FR2808277A1

FR2808277A1 - Polypeptide du ttv, acide nucleique codant pour ce polypeptide et utilisations

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Publication number: FR2808277A1
Application number: FR0005544A
Authority: FR
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2001-11-02
Also published as: EP1280914A1; AU5645501A; WO2001083757A1

Abstract

L'invention concerne un polypeptide isolé choisi parmi un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90 ou au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie précédemment, ou un fragment desdites séquences peptidiques qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés; une molécule d'ADN ou d'ARN codant pour ce polypeptide et leurs utilisations.

Description

Récemment, un virus à ADN linéaire, simple brin, circulaire, non enveloppé, appelé virus TT (TTV) a été identifié. TTV appartient à la famille des Circoviridae.

A l'origine, TTV a été isolé à partir du sérum d'un patient japonais transfusé, qui présentait une hépatite d'étiologie non connue (non-A à E). Il a par ailleurs été montré qu'il était associé à des taux de transaminases élevés chez des patients ayant subi une transfusion, de même que chez des patients atteints d'hépatites non-A à G en phase aiguë et chronique de la maladie (Nishizawa et al., (1997), Okamoto et al.

(1998a)).

L'ADN génomique du virus TTV a été cloné à partir du plasma d'un donneur de sang qui présentait un taux de transaminases élevé mais qui n'avait pas de marqueur sérologique pour des virus connus de l'hépatite (Okamoto et al. (1998a). Son génome, de polarité négative, consiste en une séquence de 3852 nucléotides et comprend deux cadres de lecture ouverts, ORF1 et ORF2, qui codent respectivement pour une protéine de manteau ou capside et une protéine non structurale putatives, respectivement de 770 et 202 acides aminés. TTV a une densité de 1,26 g/cm3 dans le sucrose, densité qui ne change pas après un traitement avec du Tween 80. Le génome viral est sensible au traitement à l'ADNase 1 et à la nucléase Mung Bean.

La comparaison d'une séquence partielle de 356 nucléotides avec d'autres séquences de TTV provenant d'isolats obtenus à partir des sérums de 78 donneurs de sang et de patients atteints d'hépatite a permis de montrer une divergence importante avec des différences pouvant atteindre jusqu'à 30 %. La variabilité du génome viral est élevée, Mushawar et al. (1999) pouvant atteindre 52% ce qui permet de le classifier dans au moins 16 génotypes différents (Okamoto et al. (1999)).

TTV est trouvé dans le foie des patients avec des titres plus élevés de 10 à 100 fois que ceux de sérums correspondants provenant de patients atteints d'hépatites chroniques non-A à G. Il est sécrété dans les fèces et dans le sérum. Il pourrait être transmis par voies orale et fécale, en plus de la transmission parentérale par transfusion (Okamoto et al.

(1998b)).

Dans des études antérieures, la prévalence des infections par TTV a été déterminée par PCR nichée en utilisant deux jeux d'amorces

différents définis à partir du clone N22 (Nishizawa et al. précité). Les premiers résultats ont révélé une fréquence de l'infection par TTV plus élevée chez les patients avec des hépatites fulminantes (Okamoto et al.

(1998)), chez des patients hémophiles ou chez des patients atteints d'une maladie du foie chronique d'étiologie non connue (Okamoto et al. (1998a), que chez des donneurs de sang. Mais des études complémentaires n'ont pas permis de montrer de différences significatives entre chacun de ces groupes (Fukuda et al. (1999), Desai et al. (1999), Irving et al. (1999)), laissant supposer que TTV n'était probablement pas le principal agent causal des hépatites sporadiques aiguës d'origine inconnue.

Les différences observées dans ces données épidémiologiques pourraient être expliquées par un manque de détection de certains isolats en raison de la divergence dans la séquence nucléotidique et de l'utilisation de paires d'amorces non optimales (Desai et al. (1999)). De plus, la charge virale est faible dans les sérums humains puisqu'elle n'excède pas 104 copies/ml (Nishizawa et al., (1999)) et nécessiterait donc l'utilisation de techniques particulièrement sensibles, fiables et robustes.

Jusqu'à ce jour une seule méthode a été publiée pour la détection d'anticorps anti-TTV qui consiste en une technique indirecte utilisant la précipitation de particules de TTV dans des sérums, suivie par une amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) des séquences d'ADN virales à partir de complexes immuns (Tsuda et al. (1999)). Cette technique n'est toutefois pas adaptée à des essais en routine, sur une large échelle, et son intérêt est restreint du fait de l'utilisation d'une technique d'amplification par PCR et des limitations afférentes, comme décrit ci-dessus, en particulier liées à la divergence nucléotidique, à la détermination d'amorces appropriées et aux problèmes de contamination.

Par ailleurs, une amplification par PCR n'est possible qu'en présence de virus circulants dans le matériel biologique testé et ne peut donc rendre compte d'une infection passée.

Il y avait donc un besoin pressant de développer un test sérologique qui pallie les inconvénients précités et qui, de plus, soit plus fiable et plus rapide qu'une détection par PCR.

Les présents inventeurs ont maintenant mis en évidence de manière surprenante que la région 3' terminale de l'ORF1 de TTV, qui commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la

séquence identifiée en SEQ ID NO 1, était une région très conservée, antigénique et montré qu'elle était utilisable pour détecter la présence du virus TTV dans un échantillon biologique, en particulier dans des sérums, avec un taux de prévalence avoisinant les 100%, indépendamment de l'origine de l'échantillon, à savoir chez des donneurs de sang, chez des patients atteints d'hépatites, chez des adultes ou des enfants et même chez des animaux. Ces données sont très intéressantes étant donnée la très grande variabilité protéique reconnue jusqu'à ce jour par de nombreux auteurs.

