FR2878165A1 - Nouvelles utilisations des netrines - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'une nétrine choisie parmi la nétrine 4, la nétrine 1, la nétrine G1 ou la nétrine 3, ou l'un de leurs fragments, ou d'une séquence nucléotidique codant pour l'une de ces nétrines ou l'un de ces fragments, ou d'un anticorps anti-idiotypique de l'une de ces nétrines ou de l'un de ces fragments, ou d'un fragment Fab desdits anticorps anti-idiotypiques, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses.
Description
NOUVELLES UTILISATIONS DES NÉTRINES
La présente invention a pour objet de nouvelles utilisations des nétrines, notamment de la nétrine 1, de la nétrine G1, de la nétrine 3 et de la nétrine 4, notamment dans le cadre du traitement de pathologies non tumorales liées à une raréfaction des péricytes.
La nétrine 4 appartient à la famille des nétrines, qui sont des molécules de guidage des axones. A ce jour, 4 membres de cette famille sont connus (nétrines 1, G, 3, 4). La nétrine 4 est une protéine constituée d'un domaine basique C-terminal interagissant avec l'héparine, de 3 domaines de type EGF et d'un domaine de type laminine (Yurchenko et al., 2004).
La nétrine 1 stimule l'attraction quand elle est liée au récepteur dcc (ou à la néogénine) et la répulsion quand elle est liée aux récepteurs dcc et un des récepteurs de la famille UNC5H (Livesey et al., 1999; Mehlen et al., 2003; Cooper et al., 1999). De plus, la nétrine 1 peut se lier au récepteur A2 et modifier le taux d'AMPc cellulaire, l'attraction ou la répulsion étant aussi contrôlées par le taux AMPc/GMPc (Corset et al., 2000).
La nétrine 3 stimule l'attraction des neurones quand elle est liée à un récepteur 20 dcc ou néogénine et induit leur répulsion quand elle est liée à un récepteur de la famille des récepteurs UNC5H (Livesey et al. , 1999).
La nétrine G représente une famille de gènes différant des autres nétrines par la présence d'un domaine C-terminal hydrophobe se liant au glycosyl phosphoinositolphosphate (Nakashiba et al., 2002). Leur fonction est encore inconnue.
En revanche il a été rapporté que la nétrine G ne se lie ni à dcc ni à UNC5H1, H2 ou H3. (Nakashiba et al., 2002) Le document US 2003/0207347A1, publié le 6 novembre 2003, décrit la nétrine 4 native et ses utilisations. Plus particulièrement, cette demande décrit un polypeptide dérivé de la nétrine 4 présentant des propriétés de modulation de l'angiogenèse, ainsi que l'utilisation de la nétrine 4 dans un procédé de modulation du développement vasculaire, notamment de l'angiogenèse, et plus particulièrement d'inhibition de l'angiogenèse, notamment dans le cadre de tumeurs.
A ce jour, rien n'est connu sur les récepteurs de la nétrine 4 ni sur ses éventuelles fonctions neuronales.
Il a été récemment publié que la nétrine 1 et la nétrine 4 inhibent l'activité des cellules endothéliales par l'intermédiaire du récepteur UNC5H2 (Lu et al., 2004) et inhibent la vascularisation de la rétine.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs de la 5 fonction d'activation des péricytes par la liaison des nétrines aux récepteurs UNC5H4 des péricytes et des cellules musculaires lisses.
La présente invention concerne l'utilisation: d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: * une nétrine choisie parmi: la nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, la nétrine 1, représentée par la séquence SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, la nétrine G1, représentée par la séquence SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12, la nétrine 3, représentée par la séquence SEQ ID NO: 14, ou * un fragment de l'une de ces protéines, sous réserve que ce fragment présente une activité d'activation des péricytes, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2n, n variant de 8 à 254, * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'activation des péricytes, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 45% avec la région comprise entre les acides aminés en position 13 et 241, ou entre les acides aminés en position 242 et 300, ou entre les acides aminés en position 376 et 419 de la séquence SEQ ID NO: 2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'activation des péricytes, ou d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant: * soit pour l'une des nétrines telles que définies ci-dessus, * soit pour un fragment de l'une des nétrines telles que définies ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de l'une des nétrines telles que définies ci-dessus, * soit pour une séquence homologue de l'une des nétrines telles que 5 définies ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1 codant pour SEQ ID NO: 2, ou à la séquence SEQ ID NO: 3 codant pour SEQ IL) NO: 4, ou à la séquence SEQ ID NO: 5 codant pour SEQ ID NO: 6, ou à la séquence SEQ ID NO: 7 codant pour SEQ ID NO: 8, ou à la séquence SEQ ID NO: 9 codant pour SEQ ID NO: 10, ou à la séquence SEQ ID NO: 11 codant pour SEQ ID NO: 12, ou à la séquence SEQ ID NO: 13 codant pour SEQ ID NO: 14, ou à l'une des séquences SEQ ID NO: 2n-1 codant pour SEQ ID NO: 2n, n variant de 8 à 254, ou d'un anticorps anti-idiotypique de l'une des nétrines telles que définies 15 ou d'un de ses fragments tels que définis ci-dessus, ou d'une séquence dérivée ou homologue telle que définie ci- dessus, ou d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des 20 pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses.
Les séquences SEQ ID NO: 2n susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO: 16 à SEQ ID NO: 508.
Plus précisément, les séquences SEQ ID NO: 2n susmentionnées correspondent aux séquences protéiques suivantes: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, 0017: ON QI ?MS 86 : ON QI aS 96 : ON QI ëaS 176 ON QI (MS Z6 : ON QI â S 06 : ON QI â [S 88 : ON QI (MS 98 : ON QI ?MS 178 : ON QI (MS Z8 ON QI ?MS 08E: ON QI bS 8L : ON (H âiS 9L ON QI ?MS '7L : ON QI âHS ZL : ON QI âHS OL : ON QI â s 89 : ON QI (MS 99 : ON QI (RIS 179:ONQI?3S Z9:ONQI?MS 09:ONQI(MS 8S:ON(Hâ s 9S:ON QI (MS 17S : ON QI (MS ZS : ON QI ?MS 'OSE: ON QI ëas 817 : ON QI âHS 9t ON CI ajS 17r : ON (H ù s Zi : ON QI ?MS 017 : ON (I ?MS 8 : ON (H â s 9 : ON QI ?MS 17 : ON QI (MS Z : ON QI âIS 0 : ON CI ?MS 8Z ON QI (MS 9Z : ON QI ?MS 'ta' : ON QI (MS ZZ : ON QI ?MS OZ : ON QI â s '81 : ON QI ?MS '91 : ON QI âiS '171 : ON QI (MS Z I : ON QI ?MS 'OIE: ON QI ?Ms 80 : ON QI âiS 90 ' : ON QI ëIS 170 : ON QI b IS Z0 : ON QI (MS 00 ON QI ?MS 86Z: ON QI (MS 96Z: ON QI (MS t76Z: ON QI ?MS Z6Z: ON QI ?MS 06Z: ON QI (MS 88Z: ON QI aaS 98Z: ON QI ?MS 178Z: ON QI (MS Z8Z: ON QI ?MS 08Z: ON QI ?MS 8LZ: ON QI ?MS 9LZ: ON QI (MS 17LZ: ON QI (3S ZLZ: ON QI ?MS OLZ: ON QI (MAS 89Z ON QI ?MS 99Z: ON QI âIS 179Z: ON QI ëas Z9Z: ON QI (3S 09Z: ON QI (MS 8SZ: ON QI ?MS 9SZ ON QI ?MS t'SZ: ON (H â s ZSZ: ON QI âS OSZ: ON QI aaiS 817Z: ON QI âiS 91Z: ON QI (MS 17fZ: ON QI ëMS Z1Z: ON QI (MS Ot'Z: ON QI bis 8Z: ON QI ?MS 9Z: ON QI ?MS 17Z: ON QI ëas ZZ: ON (I bas 0Z: ON QI (MS 8ZZ: ON QI (MS 9ZZ: ON QI aaS 17ZZ: ON QI aaS ZZZ: ON QI (MS OZZ: ON QI âqS '8I Z: ON QI ës 9IZ: ON (I bas 17l Z: ON (I ?MS Z I Z: ON QI bIS 01Z: ON QI bas 80Z: ON QI bas 90Z: ON QI ?MS t'OZ: ON QI bas ZOZ: ON QI bas OOZ: ON QI bas 861: ON QI bas 961: ON QI bas 't6 l: ON QI ?MS Z61: ON QI bas 061: ON QI baS 881: ON QI (MS 981: ON QI bas 1781: ON QI bas Z8I: ON QI bas 081: ON QI bas '8L I: ON QI bas '9L1: ON QI ?MS '17L1: ON QI bas ZL i: ON QI b s OL I: ON QI bas 891: ON QI (MS 991: ON QI ?MS 't791: ON QI bas Z91: ON QI (MS 091: ON QI ëS 8 S I: ON QI ?MS 9SI ON QI bas 17SI: ON QI (MS ZSI: ON QI ?MS OS1: ON QI ?MS 8171: ON QI bas 9171: ON QI bas 17171: ON QI bas ZVI: ON QI bas 0171: ON QI (MS SÌ: ON QI bas 9Ì: ON III ()US 171: ON QI bas ZÌ: ON QI bas 01: ON QI ?MS 8Zi: ON QI bas 9Z1: ON QI bas t7ZI: ON QI biS ZZI: ON QI (MS OZI ON QI bas 811: ON QI bas '911: ON QI b S 1711: ON QI (MS 'Z11: ON QI bas '011: ON QI bas 801: ON QI bas 901: ON QI bas 1701: ON QI MS 'Z01: ON QI (MS 001: ON QI (MS 86: ON QI ?MS 96: ON QI ()US o z oz
SI oi
S
99 I8L8Z SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 506 ou SEQ ID NO: 508.
Les séquences SEQ ID NO: 2n-1 susmentionnées correspondent aux séquences 15 nucléotidiques SEQ ID NO: 15 à SEQ ID NO: 507.
