FR2894984A1 - Composition pour augmenter la permeabilite des parois microorganismes et procede de detection sur membrane desdits microorganismes. - Google Patents
Composition pour augmenter la permeabilite des parois microorganismes et procede de detection sur membrane desdits microorganismes. Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne une composition de perméabilisation des parois de microorganismes comprenant l'association de polyéthylèneimine (PEI) avec au moins un alcool, ainsi qu'un procédé utilisant ladite composition pour dénombrer et détecter de manière ciblée les microorganismes sur une membrane. L'invention concerne également un kit et des sondes adaptées à la mise en oeuvre dudit procédé.
Description
La presente invention concerne une nouvelle composition de
permeabilisation des parois de microorganismes et ses utilisations, notamment, son utilisation dans un procede de denombrement etlou d'identification ciblee des microorganismes dans un milieu liquide ou gazeux.
L'invention s'applique au controle de la qualite microbiologique des milieux liquides et gazeux entrant dans les chaines de production de produits alimentaires ou pharmaceutiques. Dans ce domaine, les microorganismes a detecter sont souvent presents en tres petit nombre et it convient de distinguer la nature des germes afin de determiner s'ils presentent un risque pour la sante humaine. Le controle pratique doit prevenir toute contamination du produit manufacture dans un delai court, permettant, le cas echeant, de stopper sa fabrication et de prendre des mesures de decontamination. De nombreux procedes ont ete mis au point afin de minimiser le 15 temps de culture des microorganismes, tout en permettant la recherche de certains germes. C'est ('objet, notamment du procede de detection des microorganismes realises apres filtration du liquide au travers d'une membrane decrit dans la demande WO 01/59157. Selon ce procede, les microorganismes 20 contenus dans un echantillon liquide sont retenus a la surface d'une membrane par passage du liquide au travers de celle-ci. Les microorganismes sont cultives a la surface de la membrane au contact d'un milieu de culture gelose le temps necessaire pour former une microcolonie non visible a I'ceil nu. Les cellules formant la microcolonie sont alors lysees afin de liberer leur contenu en 25 adenosine triphosphate (ATP) et en acides nucleiques. L'ATP est utilise comme marqueur pour identifier et quantifier les cellules vivantes par ATP-bioluminescence. La detection est dite universelle en ce que I'ATP est un marqueur present chez tous les microorganismes vivants. La lecture du resultat est obtenue par une reaction de chimioluminescence impliquant la conversion de 30 I'ATP en photons par une enzyme specifique de celui-ci. Le signal lumineux est detecte a ('aide d'une interface video appropriee (ex : camera LCD). L'image obtenue permet de visualiser in-situ I'endroit sur la membrane ou le germe s'est developpe, de maniere analogue a un denombrement classique effectue sur boite de Petri en milieu gelose. Le systeme Milliflex rapid , commercialise par la firme Millipore, fonctionne sur le principe decrit ci-dessus. II a ete concu pour realiser les etapes de filtration et de detection sur une seule et meme membrane, laquelle est maintenue sur un support en plastique. Ce support est concu pour s'emboiter sur les differents dispositifs servant a la filtration, la culture des microorganismes, I'impregnation de la membrane a I'aide de reactifs de detection et la prise d'image dans une enceinte video.
Ce systeme miniaturise permet un gain de temps appreciable par rapport aux tests traditionnels sur boites de Petri. En outre, it permet de stocker les images obtenues sur support numerique, ce qui permet d'effectuer un suivi des contaminations (trarabilite). Ce systeme presente neanmoins certaines limites dues au fait, qu'en pratique, I'enumeration des microorganismes presents a la surface de la membrane est effectuee apres lyse des cellules. II est, des tors, difficile de reutiliser la meme membrane en vue d'identifier avec precision les microorganismes detectes. Neanmoins afin de mettre en evidence la presence de certains micro-organismes, on peut effectuer une hybridation specifique a ('aide de sondes marquees quelles soient de nature nucleotidiques ou bien de type PNA (peptides d'acides nucleiques). Les sondes PNA presentent I'avantage d'etre de nature peptidique, ce qui permet dans certaines applications de remplacer avantageusement les 25 sondes oligonucleotidiques. D'une maniere generate, ('hybridation de sondes in situ requiert une accessibilite totale aux acides nucleiques de la cellule sinon cette manipulation genere des faux negatifs. La demande WO 2004/050902 dealt un systeme de detection sur 30 membrane qui permet de detecter la presence de microorganismes contaminant les echantillons sanguins.
La particularite de ce systeme reside en ce que la detection des microorganismes se fait par la penetration d'agents de marquage a I'interieur des microorganismes au travers de leur paroi. Les agents de marquage utilises sont des molecules de petites dimensions, en particulier des composes intercalants des acides nucleiques (ADN, ARN) tels que les derives cyanines, I'iodure de propidium, I'acridine orange ou le bromure d'ethidium, ce qui pose moins de difficulte de penetration a I'interieur des microorganismes que les sondes oligonucleotidiques. L'echantillon liquide a tester est dilue dans une solution de permeabilisation comprenant ('agent de marquage et un reactif de permeabilisation cellulaire. Les cellules sont incubees dans cette solution de permeabilisation dont le but est d'augmenter la porosite des parois cellulaires, pour faciliter la penetration du produit de marquage dans les microorganismes presents. La solution de permeabilisation est ensuite filtree avec les eventuels microorganismes qu'elle contient, au travers d'une membrane. Les microorganismes presents sont alors retenus sur la membrane, puis sont detectes en faisant reagir ('agent de marquage avec un compose et/ou une source lumineuse permettant ('emission d'un signal fluorescent. Ce systeme presente I'interet de ne pas lyser les microorganismes, ou du moins de limiter autant que possible leur destruction avant leur detection. II en resulte une detection offrant une meilleure resolution. Toutefois, du fait que les marqueurs ne sont pas specifiques ce systeme ne permet de determiner la nature des microorganismes detectes. En outre, dans un tel systeme, la manipulation des microorganismes a lieu en solution, ce qui requiert des precautions particulieres et un appareillage plus complexe. II est a noter que !'incubation des cellules vivantes en solution avant filtration, presente ('inconvenient que Ies cellules peuvent continuer de croitre et se diviser avant d'etre fixees sur la membrane, ce qui fait peser une incertitude sur le resultat final du test.
