FR2874695A1

FR2874695A1 - Procede et systeme d'analyse proteomique

Info

Publication number: FR2874695A1
Application number: FR0409236A
Authority: FR
Inventors: Antony Coleman; Jerome Gilbert; Adina Lazar; Bonfils Julien De
Original assignee: DELTA PROTEOMICS SOC PAR ACTIO; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1
Current assignee: DELTA PROTEOMICS SOC PAR ACTIO; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2004-08-31
Publication date: 2006-03-03
Anticipated expiration: 2024-08-31
Also published as: FR2874695B1

Abstract

Système d'analyse d'échantillons comprenant un mélange d'au moins une protéine et un solvant pour effectuer une analyse selon un procédé d'analyse de protéines ou de complexe protéique. Le système comprend des moyens pour recevoir le support et son échantillon, des moyens d'induire la formation de micro-motifs, des moyens d'examen des micro-motifs et/ou des moyens d'examen des effets induits pendant et/ou après leur formation, des moyens de stockage et/ou d'accès aux résultats de référence, et des moyens de comparaison entre le résultat de l'examen d'un échantillon à analyser et les résultats de référence.

Description

Procédé et système d'analyse protéomique La présente invention a pour objet un procédé d'analyse chimique et/ou biologique d'un échantillon comprenant un mélange d'au moins une protéine et un solvant.
L'invention a également pour objet un système permettant la mise en oeuvre d'un tel procédé d'analyse. Les échantillons à analyser peuvent comprendre en outre des molécules non-organiques ou organiques, des mélanges de protéines ou des systèmes biologiques macromoléculaires ou des mélanges de telles molécules. Il est également envisageable d'analyser d'autres produits sous forme de co-solutés présents dans l'échantillon.
L'invention permet notamment l'analyse des protéines, seules ou en mélange, dans un échantillon. Ce type d'analyse, connu sous le nom d'analyse protéomique a pour objectif, par exemple, l'identification des protéines présentes dans un échantillon biologique, la détection de protéines mutées, la caractérisation des modifications posttranslationnelles des protéines, telles que les phosphorylations, l'identification des interactions entre protéines ou la détection des protéines qui sont différentiellement exprimées dans au moins deux échantillons biologiques. L'analyse protéomique est particulièrement importante dans le domaine de la biologie animale et végétale car elle permet la compréhension des processus biologiques dans leur globalité.Dans le domaine de la médecine humaine et vétérinaire elle permet par exemple la découverte de marqueurs de maladies qui sont utiles pour le développement de méthodes de diagnostic précoce et de méthodes de traitement efficaces. L'analyse protéomique est également utilisée lors du développement de nouveaux médicaments, notamment pour la caractérisation de leurs propriétés pharmacologiques, thérapeutiques ou toxicologiques.
L'invention peut également être avantageusement utilisée dans le domaine de l'alimentation car elle permet, par exemple, de détecter la présence de substances toxiques ou allergisantes ainsi que dans le domaine de l'environnement, par exemple, pour la détection de polluants.
L'analyse des protéines nécessite plusieurs étapes, notamment des étapes de purification, de séparation, de caractérisation et d'identification. Les méthodes utilisées pour ces différentes étapes sont fondées sur les propriétés physiques, chimiques ou biologiques des protéines et nécessitent la mise en oeuvre de techniques souvent lourdes et complexes. On utilise, par exemple, des techniques d'électrophorèse uni- ou bidimensionnelle ou de chromatographie en phase liquide pour séparer les protéines contenues dans un échantillon. On utilise classiquement différentes techniques de spectrométrie de masse ou des techniques de reconnaissance biologique, basées par exemple sur les interactions antigène-anticorps, pour l'identification des protéines.
Toutes ces techniques connues sont généralement complexes et coûteuses et nécessitent des savoir-faire approfondis de la part des professionnels qui les mettent en u̇vre.
Les techniques d'analyse connues ont également l'inconvénient de fournir des résultats qui varient de manière importante en fonction des conditions opératoires. La grande variabilité des résultats qui caractérise les solutions à l'état de l'art rend difficile le travail en collaboration ou les comparaisons entre des travaux d'origine différente. Le procédé selon l'invention offre l'avantage supplémentaire d'une dépendance significativement moins grande vis à vis des conditions opératoires que dans le cas des autres méthodes connues et de ce fait offre des possibilités de standardisation et de rationalisation des analyses répondant à un besoin souvent exprimé par les professionnels concernés.
Enfin, les techniques d'analyse connues nécessitent souvent de marquer les protéines à analyser avec des sondes, par exemple fluorescentes ou radioactives. L'utilisation de telles sondes augmente la durée et les coûts de l'analyse et nécessite des connaissances spécialisées de la part du laboratoire d'analyses.
Les raisons qui précèdent cantonnent les méthodes d'analyse protéomique connues aux applications de recherche et excluent pratiquement leur utilisation à grande échelle, notamment à des fins de diagnostic dans le cadre d'une médecine préventive performante.
Il existe donc un besoin important pour un procédé et un appareillage qui permettent une analyse rapide et fiable par des moyens peu onéreux pouvant être utilisés à grande échelle par exemple pour diagnostiquer des pathologies par l'analyse de fluides ou d'aérosols corporels, de tissus organiques ou encore pour des applications de contrôle de l'alimentation humaine ou animale. C'est l'objet de la présente invention.
L'invention repose sur la découverte du fait qu'il est possible de former des micro-motifs caractéristiques dans des échantillons liquides comprenant au moins une protéine et déposés sur une surface, et que de tels micro-motifs peuvent être associés de manière biunivoque à la présence d'une protéine, d'un complexe protéique, d'un mélange de protéines ou encore d'un produit chimique ou biochimique en co-solution dans l'échantillon.
Le procédé selon l'invention permet l'analyse d'un échantillon comprenant un mélange d'au moins une protéine et un solvant. Il comprend : - une séquence de préparation et d'examen comportant : - une étape de dépôt de l'échantillon sur un support présentant un état de surface prédéterminé, - une étape d'autoformation, à partir de l'échantillon,de micro-motifs sur le support, et - une étape d'examen desdits micro-motifs et/ou d'effets induits pendant et/ou après leur formation, de façon à produire des résultats d'examen, ladite séquence de préparation et d'examen ayant été préalablement appliquée à un mélange d'une substance de référence et dudit solvant dans des proportions prédéterminées, de façon à produire des données de référence, et - une séquence de traitement comportant :- une étape pour comparer lesdits résultats d'examen avec lesdites données de référence, de façon à produire des données de comparaison, et - une étape pour traiter lesdites données de comparaison, de façon à produire des informations d' analyse dudit échantillon.
Les conditions qui déterminent l'autoformation des micro-motifs selon l'invention dans la première étape sont de préférence dictées par les conditions préalablement mises en oeuvre pour l'obtention des résultats de référence.
Il est ainsi possible, en reproduisant des conditions d'apparition déterminées de micro-motifs caractéristiques dans l'échantillon liquide déposé sur la surface du support, de comparer les informations produites par un système d'analyse à des informations similaires associées de manière biunivoque à la présence d'une protéine, d'un complexe protéique, d'un mélange de protéines ou d'un co-soluté connu.
Il a été constaté de façon surprenante que de tels micro-motifs prennent une forme qui dépend des constituants du mélange et des paramètres d'environnement pendant leur formation. C'est pour cette raison qu'il est nécessaire de contrôler les paramètres d'environnement, au moins ceux dont l'influence est prépondérante, en leur donnant la valeur qui prévalait lors de l'analyse de référence, pour pouvoir se trouver dans les conditions d'une correspondance biunivoque entre les micro-motifs à évaluer et ceux de référence.
Les micro-motifs se forment au sein du dépôt sur la surface du support, du mélange d'au moins une protéine dans sa forme native ou dans ses formes post- translationnelles ou mutées, ladite protéine étant préférentiellement constituée d'au moins 20 acides aminés. L'échantillon peut éventuellement comprendre également d'autres substances ou molécules non-organiques, organiques ou assemblage supra moléculaire.
Les micro-motifs se matérialisent au cours de la séparation liquide/solide qui a lieu au sein de l'échantillon, lors d'une précipitation au sein d'un milieu qui reste liquide ou lors de l'élimination de la phase liquide, par exemple par séchage du mélange dans des conditions de température et éventuellement de pression déterminées.
Les micro-motifs constituent un auto-assemblage organisé et caractéristique de la matière qui précipite sur la surface de dépôt.
La nature des micro-motifs selon l'invention ainsi formés est sensible à de nombreux paramètres qu'il faut contrôler au moins en partie pour mettre en u̇vre avec succès le procédé. En effet, la présence d'autres substances ou molécules dans l'échantillon, la nature chimique et physique de la surface de dépôt ainsi que les paramètres d'environnement auxquels l'échantillon est soumis pendant l'autoformation des micro-motifs, modifient les micro-motifs produits.