Plus précisément, les séquences SEQ ID NO: 2n-1 susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO: 2n, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 15 codant pour SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 codant pour SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 codant pour SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 codant pour SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 codant pour SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 codant pour SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 codant pour SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 codant pour SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 codant pour SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 codant pour SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 codant pour SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 codant pour SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 codant pour SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 codant pour SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 codant pour SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 codant pour SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 codant pour SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 codant pour SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 codant pour SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 codant pour SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 codant pour SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 codant pour SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 codant pour SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 codant pour SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 codant pour SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 codant pour SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 codant pour SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 codant pour SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 codant pour SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 codant pour SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 codant pour SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 codant pour SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 codant pour SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 codant pour SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 codant pour SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 codant pour SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 codant pour SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 codant pour SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 codant pour SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 codant pour SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 codant pour SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 codant pour SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 codant pour SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 codant pour SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 codant pour SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 codant pour SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 codant pour SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 codant pour SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 codant pour SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 codant pour SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115 codant pour SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 codant pour SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 codant pour SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 codant pour SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123 codant pour SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 codant pour SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 codant pour SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 codant pour SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 codant pour SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 codant pour SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135 codant pour SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 codant pour SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139 codant pour SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 codant pour SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 codant pour SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 codant pour SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 codant pour SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 codant pour SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 codant pour SEQ Il) NO: 152, SEQ ID NO: 153 codant pour SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 codant pour SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 codant pour SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159 codant pour SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 codant pour SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163 codant pour SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 codant pour SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 codant pour SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 codant pour SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 codant pour SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 codant pour SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175 codant pour SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 codant pour SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179 codant pour SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 codant pour SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 codant pour SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 codant pour SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187 codant pour SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 codant pour SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 codant pour SEQ H) NO: 192, SEQ ID NO: 193 codant pour SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195 codant pour SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197 codant pour SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 codant pour SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 codant pour SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 codant pour SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 codant pour SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 codant pour SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 codant pour SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 codant pour SEQ H) NO: 212, SEQ ID NO: 213 codant pour SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215 codant pour SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217 codant pour SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 codant pour SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221 codant pour SEQ H) NO: 222, SEQ ID NO: 223 codant pour SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225 codant pour SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 codant pour SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 codant pour SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231 codant pour SEQ H) NO: 232, SEQ ID NO: 233 codant pour SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235 codant pour SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237 codant pour SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 codant pour SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241 codant pour SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 codant pour SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245 codant pour SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247 codant pour SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249 codant pour SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 codant pour SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 codant pour SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255 codant pour SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257 codant pour SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259 codant pour SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261 codant pour SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263 codant pour SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 codant pour SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 codant pour SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269 codant pour SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271 codant pour SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273 codant pour SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275 codant pour SEQ H) NO: 276, SEQ ID NO: 277 codant pour SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279 codant pour SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281 codant pour SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283 codant pour SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 codant pour SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287 codant pour SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289 codant pour SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 codant pour SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293 codant pour SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 codant pour SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297 codant pour SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299 codant pour SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301 codant pour SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303 codant pour SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305 codant pour SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307 codant pour SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309 codant pour SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311 codant pour SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313 codant pour SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315 codant pour SEQ II) NO: 316, SEQ ID NO: 317 codant pour SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 319 codant pour SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 321 codant pour SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 codant pour SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325 codant pour SEQ II) NO: 326, SEQ ID NO: 327 codant pour SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329 codant pour SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331 codant pour SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333 codant pour SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335 codant pour SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337 codant pour SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339 codant pour SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341 codant pour SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343 codant pour SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345 codant pour SEQ II) NO: 346, SEQ ID NO: 347 codant pour SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349 codant pour SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 351 codant pour SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353 codant pour SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355 codant pour SEQ II) NO: 356, SEQ ID NO: 357 codant pour SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359 codant pour SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361 codant pour SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363 codant pour SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 365 codant pour SEQ II) NO: 366, SEQ ID NO: 367 codant pour SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 369 codant pour SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 371 codant pour SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 373 codant pour SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 codant pour SEQ 11) NO: 376, SEQ ID NO: 377 codant pour SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379 codant pour SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381 codant pour SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383 codant pour SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 codant pour SEQ II) NO: 386, SEQ ID NO: 387 codant pour SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389 codant pour SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391 codant pour SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 393 codant pour SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395 codant pour SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397 codant pour SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399 codant pour SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401 codant pour SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403 codant pour SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405 codant pour SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407 codant pour SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409 codant pour SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411 codant pour SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 413 codant pour SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 415 codant pour SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 417 codant pour SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419 codant pour SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421 codant pour SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423 codant pour SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425 codant pour SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427 codant pour SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429 codant pour SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431 codant pour SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433 codant pour SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435 codant pour SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 codant pour SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439 codant pour SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441 codant pour SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 codant pour SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445 codant pour SEQ H) NO: 446, SEQ ID NO: 447 codant pour SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449 codant pour SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451 codant pour SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453 codant pour SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455 codant pour SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 codant pour SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459 codant pour SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461 codant pour SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463 codant pour SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465 codant pour SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467 codant pour SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469 codant pour SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471 codant pour SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473 codant pour SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475 codant pour SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 codant pour SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479 codant pour SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481 codant pour SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483 codant pour SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485 codant pour SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487 codant pour SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 codant pour SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 codant pour SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493 codant pour SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495 codant pour SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497 codant pour SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499 codant pour SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501 codant pour SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503 codant pour SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 505 codant pour SEQ ID NO: 506 ou SEQ ID NO: 507 codant pour SEQ ID NO: 508.
La séquence SEQ ID NO: 2 correspond à la protéine humaine nétrine 4 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1, et la séquence SEQ ID NO: 4 correspond à la protéine humaine nétrine 4 susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 3. La séquence SEQ ID NO: 2 comprend 628 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 4 comprend 609 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 2 allant du résidu 20 au résidu 628.
La séquence SEQ ID NO: 6 correspond à la protéine humaine nétrine 1 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 5, el la séquence SEQ ID NO: 8 correspond à la protéine humaine nétrine 1 susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 7. La séquence SEQ ID NO: 6 comprend 604 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 8 comprend 580 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 6 allant du résidu 25 au résidu 604.
La séquence SEQ ID NO: 10 correspond à la protéine humaine nétrine G1 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 9, et la séquence SEQ ID NO: 12 correspond à la protéine humaine nétrine G1 susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 11. La séquence SEQ ID NO: 10 comprend 438 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 12 comprend 410 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 10 allant du résidu 29 au résidu 438.
La séquence SEQ ID NO: 14 correspond à la protéine humaine nétrine 3 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 13. La séquence SEQ ID NO: 14 comprend 580 acides aminés.
La séquence SEQ ID NO: 382 correspond à une protéine humaine nétrine 4 mutée, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 381, et la séquence SEQ ID NO: 384 correspond à la protéine mutée susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 383. La séquence SEQ ID NO: 382 comprend 628 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 384 comprend 609 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 382 allant du résidu 20 au résidu 628.
La séquence SEQ ID NO: 16 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 15. Ce fragment comprend 260 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 2.
La séquence SEQ ID NO: 18 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 17. Ce fragment comprend 255 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 261 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO: 2.
La séquence SEQ ID NO: 20 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 19. Ce fragment comprend 113 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 516 au résidu 628 de la séquence SEQ ID NO: 2.
La séquence SEQ ID NO: 22 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 4 délétée de la séquence SEQ ID NO: 20, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 21. Ce fragment comprend 515 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu 515 de la 1(i séquence SEQ ID NO: 2.
La séquence SEQ ID NO: 34 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 33. Ce fragment comprend 229 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 32 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 2.
La séquence SEQ ID NO: 28 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 27. Ce fragment comprend 60 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 261 au résidu 320 de la séquence SEQ ID NO: 2.
La séquence SEQ ID NO: 30 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 29. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 332 au résidu 387 de la séquence SEQ ID NO: 2.
La séquence SEQ ID NO: 32 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 31. Ce fragment comprend 52 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 394 au résidu 445 de la séquence SEQ ID NO: 2.
Les fragments de la protéine nétrine 4 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO:24 à SEQ ID NO: 152, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 23 à SEQ ID NO: 151 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 23 32-515 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 25 32-628 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 27 261-320 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 29 332-387 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 31 394-445 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 33 32-260 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 35 1-260 + 516-628 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 37 261-628 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 39 1-320 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 41 1- 260 + 332-387 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 43 1-260 + 394-445 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 45 32-320 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 47 32-260 + 332-387 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 49 32-260 + 394-445 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 51 261-320 + 332-387 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 53 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 55 261-320 + 394-445 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 57 261-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 59 1-320 + 332-387 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 61 1-260 + 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 63 1-320 + 394- 445 SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 65 32-320 + 332-387 SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 67 32-260 + 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 69 32-320 + 394- 445 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 71 1-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 73 32-320 +332-387 + 394-445
_
SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 75 261-320 + 516-628 SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 77 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 79 _ 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 81 32-260 + 516-628 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 83 _ 32320 + 516-628 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 85 _ 32-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 87 32-260 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: _ 1-320 + 516-628 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 91 1-260 + 332-387 + 516-628
_
SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 93 1-260 + 394-445 + 516-628
_
SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 95 _ 261-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 97 261-320 + 394-445 + 516-628
_
SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 99 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 101 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 103 1-320 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 105 1-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 107 1-320 394- 445 + 516-628 SEQ ID NO: 110 SEQ ID NO: 109 32-320 + 332-387 + 516-628 SEQ IDNO: 112 SEQ ID NO: 111 32-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 113 32-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 115 1-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 117 32-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 119 20-260 SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 121 20-516 SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 123 20-260 + 516-628 SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 125 20-320 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 127 20-260 + 332-387 SEQ ID NO: 130 SEQ ID NO: 129 20-260 + 394-445 SEQ ID NO: 132 SEQ ID NO: 131 20-320 + 332-387 SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 133 20-260 + 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO: 135 20-320 + 394-445 SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO: 137 20-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 139 20-320 + 516-628 SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 141 20-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO: 143 20-260 + 394-445 + 516- 628 SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 145 20-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 147 20-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 149 20-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 151 20-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 La séquence SEQ ID NO: 154 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant: codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 153. Ce fragment comprend 283 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 1 au résidu 283 de la séquence SEQ ID NO: 6.
La séquence SEQ ID NO: 156 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO 155. Ce fragment comprend 204 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 284 au résidu 487 de la séquence SEQ ID NO: 6.
La séquence SEQ ID NO: 158 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 157. Ce fragment comprend 117 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 488 au résidu 604 de la séquence SEQ ID NO: 6.