II est egalement difficile de doser convenablement le reactif de penetration dans une solution de permeabilisation selon le procede decrit dans WO 2004/050902, notamment lorsqu'on cherche a detecter de maniere simultanee des bacteries a gram positif, generalement plus sensibles aux agents permeabilisant, et des bacteries a gram negatif plus resistantes. Les reactifs de permeabilisation pouvant entrer dans la composition de la solution de permeabilisation sont typiquement I'EthyleneDiamineTetrAcetic acid (EDTA), le polyethylene glycol (PEG), la digitonine, la nonensine, le sodium hexamethaphosphate, ou le chiorure de benzalkonium. On peut egalement utiliser le polyethylenemine (PEI), qui est un polymere aliphatique faiblement basique et polycationique connu pour rendre les parois des bacteries permeables a des solutes, tels que des antibiotiques, qui ne penetrent pas ordinairement dans le cytoplasme des bacteries [Helander, I.M. et at., Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of gram-negative bacteria, Microbiology (1997), 143: 3193-3199.] . La concentration en polyethylenimine dans les solutions de permeabilisation telle que celle decrite dans WO 2004/050902 est limitee a des concentrations generalement inferieures a 100 p.g/ml. La concentration qui convient le mieux aux bacteries a gram negatif, comme Esherichia col/ se situe autour de 20-30 g/ml. La presente invention a pour but de repondre aux limitations des systemes de detection sur membrane existants mentionnees ci-dessus.
De maniere surprenante, les inventeurs ont constate que ('utilisation de polyethylenimine (PEI), associe a au moins un alcool, particulierement un alcool primaire, et plus particulierement ('ethanol, donnait lieu une composition de permeabilisation des parois de microorganismes plus efficace. Une telle composition permet notamment de faire penetrer a I'interieur des microorganismes des macromolecules, eventuellement marquees, telles que des sondes nucleotidiques. II est notamment apparu que les microorganismes incubes dans une composition comprenant du PEI et un alcool primaire, en particulier ('ethanol, toleraient des concentrations plus elevees de PEI que dans les compositions de ('art anterieur. L'association avec un alcool primaire autorise, en particulier, une utilisation du PEI jusqu'a une concentration comprise entre 100 et 1000 pg/ml sans entrainer d'effet de lyse marque des cellules.
Par microorganisme > on designe dans la presente invention toute cellule vivante (eucaryote ou procaryote), organisme unicellulaire, gamete, ou virus comprenant un patrimoine genetique contenu dans une enveloppe forme d'une paroi simple ou multiple.
Une composition telle que definie ci-dessus permet la penetration de macromolecules a I'interieur des microorganismes tout en limitant la destruction de leurs parois. Une macromolecule se definit comme une molecule resultant de ('association d'un grand nombre de molecules simples, comme des polypeptides, des proteines, des glycoproteines, des oligonucleotides, des polysaccharides, des acides nucleiques (ADN, ARN), des anticorps, ou des derives de ceux-ci. Le polyethyleneimine (PEI) est un produit soluble disponible sous plusieurs formes. La forme polymerisee monomerique, qui a une masse moleculaire d'environ 750 kDa, est une forme preferee selon ('invention (N CAS 9002-98-6). Le PEI est utilise dans de nombreux domaines, notamment en tant qu'agent de floculation des proteines et les acides nucleiques en solution dans differents procedes de purification. II est aussi utilise en tant qu'agent permeabilisant du fait qu'il a la propriete de destructurer de maniere reversible les phospholipides presents dans les parois des cellules, rendant ainsi ces parois permeables a des agents, qui normalement ne sont pas admis a penetrer dans les cellules. Ainsi ['invention a pour objet premier une composition de permeabilisation des parois de microorganismes comprenant ('association de polyethyleneimine (PEI) avec au moins un alcool, particulierement un alcool primaire, tout particulierement ('ethanol. De preference, cette composition ne comprend pas de detergents. La concentration en PEI dans la composition de permeabilisation peut titre comprise entre 100 et 1000 g/ml, preferentiellement entre 150 et 900 g/mI, et plus preferentiellement entre 200 et 800 g/ml.
