S ; - la figure 3 représente différentes étapes d'un procédé mettant en oeuvre l'inhibiteur spécifique (I) et visant à déterminer si une protéine donnée X est détruite ou non par le système ubiquitine-protéasome ; - la figure 4 représente schématiquement un film radiographique obtenu lors d'un test Western Blot à l'issue d'un tel procédé ; - la figure 5 représente différentes étapes d'un procédé mettant en oeuvre l'inhibiteur spécifique (I) et visant à rechercher des protéines nouvelles sur la base de leur ubiquitination ; et, - la figure 6 représente schématiquement de plaques d'électrophorèse obtenues à l'issue d'un tel procédé
- la figure 2 représente schématiquement une chaîne polyubiquitinique impliquée dans la reconnaissance par le protéasome 26S ; - la figure 3 représente différentes étapes d'un procédé mettant en oeuvre l'inhibiteur spécifique (I) et visant à déterminer si une protéine donnée X est détruite ou non par le système ubiquitine-protéasome ; - la figure 4 représente schématiquement un film radiographique obtenu lors d'un test Western Blot à l'issue d'un tel procédé ; - la figure 5 représente différentes étapes d'un procédé mettant en oeuvre l'inhibiteur spécifique (I) et visant à rechercher des protéines nouvelles sur la base de leur ubiquitination ; et, - la figure 6 représente schématiquement de plaques d'électrophorèse obtenues à l'issue d'un tel procédé
<Desc/Clms Page number 7>
Selon le présent mode de réalisation, l'inhibiteur spécifique de système ubiquitine-protéasome (I) représenté schématiquement à la figure 1, est constitué par une protéine résultant de la fusion d'un module d'incorporation constitué par la pénétratine-1 (1), d'un module d'étiquetage constitué par la polyhistidine (2), et d'ubiquitine mutée en position 48 (3).
Cette molécule chimérique peut être obtenue par génie génétique à partir de gènes chimériques insérés dans des vecteurs d'expression en système procaryote (par exemple en bactéries) ou eucaryote (par exemple en baculovirus), en utilisant les signaux d'initiation de la transcription et de la traduction appropriés. La purification des protéines recombinantes est ensuite effectuée par affinité pour des ligands de la polyhistidine ou de la pénétratine 1.
Une protéine recombinante servant de témoin (T) est réalisée de la même manière mais en utilisant une ubiquitine sauvage possédant une lysine en position 48.
Deux exemples de mise en oeuvre de l'inhibiteur spécifique (I) ainsi réalisés sont donnés ci-après.
Exemple 1
Dans ce premier exemple, l'inhibiteur décrit ci-dessus (I) est utilisé pour déterminer si une protéine candidate X est détruite par le système ubiquitineprotéasome dans des cellules en culture lors de l'induction d'une activité cellulaire particulière.
Dans ce premier exemple, l'inhibiteur décrit ci-dessus (I) est utilisé pour déterminer si une protéine candidate X est détruite par le système ubiquitineprotéasome dans des cellules en culture lors de l'induction d'une activité cellulaire particulière.
En référence à la figure 3, on procède pour ce faire en plusieurs étapes.
Lors d'une première étape on procède à l'incubation d'une partie A d'une culture cellulaire avec le témoin (T) et à l'incubation d'une autre partie B de cette même culture avec l'inhibiteur spécifique (1).
On divise ensuite chaque population cellulaire A et B en deux sous-parties Al, A2 et B 1, B2.
On induit l'activité cellulaire étudiée dans les sous-parties A2 et N2 et on ne l'induit pas dans les sous parties Al et B 1. L'induction est symbolisée sur la figure 3 par le signe"+"tandis que l'absence d'induction est symbolisée par le signe"-".
Lors d'une troisième étape, on extrait la fraction protéique de chaque souspartie.
Enfin, lors d'une quatrième étape, on détecte la protéine X, par exemple par la technique du"western-blot".
<Desc/Clms Page number 8>
Une représentation de la plaque chromatographique obtenue à l'issue de la quatrième étape est montrée à la figure 4. Sur cette plaque, on peut voir que : - la protéine X est présente dans les populations Al et BI sur lesquelles l'activité cellulaire étudiée n'a pas été induite ; - la protéine X n'est presque plus présente dans la population A2 où l'activité cellulaire étudiée a été induite en présence du témoin (T) ; - la protéine X et une autre protéine de plus haut poids moléculaire est présente dans la population BI où l'activité cellulaire étudiée a été induite en présence de l'inhibiteur (1).
