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FR2815641A1 - Procede de criblage de molecules actives dans la prevention et le traitement des lesions atherosclereuses et ses applications - Google Patents

Procede de criblage de molecules actives dans la prevention et le traitement des lesions atherosclereuses et ses applications Download PDF

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FR2815641A1
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Martin Mempel
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Philippe Kourilsky
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Institut Pasteur
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Abstract

Procédé de criblage et de sélection de molécules actives dans la prévention et le traitement des lésions athéroscléreuses ou athéromateuses, produits modulant l'activité et la migration des cellules portant la chaîne invariante Valpha14Jalpha281, ainsi que leurs applications.Ledit procédé comprend essentiellement la détection comparative des cellules T Valpha 14-Jalpha 281 présentes dans des lésions athéroscléreuses ou mimant des lésions athéroscléreuses, en l'absence et en présence des molécules à tester.

Description

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La présente invention est relative à un procédé de criblage et de sélection de molécules actives dans la prévention et le traitement des lésions athéroscléreuses ou athéromateuses, aux produits modulant l'activité et la migration des cellules portant la chaîne invariante Va 14-Ja281, ainsi qu'à leurs applications.
L'athérosclérose est une lésion de la couche interne (intima) des artères. De manière plus précise, la lésion élémentaire d'athérosclérose ou plaque simple consiste en un épaississement localisé de l'intima artérielle, formé d'un amon- cellement de tissu fibreux dur (sclérose) enchâssant un centre mou constitué de lipides modifiés ou oxydés (athérome ou coeur lipidique de la plaque) et de lipoprotéines (LDL ou low density lipoprotein).
Chez l'homme, l'athérosclérose est la cause dominante des obstruc- tions qui touchent les artères de gros et de moyen calibre dans la grande circulation. Les maladies résultant de l'athérosclérose consistent en une ischémie ou insuffisance d'apport sanguin à l'organe irrigué par l'artère obstruée.
Se manifestant essentiellement chez les personnes âgées de plus de 40 ans et avec une fréquence accrue à mesure qu'elles vieillissent, l'athérosclérose est avec le cancer, une des causes premières de maladie et de mort dans les pays occidentaux.
On suspecte généralement l'inflammation chronique qui s'installe d'orchestrer la formation de la plaque athéroscléreuse.
Les phénomènes qui entrent en jeu sont multiples et complexes, impliquant essentiellement les différentes catégories de cellules présentes dans l'intima malade : cellules musculaires, cellules endothéliales, macrophages et lymphocytes.
On considère que les lymphocytes présents au niveau de la plaque sont essentiellement constitués de cellules CD4+, activées, en raison de l'expression concomitante de molécules HLA-DR, de récepteurs aux interleukines, d'antigène CD45R0 et d'antigène VLA-1 et de diverses cytokines (Demande Internationale WO 00/20019).
De manière inattendue, les Inventeurs ont trouvé que des cellules T Va24 (chez l'homme) ou VaI4-Ja281 (chez la souris) participent, de manière cruciale, à la réponse immunitaire au niveau de la lésion athéroscléreuse.
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C'est la raison pour laquelle ils ont créé un modèle in vivo et in vitro adapté au criblage et à la sélection de molécules actives, aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'homme, utilisables en complément des médicaments hypo- cholestérolémiants.
La présente invention a pour objet un procédé de criblage de molécules actives, aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la détection comparative des cellules T Va 14-Ja281 présentes dans des lésions athéroscléreuses ou mimant des lésions athéroscléreuses, en l'absence et en présence des molécules à tester (ou cribler).
On entend, au sens de la présente invention, par substance active, toute substance apte à moduler l'activité et la migration des cellules T portant la chaîne invariante Va 14-Ja28 1.
Les cellules T Va 14-Ja281 sont par exemple décrites dans T.
Kawano et al. (Science, 1997,278, 1626-1629).
De manière avantageuse, ladite détection est réalisée par l'analyse comparative des ARN messagers produits par les cellules Val4-Ja281 : analyse qualitative [Technique Immunoscope décrite dans le Brevet européen 0 613 503] ou analyse quantitative : méthode Taqman (Perkin-Elmer, Courtaboeuf, France).
Un tel modèle peut ainsi être avantageusement utilisé pour cribler et sélectionner des molécules aptes à réduire l'infiltration et donc la migration des cellules T Vex. 14-Ja281 dans lesdites lésions.
En effet, les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, que
Figure img00020001