Les éléments caractéristiques constitutifs des micro-motifs formés ont des dimensions comprises entre quelques nanomètres et plusieurs micromètres, de préférence entre dix nanomètres et un micromètre. Il s'agit donc d'un ordre de grandeur très éloigné de celui des structures étudiées par les techniques de cristallographie qui sont de l'ordre de l'Angstrcem. Les micro-motifs considérés dans le cadre de l'invention sont en outre très différents de ceux qui caractérisent les cristaux et quasi-cristaux sur le plan géométrique.
En outre, l'apparition des micro-motifs lors de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, est de nature déterministe alors que la cristallisation des protéines est un phénomène dont l'apparition peut être qualifiée de probabiliste. Contrairement aux cristaux et aux quasi-cristaux, les structures constituant ces micro-motifs ne sont souvent pas faits d'une matière homogène sur le plan moléculaire. Dans une mise en oeuvre avantageuse, l'étape d'autoformation des micro-motifs sur le support, comprend une élimination au moins partielle de la phase liquide du mélange.
La méthode préférée d'élimination de la phase liquide du mélange est le séchage de l'échantillon, en milieu ouvert, à pression ambiante à une température contrôlée. La température peut être choisie par exemple entre 25[deg]C et 70[deg]C. La durée de la période de séchage peut être comprise par exemple entre 30 secondes et 12 heures, et de préférence entre 1 et 45 minutes. Le volume de solvant à évaporer peut être compris par exemple entre 1 et 250 microlitres, et de préférence entre 20 et 50 microlitres.
Dans des modes de mise en u̇vre de l'invention plus élaborés, il est possible de mesurer la pression atmosphérique ambiante pendant l'autoformation des micro-motifs pour corriger les résultats obtenus. Il est également avantageux de gérer la température de séchage par paliers décroissants ou selon une loi à décroissance continue pour obtenir un résultat plus rapidement sans pour autant perdre en résolution. En effet, l'autoformation des micro-motifs selon l'invention est un phénomène non-linéaire qui s'accélère fortement en fin de période.En tenant compte de cette caractéristique, il est possible d'optimiser le procédé pour approcher une loi inverse du déroulement naturel des choses pour gagner du temps en début de période par l'application d'une température élevée puis en réduisant la température au fur et à mesure que l'on s'approche de la fin de la période autoformation des micro-motifs. Bien entendu, lorsque le mode de formation en température variable est mis en u̇vre lors de analyse de l'échantillon, il doit avoir été préalablement mis en u̇vre de manière sensiblement identique au cours de l'étape de constitution des informations de référence.
Dans d'autres modes de mise en oeuvre, l'étape d'autoformation des micro-motifs comprend une précipitation de matières solides sur la surface de dépôt au sein d'un volume d'échantillon qui reste liquide pendant l'autoformation des micro-motifs.
Quelle que soit la manière de provoquer l'autoformation des micro-motifs selon l'invention, les caractéristiques des micro-motifs peuvent être plus ou moins influencées par la présence de substances ou de molécules non-organiques ou organiques, présentes dans le mélange initial ou ajoutées avant ou pendant la mise en u̇vre du procédé d'analyse.
Les caractéristiques des micro-motifs peuvent être plus ou moins influencées par des conditions d'environnement particulières appliquées pendant leur auto formation. Ainsi le fait de soumettre l'échantillon à des champs de différentes natures et intensité peut avoir une influence sur les résultats obtenus. Par exemple, en appliquant des champs électriques, magnétiques ou électromagnétiques avec certaines combinaisons d'intensité, de forme d'onde et/ou de fréquence, des modification substantielles des caractéristiques des micromotifs ont été observées. De même, l'application d'ondes ultrasonores, ondes de surface ou vibrations dans des conditions particulières de fréquence, d'intensité, d'orientation et de couplage au milieu à analyser peuvent influer sur les résultats observés.
Le support peut être constitué de différentes matières, telles que des matières synthétiques, des verres, des métaux, des matériaux semi-conducteurs, des cristaux nonorganiques, des cristaux organiques, des cristaux métallo-organiques, des cristaux liquides, des minéraux naturels, des matériaux composites, des polymères, des gels ou des substances colloïdales.
Dans d'autres modes de mise en oeuvre, la surface du support a été préalablement traitée par modification chimique et/ou biochimique superficielle dudit support, de façon à obtenir l'état de surface prédéterminé du support, formant ainsi une couche superficielle chimico-adsorbée ou physio-adsorbée. Une telle modification chimique ou biochimique agit sur les propriétés, notamment physiques, électromagnétiques, optiques, chimiques et/ou biochimiques, de la surface du support. De tels traitements peuvent être induits par des réactions entre la surface du support et un agent de modification, en phase solide, liquide, colloïdale, gazeuse ou plasma. Des produits de la famille des silanes sont, par exemple, des agents de modification chimique des surfaces très efficaces.
Il est également possible de modifier les caractéristiques des surfaces de dépôt selon l'invention par le greffage secondaire d'un système biologique approprié. De tels ligands secondaires peuvent être par exemple des peptides, des protéines, des stéroïdes, des carbohydrates ou des lipides. L'adsorption physique peut inclure en outre des molécules amphiphiles naturelles ou synthétiques. Les moyens mis en oeuvre pour permettre l'adsorption sélective de protéines de l'échantillon peuvent comprendre des couches de Langmuir-Blodgett, en monocouche, en bicouche ou en complexes multicouches, mais aussi des bicouches lipidiques supportées ainsi que des couches polyélectolytes autoassemblées.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, l'état de surface déterminé du support a été obtenu par modification physique superficielle du support. Les propriétés, notamment physiques, électromagnétiques, optiques et/ou chimiques, ont alors été modulées par traitement thermique, implantation ionique, structuration spécifique de la surface (gravure, emboutissage, moulage, dépôts) ou encore par épitaxie.
Lors de l'examen des micro-motifs, on détecte la forme bi-et/ou tridimensionnelle d'au moins une partie des micro-motifs. Généralement, une partie quadratique ou circulaire d'aire comprise entre 400 et 2 500 micromètres carrés est suffisante pour obtenir une information convenable. L'examen comprend la comparaison par reconnaissance des similitudes entre tout ou partie des images.
Les micro-motifs caractéristiques peuvent être détectés par toute technique de microscopie, telle que microscopie optique, microscopie électronique ou à force atomique, microscopie confocale, microscopie en champ proche incluant tout type de source de lumière cohérente ou non, polarisée ou non, ainsi que toute les techniques d'illumination en transparence ou par réflexion, en fond clair ou en fond noir. On peut également utiliser des marqueurs fluorescents.
Les images produites peuvent être exploitées directement par l'utilisateur par comparaison avec des images de référence. La comparaison peut également porter sur des mesures d'éléments caractéristiques, tels que la taille des structures répétitives, la taille d'éléments constitutifs des structures, des mesures de densité d'éléments, des distances entre éléments caractéristiques récurrents ou des angles caractéristiques entre ces éléments.
La reconnaissance des formes et les mesures éventuelles peuvent avantageusement être réalisées par un logiciel de traitement d'image approprié travaillant sur les images à analyser après capture et numérisation en relation avec des informations de référence préalablement déterminées. L'analyse des nouvelles images peut ainsi être entièrement automatisée, jusqu'au résultat final attendu tel que, par exemple, l'état de phosphorylation d'une protéine ou bien un diagnostic d'une pathologie associée à la détection de la présence ou de l'absence d'au moins une protéine ou d'au moins un complexe protéique donné dans un échantillon.
Il est également possible de procéder à l'examen des micro-motifs en passant par la production d'une image caractéristique, par des techniques d'optique diffractive. L'image produite par ces techniques ne représente plus les formes réelles des micromotifs, mais une transformation représentative et pouvant être comparée à des images de référence également transformées et préalablement enregistrées.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, l'examen des micro-motifs peut être fait par une mesure des tensions mécaniques apparaissant à la surface du support pendant et/ou après la formation des micro-motifs.
L'autoformation des micro-motifs, en particulier lorsqu'elle repose sur l'élimination de la phase liquide, entraîne en effet l'apparition de tensions mécaniques de surfaces. La mesure de l'évolution de ces tensions de surface au cours du temps est une source d'information caractéristique qui peut être exploitée par exemple pour identifier une protéine dans l'échantillon analysé. La conversion des tensions mécaniques créées sur la surface du substrat au cours de la formation des micro-motifs en une grandeur détectable et/ou mesurable peut être faite par de multiples techniques, telles que des dispositifs microusinés dans des matériaux comme le silicium par des procédés utilisés dans l'industrie des semi-conducteurs (MEMS).Le dépôt d'échantillons sur des micro-leviers ou des micropoutres ainsi réalisés donne lieu à des déformations, respectivement des fléchissements et des flambages, aptes à révéler l'autoformation de micro-motifs selon l'invention.