Aussi, la présente invention a pour objet : - (a) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou - (b) un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90% ou au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) un fragment desdites séquences peptidiques qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12 ou de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés.

Par polypeptide, on entend une séquence qui correspond à un enchaînement d'acides aminés et cette définition inclus les protéines recombinantes et les polypeptides de synthèse ou leurs fragments qui sont obtenus par des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Par polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90 ou au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), on entend un polypeptide qui répond à la définition donnée ci-dessus et qui présente au moins la même antigénicité et/ou immunogénécité que le peptide de référence (a).

L'invention concerne également : - (a) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique

commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEO ID NO 1, ou - (b) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90% ou 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un fragment desdites séquences peptidiques (a) ou (b) et qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à
12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés, - (d) les séquences complémentaires desdites séquences (a) à (c), et - (e) une molécule d'ARN qui est le produit de transcription desdites séquences ADN définies en (a) à (d).

Les méthodes de construction, de manipulation et de vérification de molécules d'ADN recombinant et de séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier.

Les inventeurs ont, entre autres, obtenu une protéine recombinante qui correspond à la région 3' de la trame de lecture ORF1, telle que définie précédemment et dont la séquence en acides aminés commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la SEQ ID NO 1. Dans SEO ID NO 1, les acides aminés 1 à 14 correspondent à des acides aminés du plasmide utilisé pour la construction et l'expression de ladite protéine recombinante et les acides aminés 264 à 280 correspondent à des acides aminés dudit plasmide et à l'addition d'une queue polyhistidine (tagHis). La séquence nucléotidique codante pour SEQ ID NO 1 est représentée en SEQ ID NO 2.

La séquence codante a été générée à partir d'une séquence nucléotidique codant pour l'ORF1 obtenue chez un patient infecté par TTV et amplifiée à l'aide d'amorces spécifiques de la région 3' ou carboxyterminale d'intérêt. Le fragment obtenu a été cloné et sous cloné dans un vecteur approprié pour l'expression du polypeptide d'intérêt dans une cellule hôte appropriée sous le contrôle d'un promoteur approprié. Il est

ainsi possible d'utiliser une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression du gène d'intérêt codant pour le polypeptide de l'invention ou pour un fragment dudit polypeptide, tels que défini précédemment. Parmi les systèmes microbiens et eucaryotes inférieurs Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces cerevisiae ont largement été utilisés pour la production de protéines recombinantes. De préférence, la cellule est une cellule d'Escherichia coli, mais il est à la portée de l'homme du métier de définir d'autres systèmes d'expression appropriés, en particulier dans des cellules issues d'organismes eucaryotes supérieurs, telles que les cellules CHO, COS ou HeLa ou dans d'autres types cellulaires infectés par le virus de la Forêt de SemLiki recombinant avec le gène d'intérêt. L'invention n'est donc pas limitée à un système d'expression particulier.

Aussi, la présente invention englobe également une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression d'une séquence d'ADN ou d'un fragment d'ADN tel que défini précédemment, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression ; le vecteur comprenant la cassette d'expression et la cellule issue de l'organisme procaryote ou eucaryote inférieur, en particulier Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, et la protéine ainsi produite par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule. Elle concerne aussi un procédé pour préparer un polypeptide de l'invention qui consiste à cultiver une cellule hôte ci-dessus, dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que définie précédemment et, à purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis.

L'invention concerne aussi une composition diagnostique pour la détection d'anticorps dans un échantillon biologique, d'origine humaine ou animale, en particulier dans le sérum, le plasma, le foie, les fèces, ladite composition comprenant, entre autres, un polypeptide tel que défini précédemment et un procédé pour détecter et/ou quantifier lesdits anticorps dirigés contre au moins ledit polypeptide de l'invention dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. On peut ainsi mettre en évidence la présence d'anticorps par Western Blot, sandwich ou compétition, en particulier en utilisant la technologie ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbant Assay), en utilisant des anticorps ou des

fragments d'anticorps capables de se fixer au polypeptide de l'invention ou à ses fragments. Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier.

Un autre objet de l'invention est un polypeptide immunogène qui présente une séquence peptidique telle que définie précédemment ou qui consiste en une protéine recombinante obtenue selon le protocole précité et son utilisation pour la production d'un anticorps monoclonal ou polyclonal par immunisation d'un animal mammifère, de préférence une souris, un rat ou un lapin, avec ledit peptide immunogène. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kôhler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 : 495-497 et Galfre G. et al.

(1977) Nature, 266 : pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G.F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris ou de lapins avec les particules virales de TTV. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l'immunogène peut être couplé à de l'hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA). Les animaux sont soumis à une injection d'immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quelque soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps est criblé dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de

fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier. Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F (ab)2, Fab', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of
Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J.

Biochem 120 : et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : L'anticorps monoclonal ou polyclonal ainsi obtenu est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé pour détecter et/ou quantifier au moins un polypeptide de l'invention dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec ladite composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. En particulier les anticorps monoclonaux obtenus sont spécifiques de la protéine recherchée.

L'invention concerne aussi des ligands susceptibles de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique du virus TTV tels que définis ci-dessus. Ainsi, par ligand, on entend toute molécule susceptible de s'associer à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique, telle qu'un fragment nucléotidique partiellement ou totalement complémentaire, un polynucléotide complémentaire, un anticorps anti-acide nucléique. La production de fragments nucléotidiques ou de polynucléotides fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tels que définis précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de stringence appropriées. Des conditions de stringence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 C sous le Tm ( melting température ) de l'hybride à l'étude. Les conditions de stringence pour discriminer même

une seule mutation ponctuelle sont connues depuis au moins les années
1979 ; On peut citer à titre d'exemples Wallace R. B et al., DNA. Nucleic.