La séquence SEQ ID NO: 160 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 1 délétée de la séquence SEQ ID NO: 158, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 159. Ce fragment comprend 487 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 1 au résidu 487 de la séquence SEQ ID NO: 6.
La séquence SEQ ID NO: 168 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant: codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 167. Ce fragment comprend 235 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 49 au résidu 283 de la séquence SEQ ID NO: 6.
La séquence SEQ ID NO: 162 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant. codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 161. Ce fragment comprend 48 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 284 au résidu 331 de la séquence SEQ ID NO:6.
La séquence SEQ ID NO: 164 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 163. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 341 au résidu 396 de la séquence SEQ ID NO:6.
La séquence SEQ ID NO: 166 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 165. Ce fragment comprend 48 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 403 au résidu 450 de la séquence SEQ ID NO: 6.
Les fragments de la protéine nétrine 1 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 170 à SEQ ID NO: 290, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 169 à SEQ II) NO: 289 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 6 SEQ D NO: 170 SEQ D NO: 169 1-283 + 488-604 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 171 284-604 SEQ ID NO: 174 SEQ ID NO: 173 49-487 SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 175 49-604 SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 177 1-331 96-117 + 8Z-SZ S9Z: ON CU ëHS 99Z: ON CU âqS I -SZ 9Z: ON Cll âqS 1792: ON CU âqS 1709- 8817 + 8Z-SZ 19Z: ON CU âaS Z9Z ON UI âHS L817-SZ 6SZ: ON CU âIS 09Z: ON TU âHS 8Z-SZ LSZ ON CU âHS 8SZ ON âm 1709-8817 +OS17-Ò17+96-117+1- 617 SSZ:ONCU âiS 9SZ:ONGIâ S 1709-8817 + OSt7-017 + 96-117 + I -I SZ ON CU âqS 17SZ ON Gl âqS 1709-8817 + OSt7-017 + 1 -617 I SZ: ON CU ?MS ZSZ: ON CU â 3S 1709-8817 + OS17-017 + 96-117 + 8Z-617 6172 ON UT âHS OSZ: ON UT â s 1709-8817 + 96-117 + 1 -617 L17Z: ON CH âqS 817Z: ON CU âaS 1709-8817 + OS17-017 + I-1 S17Z: ON UI âHS 917Z ON GI âIS 1709-8817 + OSt7-017 + 96-117 + 8Z-i 17Z ON CU â M 1717Z: ON UI aS 1709-8817 + 96-117 + 1-1 I17Z: ON âiS Z17Z: ON Cil aM 1709-8817 + 0Sb- 0i7 + 96-117 + 1 -t78Z 6Z: ON m bIS O 'Z: ON â as 1709-8817 + OSt- 017 + 96-It7 LZ: ON TI âaS 8Z: ON GU âHS 1709-8817 + OS17-017 + I- 178Z SZ: ON UT aaS 9Z ON GU ?MS 1709-8817 + 96-11 + 1 -18Z Z ON CU âaS 172: ON ai â s 1709-881 + OSt-017 + 8Z-I I Z ON CU âIS ZZ: ON CU âM 1709-8817 + 96-I17 + 8Z-I 6ZZ: ON CU âHS 0Z r ON UI âaS 1709- 8817 + 1-1 LZZ ON CU ?MS 8ZZ ON UI â S 1709-8817 + OS17-017 + 8Z-617 SZZ: ON CU âqS 9ZZ: ON CU âHS 1709-8817 + 96-117 + 8Z-617 ZZ ON âHS 17ZZ: ON UI aS 1709-8817 + 1 -617 1 ZZ: ON CU âaS ZZZ: ON UI âqS 1709- 8817 + 8Z-617 61Z: ON UI âqS 0ZZ: ON UI a3S 1709-881+OS17-:017 LIZ:ON â s 8IZ:ONCU âqS 1709-8817+96-117 SIZ:ONGIaS 91Z:ONUIâ S 1709-8817+1- 178Z ÌZ:ONCU âqS 171Z:ONUIâ S OS17-017 + 96-117 + 1-617 1IZ: ON UI âJS ZTZ: ON UI âJS OS17-017 +96-117-1-1-I 60Z:ONUIâS 01Z:ONCU âaS () St0I7 + 1 -617 LOZ: ON UI âHS 80Z: ON UI âqS OS17-017 + 96-117 + 8Z-617 SOZ: ON CU âHS 90Z: ON CU âUS 96-117 + 1 -617 ÒZ: ON Gl âaS 170Z: ON UI âS 0S17-017 + 1 -I 10Z: ON CU âaS ZOZ: ON cn bas OS17-017 + 96-it -± 8Z-1 661: ON Cll âaS 00Z: ON UI bas 96-117 + 1-1 L61: ON m âHS 861: ON C âqS OS17-Òt + 96-117 + I-178Z S61: ON CU âqS 961: ON UI âqS OS17-017 + 1 -t8Z 61: ON UT aaS 1761: ON UI aaS OS17-017 + 96-117 161: ON UI bas Z61: ON UI âaS 96-117 + 1 -t8Z 681: ON CU âqS 061: ON UT baS OS17-017 + 8Z-617 L81 ON CU aaS 881: ON CU âqS 96-117 + 8Z-617 S81 ON CU âqS 981: ON CU âqS 1 -617 81: ON Cil bas 1781: ON UI âaS OS17-017 + 8Z-I 181: ON UI âaS Z81: ON UI âHS 96-117 + 8Z-i 6L1: ON UI âaS 081: ON UI bas Si 99 I8L8Z SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 267 25-283 + 403-450 SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO: 269 25-331 + 341-396 SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 271 25-283 + 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 273 25-331 + 403-450 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 275 25-331 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 277 25-331 + 488-604 SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 279 25-283 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 281 25- 283 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 283 25-331 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 285 25-283 + 341-396 + 403-450 + 488- 604 SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO: 287 25-331 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 290 _ SEQ ID NO: 289 25-331 + 341-396 + 403-450 + 488-604 La séquence SEQ ID NO: 292 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 291. Ce fragment comprend 295 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 1 au résidu 295 de la séquence SEQ ID NO: 10.
La séquence SEQ ID NO: 294 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 293. Ce fragment comprend 143 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 296 au résidu 438 de la séquence SEQ ID NO: 10.
La séquence SEQ ID NO: 296 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 295. Ce fragment comprend 225 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 71 au résidu 295 de la séquence SEQ ID NO: 10.
La séquence SEQ ID NO: 298 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine Gl, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 297. Ce fragment comprend 47 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine Gi allant du résidu 296 au résidu 342 de la séquence SEQ ID NO: 10.
La séquence SEQ ID NO: 300 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 299. Ce fragment comprend 37 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 373 au résidu 409 de la séquence SEQ ID NO: 10.
Les fragments de la protéine nétrine G 1 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO:302 à SEQ ID NO: 324, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 301 à SEQ II) NO: 323 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10 _ SEQ ID NO: 302 SEQ ID NO: 301 1-342 SEQ ID NO: 304 SEQ ID NO: 303 1295 + 373-409 SEQ ID NO: 306 SEQ ID NO: 305 1-342 + 373-409 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 307 71-438 SEQ ID NO: 310 SEQ ID NO: 309 71-342 SEQ ID NO: 312 SEQ ID NO: 311 71-295 + 373-409 SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 313 296-342 + 373-409 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 315 71-342 + 373-409 SEQ ID NO: 318 SEQ ID NO: 317 29-295 SEQ ID NO: 320 SEQ ID NO: 319 29-342 SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 321 29-295 + 373-409 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 323 29-342 + 373-409 La séquence SEQ ID NO: 326 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 325. Ce fragment comprend 253 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 1 au résidu 253 de la séquence SEQ ID NO: 14.
La séquence SEQ ID NO: 328 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 327. Ce fragment comprend 220 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 34 au résidu 253 de la séquence SEQ ID NO: 14.
La séquence SEQ ID NO: 330 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 329. Ce fragment comprend 180 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 254 au résidu 433 de la séquence SEQ ID NO: 14.
La séquence SEQ ID NO: 332 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 331. Ce fragment comprend 46 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 254 au résidu 299 de la séquence SEQ ID NO: 14.
La séquence SEQ ID NO: 334 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 333. Ce fragment comprend 50 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 373 au résidu 422 de la séquence SEQ ID NO: 14.
La séquence SEQ ID NO: 336 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 335. Ce fragment comprend 148 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 433 au résidu 580 de la séquence SEQ ID NO: 14.
Les fragments de la protéine nétrine 3 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 338 à SEQ ID NO: 380, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 337 à SEQ II) NO: 379 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 338 SEQ ID NO: 337 1-422 SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 339 254433 SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 341 1-253 + 433-580 SEQ ID NO: 344 SEQ ID NO: 343 1-299 SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 345 1-253 + 373-422 SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 347 1-299 + 373-422 SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO: 349 254-299 + 433-580 SEQ ID NO: 352 SEQ ID NO: 351 373-422 + 433-580 SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 353 254-299 + 373-422 SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 355 254-299 + 373-422 + 433-580 SEQ ID NO: 358 SEQ ID NO: 357 1-299 + 433-580 SEQ ID NO: 360 SEQ ID NO: 359 1-253 + 373-422 + 433-580 SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO: 361 1-299 + 373-422 + 433-580 SEQ ID NO: 364 SEQ ID NO: 363 34-433 SEQ ID NO: 366 SEQ ID NO: 365 34-253 + 433-580 SEQ ID NO: 368 SEQ ID NO: 367 34-299 SEQ ID NO: 370 SEQ ID NO: 369 34-253 + 373-422 SEQ ID NO: 372 SEQ ID NO: 371 34-580 SEQ ID NO: 374 SEQ ID NO: 373 34-299 + 373-422 SEQ ID NO: 376 SEQ ID NO: 375 34-299 + 433-580 SEQ ID NO: 378 SEQ ID NO: 377 34-253 + 373-422 + 433-580 SEQ ID NO: 380 SEQ ID NO: 379 34-299 + 373-422 + 433-580 La nétrine 4 mutée, représentée par la séquence SEQ ID NO: 382, correspond à la protéine nétrine 4 représentée par SEQ ID NO: 2 présentant les 9 mutations ponctuelles suivantes: remplacement de la cystéine en position 13 par une arginine, remplacement de la lysine en position 68 par une thréonine, remplacement de la sérine en position 183 par une proline, remplacement de l'histidine en position 205 par une tyrosine, remplacement de la cystéine en position 234 par une tyrosine, remplacement de l'alanine en position 331 par une asparagine, remplacement de la cystéine en position 332 par une arginine, remplacement de l'asparagine en position 353 par une sérine, remplacement de l'asparagine en position 515 par une lysine.