Les résultats obtenus pour la population B2 montrent que l'induction de l'activité cellulaire étudiée s'accompagne bien d'une dégradation de la protéine X par le système ubiquitine-protéasome, et les résultats obtenus pour la population A2 montrent que la conjugaison de la protéine X avec une ubiquitine normale polymérisable en chaînes K48-G76, entraîne sa dégradation.
Exemple 2
Dans ce second exemple, l'inhibiteur spécifique (I) a été utilisé pour rechercher des protéines sur la base de leur ubiquitination lors de l'induction d'une activité cellulaire.
Dans ce second exemple, l'inhibiteur spécifique (I) a été utilisé pour rechercher des protéines sur la base de leur ubiquitination lors de l'induction d'une activité cellulaire.
Il est en effet intéressant de pouvoir identifier les protéines dégradées par le système ubiquitine-protéasome dans de nombreuses situations physiologiques afin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
En référence à la figure 5, le procédé proposé comprend les étapes suivantes consistant à administrer l'inhibiteur (I) sur le modèle d'étude sélectionné (cellules en culture, culture organotypique, injection stéréotaxique dans l'organisme), à. induire dans un premier cas naturellement (cas 1) et dans un second cas expérimentalement (cas 2) le changement physiologique étudié, à extraire les protéines cellulaires à partir des deux situations (1 et 2), à comparer et à sélectionner par affinité au module d'étiquetage des protéines conjuguées à l'inhibiteur, à séparer des protéines sélectionnées par électrophorèse en deux dimensions, et à rechercher des spots différentiels entre les deux situations physiologiques à comparer.
La figure 6 représente les résultats d'électrophorèse en deux dimensions dans les cas 1 et 2, les spots entourés dans le cas 2 correspondent aux protéines ubiquitinées lors de l'activité cellulaire étudiée.
Claims (12)
- REVENDICATIONS 1. Inhibiteur spécifique du système ubiquitine-protéasome caractérisé en ce qu'il est constitué par la fusion d'au moins une molécule d'ubiquitine mutée présentant un acide aminé en position 48 qui n'est pas la lysine, ladite molécule d'ubiquitine mutée étant destinée à agir comme un terminateur de chaîne de polyubiquitination, et d'au moins un module d'incorporation cellulaire permettant la pénétration dudit inhibiteur dans une cellule.
- 2. Inhibiteur spécifique selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est un polypeptide.
- 3. Inhibiteur spécifique selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est la pénétratine-1.
- 4. Inhibiteur spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comprend de plus au moins un module d'étiquetage facilitant sa purification.
- 5. Inhibiteur spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est un polypeptide.
- 6. Inhibiteur spécifique selon la revendication 5 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est la polyhistidine.
- 7. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement du cancer.
- 8. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament anti-inflammatoire.
- 9. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Parkinson.
- 10. Utilisation dudit inhibiteur spécifique selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement de la maladie d'Alzheimer.<Desc/Clms Page number 10>
- 11. Utilisation de l'inhibiteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour rechercher si une protéine candidate X est détruite ou non par le système ubiquitine-protéasome dans des cellules en culture ou dans l'organisme lors de l'induction d'une activité cellulaire particulière.