Acids. Res. 6,3543-3557 (1979), Wallace R. B et al., Science, 209,
1396-1400 (1980), Itakura K. and Riggs A. D., Science, 209,1401-1405 (1980), Suggs S. V. et al., PNAS, 78,6613-6617 (1981), Wallace R. B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,3647-3656 (1981), Wallace R.B et al.

DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,879-894 (1981) et Conner B. J. et al., PNAS, 80,278-282 (1983). Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d'anticorps anti-acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemples Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, N . 15,2951-2957 ; Anderson, W. F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69- 74 ; Lee, J. S. et al. (1984) FEBS Lett., 168,303-306 ; Malfoy, B. et al.

(1982) Biochemistry, 21(22), 5463-5467 ; Stollar, B. D. et al., J. J. (eds) Methods in Enzymology, Academic Press, pp 70-85 ; F. et al.

(1989) J. Immunol. Meth., 123,83-91 et Traincard, F. et al. (1989) Mol.

Cell. Probes, 3,27-38).

Par fragment nucléotidique, on entend soit des fragments associés à une même unité moléculaire, soit des fragments dans un complexe moléculaire comprenant plusieurs sous-unités homologues ou hétérologues obtenues de manière naturelle ou artificielle, notamment par multi-épissage différentiel ou par synthèse sélective.

On définit ainsi une composition diagnostique qui comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique.

Les amorces, sondes et anticorps anti-acides nucléiques de l'invention sont par ailleurs utilisées dans un procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon d'origine humaine ou animale (sérum, plasma, extrait tissulaire de foie, extraits fécaux, salive) patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tels que défini précédemment, dans des conditions de stringence déterminées quand le ligand est une sonde ou une amorce et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN, ou dans des conditions d'incubation déterminées lorsque le ligand est anticorps anti-acide nucléique et on

détecte le complexe ainsi formé. Dans le cas de l'utilisation d'un anticorps anti-acide nucléique, l'anticorps peut lui même être marqué par tout marqueur approprié pour la révélation du complexe formé ou bien la formation du complexe peut être révélée par l'addition au milieu d'incubation d'un anticorps anti-anticorps acide nucléique marqué. Dans le cas d'utilisation de sondes la mise en évidence du complexe d'hybridation peut être effectuée directement par utilisation d'une sonde complémentaire ou sensiblement complémentaire de la séquence de la cible, ladite sonde étant marquée par tout marqueur approprié ou par mise en #uvre de la technique dite sandwich en une ou deux étapes qui consiste à utiliser une sonde de capture complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une partie de la séquence de la cible et une sonde dite de détection marquée complémentaire ou sensiblement complémentaire d'une autre partie de la séquence de la cible. Dans le cas d'utilisation d'amorces, celles ci peuvent être directement marquées pour la mise en évidence d'un produit d'amplification.

De nombreux outils ont déjà été développés pour introduire des gènes hétérologues et/ou vecteurs dans des cellules, en particulier des cellules de mammifères. Ces techniques peuvent être divisées en deux catégories : la première catégorie implique des technique physiques comme la micro-injection, l'électroporation ou le bombardement de particules. La seconde catégorie est basée sur l'utilisation de techniques en biologie moléculaire et cellulaire avec lesquelles le gène est transféré avec un vecteur biologique ou synthétique qui facilite l'introduction du matériel dans la cellule in vivo. Aujourd'hui, les vecteurs les plus utilisés sont les vecteurs adénoviraux et rétroviraux. Les virus possèdent des propriétés naturelles pour traverser les membranes plasmiques, éviter la dégradation de leur matériel génétique et introduire leur génome dans le noyau de la cellule. Ces virus ont été largement étudiés et certains sont déjà utilisés expérimentalement dans des applications humaines en vaccination, en immunothérapie, ou pour compenser des déficiences génétiques. Toutefois l'utilisation de certains vecteurs adénoviraux en thérapie génique présente des inconvénients et peut même avoir des effets dommageables pour la santé publique, comme relevé récemment. En particulier, il existe un risque de disséminer les particules virales produites dans l'organisme et l'environnement.

L'utilisation de l'ADN viral ou de la protéine identifiés par la présente invention permet de pallier ces risques potentiels. En effet, comme illustré dans les exemples, les inventeurs ont montré que le polypeptide de l'invention était ubiquitaire, ce qui laisse supposer un mécanisme de tolérance de l'hôte et permet donc d'envisager à moindres risques l'utilisation dudit polypeptide ou de l'ADN recombinant codant pour ledit polypeptide comme vecteur en thérapie, soit pour introduire ex vivo, in vivo ou in vitro dans des cellules un gène d'intérêt thérapeutique ou une protéine d'intérêt thérapeutique, soit pour introduire ex vivo, in vivo ou in vitro des substances pharmaceutiquement actives. Des cellules cibles peuvent ainsi être transformées par des techniques connues de l'homme du métier, telles que la transfection, la transduction ou la transformation et être ensuite introduites chez un patient pour exercer leurs propriétés.

L'invention concerne donc aussi l'utilisation d'ADN recombinant ou d'un polypeptide recombinant de TTV, répondant aux définitions précédentes, comme vecteur de thérapie, ledit ADN recombinant étant placé sous la dépendance d'un promoteur autologue ou hétérologue, de préférence un promoteur fort. Par promoteur autologue on entend un promoteur (UTR) du virus TTV et par promoteur hétérologue on entend tout promoteur qui ne soit pas un promoteur de TTV, d'origine virale, rétrovirale ou cellulaire, éventuellement modifiée, à la condition qu'il soit fonctionnel. Une telle utilisation n'a pas encore été décrite. Etant donné que l'on souhaite obtenir in vivo une transformation ciblée vers un type cellulaire ciblé, il est évident que le vecteur utilisé doit pouvoir être lui-même ciblé. Un autre objet de l'invention est ainsi une composition thérapeutique comprenant, entre autres, un tel vecteur.