Les changements de formes induits dans les microstructures par les tensions mécaniques de surface résultant de autoformation des micro-motifs sont aisément détectables par des moyens optiques ou électroniques. Selon les applications souhaitées, les dispositifs micro-usinés et les moyens de lecture associés peuvent être agencés pour travailler en mode de détection tout ou rien ou dans un mode de mesure de l'amplitude des déformations induites par la formation des micro-motifs.
On peut aussi, par exemple, utiliser comme substrat pour la formation des micromotifs, un matériau piézorésistif, tel qu'un élastomère chargé de particules conductrices comme que de la poudre de graphite, pour mesurer au moyen d'électrodes convenablement disposées, des variations de résistivité représentatives de l'évolution des tensions de surfaces mécaniques résultant de autoformation des micro-motifs.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, lors de l'examen des micro-motifs, on mesure au moins une caractéristique électrique de l'échantillon. On peut mesurer, par exemple, l'évolution, pendant l'autoformation des micro-motifs, de la conductance du mélange entre des électrodes de forme et de disposition appropriées. La forme et la disposition des électrodes préférées sont respectivement circulaire et concentrique. Cette forme et cette disposition présentent des caractéristiques isotropes qui réduisent sensiblement le bruit dû à des effets directionnels internes plus ou moins aléatoires qui naissent au sein de l'échantillon tels que des chemins de conductance préférentiels.
Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux, la comparaison est faite sur une base multidimensionnelle. Il s'agit d'ajouter des éléments variables pour enrichir l'information produite de manière à augmenter la résolution du système selon l'invention dans sa capacité à discriminer certaines protéines que l'on ne peut pas distinguer les unes des autres par une analyse uni-dimensionnelle. On peut, par exemple, mesurer la conductance du mélange entre des électrodes de forme et de disposition appropriée pendant l'autoformation des micro-motifs non plus seulement au moyen d'un courant continu, mais en faisant varier de manière contrôlée la fréquence du courant, son intensité, sa polarité et plus généralement sa forme d'onde.
Bien entendu, le caractère biunivoque de l'association entre une protéine, un complexe protéique ou un produit en co-solution à détecter, avec les données de référence correspondantes, doit être maintenu, quels que soient la complexité et le nombre de dimensions de l'espace des données représentatives.
La mise en u̇vre du procédé selon l'invention est très sensible aux variations d'un grand nombre de paramètres qu'il convient de contrôler pour rester dans les conditions d'une relation biunivoque entre l'objet d'intérêt et sa signature de référence. Cette sensibilité peut avantageusement être mise à profit pour augmenter la résolution du système d'analyse, quels que soient les moyens d'acquisition mis en u̇vre. On peut enrichir l'information produite en faisant varier, de manière contrôlée, l'environnement du mélange à analyser pendant la formation des micro-motifs.
La variable d'environnement la plus critique dans sa capacité à influencer le résultat obtenu est la température à laquelle est soumis l'échantillon pendant l'auto formation des micro-motifs. C'est pourquoi cette grandeur doit être contrôlée pour obtenir des résultats reproductibles et donc exploitables. La température peut également être une source d'enrichissement des données pour améliorer la résolution de l'analyse. Ainsi on peut envisager de réaliser la comparaison des micro-motifs obtenus avec une pluralité de substrats de référence sur lesquels des micro-motifs de référence ont été formés à des températures différentes.
De même, lorsque l'échantillon, pendant l'autoformation des micro-motifs, est soumis à des champs d'une magnitude suffisante, le résultat obtenu peut varier. Cela constitue autant de moyens pouvant être utilisés dans la mise en u̇vre du procédé selon l'invention pour améliorer la résolution jusqu'à obtenir la capacité de discrimination souhaitée. Les champs applicables sont de nature électrique, magnétique ou électromagnétique, mais aussi vibratoire, avec par exemple l'utilisation de sources ultrasonores ou la diffusion d'ondes de surface sur le support de l'échantillon.
La comparaison des micro-motifs obtenus avec un ou plusieurs micro-motifs de référence peut être faite de différentes manières.
La première étape consiste généralement à filtrer pour éliminer ou réduire tous les bruits pouvant interférer avec les données utiles. Puis, dans une deuxième étape, on procède à une recherche de correspondance entre les nouvelles données fournies par le micro-motif résultant de l'échantillon à analyser et celles préalablement enregistrées dans une base de données, associées de manière explicite ou implicite à des micro-motifs de référence obtenus dans des conditions similaires et analogues à des signatures normalisées, elles-mêmes associées aux protéines ou aux complexes protéiques à rechercher.
Dans le cas de l'utilisation d'images des micro-motifs, issues d'un système de visualisation directe par microscopie suivi d'une analyse automatique, on pourra mettre en oeuvre un logiciel de reconnaissance de formes qui s'appuiera sur ces images, produites avec des moyens analogues, qui auront été préalablement enregistrées et associées par exemple à des protéines ou à des complexes protéiques identifiés dans des conditions données.
La reconnaissance exacte des données à analyser par rapport aux données de référence peut être rendue difficile compte tenu du grand nombre de paramètres pouvant influencer les résultats et ceci, quels que soient les moyens d'acquisition mis en oeuvre.
C'est pourquoi on peut avoir avantage à ce que les moyens de comparaison fournissent non pas un résultat absolu mais une mesure de l'écart relatif entre les données provenant de l'analyse et les données de référence. Il est possible d'ajouter un dispositif à seuil après l'obtention d'une mesure de l'écart relatif entre données analysées et données de référence pour fournir un résultat binaire par comparaison entre un seuil fixé et la valeur de la mesure de cet écart. Une information binaire est recherchée dans de nombreuses applications du procédé, par exemple présence ou absence d'un objet d'intérêt de nature protéique ou d'un co-soluté dans l'échantillon. L'information binaire produite peut être agencée pour être directement en rapport avec le but final recherché, tel que par exemple le diagnostic d'une pathologie.
En outre, la mesure de l'écart entre les informations mesurées et les informations enregistrées peut être exploitée en complément de l'information binaire produite pour renseigner l'utilisateur sur la pertinence du résultat fourni par le système, par exemple sur la probabilité associée à un diagnostic.
L'invention peut être appliquée à l'analyse et la détection des protéines comprises dans l'échantillon à analyser. Dans ce cas, on déduit de la comparaison effectuée dans la deuxième étape du procédé, une information sur la protéine ou les protéines présentes dans l'échantillon.
Dans une autre utilisation intéressante de l'invention, l'échantillon comprend, outre une ou plusieurs protéines connues, en mélange dans un solvant, un co-soluté de nature inconnue à titre de produit à analyser.
De tels co-solutés peuvent être des sels en co-solution, des acides, des bases ou des ampholytes, d'autres protéines, des anticorps, des antigènes, des molécules organiques, des molécules non-organiques, des molécules métallo-organiques, des acides nucléiques tels que de l'ADN ou de l'ARN, des allergènes, des lipides, des polymères, des adjuvants provoquant des réactions spécifiques, des molécules ayant des propriété physiques, chimiques ou pharmacologiques spécifiques. Certains co-solutés peuvent permettre en outre l'utilisation de procédés de détection indirecte ou croisée basés par exemple sur la détection de photons tels que la fluorescence, sur la détection de particules, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, ou sur la détection de variations mettant en oeuvre l'électricité ou le magnétisme.
Dans ce cas où la protéine est connue et où l'élément variable est le co-soluté, on déduit de la comparaison effectuée dans la deuxième étape du procédé, une information sur le co-soluté en tant que produit à analyser. Il peut s'agir par exemple d'une toxine présente dans l'échantillon et qu'il convient de détecter et analyser.
L'invention a également pour objet un système d'analyse d'échantillons comprenant un mélange d'au moins une protéine et un solvant, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Le système comprend : - des moyens pour recevoir un support présentant un état de surface prédéterminé, sur lequel un échantillon a été déposé, - des moyens pour induire une autoformation de micro-motifs sur ledit support, à partir dudit échantillon, - des moyens pour examiner lesdits micro-motifs et/ou des effets induits pendant et/ou après leur formation, de façon à produire des résultats d'examen, - des moyens pour stocker et/ou accéder à des données de référence obtenues par un traitement et un examen préalables d'une substance de référence, - des moyens pour comparer les résultats d'examen aux données de référence,de façon à produire des données de comparaison, et - des moyens pour traiter lesdites données de comparaison de façon à produire des informations d'analyse dudit échantillon.