l'infiltration et la migration desdites cellules T Val4-Ja281 peuvent refléter l'infiltration de la lésion par d'autres cellules du système immunitaire (neutrophiles, macrophages, autres lymphocytes) et constituent un bon marqueur pour ledit criblage.
Conformément à ce principe général, le criblage des molécules aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'homme, peut être mis en oeuvre selon plusieurs variantes : - comparaison des lésions induites par un antigène, en présence et en l'absence de la molécule à tester ; - induction de lésions chez des souris nourries pendant au moins une semaine avec la molécule à tester.
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Bien que moins avantageux, les modèles de l'art antérieur (souris déficientes en ApoE ou en LDL-R) peuvent également être utilisés pour quantifier les cellules T Va 14-Ja281 présentes dans les lésions athéroscléreuses, en l'absence et/ou en présence des molécules à cribler.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, il comprend essentiellement : - l'induction d'une lésion sous-cutanée chez des souris, par administration d'une substance présente dans les lésions athéroscléreuses, et - la détection qualitative et/ou quantitative comparée des cellules T Vo [14-Ja281, à partir d'un échantillon de ladite lésion, avant et après la mise en contact (administration in vivo ou in vitro) avec une molécule à tester.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'induction d'une lésion sous-cutanée est effectuée chez des souris, par administration d'une substance présente dans les plaques d'athérosclérose, sélectionnée dans le groupe constitué par les lipoprotéines LDL, le cholestérol, des molécules modifiées telles que les lysophospholipides, des lipides ou des protéines oxydés, des hsp65, des glycolipides [phosphoinositol mannosides, lipopolysaccharides (LPS), acide lipotechoïque, glycolipides de microorganismes pathogènes, animaux ou humains modifiés chimiquement sur la partie osidique naturelle, glycolipides de synthèse tels
Figure img00030001

que céramides (a ou p)...].
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, il comprend : - le prélèvement des cellules T Va 14-J a281 de souris ou des lésions suspectées de contenir lesdites cellules, - la stimulation desdites cellules dans un milieu de culture convenable, en présence d'une substance présente dans les plaques d'athérosclérose, sélectionnée dans le groupe constitué par des substances présentes dans les plaques d'athérosclérose telles que : . les lipoprotéines LDL, . le cholestérol, . des molécules modifiées telles que les lysophospholipides, des lipides ou des protéines oxydés, des hsp65,
<Desc/Clms Page number 4>
Figure img00040001

. des glycolipides, tels que définis ci-dessus, de préférence l'aGalCer [a-galactocéramide ou (2S, 3S, 4R)-l-0- (a-D-galactopyranosyl)-2- (Nhexacosanoylamino)-1, 3, 4-octadecanetriol] - la mise en contact desdites cellules stimulées avec une molécule à tester et - la détection qualitative des cellules T Va 14-Ja281 et/ou quantita- tive comparée d'une substance exprimée par lesdites cellules en l'absence et en présence de ladite molécule à tester.
L'ensemble de ces étapes est réalisé in vitro.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, lesdites substances détectées sont sélectionnées dans le groupe constitué par l'interleukine 4 (IL-4), l'interféron y (INF-y) et le marqueur CD69.
Lesdites substances sont avantageusement détectées soit par cytométrie de flux (CD69), soit par ELISA (IL-4 et INF-y).
De manière avantageuse, de tels procédés de criblage présentent les avantages suivants : - une induction rapide des lésions (environ 7 jours) : les modèles animaux d'athérosclérose actuellement proposés, tels que des souris déficientes en ApoE ou en LDL-R, développent des lésions athéroscléreuses détectables, lorsqu'ils sont nourris avec un régime riche en graisses, seulement au bout de 4 à 5 semaines ; - une dissection rapide des lésions : lésions sous-cutanées contre lésions du sinus de l'aorte dans les modèles de l'art antérieur ; - une détection qualitative et quantitative du nombre de cellules T Val4-Ja281 ayant migré au niveau de la lésion, par une méthode simple ; - une détection et une quantification de la réponse immunitaire à des antigènes présents dans les lésions athéroscléreuses à l'aide de tests in vitro simples (analyse de type Facscan, production de cytokines).
De tels procédés permettent de détecter différents types de substances actives sur l'athérosclérose, en particulier des substances inhibant la migration des cellules T Va24 humaines et/ou la stimulation des cytokines exprimées par lesdites cellules T, telles que des inhibiteurs de MCP-1, de CCR2 ou de la molécule CD 1 d.
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La présente invention a également pour objet l'utilisation des molécules obtenues à l'aide du procédé de criblage, tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdites molécules sont des inhibiteurs de chemokines intervenant dans la régulation de la migration des cellules T Va 14-Ja281 ou T Va24, notamment des inhibiteurs de MCP-loudeCCR2.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdites molécules sont des inhibiteurs de la molécule CDld.
La présente invention a également pour objet des compositions aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose (inhibition de la formation des plaques d'athérome), caractérisées en ce qu'elles comprennent une molécule inhibant la migration des cellules T Va24 humaines et/ou l'activité desdites cellules T et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites compositions, ladite molécule inhibant l'activité des cellules T V 24 humaines inhibe la production des cytokines exprimées par lesdites cellules.
La présente invention a également pour objet une molécule active criblée par un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisée par sa capacité à moduler la migration et/ou l'activité des cellules Va24 humaines présentes dans les lésions athéroscléreuses.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente la détection des cellules T Val4-Ja281 par Immunoscope dans des lésions induites par le cholestérol.
Figure img00050001
- la figure 2 représente les réponses immunitaires différentielles des cellules T à la stimulation LPS ou aGalCer en l'absence ou en présence d'anticorps bloquants anti-CDl. L'expression du marqueur CD69 à la surface cellulaire est détectée par Facscan et la production de cytokines (IL-4 et INF-Y) par les cellules T sont détectées par immunoessai, après stimulation des cellules.
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Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple : Matériel et méthodes
Figure img00060001