La présente invention concerne aussi un matériel biologique pour la préparation de compositions pharmaceutiques, la composition comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des protéines déterminées, telles que des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique codant in vivo pour au moins une protéine ou un fragment d'une protéine d'intérêt ou pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins une protéine

ou d'un fragment de protéine d'intérêt ou pour au moins un anticorps ou une partie d'anticorps capable de se lier à au moins une protéine d'intérêt.

Plus particulièrement, ladite cellule cible provient soit de l'individu à traiter, soit d'un autre mammifère. Dans ce dernier cas, il convient de noter que ladite cellule cible aura subi un traitement la rendant compatible avec l'homme.

Ces cellules sont établies en lignées cellulaires et sont préférentiellement CMHII + ou CMHII + inductibles comme les lymphocytes, les monocytes, les astrocytes, les oligodendrocytes.

L'invention concerne également les cellules modifiées et un procédé de préparation d'une cellule telle que décrite ci dessus caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule de mammifère ne produisant pas naturellement des protéines identifiées, par tout ou moyen approprié, au moins une séquence d'acide nucléique contenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique et des éléments assurant l'expression dudit gène dans ladite cellule, ledit gène d'intérêt thérapeutique contenant une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule ou un fragment de molécule in vivo, comme décrit ci-dessus. Plus particulièrement, elle concerne des cellules eucaryotes transfectées par au moins une séquence nucléotidique et/ou un vecteur tel que décrit précédemment. Elle concerne aussi une composition thérapeutique comprenant, entre autres, une telle cellule.

La figure 1 représente les séquences nucléotidique et protéique complètes et reconstruites de l'ORF1 du clone X94-TTV de l'invention.

La figure 2 représente la construction d'un arbre phylogénique et montre que la séquence de X94-TTV est de génotype 1 et appartient au sous type 1 a.

Exemple 1 : Obtention de la séquence nucléotidique de la trame de lecture ORF1
La séquence nucléotidique qui code pour le cadre de lecture ORF1 a été obtenue à partir d'un patient transplanté (X94) de sexe masculin, âgé de 30 ans, qui présentait des taux d'alanine aminotransférase élevés, sans virémie détectable pour le virus de l'hépatite B (HBV ou VHB) et le virus de l'hépatite C (HCV ou VHC), ni réponse immune développée contre ces virus et pour lequel un diagnostic pour une hépatite d'étiologie non connue a été établi. La négativité de son sérum pour HBV/HCV a été confirmée par PCR (Polymerase Chain Reaction) et

hybridation par Southern blot. Il a été montré qu'il était infecté par le virus TTV par mise en évidence de l'ADN du virus par PCR nichée effectuée sur la base de la méthode décrite par Simmonds et al. (1998).

Le acides nucléiques totaux ont été extraits à partit de 140 l du sérum du patient à l'aide du kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (nom commercial), commercialisé par la société QIAGEN, selon le protocole établi selon les instructions du vendeur et soumis à amplification par PCR pour la région codant pour l'ORF1 de TTV.

Un premier clone (7-94X) comprenant la séquence aminoterminale de l'ORF1 de TTV, s'étendant du nucléotide 582 à 2192 par rapport à la séquence de référence de l'isolat TA278 (DDBJ, EMBL, GenBank, numéro d'accès AB008394), a été obtenu par PCR nichée en utilisant des oligonucléotides déduits de régions bien conservées dans des isolats de TTV de différents génotypes et sous types disponibles dans la base de données GenBank.

Amorce externe sens (C06+) :
5' AGCGAAACCTGCCCCTCCG 3' (position 519-537 sur l'isolat TA278)
Amorce interne sens (C014+D) :
5' GAGCACCATGGCCTATGGSTGG 3' (position 582-603)
Amorce externe anti-sens 5427 et amorce interne anti-sens 5432, décrites par Simmonds et al. (1998).

Des amorces spécifiques ont été définies à l'extrémité carboxyterminale (C015 + et CO 16 + ) de cette séquence et ont été utilisées pour générer un second fragment s'étendant des nucléotides 2062 à 2857 par rapport à l'isolat TA278, par PCR semi nichée, qui présentait une région chevauchante de 92 nucléotides avec la séquence du clone 7-94X et qui recouvrait la région carboxy-terminale de l'ORF1 de TTV. Ce fragment a été cloné et appelé 1 1-94X.

Amorce externe sens (CO15+) :
5' TACACATGAATGCCAGACTAC 3'
Amorce interne sens (CO 16 +) :
5' TACAGACCCCCAACTAATAGTAC 3'
Amorce anti-sens (C012-)/
5' GTAACAAGGTAGGGTTGATATC 3' (position 2836-2857 sur l'isolat TA278).

La première amplification a été réalisée à l'aide du kit ExpandTM High Fidelity PCR System (commercialisé par la société Roche Diagnostics) sur la totalité des acides nucléiques extraits comme suit : 94 C pendant
10 min. ; 35 cycles de 94 C pendant 1 min., 50 C pendant 1 min., 68 C pendant 2 min. ; extensionfinale à 68 C pendant 7 min. Le second tour a été réalisé dans les mêmes conditions à partir de 10 l de produits d'amplification du premier tour. Les produits de PCR ont été analysés sur gels d'agarose 0,8% et détectés par exposition aux ultra violets après coloration au bromure d'éthidium.