Selon ('invention, ('alcool primaire est generalement present dans la composition de permeabilisation a raison d'une concentration comprise entre 5 a 95 %, preferentiellement entre 5% et 50 %, plus preferentiellement entre 10 % et 50%. Un autre objet de I'invention concerne I'utilisation d'une composition selon ('invention, et plus particulierement un procede de detection des 5 microorganismes sur membrane comprenant une etape de penetration de macromolecules marquees a I'interieur des microorganismes. Pour des raisons qui ne sont pas encore bien connues, le melange de PEI avec un alcool primaire, notamment I'ethanol, facilite la penetration des macromolecules, telles que des sondes nucleotidiques, a I'interieur des 10 microorganismes. Des sondes nucleotidiques preferees selon ('invention permettent une hybridation specifique des ARN ribosomiques des microorganismes, notamment I'ARN16S ou I'ARN23S de Pseudomonas aeruginosa. De telles sondes peuvent en particulier comprendre une sequence correspondant a SEQ 15 ID NO.1, SEQ ID NO.2 ou SEQ ID NO.3. Dans le cas ou ces sondes sont capables de s'hybrider avec certains acides nucleiques presents dans les microorganismes, (edit procede permet de detecter de maniere specifique le ou Ies types de microorganismes presents dans le milieu liquide ou gazeux. II resulte du procede 20 I'obtention d'une image plus precise de la population microbienne detectee. On peut egalement envisager que Ies macromolecules consistent en des antigenes ou des anticorps et qu'elles participent a une detection de type immunologique. La figure 1 indique la fawn dont on peut tester Ies echantillons 25 gazeux selon le procede de I'invention, en faisant buller un gaz ou un melange gazeux dans un liquide tel que de ('eau peptonee a 1%. Au contact du liquide les microorganismes contenus dans le gaz sont pieges dans le liquide. Le liquide peut alors etre filtre comme indique dans la presente demande. La figure 2 illustre les differentes etapes du procede de detection et 30 d'enumeration de microorganismes selon ('invention mises en oeuvre dans I'exemple 1. La detection, pratiquee au moyen d'une sonde oligonucleotidique marquee, est specifique de P.aeruginosa.
La figure 3 represente le resultat du test decrit dans I'exemple 1. II s'agit d'une representation de la membrane en image de synthese, obtenue apres enregistrement et traitement numerique des signaux lumineux emis par les sondes.
La figure 4 est une representation tri-dimensionnelle de !'image presentee dans la figure 3. La figure 5 illustre les differentes etapes du procede de detection et d'enumeration de microorganismes selon ('invention mises en ceuvre dans I'exemple 2. La detection, pratiquee au moyen d'une sonde de type PNA 10 marquee, est specifique de P.aeruginosa. La figure 6 represente le resultat du test decrit dans I'exemple 2. II s'agit d'une representation de la membrane en image de synthese, obtenue apres enregistrement et traitement numerique des signaux lumineux emis par les sondes. 15 La figure 7 est une representation tri-dimensionnelle de I'image presentee dans la figure 3. La figure 8 illustre les differentes etapes du procede de detection des microorganismes par ATPbioluminescence mis en ceuvre dans I'exemple 3. La figure 9 represente le resultat du test mis en ceuvre dans 20 I'exemple 3 b) comparant differentes solutions de permeabilisation (PEI200 g/mL, PEI500 g/mL et Ethanoll0% + PEI500 g/mL). II s'agit des images de synthese obtenues apres enregistrement et traitement numerique des signaux lumineux emis par ATP-bioluminescence. La figure 10 represente la meme chose que dans la figure 9 pour 25 d'autres solutions de permeabilisation (Ethanol 90% et Ethanol 25 % + PEI500 g/mL). La figure 11 est un diagramme indiquant I'intensite lumineuse mesuree pour chaque solution de permeabilisation testee dans le cadre du protocole d'ATP-bioluminescence illustre dans la figure 8. 30 L'invention a plus particulierement pour objet I'utilisation de la composition de permeabilisation telle que decrite precedemment dans un procede de denombrement etlou d'identification, sur une membrane, des microorganismes initialement presents dans un milieu liquide ou gazeux. Selon une forme particuliere de ('invention, le procede se caracterise en ce quill comprend les etapes suivantes : (a) on filtre le milieu liquide ou gazeux a travers une membrane de sorte a retenir sur ou a I'interieur de la membrane les microorganismes presents dans ce milieu ; (b) on met en contact la membrane et les microorganismes avec une composition de permeabilisation telle que decrite precedemment, 10 comprenant du polyethyleneimine et au moins un alcool ; (c) on fixe les cellules sur la membrane a I'aide d'un agent de reticulation ; (d) on met en contact les microorganismes avec une ou plusieurs macromolecules, eventuellement marquees, aptes a traverser la paroi des 15 microorganismes ; et (e) on procede a la detection des macromolecules ayant penetre a I'interieur des microorganismes. Les microorganismes vises par le procede de ('invention sont plus particulierement choisis parmi les bacteries pathogenes a gram positif ou negatif 20 des genres Pseudomonas, Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium, Shigella, Clostridium, Campylobacter, ou Aeromonas ; les protozoaires du genre Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium, Cyclospora ; les mycoplasmes du genre Mycoplasma et Ureaplasma, les champignons du genre Aspergillus, Candida ou 25 Penicillium, les virus de I'hepatite A et E, lesquels sont des microorganismes a caractere pathogene rencontres frequemment dans I'environnement. Ce procede est, en principe, egalement applicable a la detection d'algues unicellulaires telles que des cyanobacteries, a des formes unicellulaires d'organismes parasitaires telles que des amibes ou des ceufs de nematodes, de 30 trematodes ou d'ascaris, ou encore de gametes de plantes ou d'animaux tels que des pollens ou des spermatozoldes. A ? 03/.4 9_4 Le but de ce procede est de denombrer les microorganismes presents dans un milieu liquide tel que de ('eau, ou gazeux tel que ('air, tout en determinant, autant que possible, leur identite (famille, genre, espece...). Par milieu liquide ou gazeux, on entend tout fluide pouvant titre filtre en appliquant une difference de pression au travers d'une membrane ayant des pores d'un diametre moyen compris generalement entre 0,1 et 1,5 microns, de preference entre 0,15 et 0,8 microns, plus preferentiellement entre 0,2 et 0,6 microns. Un tel fluide peut consister en des solutions pures entrant dans la fabrication de produit steriles mais aussi en des solutions complexes (eau potable, serum, urines, liquide amniotique...etc..) ou encore en des melanges gazeux comme ('air atmospherique. Le present procede peut d'ailleurs avoir des applications dans le domaine du diagnostique pour ('analyse d'echantillons provenant d'animaux ou patients.