Anticorps et réactifs Les anticorps conjugués suivants : APC (phosphatase alcaline)-ou biotine-anti-TCRap (H57-597), phycoérythrine (PE)-anti-NKl. l- (PK136), PE-anti- CD19, biotine-anti-CD69, PE-anti-CD14 (rmC5-3), biotine-anti-Macl (mil/70), biotine-anti-Grl (RB6-8C5), biotine-anti-CDllb, biotine-anti-CDld (lBl), Fcy III/II (Fc bloc, 2.4G2) et APC-streptavidine sont fournis par PharMingen (San Diego, CA).
Les anticorps conjugués FITC (Isothiocyanate de fluorescéine)-anti-TCRap (H57- 597) et biotine-anti-B220 (RA3-6B2), ainsi que la streptavidine-tricolore sont fournis par Caltag (San Francisco, CA). L'anticorps monoclonal anti-CDld (clone 20H2) est décrit dans Roark et al., J. Immunol, 1998,160, 3121-3127.
Le aGalCer (2S, 3S, 4R)-1-0- (a-D-galactopyranosyl)-2- (N-hexaco- sanoylamino)-1, 3, 4-octadecanetriol) est commercialisé par le Laboratoire de Recherche Pharmaceutique Kirin Brewery Co. Ltd. (Gunma, Japon). La solution stock est ajustée à 100 lig/ml dans du DMSO 10% puis diluée à une concentration finale de 100 ng/ml dans le milieu de culture. Une solution véhicule de DMSO à 10%, diluée à
Figure img00060002

une concentration finale de 0, 1%, est utilisée comme contrôle.
Le LPS complexé au CD 14 soluble est préparé en incubant du LPS (10 ng/ml) avec du CD14 soluble (200 ng/ml), une nuit à 37OC, selon le protocole décrit dans Hailman et al., J. Immunol., 1996, 156, 4384-4390.
L'aprotinine, le tampon phosphate (PBS) de Dubelcco et la BSA dégraissée sont fournis par Sigma Chemical Co. (St Louis, MO).
Animaux et traitement in vivo
Les souris C57BL/6 sont fournies par Iffa-Credo (L'Arbresle, France).
Figure img00060003
Les souris homozygotes déficientes en CD1 sont croisées avec les souris C57BL/6 comme décrit par Mendiratta dans Immunity, 1997, 6, 4, 469-477.
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Les souris transgéniques pour Va 14 sont décrites dans Bendelac et al. (J. Exp. Med., 1996, 184, 4, 1285-1293).
Pour le transfert de cellules enrichies en Val4, des souris sont anesthésiées avec du pentobarbital à 0,1% puis injectées par voie intrasplénique avec 100 ul d'une suspension de cellules enrichies en Val4, en présence ou en l'absence d'anticorps 20H2 (10 Ilg ! 106 cellules).
Des souris âgées de 3 à 7 semaines sont injectées avec un antigène puis 7 jours plus tard les animaux sont sacrifiés et des extraits de leur foie et de leur
Figure img00070001