La séquence SEQ ID NO: 386 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 385. Ce fragment comprend 260 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 382.
La séquence SEQ ID NO: 388 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 387. Ce fragment comprend 255 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 261 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO: 382.
La séquence SEQ ID NO: 390 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 4 mutée délétée de la séquence SEQ ID NO: 20, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 389. Ce fragment comprend 515 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO: 382.
La séquence SEQ ID NO: 398 est un fragment de type laminine de la protéine 30 humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 397. Ce fragment comprend 229 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 32 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 382.
La séquence SEQ ID NO: 396 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 395. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 332 au résidu 387 de la séquence SEQ ID NO: 382.
Les fragments de la protéine nétrine 4 mutée correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 392 à SEQ ID NO: 508, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 391 à SEQ ID NO: 507 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 382 SEQ ID NO: 392 SEQ ID NO: 391 32-515 SEQ ID NO: 394 SEQ ID NO: 393 32628 SEQ ID NO: 396 SEQ ID NO: 395 332-387 SEQ ID NO: 398 SEQ ID NO: 397 32-260 SEQ ID NO: 400 SEQ ID NO: 399 1-260 + 516-628 SEQ ID NO: 402 SEQ ID NO: 401 261-628 SEQ ID NO: 404 SEQ ID NO: 403 1-320 SEQ ID NO: 406 SEQ ID NO: 405 1-260 + 332-387 SEQ ID NO: 408 SEQ ID NO: 407 1-260 + 394-445 SEQ ID NO: 410 SEQ ID NO: 409 32-320 SEQ ID NO: 412 SEQ ID NO: 411 32-260 + 332-387 SEQ ID NO: 414 SEQ ID NO: 413 32-260 + 394-445 SEQ ID NO: 416 SEQ ID NO: 415 261-320 + 332-387 SEQ ID NO: 418 SEQ ID NO: 417 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 420 SEQ ID NO: 419 261-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 422 SEQ ID NO: 421 1-320 + 332-387 SEQ ID NO: 424 SEQ ID NO: 423 1260 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 426 SEQ ID NO: 425 1-320 + 394-445 SEQ ID NO: 428 SEQ ID NO: 427 32-320 + 332-387 SEQ ID NO: 430 SEQ ID NO: 429 32-260 + 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 432 SEQ ID NO: 431 32-320 + 394-445 SEQ ID NO: 434 SEQ ID NO: 433 1-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 436 SEQ ID NO: 435 32-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 438 SEQ ID NO: 437 332387 + 516-628 SEQ ID NO: 440 SEQ ID NO: 439 32-260 + 516-628 SEQ ID NO: 442 SEQ ID NO: 441 32-320 + 516-628 SEQ ID NO: 444 SEQ ID NO: 443 132-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 446 SEQ ID NO: 445 32-260 + 394-445 + 516628 SEQ ID NO: 448 SEQ ID NO: 447 1-320 + 516-628 SEQ ID NO: 450 SEQ ID NO: 449 1-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 452 SEQ ID NO: 451 1-260 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 454 SEQ ID NO: 453 261-320 + 332-387 + 516628 SEQ ID NO: 456 SEQ ID NO: 455 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 458 SEQ ID NO: 457 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 460 SEQ ID NO: 459 1-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 462 SEQ ID NO: 461 1260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO: 463 1-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 466 SEQ ID NO: 465 32-320 + 332-387 + 516628 SEQ ID NO: 468 SEQ ID NO: 467 32-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 470 SEQ ID NO: 469 32-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 472 SEQ ID NO: 471 1-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 474 SEQ ID NO: 473 32-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 476 SEQ ID NO: 475 20-260 SEQ ID NO: 478 SEQ ID NO: 477 20-516 SEQ ID NO: 480 SEQ ID NO: 479 20-260 + 516-628 SEQ ID NO: 482 SEQ ID NO: 481 20-320 SEQ ID NO: 484 SEQ ID NO: 483 20-260 + 332-387 SEQ ID NO: 486 SEQ ID NO: 485 20-260 + 394-445 SEQ ID NO: 488 SEQ ID NO: 487 20--320 + 332-387 SEQ ID NO: 490 SEQ ID NO: 489 20-260 -h 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 492 SEQ ID NO: 491 20.-320 + 394-445 SEQ ID NO: 494 SEQ ID NO: 493 20-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 496 SEQ ID NO: 495 20-320 + 516-628 SEQ ID NO: 498 SEQ ID NO: 497 20-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 500 SEQ ID NO: 499 20-260 + 394- 445 + 516-628 SEQ ID NO: 502 SEQ ID NO: 501 20-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 504 SEQ ID NO: 503 20-260 + 332.-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 506 SEQ ID NO: 505 20-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 508 SEQ ID NO: 507 20-320 + 332.-387 + 394-445 + 516-628 L'activité d'activation des péricytes est vérifiée notamment par les tests de prolifération et de migration tels que décrits ci:-après et dans la partie expérimentale. La présente invention concerne également l'utilisation: d'une protéine telle que définie ci-dessus, ou d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ou d'un anticorps anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses, et éventuellement par une activation de la prolifération des cellules endothéliales.
L'activité d'activation des cellules endothéliales est vérifiée notamment par les tests de prolifération tels que décrits ci-après.
L'activité d'inhibition de l'angiogenèse est également désignée activité antiangiogénique. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la différenciation, de cellules endothéliales par les séquences peptidiques de l'invention. La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence de la séquence peptidique dont on souhaite évaluer l'activité. La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une blessure sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence de la séquence peptidique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure.
La mesure de l'inhibition de la différenciation (tubulogenèse) des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tubules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence de la séquence peptidique à tester.
Parmi les modèles classiques de mesure d'angiogenèse, on peut citer les modèles par délivrance locale comme: l'injection sous-cutanée de Matrigel (Becton Dickinson) imprégné du composé de l'invention (Inoki et al., 2002), ou le dépôt sur la membrane chorio-al]antoïdienne de poulet d'un implant contenant un composé de l'invention (Celerier et al., 2002).
Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation selon la présente invention est caractérisée en ce que les pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses, et nécessitant une activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, sont choisies parmi: la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, le glaucome néovasculaire, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique, les angiomes, l'athérosclérose, l'obésité, les malformations intestinales, la maladie de Crohn, les démences vasculaires, sous-corticales vasculaires dont Cadasil est un
exemple,
la maladie d'Alzheimer, les pathologies dégénératives osseuses et les fractures, et les anévrysmes et les dissections vasculaires.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation selon la présente invention est caractérisée en ce que les pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses, et nécessitant une activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, sont choisies parmi: les rétinopathies diabétiques, les malformations intestinales, la maladie de Crohn, l'athérosclérose, l'obésité, les démences vasculaires, telles que la maladie d'Alzheimer, les pathologies dégénératives osseuses et les fractures, et les anévrysmes et les dissections vasculaires.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'activité d'activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses est mesurée selon le test de prolifération ou de migration, et en ce que cette activité d'activation correspond à au moins 120% des cellules obtenues en l'absence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps anti-idiotypique tels que définis ci- dessus.
Cette propriété peut être utilisée pour expandre des cellules musculaires lisses ou des péricytes à partir de tout prélèvement de cellules progénitrices ou de cellules souches afin de pratiquer des thérapies cellulaires.
La mesure de l'activation de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses peut être réalisée en effectuant une "blessure" sur un tapis de cellules et en incubant ensuite les cellules en présence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps antiidiotypique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure.
La mesure de l'activation de la prolifération des péricytes ou des cellules musculaires lisses peut être réalisée en plaçant les péricytes ou cellules musculaires lisses dans un milieu de culture approprié, notamment dans du milieu DMEM ne contenant pas de sérum, et en mesurant ensuite le nombre total de cellules.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'activité d'inhibition de la. formation des plaques d'athérome est mesurée selon le test de prolifération ou de migration susmentionnés, et en ce que cette activité d'inhibition correspond à un pourcentage d'inhibition compris de 20% à 100% des plaques d'athérome obtenues en l'absence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps anti-idiotypique tels que définis ci-dessus.
L'activité anti-athéromateuse est mesurée par le test tel que décrit dans Arnal et al. (2003).
Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de la protéine nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, à titre de substance active.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus de la protéine nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, pour la préparation d'un médicament susceptible d'être administré à raison d'environ 0,1 à environ 20 mg/kg/jour, notamment par voie intraveineuse, par voie sous-cutanée, par voie systémique, par injection intra-vitréenne, par voie locale au moyen d'infiltrations ou par l'intermédiaire d'un collyre, éventuellement associé à une électroperméation.
La protéine nétrine 4 peut également être délivrée par une injection de plasmide codant pour la protéine d'intérêt nétrine 4.
Alternativement, l'une quelconque des nétrines de l'invention ou l'un de ses fragments peut être délivré par tout procédé de dispositif intravasculaire (stents) après fixation de la protéine ou du fragment sur ledit dispositif.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, du fragment de la protéine nétrine 4 représenté par SEQ ID NO: 20, ou d'une protéine ou d'un peptide contenant la séquence SEQ ID NO: 20, d'un gène codant pour ce fragment, ou pour cette protéine ou peptide contenant ce fragment.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'anticorps anti-idiotypiques d'une nétrine, notamment de la protéine nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, lesdits anticorps antiidiotypiques étant caractérisés en ce qu'ils reconnaissent le récepteur UNC5H4 à la surface des péricytes ou cellules musculaires:risses.
Les Inventeurs ont démontré que seul l récepteur UNC5H4 est associé à l'action stimulatrice des cellules musculaires et des péricytes des nétrines 1, 3, 4 et G1.
Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus d'anticorps anti-idiotypiques d'une nétrine, notamment de la protéine nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, reconnaissant le récepteur UNC5H4 à la surface des péricytes ou cellules musculaires lisses, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement despathologies suivantes: la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, le glaucome néovasculaire, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique, les angiomes, l'athérosclérose, l'obésité, les malformations intestinales, la maladie de Crohn, les démences vasculaires, sous-corticales vasculaires dont Cadasil est un 25 exemple, la maladie d'Alzheimer, les pathologies dégénératives osseuses et les fractures, et les anévrysmes et les dissections vasculaires.