Les fragments amplifiés des parties N- et C-terminales de l'ORF1 ont été clonés séparément dans le plasmide pCR2.1-TOPO en utilisant le kit TOPOTMTA Cloning Kit, commercialisé par la société Invitrogen. Ces deux fragments ont été séquences dans les deux directions en utilisant le kit Prism Ready Reaction Kit Dye Deoxyterminator Cycle Sequencing Kit (nom commercial), commercialisé par la société Applied Biosystems, à l'aide des séquenceurs d'ADN automatisés 377 et 373A de la société Applied Biosystems, en utilisant les oligonucléotides habituels.

L'analyse des séquences obtenues a été réalisée à l'aide des logiciels GeneWorks (IntelliGenetics) et MacVector 4. 5 (Kodak). Les recherches dans les bases de données ont été réalisées par BLAST (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) sur toutes les banques de données principales (GEnBank, EMBL, PIR, SWISS-PROT, Dbest) pour générer des alignements multiples à la fois au niveau nucléotidique et protéique.

L'analyse des séquences obtenues à partir des clones 7-94X et 11-94X a révélé 100 % d'identité au niveau de la région de chevauchement. En combinant toutes les parties chevauchantes, une séquence proche de la séquence complète de l'ORF1 de TTV, recouvrant les nucléotides 589 à 2857, par rapport à la séquence de l'isolat de référence TA278, a été reconstruite et il a été montré qu'elle contenait un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine de 756 acides aminés. Une comparaison par alignement des séquences nucléotidiques de X94 et TA278 a montré une similarité importante, avec une identité de 95 %.

Exemple 2 : Caractérisation de la protéine de l'ORF1.

La séquence en acides aminés prédite, codée par la séquence de l'ORF1 de X94-TTV a été analysée. Comme montrée à la figure 1

annexée, elle contient à son extrémité N-terminale un domaine très riche en arginine (et lysine), comme cela avait déjà été montré antérieurement pour les protéines de capside des circovirus (Niagro et al., (1998) ; Takahashi et al,. (1998) ; Mushahwar et al., (1999)), et quatre sites de glycosylation liés à l'asparagine dans la région centrale. De plus, trois des quatre motifs conservés de la protéine Rep (FTL) et (YXXK) décrits antérieurement (Niagro et al., (1998) chez les circovirus ont été trouvés dans la protéine de l'ORF1 de X94-TTV suggérant une possibilité de réplication virale par un mécanisme de cycles tournant (Mushahwar et al., (1999)).

La caractérisation de la protéine de l'ORF1 par analyse de l'hydrophilie, en utilisant la méthode de Hopp et Woods (1981) a permis de mettre en évidence la présence de deux régions hydrophiles majeures.

La première région hydrophile est localisée au niveau de la partie Nterminale de la séquence en acides aminés et contient un domaine riche en arginine, et la seconde est localisée à proximité de l'extrémité C-terminale de la séquence de l'ORF1.

Exemple 3 : Analyse phylogénique
Un arbre phylogénique a été construit par la méthode décrite par Saitou et al. (1987), après alignement de la protéine ORF1 de X94TTV avec 26 séquences complètes disponibles dans les bases de données de l'ORF1 de TTV. Trois branches majeures ont été observées avec des supports significatifs de bootstrap de 100 % qui correspondaient aux génotypes 1,2 et 3 (Mushahwar et al., 1999 et Erker et al., 1999). Des résultats similaires ont été observés après construction d'un arbre phylogénique sur la base des séquences nucléotidiques. La relation génétique de la séquence de X94-TTV a été déterminée comme étant la plus proche des séquences du génotype 1 et il en a été déduit qu'il appartenait au sous type 1a.

Exemple 4: Expression et purification de la protéine recombinante de la partie C- terminale de l'ORF1 .

Le clone positif 11-94X correspondant à la région C-terminale de l'ORF1 a été ré-amplifié en utilisant les oligonucléotides ci-dessous pour

les sites de restriction BamHl et SacI aux extrémités 5' et 3', respectivement.

5' TCTCTGGATCCGGACAGACCCCCAACTAATA 3'
5' TCTCTCGAGCTCGGGTTGATATCTTGATTTTG 3'
Le produit de PCR digéré BamHI-SacI a été lié dans les sites BamHl et Sacl du vecteur d'expression pET21 b (Novagen) en amont d'une queue polyhistidine. La transformation du mélange de ligation a été réalisée dans la souche JM109 d'Escherichia coli et l'ADN recombinant des clones sélectionnés a été extrait à l'aide du kit QIAfilter Plasmid Midi Kit (nom commercial), commercialisé par la société QIAGEN. L'expression des protéines recombinantes a ensuite été réalisée dans la souche BL21 d'Escherichia coli. Après culture une nuit à 37 C dans le milieu de Luria Bertani (LB) contenant 100 g/ml d'ampicilline, une dilution au 1 :50ème a été soumise à croissance jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 0,6 à 1 unité. Les cultures ont ensuite été amenées à la concentration finale de 1 mM par addition pendant trois heures d'isopropyl- P-D-thiogalactopyranoside. Les bactéries ont été centifugées à 3000 tpm pendant 20 min., à 4 C, puis le culot de centrifugation a été resuspendu dans 1 :10 volume de tampon PBS et une lyse a été réalisée par sonication sur glace jusqu'à ce que le surnageant devienne clair. Le fait que la protéine recombinante surexprimée soit récupérée à partir de la fraction insoluble du lysat cellulaire, suggère une agrégation protéique dans des corps d'inclusion insolubles ou une co-précipitation avec des débris cellulaires bactériens non solubles. Les corps d'inclusion ont été traités avec du sarcosyl 1,5% dans du tampon STE (10 mmoles/I Tris, pH 8,100 mmoles/I EDTA, pH 8) pour obtenir la partie C-terminale de l'ORF1 dans la fraction soluble. Alternativement, la protéine recombinante a été solubilisée avec de l'urée 8M dans Na2HP04 0,1 M, Tris-HCI 0,01 M, Tween 20 0,05%, pH 8. Cette dernière condition a permis de purifier la protéine sur des billes d'agarose magnétiques Ni-NTA (Ni-NTA Magnetic Agarose Beads, QIAGEN) en conditions dénaturantes. Les résidus histidine de la protéine recombinante se lient efficacement sur une colonne d'affinité avec un agent chélatant Ni2 +, dans des conditions dénaturantes.