rate sont préparés et injectés à des animaux comme indiqué ci-après.
Injection aux animaux et prélèvement des échantillons Les extraits contenant les molécules inductrices présentes dans les plaques d'athérosclérose (Ox-LDL, phospholipides...), en présence de 12, 5% d'alu- gel-S (Serva, Heidelberg, Allemagne) dans un volume de 100 III sont injectés, par voie sous-cutanée à la base de la queue des souris C57BL/6 (Apostolou et al., PNAS, 1999,96, 5141-5146). Les animaux témoin reçoivent 100 u ! de PBS par la même voie d'injection. Les animaux sont sacrifiés 7 jours après l'injection et des échantillons de peau correspondant au site d'injection, et éventuellement les foies sont prélevés et congelés immédiatement. A partir de ces échantillons :
Figure img00070002

des coupes des lésions sont analysées par histologie, les cellules T Val4-Ja281 sont détectées par une technique basée sur la RT-PCR (Immunoscope) qui utilise comme marqueur spécifique, le caractère pratiquement invariable de la chaîne Val4-Ja281 du récepteur des lymphocytes T (TCR) et un CDR3 long de 10 acides aminés.
Amorces PCR
Les amorces sont synthétisées par Eurogentech (Orléans, France).
Pour la technique basée sur la RT-PCR, les amorces spécifiques présentant les séquences suivantes ont été utilisées :
Val4 : CTAAGCACAGCACGCTGCACA ;
Ca : TGGCGTTGGTCTCTTTGAAG ;
Ca marqué : FAM-ACACAGGAGGTTCTGGGTTC ; Ja281 marqué : FAM-CAGCTGAGTCCCAGCTCC.
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Figure img00080001
Analyse automatisée (immunoscope) ou semi-automatisée de la diversité des cellules T L'ARN total est extrait en utilisant le réactif Trizol (Gibco BRL) puis il est précipité à l'éthanol et les culots sont remis en suspension dans 20 PLI d'eau distillée. 10 ptl sont réverse-transcrits dans un volume final de 40 Ill en utilisant la réverse transcriptase (RT) du virus de la myéloblastose aviaire et un oligo-dT, selon des protocoles standards. Deux microlitres de la solution d'ADNc obtenue sont ampli-
Figure img00080002