Par < membrane D, on designe dans la presente demande un support synthetique presentant deux faces, dont les pores ont un diametre moyen connu. La membrane utilisee dans le cadre de la presente invention presente, en general, un rapport surface/volume eleve et une epaisseur 20 constante comprise, de preference, entre 90 et 200 microns. Une telle membrane peut titre mono ou multicouche. Elie est en general constituee d'un ou plusieurs materiaux choisis parmi le polytetrafluoroethylene, le fluorure de poly(vinylidene) (PVDF), le polycarbonate, le polyamide, le polyester, le polyethersulfone, I'acetylcellulose 25 et la nitrocellulose. Les materiaux sont de preference choisis pour titre compatibles avec les solvants utilises, en particulier, les alcools et aldehydes susceptibles d'etre employes aux differentes etapes du procede. La membrane sur laquelle sont detectes les microorganismes est, 30 de preference, principalement constituee de PVDF (fluorure de poly(vinylidene) ou de Nylon . Plus preferentiellement, it s'agit d'une membrane filtrante en PVDF, du type de celle commercialisee par la firme Millipore sous le nom de marque Milliflex et les references HVWP ou HVMFX . L'etape a) du procede selon ('invention consiste en la filtration du milieu liquide ou gazeux a analyser a travers une membrane telle que definie ci- dessus de sorte a retenir a la surface de cette membrane Ies microorganismes contenus dans (edit milieu. Une fois les microorganismes filtres et retenus sur la membrane, une &tape facultative de culture des microorganismes au contact d'un milieu de culture appropri& peut titre incluse dans le procede entre Ies &tapes a) et b). Ce milieu de culture est pr&ferentiellement un milieu gelose sur Iequel on depose la membrane apres filtration. Cette &tape, qui est facultative, permet d'obtenir des colonies de chacun des microorganismes initialement filtres, afin de pouvoir plus facilement les detecter. Selon ('invention, les microorganismes sont ensuite incubes a ('&tape b), dans une composition de permeabilisation selon ('invention. Cette &tape d'incubation se produit dans un faible volume de solution formant un film a la surface de la membrane. Avantageusement, la composition de permeabilisation peut titre contenue dans un support solide sur Iequel la membrane sera deposee comme par exemple un tampon impr&gne, ce qui limite les eventuels deplacements de liquide a la surface de la membrane, et donc le melange des microorganismes. Elie est conduite a une temperature comprise entre 20 C et 35 C pour une dui-6e de 5 a 20 minutes. Le procede selon !'invention est d'autant plus efficace qu'il comprend une &tape (c) par laquelle on fixe les cellules sur la membrane a I'aide 25 d'un agent servant d'agent de reticulation. Cette &tape permet de fixer les cellules sur le support que constitue la membrane. Un agent de reticulation prefer& selon ('invention est choisi parmi le glutaraldehyde, le formaldehyde et le paraformaldehyde, le paraformaldehyde se definissant comme une molecule composee d'au moins six unites de 30 formaldehyde. Avantageusement, la composition de fixation peut titre contenue dans un support solide sur Iequel la membrane sera deposee comme par exemple un tampon impregne, ce qui limite les eventuels deplacements de liquide a la surface de la membrane, et donc le melange des microorganismes. Preferentiellement selon ['invention, I'etape de fixation est realisee a une temperature comprise entre 20 C et 35 C pour une duree de 5 a 20 minutes. Cette etape de fixation peut titre egalement realisee par irradiation des microorganismes sur la membrane a I'aide d'un rayonnement UV. La membrane est alors preferentiellement constituee de Nylon . L'etape d) de mise en contact des microorganismes avec une ou plusieurs macromolecules, eventuellement marquees, la ou lesquelles penetrent a travers la paroi des microorganismes a I'interieur desdits microorganismes est realisee preferentiellement a I'issu des etapes respectives d'incubation et de fixation b) et c), car c'est a ce moment precis qu'il a ete observe que les parois des microorganismes etaient le plus permeables aux macromolecules. Selon une forme preferee de ('invention, les macromolecules sont marquees et utilisees en tant que sondes.
Par sonde, on entend ici des macromolecules capables de reconnoitre et de s'associer avec un element biologique particulier du microorganisme permettant ainsi sa visualisation. Selon encore une autre forme preferee de ('invention, la sonde peut titre une macromolecule capable de s'hybrider avec des sequences d'ADN ou d'ARN presentes dans le microorganisme et presentant un certain degre de specificite vis-a-vis desdits acides nucleiques. On parlera alors dans le present texte de sondes d'acides nucleiques. L'invention prevoit tout type de sonde acides nucleiques connu de I'homme du metier pouvant donner lieu a une hybridation avec des acides nucleiques, tel que, par exemple des oligonucleotides simples, des oligonucleotides de type 2'O-methyl-ARN, des sondes de type PNA (sondes constituees d'une chaine polypeptidique substituees par des bases puriques et pyrimidiques) [Nielsen P.E. et al. Science (1991) 254 :1497-1500] ou LNA (oligonucleotides comprenant un ou plusieurs monomer-es de 2'-0-4'-C-methylene-[3-D-ribofuranosyl) telles que decrites dans le brevet EP 1 013 661.