Le système comprend en outre des moyens pour déduire de la comparaison effectuée, une information relative à la présence ou à l'absence de l'entité d'intérêt recherchée, par exemple une protéine, un complexe protéique ou un co-soluté, dans l'échantillon à analyser.
Dans tous les cas, le système comprend avantageusement un jeu de supports d'état de surface déterminé correspondant à ceux qui ont été utilisés pour produire les données de référence, pour l'analyse de différents échantillons. Bien entendu on reste dans le cadre de ) l'invention si l'on multiplie les moyens de traitement unitaires pour augmenter la productivité du système ou élargir son champ d'application.
De même, tout ou partie des composants du système peuvent être indifféremment localisés physiquement sur le lieu de l'analyse ou être externalisés sans sortir du cadre de la présente invention. Dans le cas d'une externalisation physique de tout ou partie des composants du système, l'unité de fonctionnement du procédé selon l'invention repose sur des communications entre les éléments du système. Des moyens de mise en réseau, locaux ou distants (LAN ou WAN) standards, par exemple Ethernet ou Internet, conviennent parfaitement à une mise en u̇vre éclatée de l'invention a des fins de partage local de ressources ou d'accès à des moyens distants.
Il peut y avoir de nombreux avantages à une mise en u̇vre éclatée de l'invention, en particulier dans le domaine économique. En effet, le système selon l'invention devient globalement moins coûteux à déployer si on réduit au minimum les moyens physiquement installés sur le lieu de l'analyse des échantillons et que l'on centralise en un autre endroit, la base de données de référence et/ou les moyens de comparaison entre les données issues de l'analyse avec les données de référence et/ou les moyens d'élaboration d'un résultat en rapport avec les attentes des utilisateurs tels que des diagnostics.
En outre, d'autres avantages économiques peuvent naître du fait que l'accès à tout ou partie des composants du système selon l'invention peut être conditionné à l'obtention de droits d'accès par exemple par une transaction financière ayant lieu lors de chaque analyse ou dans le cadre d'un abonnement au service ou selon toute autre forme d'accord entre les parties concernées.
Une base de données de référence centralisée offre également des avantages en terme de facilité de gestion des mises à jour qui sont nécessairement fréquentes dans le cas de l'invention compte tenu de l'étendue des applications possible et du très grand nombre d'entités protéiques ou de produits en co-solution pouvant présenter un intérêt. En outre l'accès aux données résultant des analyses peut permettre des valorisations complémentaires moyennant des traitements adaptés, par exemple pour extraire des informations pouvant être réutilisées dans le cadre de l'amélioration continue de la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour améliorer par exemple sa résolution, l'étendue de ses domaines d'application et ses performances, par exemple en matière de diagnostic.
Bien entendu toute répartition intermédiaire des composants du système entre le tout local et le tout éclaté reste dans l'objet de l'invention. On peut par exemple stocker localement les données de référence les plus fréquemment utilisés dans le cadre d'une application du procédé, le système pouvant consulter une base de donnée externe et éventuellement spécialisée pour des besoins plus spécifiques.
Dans le mode préféré de mise en u̇vre du système selon l'invention, le support d'échantillon, qui peut réunir une pluralité de surfaces de dépôt, comprend également des moyens d'identification embarqués. Ces moyens d'identification peuvent être physiquement l'impression directe ou via une étiquette d'un code à barres, une étiquette radiofréquence ou bien encore une puce mémoire embarquée. Le dispositif d'analyse selon l'invention inclut alors des moyens de lecture adaptés à la solution d'identification retenue. Dans un mode de réalisation préféré, l'identification repose sur un marquage au laser sur le support d'échantillon que les moyens mis en oeuvre pour l'analyse des micro-motifs permettent de lire et de décoder sans surcoût.Le moyen d'identification associé à chaque support d'échantillon comprend avantageusement un code unique permettant la traçabilité et une facilité de gestion des données issues de l'analyse.
Le moyen d'identification comprend en outre un codage qui est associé d'une manière biunivoque à la description complète de tout ou partie des caractéristiques du support : nature des surfaces du support, leur nombre, types de traitement qu'elles ont subi, processus autoformation des micro-motifs devant leur être associés, référence du lot, code du fabricant, numéro de l'usine, éventuelles données d'étalonnage etc. Le codage d'un numéro unique et le codage des caractéristiques du support peuvent être indifféremment traités en tant qu'objets séparés ou en tant qu'objet imbriqués, par exemple un code unique pouvant être constitué de sous-codes descriptifs auxquels est ajouté un élément de code unique.
Ainsi le système d'analyse selon l'invention peut se gérer automatiquement en fonction du support consommable que l'utilisateur choisit et/ou en fonction du but qu'il recherche. Le système prenant connaissance des conditions opératoires à exécuter par le codage associé au consommable qu'est le support d'échantillon, il est même possible de faire en sorte que le système guide l'utilisateur de manière appropriée pour la suite des opérations à réaliser. La mise en u̇vre d'un tel système entièrement automatisé offre des avantages qui font défaut aux systèmes à l'état de l'art, c'est-à-dire une utilisation qui ne demande aucune compétence particulière et l'élimination des risques d'erreurs lors des manipulations ainsi que lors de la gestion des résultats.
Un des modes de réalisation préférés du système selon l'invention consiste à associer des techniques de détection différentes des micro-motifs ou de leurs effets induits. En effet, un système de détection, par exemple intégralement basé sur la microscopie optique, nécessite des performances et une qualité de réalisation qui ont un certain coût. Il en va de même dans le cas d'un système de détection intégralement basé sur l'analyse des caractéristiques électriques de l'échantillon. En revanche, en combinant ces deux techniques différentes, le besoin en performance pour chacune est notablement moins élevé ce qui permet une réalisation moins coûteuse utilisant par exemple des lentilles en matière plastique moulée pour la partie optique et une électronique simplifiée pour la détection selon les caractéristiques électriques.
On peut aussi avantageusement prévoir un système d'analyse selon l'invention dans lequel le jeu de supports comprend des moyens de rétention d'un ou plusieurs produits déterminés en relation avec les données de référence qui sont destinés à devenir des co-solutés lorsque l'échantillon sera déposé sur les surfaces correspondantes.
Par ailleurs, des moyens physiques et/ou physico-chimiques peuvent être ajoutés au système d'analyse selon l'invention, pour homogénéiser le mélange d'un produit additionnel avec l'échantillon.
La présente invention sera maintenant décrite de manière plus précise à partir de quelques modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et illustrés par les figures annexées sur lesquelles : - les figures la et lb illustrent avec des grossissements différents, une portion d'un micro-motif de référence obtenu comme décrit à l'exemple 1; - les figures 2 à 22 illustrent différents micro-motifs de référence obtenus comme décrits aux exemples 2 à 22; - les figures 23 à 25 illustrent des paramètres géométriques de micro-motifs de référence obtenus comme décrits aux exemples 23 à 25; - les figures 26a et 26b illustrent les variations de résistivité lors de la formation d'un micro-motif de référence; - la figure 27 illustre les variations de résistivité en fonction de la fréquence sur un micro-motif de référence;- la figure 28 représente un ensemble d'images obtenues par microscopie à force atomique illustrant l'exemple 28 ; - les figures 29aECH et 29aREF illustrent respectivement une image obtenue par des moyens optiques simples dans le cadre de l'expérience n[deg]l, et l'image de référence la plus proche obtenue avec de la Fibrine+Na03 ; - les figures 29bECH et 29bREF illustrent respectivement une image obtenue par des moyens optiques simples dans le cadre de l'expérience n[deg]2, et l'image de référence la plus proche obtenue avec BSA+Fibrine+Nac03 ; - les figures 29cECH et 29cREF illustrent respectivement une image obtenue par des moyens optiques simples dans le cadre de l'expérience n[deg]3, et l'image de référence la plus proche obtenue avec BSA+Fibrine+Na03 ;- les figures 30ECH et 30REF représentent respectivement une image d'un micromotif obtenue par des moyens optiques simples, et l'image de référence la plus proche obtenue avec BSA+Na2HPO4 ; - la figure 31 illustre schématiquement les principaux éléments d'un système d'analyse selon l'invention, - la figure 32 illustre une variante du système de la figure 31 ; et - la figure 33 représente une vue de dessus et une vue latérale d'un exemple de réalisation d'un système d'analyse selon l'invention.