fiés par 40 cycles de polymérisation en chaîne (PCR) alternant une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 s, une étape de fixation des amorces à 60 C pendant 30 s et une étape d'extension à 72 C pendant 30 s, en utilisant les amorces spécifiques Val4et Ca précédemment décrites. Deux microlitres des produits amplifiés par PCR sont utilisés dans des expériences de run-off (5 cycles) en utilisant les amorces fluorescentes spécifiques des segments Ja281 ou Ca précédemment décrites. La longueur de la région CDR3 et l'intensité de fluorescence des produits du run-off sont déterminées à l'aide d'un séquenceur automatique (Perkin-Elmer) et analysées en utilisant un logiciel"Immunoscope" (Pannetier, PNAS, 1993,90, 4319-4323). La taille de la région CDR3 d'un couple V-C est représentée par une famille de pics séparés par 3 nucléotides (dérivé de l'ARNm en phase), dont la surface est proportionnelle à la quantité initiale d'ARNm. En l'absence d'une prolifération des cellules T, déclenchée par l'antigène, les six à huit pics observés présentent une distribution sensiblement gaussienne. Une prolifération des cellules T déclenchée par l'antigène résulte typiquement en des distorsions de la distribution gaussienne.
Taqman
Dans une approche quantitative, l'infiltration des cellules T Va14- Ja281 a été mesurée en utilisant des amorces spécifiques des gènes ss-actine, Ca, Va 14 et Ja281.
Préparation des cellules
Les foies et les rates sont prélevés des souris avec précaution. Les suspensions cellulaires des foies et des rates sont préparées à l'aide d'un homogénéisateur. La totalité des cellules du foie est remise en suspension dans une solution isotonique de Percoll à 80% (Pharmacia, Uppsala, Suède) et recouverte d'une solution
<Desc/Clms Page number 9>
isotonique de Percoll à 40%. Après 30 min de centrifugation à 3000 rpm, les cellules mononucléées qui se rassemblent à l'interface entre les solutions à 40 et à 80% sont recueillies et lavées avec du PBS additionné de 2% de sérum de veau foetal (FCS).
Quand cela est nécessaire, les cellules mononucléées du foie sont marquées avec des anticorps biotine-anti-Macl et les cellules présentatrices d'antigène sont isolées en utilisant des billes de streptavidine magnétiques (Dynal, Oslo, Norvège).
Figure img00090001
Cultures primaires de cellules répondeuses
Des cellules mononucléées isolées du foie et de la rate sont cultivées dans des microplaques de 96 puits à fond rond (Nunc), en présence de RPMI 1640 (Gibco BRL) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL), 100 UI/ml de pénicilline et 1001lu g/ml de streptomycine, additionné d'aGalCer (100 ng/ml) ou de concentrations variées d'antigène, et/ou d'anticorps bloquants anti-CD1. Les surna- geants sont récoltés 16 à 72 heures plus tard et stockés à -20OC jusqu'à ce que les dosages d'IL-4 et d'IFN-y soient réalisés. Les cellules sont marquées à l'aide d'anticorps fluorescents et l'expression du marqueur d'activation CD69 sur les différentes populations est étudiée par cytométrie de flux (Facscan). Les cellules T triées sont cultivées pendant 16 à 72 heures dans un milieu AIM V (Gibco-BRL) contenant des antibiotiques, en présence ou en l'absence de cellules présentatrices d'antigène.
Les surnageant de culture cellulaire sont récoltés et congelés.
Dosages de cytokine
La quantification des IFN-y, IL-4 et TNF-a murins présents dans les sera et les surnageant de culture est déterminée en utilisant des tests ELISAsandwich classiques, selon les recommandations du fabricant. Les kits ELISA IFN-y, IL-4 et TNF-a sont fournis par Pharmingen. Dans certains essais, les échantillons sont dosés d'après un protocole modifié utilisant la streptavidine-peroxydase (Amersham, Les Ulis, France) et la lecture des plaques est effectuée sur un cytofluorimètre (Perspective Biosystems). Les données sont exprimées en moyennes : erreur standard (SEM).
Cytométrie deflux & tri des cellules
Les suspensions cellulaires de foie et de rate sont colorées à l'aide de 4 couleurs en utilisant des combinaisons d'anticorps conjugués au FITC, PE, APC ou à la biotine puis au Tricolor ou/et à la streptavidine conjuguée à l'APC, et analy-
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sées par cytométrie de flux (FACS ; Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA). L'analyse phénotypique des lymphocytes T de foie a été réalisée à 4 C. Les cellules sont d'abord incubées 10 min. avec de l'anti-Fc y III/II, puis exposées 30 min. à des anticorps PE-NK1. 1 et TCRss-biotinylés et, si nécessaire, FITC-CD69. Après deux lavages, de la streptavidine-Tricolore (Caltag) ou de la streptavidine-APC a été ajoutée. Après d'autres lavages, les cellules sont mises en suspension dans du PBS contenant 2% de sérum de veau foetal (FCS) et analysées selon des procédures conventionnelles. Les données sont analysées en utilisant un logiciel Cell-Quest (Becton-Dickinson).
Les cellules colorées TCRap+NKI. l+ sont triées en utilisant un appareil"Facstar Plus" (Becton-Dickinson) ou un"Elite" (Coulter) équipé de lasers doubles (argon et colorant) à un débit de 3500 évènements par seconde, et récoltées dans du RPMI additionné de 10%. de sérum de veau foetal (FCS). Dans ces conditions, la pureté de chaque fraction cellulaire enrichie est supérieure à 94% après nouvelle analyse.
Résultats Infiltration in vivo de cellules V74-Ja281 dans des lésions induites par le cholestérol ou le LPS
Les résultats illustrés à la figure 1 montrent que l'injection souscutanée de cholestérol ou de LPS chez des souris induit une infiltration majeure des cellules T au site de l'injection, caractérisée par la détection du Val4-Ja281 de la chaîne a invariante du TCR par Immunoscope (Fig. 1). Ces observations indiquent que dans des conditions physiologiques, des antigènes tels que le cholestérol ou le LPS sont susceptibles de promouvoir des réponses immunitaires en recrutant des
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cellules T au site de l'injection.
Réponses in vitro des cellules Taux antigènes Les foies et rates de souris transgéniques pour Val4 sont isolés et les cellules mononucléées sont stimulées in vitro.
La figure 2 montre que l'aGalCer et le LPS sont capables de stimuler des cellules T, d'une façon dépendante de la molécule CD1. En effet, après stimulation avec le glycolipide aGalCer ou le LPS, on observe une nette augmentation
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de l'expression du CD69 à la surface des cellules T et de la production d'INF-y et d'IL-4, qui sont complètement inhibées en présence d'anticorps anti-CDl.
La figure 2 montre également que la stimulation des cellules T peut être mesurée aussi par l'augmentation de l'expression du CD69 en cytométrie de flux que par le dosage en ELISA de l'IL-4 ou de l'INF-y.
Des résultats similaires sont observés à partir de cellules T triées, stimulées en présence ou en l'absence de cellules présentatrices d'antigène et d'un antigène d'intérêt présent dans les lésions d'athérosclérose.
Ces résultats montrent que les cellules T Val4-Ja281 sont stimulées par des antigènes d'intérêt présents dans les lésions d'athérosclérose (cholestérol, glycolipide).
Par conséquent, le criblage de molécules aptes à inhiber la stimulation des cellules T Va 14-Ja281 par des tests qui mesurent l'expression du CD69, d'IL- 4 ou d'INF-y par lesdites cellules T stimulées, tels que ceux décrits ci-dessus permet avantageusement de cribler des médicaments aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'Homme.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (9)