La présente invention concerne également l'utilisation du récepteur UNC5H4 à la surface des péricytes ou cellules musculaires lisses, ou de péricytes ou cellules musculaires lisses porteuses de ces récepteurs, pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage de composés activateurs de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses.
La présente invention concerne un procédé de criblage de composés activateurs de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: la mesure de l'inhibition de la liaison de la nétrine 4 à son récepteur UNC5H4, ou de l'inhibition de l'activité mitogénique, chimiotactique, anti-apoptotique ou de différenciation des nétrines ou de tout autre facteur de type nétrine sur les cellules musculaires lisses ou péricytes, et la mesure de la perte de l'inhibition de l'activité mitogénique ou chimiotactique ou anti-apoptotique ou de différenciation des nétrines ou de tout autre facteur de type nétrine sur les cellules musculaires lisses ou péricytes, par adjonction d'un anticorps neutralisant le récepteur UNC5H4.
Les tests utilisés dans le cadre de ce procédé de criblage sont les tests tels que décrits ci-dessus de prolifération ou de migration.
La présente invention concerne un procédé de criblage de composés modulateurs de la liaison entre le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4 représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: la mise en présence dudit composé modulateur avec le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4, et la mesure du taux de liaison spécifique entre le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4, une différence dudit taux en présence dudit composé par rapport au taux normal en l'absence dudit composé étant une indication de la propriété dudit composé à moduler la liaison entre le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4..
Le test de criblage est effectué de la manière suivante: Des immunoglobulines de chèvre dirigées contre les domaines Fc des IgG humaines sont incubées sur des plaques de microtitration (0,1-20 g/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les protéines contenant les domaines extracellulaires du récepteur UNC5H4 fusionné à une séquence Fc d'IgG humaine sont immobilisées sur les plaques de microtitration (incubation à une concentration comprise entre 1 et 1000 ng/ml). Les composés sont ajoutés dilués en série dans du tampon PBS contenant 0,05% de Tween 20 et 10-500 pg de nétrine 1, 3, 4 ou G soit marquée par tout procédé convenable (iode radioactif, biotine, fluorochrome). Après rinçages, la quantité de nétrine liée au récepteur est révélée soit par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-nétrine couplé à la peroxydase, soit par mesure de radioactivité, soit par adjonction d'avidine couplée à la peroxydase, soit par mesure de fluorescence. La peroxydase est ensuite révélée par une réaction colorimétrique. Dans tous les cas, la quantité du composé à tester est mesurée par sa capacité à inhiber la quantité de netrine fixée.
La présente invention concerne également des fragments de nétrine, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes: * l'une des séquences SEQ ID NO: 2p, p variant de 14 à 190, ou * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs io acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'activation des péricytes, ou * toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO: 2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'activation des péricytes.
Les séquences SEQ ID NO: 2p susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO: 28 à SEQ ID NO: 380 et sont des nouveaux fragments de la nétrine 4, de la nétrine 1, de la nétrine G1 et de la nétrine 3; ils présentent par ailleurs une activité anti-angiogénique.
La présente invention concerne également une protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes: * la séquence SEQ ID NO: 382 ou SEQ ID NO: 384, ou * un fragment de l'une de ces protéines, sous réserve que ce fragment présente une activité d'activation des péricytes, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2i, i variant de 193 à 254, * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'activation des péricytes, ou * toute séquence homologue de:l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO: 2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'activation des péricytes.
La protéine SEQ ID NO: 382 susmentionnée est une nouvelle protéine correspondant à la protéine nétrine 4 mutée et la protéine SEQ ID NO: 384 susmentionnée correspond à la protéine SEQ ID NO: 382 sans peptide signal. Ces deux protéines présentent par ailleurs une activité antiangiogénique.
Les fragments susmentionnés, correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 386 à SEQ ID NO: 508, sont de nouveaux fragments correspondant à des fragments de la nétrine 4 mutée susmentionnée; ils présentent par ailleurs une activité anti-angiogénique.
Les séquences SEQ ID NO: 2i susmentionnées correspondent aux séquences protéiques suivantes: SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 506 ou SEQ ID NO: 508.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus.
Une séquence nucléotidique préférée selon l'invention est une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 2p-1 codant pour SEQ ID NO: 2p, p variant de 14 à 190, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO: 2p, p variant de 14 à 190, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO: 2p, p variant de 14 à 190, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO: 2p-1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO: 2p, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
Une séquence nucléotidique préférée selon l'invention est une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 381 codant pour SEQ ID NO: 382, ou la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 383 codant pour SEQ ID NO: 384, un fragment de l'une de ces séquences nucléotidiques, et notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2i-1, i variant de 193 à 254, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO: 2i, i variant de 193 à 254, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO: 2i, i variant de 193 à 254, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO: 2i-1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO: 2i, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
L'expression "hybrider dans des conditions stringentes" correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que 0,5X SSC, à une température d'hybridation de 60 C, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que 0,1X SSC additionné de 1% de SDS et à une température de lavage de 50 C.
Les séquences SEQ ID NO: 2i-1 susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO:2i, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 385 codant pour SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 387 codant pour SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389 codant pour SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391 codant pour SEQ II) NO: 392, SEQ ID NO: 393 codant pour SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395 codant pour SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397 codant pour SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399 codant pour SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401 codant pour SEQ II) NO: 402, SEQ ID NO: 403 codant pour SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405 codant pour SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407 codant pour SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409 codant pour SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411 codant pour SEQ II) NO: 412, SEQ ID NO: 413 codant pour SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 415 codant pour SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 417 codant pour SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419 codant pour SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421 codant pour SEQ II) NO: 422, SEQ ID NO: 423 codant pour SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425 codant pour SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427 codant pour SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429 codant pour SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431 codant pour SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433 codant pour SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435 codant pour SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 codant pour SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439 codant pour SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441 codant pour SEQ II) NO: 442, SEQ ID NO: 443 codant pour SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445 codant pour SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447 codant pour SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449 codant pour SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451 codant pour SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453 codant pour SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455 codant pour SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 codant pour SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459 codant pour SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461 codant pour SEQ II) NO: 462, SEQ ID NO: 463 codant pour SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465 codant pour SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467 codant pour SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469 codant pour SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471 codant pour SEQ II) NO: 472, SEQ ID NO: 473 codant pour SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475 codant pour SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 codant pour SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479 codant pour SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481 codant pour SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483 codant pour SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485 codant pour SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487 codant pour SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 codant pour SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 codant pour SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493 codant pour SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495 codant pour SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497 codant pour SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499 codant pour SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501 codant pour SEQ H) NO: 502, SEQ ID NO: 503 codant pour SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 505 codant pour SEQ ID NO: 506 ou SEQ ID NO: 507 codant pour SEQ ID NO: 508.
La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques tels que définis précédemment, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre un fragment de nétrine tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps monoclonal antiidiotypique, spécifique du récepteur UNC5H4 susmentionné, dirigé contre un anticorps tel que défini ci-dessus. Cet anticorps antiidiotypique est un mime du fragment de nétrine utilisé pour préparer l'anticorps contre lequel cet anticorps anti-idiotypique est dirigé. Ainsi, cet anticorps anti-idiotypique peut être un agoniste ou un antagoniste de UNC5H4. S'il est un agoniste de UNC5H4, il stimule les fonctions des cellules musculaires lisses sans inhiber ou stimuler les fonctions des nétrines sur les cellules endothéliales. S'il est un antagoniste de UNC5H4, il inhibe l'action stimulante des nétrines sur les fonctions des cellules musculaires lisses sans inhiber ou stimuler les fonctions des nétrines sur les cellules endothéliales.
La présente invention concerne également un fragment Fab d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, présentant notamment une activité antagoniste.