La protéine tag-His a ensuite été éluée des billes en réduisant le pH à 4,5.

La protéine éluée a été analysée par coloration au Bleu Brillant de Coomassie après électrophorèse sur gel SDS PAGE 10%, en conditions

dénaturantes (Laemmli (1970)). La pureté de la fraction éluée était supérieure à 95 % Une analyse par Western blot de la protéine purifiée avec un anticorps anti-histidine a confirmé la masse moléculaire prédite de l'extrémité C-terminale de l'ORF1, par détection d'un signal positif aux alentours de 32 kDa.

Exemple 5 : Détection d'anticorps anti-TTV dans des sérums humains.

L'immunoréactivité de la partie C-terminale de l'ORF1 de la protéine contre des sérums humains a été testée par Western blot. Après migration sur gel préparatif SDS PAGE 10 %, la protéine recombinante purifiée ou solubilisée dans le sarcozyl a été transférée par électrophorèse sur des membranes de fluorure de polyvinylidiène de la société Millipore, selon la méthode de Towbin et al. (1979). Les blots ont été bloqués 30 min. à température ambiante avec la poudre de lait non gras à 5% dans une solution tamponnée par du Tris (TBS. Tris 20 mmoles/l, pH 7,5, NaCI 500 mmoles/l) avant incubation pendant une nuit à 4 C avec des sérums humains dilués au 1 :100 dans du TBS contenant du Tween 20 (0,5 ml/l) (TBS-T). 70 sérums incluant 30 donneurs de sang volontaires, 30 patients atteints d'hépatites non A à G et 10 enfants sains âgés de 2 à 5 ans ont été testés. Les membranes ont été lavées trois fois avec TBS-T et incubées à température ambiante pendant 1 heure avec des anticorps antiIgA+IgG+IgM humaines de chèvre conjuguées à la phosphatase alcaline ou avec des anticorps monoclonaux anti- IgM humaine de souris conjugués à la phosphatase alcaline à une dilution au 1 : 2000 dans du TBS-T. Les membranes ont ensuite été lavées deux fois avec du TBS-T, une fois avec du tampon borate (borate 31,5 mmoles/l, pH 9,7, MgS04 10 mmoles/l) et incubées avec une solution de substrat (o-dianisidine tétra-azotée 0,5g/l et phosphate d'acide ss-naphtylique 0,5/1 dans du tampon borate). De manière alternative, des blots ont été révélés en utilisant soit un conjugué Ni2+NTA-phosphatase alcaline avec une procédure en une étape (QIAGEN), soit avec un anticorps monoclonal anti-penta-histidine avec une procédure en deux étapes (QIAGEN), en utilisant les protocoles du fabricant. Les résultats ont révélé la présence d'anticorps anti-TTV, dirigés contre la protéine recombinante de 32 kDa. Une analyse complémentaire avec la protéine recombinante purifiée a conduit à des résultats identiques avec

des sérums, sans réactivité croisée avec des protéines de E. coli, ce qui confirme le caractère immunogène de la protéine native. La spécificité de la réponse IgG anti-TTV a été contrôlée par des dilutions successives de 3 sérums positifs qui donnaient pour chacun un signal positif jusqu'à la dilution au 1/1000. De plus, la réactivité de deux sérums anti-TTV était réduite de manière significative quand ces échantillons de sérums avaient été antérieurement pré-incubés avec la protéine recombinante fixée sur des billes d'agarose Ni-NTA. Tous les sérums humains testés, excepté un, montraient une immunoréactivité contre la protéine recombinante, révélée par les anticorps anti-lgG, IgM et IgA humaines, indiquant une prévalence élevée de 98,5 % de la réponse anti-TTV chez les humains. De plus, la réponse IgM anti-TTV a été testée sur 26 sérums d'adultes et 10 sérums d'enfants avec la protéine recombinante solubilisée dans le sarcozyl par Western blot. Aucune réponse primaire n'a été détectée, suggérant qu'il n'y avait pas eu d'infection récente des hôtes infectés.

Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.

Tableau

<tb>
<tb> Solubilisation <SEP> au <SEP> sarcozyl <SEP> Purification <SEP> par <SEP> chélation
<tb> métallique
<tb> Sérums <SEP> humains <SEP> IgG <SEP> + <SEP> IgM <SEP> + <SEP> IgA <SEP> IgM <SEP> IgG <SEP> + <SEP> IgM <SEP> + <SEP> IgA <SEP>
<tb> Donneurs <SEP> sang <SEP> 30/30 <SEP> (100%) <SEP> 0/18 <SEP> 18/18 <SEP> (100%)
<tb> Hépatite* <SEP> 29/30 <SEP> (96,6%) <SEP> 0/8 <SEP> 10/11 <SEP> (90,9%)
<tb> Enfants <SEP> 10/10 <SEP> (100%) <SEP> 0/10 <SEP> 10/10 <SEP> (100%)
<tb>
Hépatite d'étiologie inconnue Exemple 6 : d'anticorps anti-TTV chez des animaux.

En raison de la prévalence immune très élevée chez les humains, et parce que des séquences du virus TTV ont été détectées dans des sérums d'animaux domestiqués, la recherche d'anticorps anti-TTV a été effectuée dans les sérums de chien, de chat, de chèvre, de mouton et de lapin. Un échantillon sérique de chacune de ces cinq espèces d'animaux a été testé. L'incubation et le traitement des membranes ont été réalisés dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 5, avec l'utilisation d'anti-IgG pour chaque espèce conjuguées à la

phosphatase alcaline. Des anticorps anti-TTV ont ainsi été détectés par Western blot dans tous les échantillons de sérums animaux testés, avec une intensité de signal forte, comme celle observée à partir des sérums humains.