Conditions préalables
Dans les exemples suivants, les solutions ont été préparées dans l'eau milliQ purifiée avec un système Millipore (résistivité supérieure à 18 M(cm-l). Les protéines (albumine de sérum bovin ou BSA, fibrine, a-caséine, etc.) proviennent de la société SIGMA et les sels (Na2C03, Na2N03, etc.) de la société ACROS. Lorsque les expériences ont été réalisées sur des lames de verre optique (76 x26xlmm), celles-ci ont été lavées au préalable avec du méthanol et de l'acétone dans un bain à ultrasons, pendant 15 minutes pour chaque solvant, puis séchées avec du papier optique. Les dépôts de gouttes d'échantillons ont été réalisés avec des micropipettes Gilson.Lorsque les mesures ont été faites au microscope à force atomique (ou AFM pour Atomic Force Microscopy), on a utilisé un système Thermomicroscope Explorer équipé d'un scanner de 100 Microm, en mode non-contact. La vitesse de balayage était de 1 à 2 Hz et la résolution était de 500 x 500 points d'échantillonnage par image. Pour chaque échantillon, on a généralement réalisé des balayages à 50 Microm, 25 Microm, 10 Microm et 5 Microm. Les stylets étaient en silicium, la fréquence de résonance était fo=260 kHz et la constante de force était de 45 Newton. On a caractérisé la surface par des mesures topographiques en trois dimensions, à partir d'une mesure angulaire, de mesures de distance et de hauteur, ainsi que de mesures de rugosité. La rugosité moyenne superficielle a été calculée de la façon suivante:
Rms=(1/N) / (Zi-Z) Pour les expériences faites sur des surfaces ayant des propriétés polaires réactives, on a modifié la surface de pastilles de dioxyde de silicium avec des dérivés de silanes achetés auprès de la société ABCR Chemicals. Pour ce faire, on a préparé des solutions de 50 ml comportant 95% d'éthanol et 5 % d'eau en volume auxquelles on a ajouté 1 ml d'un dérivé de silane. Après 5 minutes, un silanol s'est formé. Les pastilles de dioxyde de silicium sont alors plongées dans la solution sous agitation lente pendant 3 à 4 minutes.
Les pastilles sont ensuite lavées dans l'éthanol puis séchées à température ambiante puis chauffées à 130[deg]C pendant 15 minutes avant emploi.