Protéines Séquence protéique Séquence nucléotidique Nétrine 4 (avec peptide signal)(1-628) SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 1 Nétrine 4 (sans peptide signal)(20-628) SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 3 Nétrine 1 (avec peptide signal) (1-604) SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 5 Nétrine 1 (sans peptide signal) (25-604) SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 7 Nétrine G (avec peptide signal)(1-530) SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 9 Nétrine G (sans peptide signal)(18-530) SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 11 Nétrine 3 (1-580) SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 13 Nétrine 4 mutée (avec peptide signal)(1-628) SEQ ID NO: 382 SEQ ID NO: 381 Nétrine 4 mutée (sans peptide signal)(20-628) SEQ ID NO: 384 SEQ ID NO: 383 Fragments de nétrine 4 Séquence protéique Séquence nucléotidique 1 (1-260) SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 15 2 (261-515) SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 17 3 (516-628) SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 19 1+2 (1-515) SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 21 la+2 (32-515) SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 23 la+2+3 (32-628) SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 25 2a (261-320) SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 27 2b (332-387) SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 29 EL ON QI âIS PL: ON âHS (Stit-i6 + L8-Z+ OZ-I9Z + 09Z-Z) 3Z+qZ+'Z+tj IL: ON âIS ZL: ON Cff âiS (S6t'-66 + L8- Z+ OZ-I9Z + 09Z-I) 3Z+qZ+'Z+i 69: ON CH â S OL: ON (H âIS (St-t'-66 + OZ-I9Z + 09Z-Z)'Z+uZ+'I L9: ON QI â S 89: ON ai bis (Sbp-b6 + L8-Z + 09Z-Z) 3Z+qZ+B1 S9 ON ( âjS 99 ON (H âIS (L8-Z + OZ-I9Z + 09Z-Z) qZ+tZ+ui 9: ON (H âIS 179: ON QI â1s (St.b-t6 + OZ-I9Z + 09Z-I) 3Z+EZ+ T 19: ON al â s Z9: ON a ?MS (S17t'-t'6 + L8-Z + 092-1) 3Z+qZ+I 6S ON C11 â S 09 ON â S (L8-Z + OZ-19Z + 092-1) qZ+'Z+I LS ON (II âqS 8S: OII (1T âTS (St'P-f76 + L8-Z+ OU-19Z) 3Z+qZ+uZ SS: ON (H â S 9S: ON (H â S (Srf-fr6 + OZ-19Z) 3Z-FEZ S ON (H âHS bS: ON (H â S (Sf711-1'6 + L8-Z) 3Z+qZ I ON CE â ZS: ON CR âIS (L8-Z + OZ-[9Z) qZ+uz 617: ON UT â S OS: ON ais (Sf7f9-'6î + 09Z-Z) 3Z+1T Lti: ON (H âiS 817: ON QI b S (L8-Z + 09Z-Z) qZ+EI Sb: ON (H âHS 917: ON (H â S (OZ-19Z + 0922)'2+'T 17: ON âIS 1717 ON CU â S (Sfrt'-1;.6î + 092-1) 3Z+I It: ON CEI âIS Zb: ON al b s (L8-Z + 09Z-I) qZ+I 6 : ON QI ?ms 017: ON 01 âiS (02-192 + 09Z-I) tZ+I L : ON 01 âHS 8 : ON (H âiS (8Z9-19Z) +Z S : ON G1 âqS 9 : ON CEE âIS (8Z9-91 + 09Z-D +T : ON (H â[S t : ON QI âHS (09Z-Zî) el 1 : ON (H âHS Z : ON â s (St.fr-t.6) 3Z 2a+3 (261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 75 2b+3 (332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 77 2c+3 (394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 79 la+ 3f32-260 + 516-628) SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 81 la+2a+3 (32-260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 83 la+2b+3 (32-260 + 332-387 + 516628) SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 85 la+2c+3 (32-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 87 1+2a+3 (1-260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 89 1+2b+3 (1-260 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 91 1+2c+3 (1-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 93 2a+2b+3 (261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 95 2a+2c+3 (261320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 97 2b+2c+3 (332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 99 2a+2b+2c+3 (261-320 + 332387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 101 1+ 2a+2b+3 (1-260 + 261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 103 1+2b+2c+3 (1260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 105 1+2a+2c+ 3 (1-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 107 la+ 2a+2b+3 (32-260 + 261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 110 SEQ ID NO: 109 la+2b+2c+3 (32-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 111 la+2a+2c+3 (32-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 113 1+2a+2b+2c+3 (1-260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 115 la+2a+2b+2c+3 (32-260 + 261-320 + 332-387+ 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 117 1 sans peptide signal (20-260) SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 119 1+2 sans peptide signal (20516) SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 121 1+3 sans peptide signal (20-260 + 516628) SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 123 1+2a sans peptide signal (20-260 + 261320) SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 125 1+2b sans peptide signal (20-260 + 332387) SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 127 1+2c sans peptide signal (20-260 + 394445) SEQ ID NO: 130 SEQ ID NO: 129 1+2a+2b sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387) SEQ ID NO: 132 SEQ ID NO: 131 1+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 394-445) SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 133 1+2a+2c sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 394-445) SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO: 135 1+2a+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 261-320 +332-387 + 394- 445) SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO: 137 1+2a+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 139 1+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 141 1+2c+3 sans peptide signai (20-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID m.) .144 SEQ lê NO:143 1+2a+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387 + 516- 628) SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 145 1+2b+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 147 1+2a+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 149 1+2a+2b+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 -1 332- 387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 151 61: ON QI âHS 1761: ON ai âHS (OS7-07 + [-68z) aZ+uZ 161: ON UI bis Z61: ON QI âHS (OS7-07 + 96-17) oZ+qZ 681: ON âHS 061: ON Gl âHS (96-I6 + !-78Z) qZ+uZ L81: ON QI âHS 881: ON QI biS (OS7-07 + 8Z-67) aZ+uT 581: ON QI âHS 981: ON QI âHS (96-[7 + 8Z-67) qZ+uI (!-178Z + SZ-67) uZ+uT 8I ON U âHS 1781: ON UI âHS 181: ON UI âHS Z81: ON Ç âHS (OS7 07 + 8Z I) aZ+i 6L1: ON UI âIS 081: ON CU brS (96-17 + 8Z-!) qZ+i 8L 1: ON UI âHS (I-178Z + 8Z-I) uZ+T LL I ON u bas SL1: ON UI OIS 9L1: ON UI OIS (709- 67) +Z+ui LI: ON âHS 17L1: ON UI âHS (L87-67) Z+ ui ILI: ON UI âIS ZLI: ON UI b IS (709-78Z) +Z 691: ON CR âHS OL 1: ON QI âHS (709-886 + SZ [) +I L91: ON UI âHS 891: ON UI âHS (8Z-67) uT S91: ON G â S 991: ON UI âHS (OS7-07) aZ 91: ON GE âIS 1791: ON CH âHS (96-!7) qZ 191:ONUIâ S Z9I:ONUIb1S (I-178Z) uZ 6S1: ON QI âIS 091: ON UI âHS (L87-I) Z+T LSI ON CH ëIS 8S1: ON UI âHS (709-887) SSI: ON UI âHS 9S1: ON CU âHS (L87- 78z) Z SI ON QI âHS 17S1: ON QI âHS (8Z-I) T anbipgoalonu aouanbaS anbtaloid aouanbaS T auiJ;au ap s;umeua3 LEZ ON al bis Z: ON CR âqS (609- 886 + 056-806 + 96E-168) +3Z+qZ su: ON UT ëS 9Z: ON GI â S (609-886 + OS6-806 + [88-682) +3Z+'Z Z ON Cll â S bZ: ON UT ëS (609-886 + 968- 168 + I88-68Z) +qZ+'Z 1 Z ON UT ëIS ZZ: ON al ëis (609-886 + OS6-806 + 882-I) +3Z+1 6ZZ: ON QI âqS OZ: ON âqS (609-886 + 968-I68 + 88Z-I) +qZ+ I LZZ: ON C11 ëjS 8ZZ: ON UI âUS (609-886 + I88-68Z + 88Z-I) +'Z+1 1 SZZ: ON ?MS 9ZZ: ON (H âqS (609-886 + OS/7-806 + 88Z-66) +3Z+EI ZZ ON âqS 17ZZ: ON (H âHS (609-886 + 968-I68 + 8Z-66) +qZ+'I IZZ ON CR âqS ZZZ: ON CR âqS (609-886 + I88-68Z + 88Z-66) +'Z+'I 6IZ nr CR âHS o77: ( cTT bgS (609-886 + 882-66) +Ei LTZ: ON UT ëiS 8IZ: ON al â S (609-886 + OS6-806) +3Z S I Z: ON QI â S 9 I Z: ON CR âHS (609-886 + 968-I68) +qZ 1z ON a l bas t u: ON al bas (609-886 + I88-682) +'Z 11Z: ON UT ëiS ZTZ: ON UT âqS (OS17-8017 + 968-[68 + 188-68Z + 882-66)'2+qZ+uZ+ ti 60Z: ON UT â S OIZ: ON Q ëS (OS6-EO6 + 968-[68 + 788-682 + 88Z-1) 3Z+ qZ+uZ+i LOZ: ON CR âHS 80Z ON Cll âqS (OS6-806 + [88-682 + 882-66) 3Z+uZ+ ti SOZ ON UT ëis 90Z ON UT ëaS (OS6-806 + 968-I68 + 882-66) 3Z+qZ+gi ÒZ ON QI ëES 17OZ ON CU ëaS (968-I68 + I88-682 + 882-66) qZ+'Z+'I i0Z: ON UT bas ZOZ ON CR âqS (OS17-F0P + 788-682 + 882-1) 3Z+'Z+I 661: ON âqS 00Z: ON UT âHS (OS6-806 + 968-[68 + 882-I) 3Z+qZ+I L6I: ON QI ëIS 861: ON al âqS (968-I68 + I88-682 + 882-I) qZ+'Z+i S61 ON GE âqS 96I: ON (H ?MS (OS6-806 + 968-I68 + I88-682) 3Z+qZ+tz 18Z: ON CR âiS Z8Z: ON al âIS (609-886 + OS6-06 + 8Z-SZ) 'tels appdad sues .1-3Z+1 6LZ: ON GI âHS 08Z ON ai â S (609-886 + 96-Ifr + 8Z-SZ) [eeIs aplTdad suis +qZ+T LLZ: ON ai âHS 8LZ: ON l âiS (609-886 + I-b8Z + 8Z-SZ) mals aplTdad sues +uZ+T SLZ: ON âiS 9LZ: ON CR âHS (OS6-Ò6 + 96-I6 + I -68Z + 8Z-SZ) IuuËps appdad sues aZ+qZ+uZ+T LZ ON ai âIS I7LZ: ON ai bas (OS6-Ò6 + f-/7g' + 8Z- T) Ieuâjs app;dad suis aZ+uZ+T ILZ ON CII bas ZLZ: ON CR bas (0Sfi- 06 + 96-I6 + 8- T) p u2Is aplTdad suas aZ+qZ I 69Z: ON bas OLZ: ON CR bis (96-I6 + I-68Z + 8Z-ST) [gels app;dad suas qZ+uZ+I L9Z: ON ai bas 89Z: ON ai bas (OS6-06 + 8z-SZ) mals aplTdad suis aZ+I S9Z ON Cff âIS 99Z: ON UT bas (96-76 + 8Z-SZ.) [eu Is app;dad sues qZ+I
I