Références bibliographiques Desai, S. M., Muerhoff, A. S., Leary, T. P., Erker, J. C., Simons, J. N., Chalmers, M. L., Birkenmeyer, L. G., Pilot-Matias, T. J. & Mushahwar, I. K (1999). Prevalence of TT virus infection in US blood donors and populations at risk for acquiring parenterally transmitted viruses. Journal of Infectious Diseases 179,1242-1244.

Erker, J. C., Leary, T. P., Desai, S. M., Chalmers, M. L. & Mushahwar, I.K. (1999). Analyses of TT virus full-length genomic séquences. Journal of General Virology 80,1743-1750.

Fukuda, Y., Nakano, I., Katano, Y., Kumada, T., Hayashi, K., Nakano, S.

& Hayakawa T. (1999). TT virus (TTV) is not associated with acute sporadic hepatitis. Infection 27, 125-127.

Hopp, T. P. & Woods, K. R. (1981). Prediction of protein antigenic déterminants from amino acid séquences. Proceeding of the National Academy of Sciences,USA 78,3824-3828.

Irving, W. L., Ball, J. K., Berridge, S., Curran, R., Grabowska, A. M., Jameson, C. L., Neal, K. R., Ryder, S. D. & Thomson, B. J. (1999). TT virus infection in patients with hepatitis C: frequency, persistence, and séquence heterogeneity. The Journal of Infectious Diseases 180,27-34.

Laemli U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227,680-685.

Mushahwar, I. K., Erker, J. C., Muerhoff, A. S., Leary, T. P., Simons, J. N., Birkenmeyer, L. G., Chalmers, M. L., Pilot-Matias, T. J. & Desai, S.

M (1999). Molecular and biophysical characterization of TT virus : Evidence for a new virus family infecting humans. Proceeding of the National Academy of Sciences,USA 96,3177-3182.

Niagro, F. D., Forsthoefel, A. N., Lawther, R. P., Kamalanathan, L., Ritchie, B. W., Latimer, K. S., & Lukert, P. D. (1998). Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes : Intermediates between the geminiviruses and plant circoviruses. Archives of Virology 143,1723- 1744.

Nishizawa, T., Okamoto, H., Konishi, K., Yoshizawa, H., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1997). A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown aetiology.

Biochemical and Biophysical Research Communications 241,92-97.

Nishizawa, T., Okamoto, H., Tsuda, F., Aikawa, T., Sugai, Y., Konishi, K., Akahane, Y., Ukita, M., Tanaka, T., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1999). Quasispecies of TT virus (TTV) with séquence divergence in hypervariable regions of the capsid protein in chronic TTV infection. Journal of Virology 73,9604-9608.

Okamoto, H., Nishizawa, T., Kato, N., Ukita, M., Ikeda, H., lizuka, H., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1998a). Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research 10,1- 16.

Okamoto, H., Akahane, Y., Ukita, M., Fukuda, M., Tsuda, F., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1998b). Fecal excrétion of a non-enveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non-A-G hepatitis. Journal of Medical Virology 56,128-139.

Okamoto, H., Takahashi, M., Nishizawa, T., Ukita, M., Fukuda, M., Tsuda, F., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1999). Marked genomic heterogeneity and frequent mixed infection of TT virus demonstrated by PCR with primers from coding and noncoding regions. Virology 259, 428-436.

Saitou, N. & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method : Anew method for constructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evololution 4, 406-425.

Simmonds, P., Davidson, F., Lycett, C., Prescott, L. E., Mac Donald, D.

M., Ellender, J., Yap, P. L., Ludlam, C. A., Haydon, G. H., Gillon, J. & Jarvis L. M. (1998). Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products. Lancet 352,191-195.

Takahashi, K., Ohta, Y. & Mishiro, S. (1998). Partial -2. 4 kb séquences of TT virus (TTV) genome from eight Japanese isolates: diagnostic and phylogenetic implications. Hepatology Research 12,111-120.

Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications. Proceeding of the National Academy of Sciences,USA 76,4350-4354.

Tsuda, F., Okamoto, H., Ukita, M., Tanaka, T., Akahane, Y., Konishi, K., Yoshizawa, H., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1999). Détermination of antibodies to TT virus (TTV) and application to blood donors and patients with post-transfusion non-A to G hepatitis in Japan. Journal of Virological Methods 77,199-206.