Exemple 1
Cet exemple illustre une étude de la constitution des micro-motifs de BSA formés en présence NaN03.
On a préparé une solution de BSA avec de la Fluorescéine Iso-ThioCyanate (FITC) (10 g/1) et NaN03 (0,154 M). On a déposé des gouttes de 20 Microl de cette solution sur des lames de verre et on a séché ces échantillons à différentes températures afin de montrer l'influence de la température et de la vitesse d'évaporation sur l'organisation des micromotifs protéiques. Les échantillons ont été étudiés en utilisant un microscope à lumière blanche, un microscope à fluorescence confocale et un microscope optique à balayage en champ proche (SNOM) fonctionnant en transmission. On a obtenu également des images de fluorescence et de transmission en utilisant le microscope optique à balayage. Pour toutes les mesures, on a utilisé un laser à argon refroidi à l'air, à 488 nm pour exciter l'échantillon.On a utilisé une combinaison d'un filtre OG515 et d'un filtre OG530 pour séparer la fluorescence de la longueur d'onde d'excitation. On a encore utilisé une seule photodiode à avalanche de comptage de photons (APD) pour détecter finalement la fluorescence émise par l'échantillon. La topographie de l'échantillon est montrée en figure la. La figure lb illustre la fluorescence confocale avec un grossissement moindre. Les micro-motifs de référence visibles sur les figures la et lb représentent de longues structures cristallines, caractéristiques d'une protéine fluorescente à l'intérieur des structures principales de ramification ce qui montre l'importance de l'élément biologique dans l'organisation du motif.
Cette expérience démontre l'importance de la protéine dans l'organisation des motifs : malgré une présence concentrée uniquement dans des zones de petite taille incluses à l'intérieur des motifs, les propriétés spécifiques de la protéine influencent la formation et la géométrie des ramifications générales, cette influence est combinée avec la nature des sels pour déterminer la nature exacte des motifs. Cet exemple montre également la constitution hétérogène de la matière qui constitue les micro-motifs selon l'invention.