Selon un aspect pref&re de I'invention, les sondes utilisees aux fins de la detection ciblee des microorganismes tel que Pseudomonas aeruginosa, comprennent une ou plusieurs des sequences indiquees ci-apres : 5'-TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC-3' [SEQ ID NO.1] 5'-CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3' [SEQ ID NO.2] 5'-CCCGAGGTGCTGGTAACT -3' [SEQ ID NO.3] Les sequences SEQ ID NO.1, 2 et 3 ont la particularite de s'hybrider de maniere specifique et selective respectivement a I'ARN16S ou I'ARN23S de Pseudomonas aeruginosa. Les inventeurs ont constat& en effet que les sondes capables d'hybrider les ARN ribosomiaux des microorganismes &taient particulierement utiles pour realiser I'invention. Un aspect de I'invention consiste donc en des sondes comprenant une sequence correspondant a SEQ ID NO.1 ou SEQ ID NO.2, c'est-a-dire une sequence presentant au moins 80 % d'identite, de preference 90 %, plus preferentiellement 95 % avec les sequences indiquees ci-dessus. De telles sondes sont particulierement indiquees pour la mise en oeuvre d'un procede de denombrement etlou d'identification selon ['invention. Selon un autre aspect de I'invention les macromolecules que I'on fait penetrer dans les microorganismes, et qui peuvent etre de meme nature que les sondes decrites ci-dessus, sont utilisees en tant qu'amorces pour realiser une &tape supplementaire d'amplification specifique des acides nucleiques contenus dans les microorganismes. Si de telles macromolecules sont utilisees dans le procede selon ('invention, alors une &tape supplementaire, mais neanmoins facultative, est introduite dans le procede entre les &tapes d) et e).
Une telle &tape d'amplification peut s'av&rer utile pour une detection optimale des microorganismes en augmentant la quantite des acides nucleiques disponibles aux fins de la detection. Si cette &tape d'amplification est hautement specifique, elle permet en outre d'identifier les microorganismes avec davantage de selectivite et de diminuer ainsi le nombre des faux positifs. L'amplification est de preference une amplification de type NASBA [Compton, J., Nature (1991) 350 :91-92 ] ou de type LAMP-PCR [Notomi T., Nucleic Acids Research (2000), 28(12): e63].
Les sondes ou amorces decrites plus haut peuvent titre connues pour detecter un seul ou plusieurs types de microorganismes. Elles peuvent, en cela presenter un degre de specificite variable vis-a-vis des elements biologiques presents dans les microorganismes. Par exemple, si les amorces ou sondes sont des acides nucleiques, choisis pour s'hybrider avec des acides nucleiques dont la sequence est conserve chez de nombreuses especes de microorganismes, ('identification sera peu specifique, si, au contraire, leur sequence est choisi pour ne reconnoitre que des sequences propres a un petit nombre d'especes la specificite sera plus importante.
Selon encore une autre forme particuliere de ('invention, et de maniere avantageuse, une &tape d'hybridation specifique des sondes acides nucleiques ou des amorces avec Ies acides nucleiques desdits microorganismes peut titre mise en oeuvre apres ['elope d) et avant ('&tape de detection e) suivante. Cette &tape d'hybridation des sondes acides nucleiques ou amorces s'effectue dans des conditions standard d'hybridation connues de I'homme du metier. Elie peut comprendre en outre une &tape de lavage permettant d'&liminer les sondes acides nucleiques ou amorces ayant donne lieu a des hybridations non specifiques. Aux fins de la detection, les sondes acides nucleiques ou amorces selon l'invention sont pr&ferentiellement marquees en fluorescence ou bien couplees a des enzymes permettant de realiser une reaction de chimioluminescence. L'etape (e) de detection des microorganismes est effectuee par la 25 detection du signal lumineux provenant de la reaction de chimioluminescence ou ('emission obtenue en fluorescence correspondant au marquage de la sonde ou de I'amorce, a ('aide d'une interface appropriee. Selon un aspect plus prefer& de ('invention, les sondes acides nucleiques telles que des oligonucleotides sont couplees a Ia peroxydase. La 30 peroxydase lorsqu'elle est mise en presence de luminol (substrat de la peroxydase) degrade celui-ci et le produit de degradation &met des photons qui sont detectes par ('interface video (camera LCD) du systeme Milliflex. 20 Selon encore un autre aspect !'invention consiste en ('utilisation d'une composition de permeabilisation telle que decrite plus haut pour pratiquer un test diagnostique in-vitro. On peut, en effet, envisager d'utiliser les proprietes particulieres d'une composition de permeabilisation selon ('invention pour faire penetrer des sondes nucleotidiques ou toute autre complexe moleculaire dans des cellules prelevees sur I'homme ou !'animal, ou maintenues en culture, afin de realiser de la detection in-situ. La composition de permeabilisation selon ('invention peut en outre, trouver de nombreuses applications dans le domaine medical, par exemple, en tant qu'adjuvant de medicament pour augmenter la permeabilite des parois des cellules ou des microorganismes, afin, par exemple, de sensibiliser lesdites cellules ou lesdits microorganismes a des principes actifs tels que des antibiotiques ou des antiviraux.
Plus particulierement, une composition selon ('invention est utile pour faire penetrer des acides nucleiques antisens, particulierement des ARN anti-sens (RNAi) dans des cellules dans lesquelles on cherche a inhiber ('expression de certains genes, notamment dans le traitement de maladies genetiques ou de certains cancers. La presente invention entend couvrir, en outre, un kit pour la detection
et !'enumeration des microorganismes dans un milieu liquide ou gazeux comprenant au moins : - une membrane pour filtrer un milieu liquide ou gazeux ; et - une composition de permeabilisation telle que decrite dans la presente invention. De preference la membrane contenue dans ce kit est constituee principalement de PVDF ou de Nylon . Avantageusement, un tel kit comprend, en outre, une composition comprenant un agent de reticulation choisi parmi le glutaraldehyde, le formaldehyde et le paraformaldehyde. Cette seconde composition permet la fixation des microorganismes sur la membrane, ce qui permet, en mettant en oeuvre le procede selon ('invention, d'obtenir une meilleure resolution de la detection. Un kit selon ('invention peut egalement comprendre une sonde permettant la detection specifique du microorganisme recherche, en particulier une sonde telle que definie plus haut comprenant une sequence presentant au moins 80 % d'identit& avec SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 ou SEQ ID NO.3.
Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer ('invention.
Exemple 1 Detection specifique de P. aeruginosa a i'aide d'une sonde oligonucleotidique.
Les &tapes du procede mises en oeuvre sont illustrees dans la figure 2.
La mise en oeuvre de ce procede consiste d'abord a filtrer 100 mL d'une solution en utilisant le dispositif commercialise sous le nom de Milliflex de reference HVWP ou HVMFX . Ce dispositif comprend une membrane filtrante de type PVDF maintenue sur une structure circulaire en plastique. A Ia suite de la filtration, la membrane est placee sur une cassette 20 de milieu gelose puis incube a 35 C durant 5h30 afin que des micro-colonies bacteriennes puissent se developper a la surface de la membrane. La membrane est desolidarisee de la cassette de milieu gelose puis est placee au contact d'un tampon en cellulose impregne de solution de permeabilisation [Ethanol 20%, PEI 200 pg/mL] durant 10 minutes a temperature 25 ambiante. La membrane est alors placee sur un pad en cellulose impregn& de Ia solution de fixation [Methanol 80%, Formaldehyde 1%, NaN3 5 mM, 0,01% H2O2-uree durant 10 minutes a temperature ambiante. La structure en plastique sur laquelle se trouve la membrane est 30 ensuite emboitee sur une cassette d'hybridation dont la partie inferieure est close de maniere herm&tique. La membrane est incub&e dans la casette d'hybridation a 45 C pendant 30 minutes au contact de 2 mL d'une premiere solution de pre-hybridation [PEG 10 % ; NaCl 300 mM ; Formamide 30 0/0; sodium pyrophosphate 0,1 % ; PVP 0,2 % ; Ficoll 0,2 %; EDTA 5 mM; Triton X-100 1 %; Iris-NCI 50 mM - pH 7,5]. La premiere solution etant eliminee, la membrane est placee au contact du meme volume d'une solution d'hybridation contenant 100 nM d'une sonde oligonucleotidique couplee a la peroxydase de la graine de soja a 45 C pendant 60 minutes. La sonde oligonucleotidique utilisee, specifique de I'ARN 16S de P. aeruginosa, presente la sequence suivante [SEQ ID NO. 2] : 5'CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3' [SEQ ID NO. 2] La membrane est ensuite desolidarisee de la cassette d'hybridation puis placee dans une cuvette de lavage au contact de 100 mL d'une solution de lavage [CAPSO 10 mM, Tween20 0,02%]. Trois lavages de 10 min a 45 C sont realises. La membrane est sechee puis le reactif bio-luminescent, apres reconstitution, [Millipore cat # WBKLS0100] est vaporise a la surface de la membrane. Le dispositif est place dans le systeme Milliflex Rapid et les signaux lumineux sont enregistres. Le resultat de la detection de P. aeruginosa a la surface de la membrane est presente dans la figure 3. Une vue tri-dimensionelle de la meme analyse est presentee dans la figure 4, ou I'on distingue nettement la localisation sur la membrane de chacune des microcolonies de P. aeruginosa.
Exemple 2 Detection specifique de P. aeruginosa a !'aide d'une sonde de type PNA.
a) Utilisation d'une solution de permeabilisation Ethanol 20%, PEI 200 pg/mL
Les etapes du procede mises en ceuvre sont illustrees dans la figure 5. Apres une filtration realisee selon le protocole de I'exemple 1, la membrane est placee sur une cassette de milieu gelose et incubee a 35 C durant 6h00. 30 La membrane est desolidarisee de la cassette de milieu gelose puis elle est placee sur un tampon en cellulose impregne de la solution de permeabilisation [Ethanol 20%, PEI 200 pg/mL] durant 10 minutes a temperature ambiante.
Le dispositif est ensuite place sur un tampon en cellulose impregne d'une solution de fixation [Methanol 80%, Formaldehyde 1%, NaN3 5 mM, 0,01% H2O2-uree] durant 10 minutes a temperature ambiante. La membrane est placee, comme dans I'exemple 1, sur une cassette d'hybridation, au contact de 2 mL d'une solution d'hybridation [PEG 10 % ; NaCl 10 mM ; Formamide 30 % ; sodium pyrophosphate 0,1 % ; PVP 0,2 % ; Ficoll 0,2 %; EDTA 5 mM; Triton X-100 1 %; Tris-HCI 50 mM - pH 7,51 comprenant 100 nM d'une sonde PNA couplee a la peroxydase de la graine du soja. L'ensemble est place a 50 C pendant 60 minutes. La sonde PNA utilisee est capable de s'hybrider a la meme 15 sequence d'ARN 16S de Pseudomonas aeruginosa que la sonde oligonucleotidique de I'exemple 1 de sequence SEQ ID NO.3. La membrane sur son support est desolidarisee de la cassette d'hybridation puis place dans la cuvette de lavage au contact de 100 mL d'une solution de lavage [CAPSO 10 mM, Tween20 0,02%]. Trois lavages de 10 min a 20 50 C sont realises. La membrane est sechee, puis le reactif bio-luminescent apres reconstitution [Millipore cat # WBKLS0100], est vaporise a sa surface. La membrane est enfin placee dans I'analyseur d'image du systeme Milliflex Rapid oO les signaux lumineux sont enregistres. L'image obtenue est presentee dans la 25 figure 6. Une vue tri-dimensionelle de la meme analyse est presentee dans la figure 7. Ce procede permet de detecter specifiquement la presence de P. aeruginosa a la surface d'une membrane filtrante.