SEQ ID NO 1 MASMTGGQQM GRDPTDPQLI VHTNPTKGFV PYSLNFGNGK MPGGSSNVPI 50 RMRAKWYPTL FHQQEVLEAL AQSGPFAYHS DIKKVSLGMK YRFKWIWGGN 100 PVRQQVVRNP CKDSHSSGNR VPRSLQIVDP KYNSPELTFH TWDFRRGLFG 150 QKAIERMQQQ PTTTDIFSAG RKRPRRDTEV YHSSQEGEQK ESLLFPPVKL 200 LRRVPPWEDS QQEESGSQSS EEETQTVSQQ LKQQLQQQRI LGVKLRLLFN 250 QVQKIQQNQD INPSSVDKLA AALEHHHHHH 280 SEQ ID NO 2 ATGGCTAGCA TGACTGGTGG ACAGCAAATG GGTCGGGATC CGACAGACCC 50 CCAACTAATA GTACACACAA ACCCCACAAA AGGCTTTGTT CCCTACTCTT 100 TAAACTTTGG AAATGGTAAA ATGCCAGGAG GTAGTAGTAA TGTGCCTATT 150 AGAATGAGAG CTAAATGGTA TCCAACATTG TTTCACCAGC AAGAAGTACT 200 AGAGGCCTTA GCACAGTCAG GCCCCTTTGC ATACCACTCA GACATTAAAA 250 AAGTATCTCT GGGTATGAAA TACCGTTTTA AGTGGATCTG GGGTGGAAAC 300 CCCGTTCGCC AACAGGTTGT TAGAAATCCC TGCAAAGACT CCCACTCCTC 350 GGGCAATAGA GTCCCTAGAA GCTTACAAAT CGTTGACCCG AAATACAACT 400 CACCGGAACT CACATTCCAT ACCTGGGACT TCAGACGTGG CCTCTTTGGC 450 CAGAAAGCTA TTGAGAGAAT GCAACAACAA CCAACAACTA CTGACATTTT 500 TTCAGCAGGC CGCAAGAGAC CCAGGAGGGA CACCGAGGTG TACCACTCCA 550 GCCAAGAAGG GGAGCAAAAA GAAAGCTTAC TTTTCCCCCC AGTCAAGCTC 600 CTCAGACGAG TCCCCCCGTG GGAAGACTCG CAGCAGGAGG AAAGCGGGTC 650 GCAAAGCTCA GAGGAAGAGA CGCAGACCGT CTCCCAGCAG CTCAAGCAGC 700 AGCTGCAGCA ACAGCGAATC CTGGGAGTCA AACTCAGACT CCTGTTCAAC 750 CAAGTCCAAA AAATCCAACA AAATCAAGAT ATCAACCCGA GCTCCGTCGA 800 CAAGCTTGCG GCCGCACTCG AGCACCACCA CCACCACCACT GA 842

Claims

REVENDICATIONS

1. Polypeptide isolé choisi parmi : - (a) un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou - (b) un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90 ou au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) un fragment desdites séquences peptidiques qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés.

2. Molécule d'ADN choisie parmi : - (a) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique commence à l'acide aminé 15 et se termine à l'acide aminé 263 de la séquence identifiée en SEQ ID NO 1, ou - (b) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un polypeptide dont la séquence peptidique présente au moins 70%, de préférence au moins 80% et avantageusement au moins 90% ou au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence définie en (a), ou - (c) une molécule d'ADN qui comprend une séquence nucléotidique qui code pour un fragment desdites séquences peptidiques (a) ou (b) et qui comprend au moins 4 acides aminés, de préférence au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 12, de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés, - (d) les séquences complémentaires desdites séquences (a) à (c).

3. Molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle est le produit de transcription desdites séquences d'ADN définies en (a) à (d), selon la revendication 2.

4. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur permettant l'expression d'une séquence d'ADN telle que définie dans la revendication 2, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.

5. Cassette d'expression selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans une cellule d'Escherichia coli, de Schizosaccharomyces pombe ou de Saccharomyces cerivisiae.

6. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5.

7. Cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote inférieur, telle qu'une cellule d'Escherichia coli, de Schizosaccharomyces pombe ou de Saccharomyces cerivisiae comprenant une cassette d'expression selon la revendication 4 ou 5 ou un vecteur selon la revendication 6.

8. Procédé pour préparer un polypeptide selon la revendication 1 qui consiste à cultiver une cellule hôte selon la revendication 7 dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence nucléotidique d'ADN telle que définie dans la revendication 2 et, à purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis.

9. Peptide immunogène, caractérisé en ce qu'il présente une séquence peptidique telle que définie dans la revendication 1 .

10. Anticorps monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal mammifère avec un peptide immunogène selon la revendication 9.

11. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autres, un polypeptide selon la revendication 1 ou au moins un anticorps selon la revendication 10.

12. Procédé pour détecter et/ou quantifier des anticorps dirigés contre au moins un polypeptide selon la revendication 1 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique selon la revendication 11 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes antigène/anticorps et on détecte et/ou quantifie la formation desdits complexes.

13. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autres, au moins un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal tel que défini dans la revendication 10.

14. Procédé pour détecter et/ou quantifier au moins un polypeptide selon la revendication 1 dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique selon la revendication 13 dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes antigène/anticorps et on détecte et/ou quantifie la formation desdits complexes.

15. Sonde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3.

16. Amorce, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3.

17. Anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 2 et 3.

18. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel(le) que défini(e) dans les revendications 15, 16 et 17.

19. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève ou recueille un échantillon biologique, tel qu'un fragment tissulaire de foie, du sérum, du plasma d'un patient ou d'un animal, ou des extraits fécaux, ou de la salive, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce telle que définie dans les revendications 15 et 16, dans des conditions de stringence déterminées et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN.

20. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève ou recueille un échantillon biologique, tel qu'un fragment tissulaire de foie, du sérum, du plasma d'un patient ou d'un animal, ou des extraits fécaux, ou de la salive, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps anti-acide nucléique tel que défini dans la revendication 17, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps.

21. Vecteur de thérapie, caractérisé en ce qu'il consiste en un polypeptide selon la revendication 1 ou en une molécule d'ADN selon la revendication 2, associé à une molécule d'intérêt thérapeutique, telle qu'un gène ou une protéine d'intérêt thérapeutique ou une substance pharmaceutiquement active et en ce qu'il est capable de s'introduire dans une ou des cellules cibles ex vivo, in vivo ou in vitro.

22. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autres, un vecteur tel que défini dans la revendication 21.

23. Matériel biologique pour la préparation d'une composition thérapeutique, comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des protéines déterminées, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins un vecteur selon la revendication 21.

24. Cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules eucaryotes et de préférence eucaryotes supérieures humaines ou animales, transformées par au moins un vecteur selon la revendication 21.

25. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, une cellule telle que définie dans la revendication