Exemple 2:
Cet exemple illustre une formation de micro-motifs et une constitution de données de référence, dans le cas de micro-motifs à cosoluté variable, à protéine fixe, température fixe, et surface fixe, ainsi qu'une étude des micro-motifs produits par l'a-caséine.
On a préparé une solution d'a-caséine (10 g/1) et on a déposé des gouttes de 20 Microl de cette solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, on a examiné les échantillons au microscope à force atomique et on a observé des micro-motifs illustrés par la figure 2. On voit la formation un film d'a-caséine relativement plat avec des concrétions dispersées de tailles variables, comprises entre 0,540 et 0,853 nm et des hauteurs allant jusqu'à 31,85 nm. La rugosité moyenne superficielle est de 12,4 nm; des pores d'environ 100 nm sont dispersés de manière aléatoire dans l'échantillon.

Exemple 3
Cet exemple illustre une formation de micro-motifs et une constitution de données de référence, dans le cas de micro-motifs à cosoluté variable, avec protéine fixe, température fixe, et surface fixe, ainsi qu'une étude des micro-motifs produits par l'acaséine en présence de Na2CO3 .
On a préparé une solution d'a-caséine (10 g/1) et de Na2C03 (0,154 M) et on a déposé des gouttes de 20 Microl de solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, on a soumis la surface du film au microscope à force atomique dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1. On a observé des micro-motifs illustrés par la figure 3 et caractérisés par une structure amorphe nuageuse avec des pores et une organisation légèrement inter fibrillaire et une rugosité superficielle de 354,2 nm.

Exemple 4
Cet exemple illustre une formation de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, et une constitution de données de référence, ainsi qu'une étude des micro-motifs produits par la BSA.
On a préparé une solution de BSA (10 g/1) et on a déposé des gouttes de 20 Microl de cette solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, on a soumis la surface du film au microscope à force atomique dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1. On a observé les micro-motifs illustrés par la figure 4. Le film de BSA est très plat avec une rugosité de 4,03 nm; des concrétions de 150 nm maximum, ainsi que des pores dispersés de manière aléatoire sont présents sur la surface.

Exemple 5
Cet exemple illustre une formation de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, une constitution de données de référence, ainsi qu'une étude des micro- motifs produits par la BSA en présence de Na2C03.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 3 à ceci près que l'on a utilisé de la BSA à la place de l'a-caséine. Les images des micro-motifs obtenues au microscope à force atomique sont illustrées sur la figure 5. On a observé des structures en formes de blocs de tailles variables, comprises entre 0,630 Microm et 1,54 Microm, et présentant une hauteur maximale de 2,12 Microm ; ces blocs sont faits de structures parallèles et confèrent une rugosité moyenne superficielle de 365,6 nm.

Exemple 6
Cet exemple illustre une formation de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, une constitution de données de référence, ainsi qu'une étude des micro-motifs produits par la BSA en présence de Na2HP04.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 5 mais on a utilisé du Na2HP04 à la place de Na2C03. Les images obtenues au microscope à force atomique sont illustrées par la figure 6. On a observé une surface amorphe présentant des fissures de profondeur de 1300 nm et des concrétions de hauteur de 1090 nm conférant une rugosité moyenne superficielle de 374 nm. Cependant, la valeur de rugosité superficielle moyenne pour une zone ne comprenant pas de fissures est de 124 nm, montrant que le film est relativement plat.

Exemple 7
Cet exemple illustre une formation de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par la BSA en présence de NaBr.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 5 à ceci près que l'on a utilisé du NaBr à la place de Na2C03. On a obtenu des images de micro-motifs au microscope à force atomique illustrées par la figure 7. On a observé des agrégats aléatoires mais souvent légèrement organisés comme une structure linéaire. Les blocs coniques qui forment ces agrégats, présentant un diamètre relativement grand allant de 1,3 Microm à 4,22 Microm, peuvent atteindre une hauteur de 4 000 nm. Des structures dendritiques avec une orientation de 90[deg] sont entourées par des pores relativement profonds. La rugosité moyenne superficielle est de 685,17 nm.

Exemple 8
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par la BSA en présence de NaBF4.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 5, mais on a utilisé du NaBF4 à la place de NaC03. Les images obtenues sont illustrées par la figure 8. On a observé des structures régulières et de forme dendritique qui résultent de concrétions organisées de façon extrêmement dense et ayant une hauteur maximum de 500 nm. La rugosité moyenne superficielle est de 80 nm.

Exemple 9
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par la BSA en présence de NaHC03.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 5 sauf que l'on a utilisé du NaHC03 à la place du NaC03. Les images observées sont illustrées par la figure 9. On a observé des structures dendritiques de hauteur maximum d'environ 600 nm. La rugosité moyenne superficielle de la surface est de 95,23 nm.