30 b) Utilisation d'une solution de permeabilisation comprenant 200pg/mL de PEI seul, 500fag/mL de PEI seul ou un melange compose d'Ethanol 10% et de PEI a une concentration de 500 fag/mL (EtOH10%-PEI500) Le meme protocole que celui decrit ci-dessus a ete effectue avec une solution de permeabilisation comprenant uniquement du PEI, puis avec un melange compose d'Ethanol 10% et de PEI a une concentration de 500 pg/mL (EtOH 10%-PEI500).
A la suite de la filtration, la membrane a ete placee sur une cassette de milieu gelose puis incube a 35 C durant 15h. La membrane a ensuite ete placee sur un tampon en cellulose impregne d'une solution de permeabilisation contenant 200pglmL de PEI seul, 500pg/mL de PEI seul, ou un melange compose d'Ethanol 10% et de PEI a une concentration de 500 pg/mL durant 10 minutes a temperature ambiante, une membrane non traitee ayant ete utilisee comme temoin. La membrane a ensuite ete placee sur un tampon en cellulose impregne de la solution de fixation [Methanol 80%, Formaldehyde 1%, NaN3 5 mM, 0,01% H2O2-uree durant 10 minutes a temperature ambiante, puis traitee comme indique plus haut. Les resultats obtenus pour Ies differentes concentrations de PEI, ainsi que pour ('utilisation conjointe de PEI et d'alcool sont presentes dans la figure 9. On peut y constater que ('utilisation conjointe de PEI et d'EtOH permet I'obtention d'un signal fort et precis au regard de ce qui peut titre obtenu en absence d'agent de permeabilisation (temoin) ou en presence de PEI seul.
Exemple 3 Detection non specifique de microorganismes par ATP-bioluminescence 25 La composition de permeabilisation selon ('invention peut titre utilisee dans un procede permettant de detecter I'ATP produit par les microorganismes vivants, selon une reaction de chimio-bioluminescence connue de ('art anterieur [Alexander, D. N., G. M. Ederer, and J. M. Matsen. 1976. 30 Evaluation of an adenosine 5'-triphosphate assay as a screening method to detect significant acteriuria. J. Clin. Microbiol. 3:42-46].
L'utilisation d'une composition selon ('invention permet de mieux permeabiliser la paroi des microorganismes en vue de liberer leur contenu en ATP. a) Traitement des cellules a ('ethanol 90% ou ethanol 25%-PEI 500pg/mL avant detection de ('ATP par chimioluminescence.
Un procede de detection par ATP-bioluminescence de Saccharomyces cerevisiae presents dans ('eau, dont les differentes etapes sont illustrees dans la figure 8, a ete teste. Dans ce test, les cellules sont prealablement traitees par I'ethanol 90% ou a I'ethanol 25%-PEI 500pglmL avant la reaction de chimioluminescence. Le protocole consiste, comme dans les exemples precedents, a filtrer 100 mL d'une solution en utilisant le dispositif Milliflex .
La membrane est alors traitee avec 40 pL d'une solution d'ethanol 90% ou d'ethanol 25%-PEI 500pg/mL vaporisee a la surface de la membrane, puis a nouveau sechee. La membrane est ensuite traitee a ('aide de 40 pL d'une solution de bioluminescence vaporisee a la surface de la membrane, puis placee dans I'analyseur d'image ou les signaux lumineux sont enregistres.
b) Traitement a PEI seul (100-500pg/mL) ou de melanges Ethanol-PEI avant la detection de I'ATP par chimioluminescence.
Le meme protocole que decrit ci-dessus a ete effectue dans Iequel le traitement a I'ethanol a ete remplace par un traitement a ('aide de PEI seul (100-250-500pg/mL) ou de melanges Ethanol-PEI (composition selon !'invention) : EtOH 10% - PEI100 pg/mL ; EtOH 10% - PEI250 pg/mL ; EtOH 10% - PEI500 pg/mL EtOH .
Les resultats concernant les differents traitements effectues selon a) et b) sont presentes dans le tableau de la figure 10 et dans le diagramme de la figure 11. II ressort de ces resultats comparatifs que la cornbinaison de I'EtOH et du PEI permet I'obtention d'un signal nettement plus fort que ('utilisation de I'EtOH ou du PEI seuls, meme lorsque le PEI seul est utilise a des concentrations elevees.
Exemple 4 Detection non specifique de microorganismes par penetration d'un agent intercalant de 1'ADN (SYBRgreen).
Une experience a consiste a incuber des bacteries E. coli en 10 solution dans une composition selon ('invention comprenant un melange Ethanol 10%-PEI 100pg/mL. La meme experience a ete realisee en incubant les cellules dans une solution de PEI seul a une concentration de 25pg/mL ou de 100pg/mL ou en absence de permeabilisation (PBS). 15 L'experience a consiste a incuber les bacteries pendant 15 minutes en presence des agents cites precedemment et d'un agent intercalant de I'ADN (SYBRgreen I, 1/4000) puis a mesurer la presence de fluorescence a ('aide d'un lecteur de microplaques. Les resultats ont ete reportes dans le tableau 1 presente ci-20 dessous. La combinaison de I'EtOH et du PEI permet I'obtention d'un signal nettement plus fort que dans le cas ou le PEI est utilise seul. Ceci montre que I'on peut obtenir une meilleure permeabilite des parois des microorganismes en associant I'alcool au PEI.
Tableau 1 : Permeabilisation et marquage d'E.coll (SYBRgreen) Solution de Fluorescence Permeabilisation Unites relatives de fluorescence (E. coil) PBS 9375 PEI 25 g/mL 13036 PEI 100 g/mL 15152 PEI 100 glmL/EtOH10% 209985
Claims (28)
1. Composition de permeabilisation des parois de microorganismes comprenant I'association de polyethyleneimine (PEI) avec au moins un alcool.