9Z: ON (II bas b97: ON al bas (I-68Z + Sz-ç) IeuIs app;dad sues uZ+I 19Z: ON ai bas Z9Z ON QI bas (609-88fr + 8Z-SZ) IeuâIs appdad suas +T 6SZ: ON a bas 09Z ON al bas (L86-SZ) mais aplTdad sues Z+T LSZ ON CR bas 8SZ: ON ai bas (8-Sy) mals aplTdad suis SSZ: ON CR aaS 9SZ: ON ai bas (609-886 + OS6-Ò6 + 96-[6 + I-178î + 8Z-66) +aZ+qZ+eZ+uI SZ: ON ai bas 17SZ: ON ai bas (609-886 + OS6-Ò6 + 96-16 + I-68Z + 8Z-I) + aZ+qZ+uZ+T I SZ ON ai bas ZSZ: ON ai bas 0709-886 + OS6-Ò6 + I -68Z + 8Z-6t) +aZ+eZ+uq 617Z: ON al bas OSZ: ON ai bas (609-886 + OS6-Ò6 + 96-16 + 8Z-66) +aZ+qZ+uT Lt7Z ON ai baS 817Z: ON ai bas (609-886 + 96-I6 + I -68Z + 8Z-66) +qZ+uZ+uJ St7Z: ON bas 917Z: ON ai bas (609886 + OS6-Ò6 + I -fi8Z + 8Z-I) +aZ+eZ+T bZ ON al bas 1717Z: ON ai bas (609-886 + OS6-06 + 96-I6 + 8Z-I) +aZ+qZ+T IbZ ON ai bas Z17Z: ON CR bas (609-886 + 96-I6 + I -68Z + 8Z-I) +qZ+eZ+T 6Z: ON Cll bas ObZ: ON al bas (609-886 + OS6-Ò6 + 96-I6 + I -68Z) + aZ+qZ+uZ 1+ 2a+2b+3 sans peptide signal (25-283 + 284-331 + 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ON CEE a3S (8D-91S + L8-Z) +qz S17: ON QI âqS 917 ON CR OIS (ç -fr6 + L8-Z+ OZ-19Z + 09Z-Z) 3Z+qZ+uZ+'T t ON CR a3S 1717: ON CILI â3S (St t%-t6 + L8-Z+ OZ-19Z + 09Z-I) 3Z+qZ+uZ+i I t cfi: OM (H âqS Zcfi ON (LI OIS cfifi-t6F nec-19Z -Zî) Iz .r au v..v v. v via a.aa OIS 1J// VL V. {. + V/V O9ZV(./ -.-z vi
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6Zt ON CET âqS 017: ON CH a3S (St't-tr6 + L8-Z + 09Z-Z) 3Z+ qZ+ti LZ17: ON CR âqS 8Z17: ON (H âiS (L8-Z + OZ-19Z + 09Z-Z) qZ+'Z+ 'I SZt: ON (H b3S 9217: ON CU bas St P-t'6 + OZ-19Z + 09Z-I) 3Z+'Z+I Z17: ON QI âqS tZt: ON CLI bas St't'-t'6 + L8-Z + 092-1) 3Z+qZ+1 JZt: () Nul bas ZZ17: ON CU bas L8-Z + OZ-19Z + 09Z-1) qZ+'Z+I 6117: ON CFI bas Z17: ON CR bas Sfrt'-b6 + L8-Z+ OZ-[9Z) 3Z+qZ+'Z Lit: ON (H bas 117: ON (H bas St't'-f6 + L8-Z) 3Z+qz 117: ON Cri bas 117: ON QI OIS (L8-Z + 0Z-19Z) qZ+Z 117: ON bas 7117: ON al bas (St't'-t76 + 09ZZ) 3Z+ui 1117: ON OIS ZI17: ON CR bas LS-Z + 09t-Z) qZ+ui 6017: ON CR bas 117: ON CR bas 0Z-19Z + 09Z-Z) Z+ET L017: ON CH bas 017: ON al bas (Sbfr-176 + 092-1) 3Z+I 1+2c+3 (1-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 452 SEQ ID NO: 451 SEQ ID NO: 454 SEQ ID NO: 453 2a+2b+3 (261-320 + 332-387 + 516-628) 2b+2c+3 (332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 456 SEQ ID NO: 455 2a+2b+2c+3 (261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 458 _ SEQ ID NO: 457 SEQ ID NO 460 SEQ ID NO: 459 1+2a+2b+3 (1-260 + 261-320 + 332-387 + 516-628) 1+2b+2c+3 (1-260 + 332-387 + 394-445 + 516- 628) SEQ ID NO: 462 SEQ ID NO 461 1+2a+2c+3 (1-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO: 463 la+2a+2b+3 (32-260 + 261-320 + 332- 387 + 516-628) SEQ ID NO: 466 SEQ ID NO 465 la+2b+2c+3 (32-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 468 SEQ ID NO 467 la+2a+2c+3 (32-260 + 261320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 470 SEQ ID NO: 469 1+2a+2b+2c+3 (1260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 472 SEQ ID NO: 471 la+2a+2b+2c+3 (32-260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 474 SEQ ID NO 473 1 sans peptide signal (20-260) SEQ ÏD NO.4 /0 SEQ iL NO 4 /3 1+2 sans peptide signal (20-516) SEQ ID NO: 478 SEQ ID NO: 477 1+3 sans peptide signal (20-260 + 516-628) SEQ ID NO: 480 SEQ ID NO: 479 1+2a sans peptide signal (20-260 + 261-320) SEQ ID NO: 482 SEQ ID NO 481 1+2b sans peptide signal (20-260 + 332-387) SEQ ID NO 484 SEQ ID NO: 483 1+2c sans peptide signal (20-260 + 394-445) SEQ ID NO 486 SEQ ID NO: 485 1+2a+2b sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387) SEQ ID NO: 488 SEQ ID NO: 487 1+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 394-445) SEQ ID NO: 490 _SEQ ID NO: 489 1+2a+2c sans peptide signal (20-260 + 261320 + 394-445) SEQ ID NO: 492 SEQ ID NO: 491 1+2a+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 261-320 +332-387 + 394-445) SEQ ID NO: 494 SEQ ID NO: 493 1+2a+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 496 SEQ ID NO: 495 1+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 498 SEQ ID NO: 497 1+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 394- 445 + 516-628) SEQ ID NO: 500 SEQ ID NO: 499 1+2a+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 502 SEQ ID NO: 501 1+2b+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 504 SEQ ID NO: 503 1+2a+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 261- 320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 506 SEQ ID NO: 505 1+2a+2b+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 508 SEQ ID NO: 507
46 DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 correspond au test de migration des cellules musculaires lisses d'aorte. Les cellules sont comptées dans 8 champs et la moyenne et l'écart-type sont représentés sur l'axe des ordonnées. L'axe des abscisses correspond à la concentration des protéines nétrine 1 et nétrine 4 en ng/ml. Les colonnes blanches correspondent à une concentration de 0 ng/ml; les colonnes avec les hachures verticales correspondent à une concentration de 6 ng/ml; les colonnes avec les hachures horizontales correspondent à une concentration de 18 ng/ml; les colonnes avec les hachures obliques correspondent à une concentration de 55 ng/ml; les colonnes grises correspondent à une concentration de 160 ng/ml et les colonne noires correspondent à une concentration de 500 ng/ml.
La Figure 2 correspond au test de prolifération des cellules musculaires lisses d'aorte. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine nétrine 1, G1 ou 4 en ng/ml et l'axe des ordonnées à la densité optique mesurée à 595 nm. La courbe avec les ronds blancs correspond aux cellules ayant reçu de la nétrine G1; la courbe avec les carrés blancs correspond aux cellules ayant reçu de la nétrine 1 et la courbe avec les carrés noirs correspond aux cellules ayant reçu de la nétrine 4.
La Figure 3 représente l'effet d'un anticorps anti-néogénine. L'axe des ordonnées représente la densité optique à 595 nm. Les colonnes blanches correspondent au cas sans anticorps anti-néogénine et les colonnes noires correspondent au cas où 5 g/ml d'anticorps anti-néogénine ont été injectés aux cellules.
La Figure 4 représente la séquence protéique de la nétrine 4 (SEQ ID NO: 2) et la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 1).
La Figure 5 représente la séquence protéique de la nétrine 1 (SEQ ID NO: 6) et la 30 séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 5).
La Figure 6 représente la séquence protéique de la nétrine 3 (SEQ ID NO: 14) et la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 13).
La Figure 7 représente la séquence protéique de la nétrine G1 (SEQ ID NO: 10) et la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 9).
La Figure 8A représente la séquence protéique de la nétrine 4 mutée (SEQ ID NO: 382) et la Figure 8B représente la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 384).
PARTIE EXPÉRIMENTALE Matériels: Les molécules nétrine 1 (SEQ ID NO: 6), nétrine 4 (SEQ ID NO: 2), nétrine 3 (SEQ ID NO: 14) et nétrine Gi (SEQ ID NO: 10) sont des protéines recombinantes.
L'isoforme de 165 acides aminés du VEGF' est produite par infection de cellules d'insecte SF9 par un baculovirus recombinant contenant l'ADNc correspondant (Plouët et al., 1997).
Des cellules musculaires lisses d'aorte(Clonetics) ont été maintenues dans du milieu DMEM additionné de 15% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chaleur, 100 gg/ml de pénicilline et 100 gg/ml de streptomycine à 37 C dans 10% de CO2. Les cultures souches ont reçu 2 ng/ml de FGF chaque jour pair.
Tests de migration Des cellules musculaires lisses (VSM) sont inoculées dans des puits de 4 cm2 à haute densité (50 000 cellules/puits). Quand la monocouche est confluente, la prolifération est arrêtée par l'incubation, pendant une nuit, en présence de M199 (Life Sciences) contenant 2% de SVF. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche à l'aide d'un grattoir mousse, permettant de délimiter une surface libre de toute cellule. Les monocouches sont ensuite lavées 3 fois par du M199 pour enlever les cellules non adhérentes. Une photographie est alors prise pour délimiter la surface avant toute migration cellulaire. Les puits sont ensuite incubés en M199 et 2% de SVF seul ou en présence de 50 ng/ml de VEGF en présence de concentrations variables de nétrine 4 (NET-4) ou nétrine 1 (NET-1). Après 24 h les puits sont lavés 3 fois et colorés au May-Grunwald-Giemsa et photographiés. Les photographies prises avant et après l'expérience sont alors superposées pour permettre le comptage des cellules ayant migré.
Les résultats de ces tests sont indiqués dans la Figure 1.
D'après la Figure 1, on constate que la nétrine 1 et la nétrine 4 ont un effet positif sur la migration des VSM. En effet, la nétrine 1 et la nétrine 4 stimulent la migration des cellules musculaires lisses et 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 20 ng/ml de NET-4.
Tests de prolifération Des plaques de culture à 96 puits ont été ensemencées avec 2 000 cellules VSM par puits dans du milieu DMEM additionné de 10% de SVF. Les cellules ont été stimulées ou non avec différentes concentrations de nétrine 1, netrine G1 ou nétrine 4.
Dans certains puits 5 g/ml d'anticorps anti-néogénine ont été ajoutés. Au bout de 5 jours, les puits ont été rincés doucement avec du DMEM et les cellules ont été fixées dans 1% de glutaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de cristal violet (Kueng et al., 1989) : les cellules ont été incubées dans 0,1% de cristal violet (Sigma) pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant violet cristallisé incorporé a ensuite été solubilisé par 100 l de 10% d'acide acétique par puits. Les lectures de densité optique ont été effectuées à 595 nm. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois expériences séparées (voir Figure 3). Les valeurs indiquées sont des densités optiques moyennes de 6 puits SD.