- 12. Utilisation de l'inhibiteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour rechercher des protéines sur la base de leur ubiquitination lors de l'induction d'une activité cellulaire.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0017358A FR2818982B1 (fr) | 2000-12-29 | 2000-12-29 | Inhibiteur specifique du systeme ubiquitine-proteasome et applications therapeutiques correspondantes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0017358A FR2818982B1 (fr) | 2000-12-29 | 2000-12-29 | Inhibiteur specifique du systeme ubiquitine-proteasome et applications therapeutiques correspondantes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2818982A1 true FR2818982A1 (fr) | 2002-07-05 |
| FR2818982B1 FR2818982B1 (fr) | 2003-10-31 |
Family
ID=8858451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0017358A Expired - Fee Related FR2818982B1 (fr) | 2000-12-29 | 2000-12-29 | Inhibiteur specifique du systeme ubiquitine-proteasome et applications therapeutiques correspondantes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2818982B1 (fr) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000062067A1 (fr) * | 1999-02-28 | 2000-10-19 | Washington University | Nouvelles molecules de transduction et leurs procedes d'utilisation |
-
2000
- 2000-12-29 FR FR0017358A patent/FR2818982B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000062067A1 (fr) * | 1999-02-28 | 2000-10-19 | Washington University | Nouvelles molecules de transduction et leurs procedes d'utilisation |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| AUSTIN, KATHY J. ET AL: "Complementary deoxyribonucleoic acid sequence encoding bovine ubiquitin cross-reactive protein. A comparison with ubiquitin and a 15-kDa ubiquitin homolog", ENDOCRINE (1996), 5(2), 191-197, XP001030936 * |
| CHAU, VINCENT ET AL: "A multiubiquitin chain is confined to specific lysine in a targeted short-lived protein", SCIENCE (WASHINGTON, D. C., 1883-) (1989), 243(4898), 1576-83, XP000051650 * |
| HAAS, ARTHUR ET AL: "Ubiquitin -mediated degradation of histone H3 does not require the substrate-binding ubiquitin protein ligase, E3, or attachment of polyubiquitin chains", J. BIOL. CHEM. (1990), 265(35), 21664-9, XP001030873 * |
| SPENCE, JEAN ET AL: "A ubiquitin mutant with specific defects in DNA repair and multiubiquitination", MOL. CELL. BIOL. (1995), 15(3), 1265-73, XP001030874 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2818982B1 (fr) | 2003-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12467049B2 (en) | Methods and kits using nucleic acid encoding and/or label | |
| US20240377409A1 (en) | Kits for analysis using nucleic acid encoding and/or label | |
| US12320813B2 (en) | Macromolecule analysis employing nucleic acid encoding | |
| EP0797589B1 (fr) | Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives | |
| Belshaw et al. | Aminoacyl-CoAs as probes of condensation domain selectivity in nonribosomal peptide synthesis | |
| Fottner et al. | Site-specific protein labeling and generation of defined ubiquitin-protein conjugates using an asparaginyl endopeptidase | |
| Sohma et al. | Development of O‐acyl isopeptide method | |
| Achenbach et al. | Outwitting EF-Tu and the ribosome: translation with d-amino acids | |
| KR102567902B1 (ko) | 변형된 클리바아제, 이의 용도 및 관련 키트 | |
| US20240409995A1 (en) | Single-molecule peptide sequencing through molecular barcoding and ex-situ analysis | |
| Gersch et al. | Barrel-shaped ClpP proteases display attenuated cleavage specificities | |
| CN114793437A (zh) | 用于从多肽上切割n端氨基酸的方法和试剂 | |
| US20250101496A1 (en) | Methods for balancing encoding signals of analytes | |
| Wang et al. | Viral and cellular MARCH ubiquitin ligases and cancer | |
| US20250327811A1 (en) | Single-molecule peptide sequencing using dithioester and thiocarbamoyl amino acid reactive groups | |
| US12259394B2 (en) | Protein sequencing via coupling of polymerizable molecules | |
| CN113454106A (zh) | 存活靶向性嵌合（surtac）分子 | |
| Viswanathan et al. | Protease-catalyzed oligomerization of hydrophobic amino acid ethyl esters in homogeneous reaction media using l-phenylalanine as a model system | |
| FR2818982A1 (fr) | Inhibiteur specifique du systeme ubiquitine-proteasome et applications therapeutiques correspondantes | |
| WO2015115661A1 (fr) | Procédé pour la production de peptides ayant un squelette dérivé d'azole | |
| FR3127946A1 (fr) | Procédé de purification d’une protéine d’intérêt et moyens pour sa mise en œuvre | |
| CN118679389A (zh) | 通过分子条形码化和非原位分析的单分子肽测序 | |
| HK40077845A (en) | Methods and reagents for cleavage of the n-terminal amino acid from a polypeptide | |
| Davies | Potential Role of Protein Oxidation and Proteasome in Antigen Processing | |
| Alaedini | Detection and characterization of murein-synthesizing multienzyme complexes in Haemophilus influenzae |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20060831 |