2. Composition selon la revendication 1, caracterisee en ce que ('alcool est un alcool primaire, en particulier ('ethanol.
3. Composition selon rune des revendications 1 ou 2, caracterisee en ce que la concentration de la composition en polyethyleneimine est comprise entre 100 et 1000 pgIml, preferentiellement entre 150 et 900 g/ml, plus preferentiellement entre 200 et 800 g/ml.
4. Composition selon rune quelconque des revendications 1 a 3, caracterisee en ce qu'eile comprend entre 5 % et 95 % d'alcool, preferentiellement entre 5 % et 50 %, plus preferentiellement entre 10%et50%.
5. Utilisation de la composition selon rune quelconque des revendications 1 a 4, dans un proced& de denombrement etlou d'identification de microorganismes.
6. Procede de denombrement etlou d'identification, sur une membrane, des microorganismes initialement presents dans un milieu liquide ou gazeux caracterise en ce qu'il comprend les &tapes suivantes : (a) on filtre le milieu liquide ou gazeux a travers une membrane de sorte a retenir sur ou a I'int&rieur de la membrane les microorganismes presents dans ce milieu ; (b) on met en contact la membrane et les microorganismes avec une composition de permeabilisation selon ('une des revendications 1 a 4, comprenant du polyethyleneimine et au moins un alcool ; (c) on fixe les cellules sur la membrane a ('aide d'un agent de reticulation ;(d) on met en contact Ies microorganismes avec une ou plusieurs macromolecules, eventuellement marquees, aptes a traverser la paroi des microorganismes ; et (e) on procede a Ia detection des macromolecules ayant penetre a I'interieur des microorganismes.
7. Procede selon la revendication 6, caracterise en ce qu'il comprend entre I'etape a) et I'etape b) une etape supplementaire de culture des microorganismes.
8. Procede selon rune des revendications 6 ou 7, caracterise en ce que ('agent servant d'agent de reticulation de I'etape c) est choisi parmi le glutaraldehyde, le formaldehyde et le paraformaldehyde.
9. Procede selon rune quelconque des revendications 6 a 8, caracterise en ce qu'a I'etape d) Ia macromolecule utilisee est une sonde de type PNA.
10. Procede selon rune quelconque des revendications 6 a 8, caracterise en ce qu'a I'etape d) la macromolecule utilisee est une sonde de type oligonucleotidique.
11. Procede selon rune des revendications 9 ou 10, caracterise en ce que Ia sonde utilisee a I'etape d) comprend une sequence presentant au moins 80 % d'identite avec SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 ou SEQ ID NO.3.
12. Procede selon rune quelconque des revendications 6 a 11, caracterise en ce qu'a I'etape d) les sondes ou les amorces sont marquees par couplage avec une enzyme permettant ('emission d'un signal lumineux.
13. Procede selon la revendication 12, caracterise en ce que la detection des microorganismes a I'etape (e) est effectuee par une reaction de chimioluminescence et reconnaissance du signal lumineux emis a ('aide d'une interface appropriee.
14. Procede selon ('une quelconque des revendications 6 a 11, caracterise en ce qu'a I'etape d) les sondes ou Ies amorces sont marquees avec une molecule fluorescente.
15. Procede selon la revendication 14, caracterise en ce que la detection des microorganismes a I'etape (e) est effectuee par la detection d'un signal d'emission en fluorescence correspondant au marquage de la sonde ou de I'amorce a ('aide d'une interface appropriee.
16. Procede selon rune quelconque des revendications 6 a 15, caracterise en ce qu'iI comprend entre I'etape d) et I'etape e) une etape supplementaire d'hybridation specifique des sondes ou amorces avec les acides nucleiques desdits microorganismes.
17. Procede selon rune quelconque des revendications 6 a 16, caracterise en ce qu'iI comprend entre I'etape d) et I'etape e) une etape supplementaire d'amplification specifique des acides nucleiques presents dans les microorganismes.
18. Procede selon rune quelconque des revendications 6 a 17 caracterisee en ce que la membrane sur laquelle sont detectes les microorganismes est constituee principalement de PVDF ou de Nylone.
19. Utilisation d'une composition selon rune quelconque des revendications 1 a 4, pour augmenter la permeabilite des parois des microorganismes.
20. Utilisation d'une composition selon rune quelconque des revendications 1 a 4, pour faire penetrer in vitro des acides nucleiques dans une cellule.
21. Utilisation d'une composition selon rune quelconque des revendications 1 a 4, en tant qu'adjuvant de medicament.
22. Utilisation d'une composition selon rune quelconque des revendications 1 a 4, pour faire penetrer in vitro des principes actifs dans une cellule.
23. Une sonde d'hybridation comprenant une sequence presentant au moins 80 % d'identite avec SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 ou SEQ ID NO.3.
24. Un kit pour la detection et le denombrement des microorganismes, caracterise en ce qu'il comprend :- une membrane pour filtrer un liquide ; et - une composition selon rune quelconque des revendications 1 a 4.
25. Un kit selon la revendication 24, caracterise en ce qu'il comprend, en outre, une composition comprenant un agent de reticulation choisi parmi le glutaraldehyde, le formaldehyde et le paraformaldehyde.
26. Un kit selon rune des revendications 24 ou 25, caracterise en ce qu'il comprend, en outre, au moins une sonde permettant la detection specifique de microorganismes.
27. Un kit selon la revendication 26, caracterise en ce que la sonde permettant la detection specifique du microorganisme recherche est telle que definie dans la revendication 23.
28. Un kit selon rune quelconque des revendications 24 a 27, caracterise en ce que la membrane est constituee principalement de PVDF ou de Nylon .
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