Les protéines nétrine 1, netrine G el nétrine 4 utilisées seules ont un effet significatif sur la prolifération sur un mode dépendant de la dose. 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 20 ng/ml.
La figure 3 montre que l'addition d'anticorps anti-néogénine ne reverse pas 25 l'activité inhibitrice de la prolifération induite par la nétrine 4..
Production d'anticorps anti-idiotypiques Dans un premier temps on prépare un anticorps neutralisant de nétrine 1, 3, G ou 4 ou de l'un de ses fragments susmentionnés (SEQ ID NO: 28 à 380) en injectant à un animal, notamment une souris, ladite nétrine ou ledit fragment mélangée avec de l'adjuvant complet de Freund (1 volume par volume de nétrine ou de fragment de nétrine). On choisira une quantité de nétrine ou de fragment de nétrine comprise entre 10 et 500 g/kg de poids corporel pour immuniser l'animal. La même opération est effectuée à 15 et 30 jours d'intervalle, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Au jour 40 une saignée est pratiquée, le sérum est séparé et les immunoglobulines sont purifiées par toute méthode de fractionnement habituelle, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie d'affinité pour la protéine A ou G. On mesure l'activité neutralisante des immunoglobulines par n'importe quel test décrit (par exemple, dans le cas de la nétrine 4 ou de l'un de ses fragments, liaison de la nétrine 4 marquée au domaine extracellulaire de l'un quelconque de ses récepteurs, prolifération, migration, adhésion cellulaire). Ainsi, un lot d'anticorps sera dit neutralisant quand il aura la capacité d'inhiber l'interaction de la nétrine 1, 3, 4 ou G avec soit le domaine extracellulaire de dcc, soit de néogénine, soit de UNC5H1, soit de UNC5H2, soit de UNC5H3, soit de UNC5H4.
Dans un deuxième temps on prépare des anticorps anti-idiotypiques de la nétrine 1, 3, G ou 4, ou de l'un de leurs fragments en injectant à des souris par voie sous-cutanée 1-100 g de la préparation des immunoglobulines neutralisant l'activité de ladite nétrine ou dudit fragment précédemment décrites en association avec 100 l d'adjuvant, notamment de l'adjuvant complet de Freund (Sigma). L'injection est répétée 15, 30 et 45 jours après. Cinquante-cinq jours après la première injection, on injecte à des souris 10 g du même anticorps par voie intrapéritonéale. Cinquante-huit jours après la première injection, les souris sont sacrifiées et leurs rates sont prélevées et dilacérées dans du milieu ISCOVE pour libérer les splénocytes. Les splénocytes sont fusionnés avec des cellules de myélome de souris, notamment des cellules AG8X 63 (Kearney et al., 1979), et incubés à raison de 100 000 cellules/puits. La fusion s'effectue par ajout de 20 fois 50 l de polyéthylène glycol (PEG) à 30 secondes d'intervalle. Quatre ml de milieu ISCOVE préchauffé à 37 C sont alors ajoutés goutte à goutte sur la suspension cellulaire, puis après une période d'incubation de 4 minutes à 37 C, 4 ml sont ajoutés. La suspension est centrifugée puis le culot cellulaire est alors repris dans 100 ml de milieu ISCOVE complémenté avec 20% de sérum de veau foetal et du HAT 1X (50X: Hypoxanthine 5 mM, Aminoptérine 20 M et Thymidine 0,8 mM) et distribuées à raison de 100 l par puits sur les macrophages. Après 5 jours, 100 l de milieu HAT sont ajoutés, et entre 8 et 14 jours le milieu conditionné de chaque hybridome est prélevé pour mesurer par ELISA les anticorps dirigés contre les anticorps ayant servi d'agent immunogène, c'est à dire les anticorps anti- nétrine 1, 3, G ou 4. On mesure alors l'activité des anticorps anti- idiotypiques par un test ELISA: Les fragments Fab des immunoglobulines anti-nétrine 1, 3, G ou 4, préparés par toute technique conventionnelle, notamment une digestion à la papaïne, sont immobilisés sur des plaques de microtitration (0,1-20 gg/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les surnageants de cultures d'hybridomes sont ajoutés dilués pour moitié dans du tampon PBS (solution tampon phosphate) contenant 0,05% de Tween 2,0. Après rinçages, les anticorps antiidiotypiques sont révélés par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-Fc de souris couplé à la peroxydase. La quantité d'anticorps anti-idiotypique fixé est alors mesurée par révélation de la peroxydase et est proportionnelle à l'intensité de la réaction colorimétrique.
ro Les hybridomes sélectionnés par leur capacité à sécréter des anticorps dirigés contre des anticorps anti-nétrine 1, 3, G ou 4 sont alors clonés, c'est-à-dire que les cellules sont ensemencées en condition de dilution limite (5 cellules/ml) sous un volume de 0,1 ml par puits. Le milieu est changé après 10 jours. Après 15 jours, certains puits contiennent des foyers de cellules qui se sont multipliées à partir de la cellule ensemencée au départ, donc toutes ces cellules sont identiques et sont issues du même clone. Quand la surface occupée par les cellules représente au moins la moitié de la surface totale du puits, le milieu est prélevé et analysé comme précédemment par un ELISA sur Fab anti-NOV. A ce stade, on peut sélectionner les clones producteurs d'anticorps et connaître leur spécificité.
On met en oeuvre alors un second ELISA: des immunoglobulines de chèvre dirigées contre les domaines Fc des IgG humaines sont incubées sur des plaques de microtitration (0,1-20.tg/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les protéines contenant les domaines extracellulaires des récepteurs des nétrines fusionnés à une séquence Fc d'IgG humaine sont immobilisés sur les plaques de microtitration (incubation à une concentration comprise entre 1 et 100 g/ml). Les surnageants de cultures d'hybridomes sont ajoutés dilués pour moitié dans du tampon PBS contenant 0,05% de Tween 20. Après rinçages, les anticorps antiidiotypiques sont révélés par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-Fc de souris couplé à la peroxydase. La quantité d'anticorps anti-idiotypique fixé est alors mesurée par révélation de la peroxydase et est proportionnelle à l'intensité de la réaction colorimétrique.
Une fois les clones identifiés, leur nature monoclonale est affirmée par l'opération classique consistant à ensemencer une plaque de 96 puits avec des cellules issues du même clone diluées en conditions limites cornme précédemment. Les clones sécréteurs doivent donc tous sécréter un anticorps de même spécificité pour que l'on déclare cet anticorps monoclonal. Un troisième clonage est alors effectué exactement dans les mêmes conditions pour s'assurer que les clones sont bien monoclonaux.
Les anticorps anti-idiotypiques monoclonaux sont criblés par une batterie de tests, notamment par un test ELISA sur domaines extracellulaires de néogénine, de UNC5H4, de neuropiline 1, d'inhibition de la prolifération ou de la migration des cellules HUAEC, de stimulation de la prolifération ou de la migration des cellules muscualires lisses (VSM) et des péricytes, ou des tests de mesure in vivo d'une activité anti- angiogénique ou d'inhibition du développement des plaques d'athérosclérose ou de réduction de la taille de l'anévrysme dans un modèle expérimental.
Les anticorps anti-idiotypiques ainsi obtenus sont donc des mimes de domaines de nétrines. Le but est de fabriquer une "image interne" d'un domaine de nétrine et donc de pouvoir obtenir un anticorps liant un récepteur de nétrine sans lier tous les récepteurs.
Une fois la spécificité attestée, on détermine la fonction agoniste ou antagoniste de cet anticorps donné en mesurant son activité sur des cellules, par exemple: agoniste de UNC5H4: stimule les fonctions des VSM sans inhiber ou stimuler les fonctions des nétrines sur les cellules endothéliales artérielles ombilicales humaines (HUAEC) ou antagoniste de UNC5H4: inhibe l'action stimulante des nétrines sur les fonctions des VSM sans inhiber ou stimuler les fonctions des nétrines sur les HUAEC.
L'intérêt général de ces anticorps est de pouvoir mimer une fonction des nétrines sur une cible cellulaire sans affecter d'autres cibles. Ainsi, il serait intéressant de stimuler les fonctions des péricytes sans induire l'apoptose des cellules endothéliales ou inhiber leur migration, leur prolifération ou leur différenciation dans certaines pathologies telles que: la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, à un stade précoce où le. raréfaction des péricytes précède la neovascularisation, le glaucome néovasculaire, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique, les angiomes, l'athérosclérose, l'obésité, les malformations intestinales, la maladie de Crohn, les démences vasculaires, sous-corticales vasculaires dont Cadasil est un exemple, la maladie d'Alzheimer, les anévrysmes et les dissections vasculaires.
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Claims (6)
1. Utilisation d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: * la nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou * un fragment de l'une de ces protéines, ledit fragment étant représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2n, n variant de 8 à 76, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses, et nécessitant une activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, sont choisies parmi: la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, le glaucome néovasculaire, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique, les angiomes, l'athérosclérose, l'obésité, les malformations intestinales, la maladie de Crohn, les démences vasculaires, sous-corticales vasculaires dont Cadasil est un exemple, la maladie d'Alzheimer, les pathologies dégénératives osseuses et les fractures, et les anéveysmes et les dissections vasculaires.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'activité d'activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses est mesurée selon le test de prolifération ou de migration, et en ce que cette activité d'activation correspond à au moins 120% des cellules obtenues en l'absence de la protéine.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de la protéine nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, à titre de substance active.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, d'une nétrine, notamment de la protéine nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, pour la préparation d'un médicament susceptible d'être administré à raison d'environ 0,1 à environ 20 mg/kg/jour, notamment par voie intraveineuse, par voie sous-cutanée, par voie systémique, par injection intra-vitréenne, par voie locale au moyen d'infiltrations ou par l'intermédiaire d'un collyre, éventuellement associé à une électroperméation.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, du fragment de la protéine nétrine 4 représenté par SEQ ID NO: 20, ou d'une protéine ou d'un peptide contenant la séquence SEQ ID NO: 20, ou pour cette protéine ou peptide contenant ce fragment.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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