REVENDICATIONS
1 ) Procédé de criblage de molécules actives, aptes à prévenir et/ou à traiter l'athérosclérose chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la détection comparative des cellules T Ve [14-Ja281 présentes dans des lésions athéroscléreuses ou mimant des lésions athéroscléreuses, en l'absence et en présence des molécules à tester.
2 ) Procédé de criblage selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite détection est réalisée par l'analyse comparative des ARN messagers produits par les cellules Va 14-Ja28 1.
3 ) Procédé de criblage selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : - l'induction d'une lésion sous-cutanée chez des souris, par administration d'une substance présente dans les lésions athéroscléreuses, et - la détection qualitative et/ou quantitative comparée des cellules T Val4-Ja281, à partir d'un échantillon de ladite lésion, avant et après la mise en contact avec une molécule à tester.
4 ) Procédé de criblage selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'induction d'une lésion sous-cutanée est effectuée chez des souris, par administration d'une substance présente dans les plaques d'athérosclérose, sélectionnée dans le groupe constitué par les lipoprotéines LDL, le cholestérol, des molécules modifiées telles que les lysophospholipides, les lipides ou protéines oxydés, les hsp65 ou des glycolipides.
5 ) Procédé de criblage selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend : - le prélèvement de cellules T Va 14-Ja281 de souris ou des lésions suspectées de contenir lesdites cellules, - la stimulation desdites cellules dans un milieu de culture convenable, en présence d'une substance présente dans les plaques d'athérosclérose, sélectionnée dans le groupe constitué par les lipoprotéines LDL, le cholestérol ou des molécules modifiées telles que les lysophospholipides, les lipides ou protéines oxydés, les hsp65 ou des glycolipides,
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- la mise en contact desdites cellules T Val4-Ja281 stimulées avec une molécule à tester et - la détection qualitative desdites cellules T Val4-Ja281 et/ou quantitative comparée d'une substance exprimée par lesdites cellules en l'absence et en présence de ladite molécule à tester.
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6 ) Procédé de criblage selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdites substances détectées sont sélectionnées dans le groupe constitué par l'interleukine 4 (IL-4), l'interféron y (INF-y) et le marqueur CD69.
7 ) Utilisation des molécules obtenues à l'aide du procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir et/ou traiter l'athérosclérose.
8 ) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que lesdites molécules sont des inhibiteurs de chemokines intervenant dans la régulation de la migration des cellules T Va 14-Ja281, notamment des inhibiteurs de MCP-1 ou de CCR2.
9 ) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que lesdites molécules sont des inhibiteurs de la molécule Cold.
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