Exemple 10
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par un mélange d'a-caséine et de fibrine.
On a préparé une solution de 10 g/1 d'a-caséine et on a ajouté à cette solution 1,5 % en volume d'une solution d'hydroxyde de sodium saturé en fibrine (3,8g/1). On a déposé des gouttes de 20 Microl de cette solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20.C pendant 24 heures, les images observées en microscopie à force atomique sont illustrées par la figure 10. Les micro-motifs présentent une micro-porosité circulaire similaire à la structure de certains fromages. De fines concrétions sont présentes à la surface et dans les pores. La rugosité moyenne superficielle de la surface est de 67,5 nm et la différence maximum entre les extrémités est de 161,61 nm.

Exemple 11
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par un mélange de BSA et de fibrine On a opéré de la même manière que dans l'exemple 10 à ceci près que l' alpha -caséine est remplacée par l'albumine de sérum de bovin. Les images obtenues sont illustrées par la figure 11. On observe de grandes sphérulites présentant des hauteurs relativement petites (50 nm). Des concrétions de hauteur de 36 nm sont dispersées de manière abondante sur la surface. La rugosité moyenne superficielle est de 94,08 nm.

Exemple 12
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par un mélange d'a-caséine et de fibrine avec Na2C03 .
On a préparé une solution d' a-caséine (10 g/1), de fibrine (0,285 g/1) et de Na2C03 (0,154 M). On a déposé des gouttes de 20 Microl de cette solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 12. On observe une couche nuageuse qui couvre des agrégats denses et des pores dispersés à la surface. La rugosité moyenne superficielle est de 227,07 nm.

Exemple 13
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par un mélange de BSA et de fibrine avec Na2C03 On a opéré de la même manière que dans l'exemple 12 mais on a remplacé l'acaséine par la BSA. Les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 13. On observe des structures fibrillaires fines et denses de 1,85 Microm de longueur qui se regroupent en blocs légèrement orientés, de taille relativement petite (0,55 Microm). La hauteur maximum atteint 1,29 Microm et la rugosité moyenne superficielle est de 261,07 nm.

Exemple 14
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température variable, surface fixe, produits par la BSA en présence NaN03 obtenus à 20[deg]C.
On a préparé une solution de 10 g/1 de protéine et de 0,154 M de NaN03 et on a déposé des gouttes de 20 Microl de cette solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 14. On observe une structure dendritique très régulière. Les dendrites sont parfaitement organisées, ramifiées à angle droit toujours du même côté. Les principales ramifications ayant une largeur de 3,99 Microm et une hauteur de 450 nm, présentent des canaux de profondeur de 265 nm. Des ramifications secondaires sont moins larges mais légèrement plus élevées (474 nm). On observe une hauteur maximum aux extrémités des dendrites allant jusqu'à 760 nm.

Exemple 15
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température variable, surface fixe, produits par la BSA en présence NaN03 obtenus à 37[deg]C.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 14 à ceci près que l'évaporation a été réalisée à 37[deg]C. Les images obtenues sont illustrées par la figure 15. On observe un film très organisé. La structure est fibreuse et pseudo-dendritique, relativement dense et totalement orientée. Les ramifications principales sont parallèles, présentant des canaux d'environ 260 nm. De courtes ramifications latérales (7,48 um) se situent le long des ramifications principales, toujours du même côté et à un angle constant de 45[deg].

Exemple 16
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température variable, surface fixe, produits par la BSA en présence NaN03 obtenus à 75[deg]C.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 14 mais l'évaporation a été réalisée à 75[deg]C. Les images obtenues sont illustrées par la figure 16. Les structures sont d'aspect pseudo-dendritique. Les ramifications latérales sont, soit longues, soit ramifiées, d'une part, ou courtes et denses d'autre part. La largeur des ramifications principales varie de 0,971 Microm à 4,31 Microm, avec des hauteurs de 700 nm. Les angles de ramification pour les ramifications principales ainsi que pour les secondaires sont de 45[deg].

Exemple 17
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 sur une surface traitée avec de l'aminopropyltriméthoxysilane.
On a préparé une solution de BSA (10 g/1) et de NaN03 (0,154 M). Afin d'obtenir des propriétés polaires réactives, on a modifié la surface d'une pastille de dioxyde de silicium en utilisant le 3- aminopropyltriméthoxysilane.

couche formée à la surface de la pastille (R = aminopropyl) On a déposé 20 Microl de solution de BSA et de NaN03 sur la pastille de dioxyde de silicium modifié sèche. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 17. Le film obtenu est très organisé. La rugosité de la surface est élevée (259 nm) en raison des structures cristallines régulières. Elles présentent la forme de triangles équilatéraux et ont une taille de 12 Microm. Les blocs cristallins sont formés de plusieurs plans superposés et sont légèrement orientés.

Exemple 18
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 sur une surface traitée avec du n-octodécyltriméthoxysilane.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 17 sauf que la surface de la pastille de dioxyde de silicium a été traitée avec du n-octodécyltriméthoxysilane, afin d'obtenir des propriétés hydrophobes, à la place de l'aminopropyltriméthoxysilane.

couche formée à la surface de la pastille (R = octodécyl) On a déposé 20 Microl de la solution de BSA et de NaN03 sur la pastille de dioxyde de silicium modifié. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 18. On observe des blocs cristallins prolongés par des petites structures dendritiques. Les cristaux présentent une forme triangulaire régulière, l'un des côtés mesurant environ 10 Microm, et apparemment formés par des plans superposés. Ces larges blocs confèrent une rugosité moyenne superficielle de 320,2 nm. On observe de fines dendrites sans orientation préférentielle en prolongement des coins cristallitiques et présentant une hauteur moyenne de 50 nm.

Exemple 19
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 sur une surface traitée avec de l'acétoxypropyltriméthoxysilane.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 17 à ceci près que la surface de la pastille de dioxyde de silicium avec de l'acétoxypropyltriméthoxysilane.

Couche formée à la surface de la pastille (R = acétoxypropyl) Les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 19. On observe des structures pseudo-dendritiques régulières. Le développement des pseudo-dendrites est fractal et se fait de manière constante du même côté. Les dendrimères sont parallèles et leurs ramifications sont à 90[deg]. Une rugosité moyenne superficielle importante est constatée.

Exemple 20
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 sur une surface traitée avec de l'isocyanatopropyltriméthoxysilane.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 17 mais on a modifié la surface de la pastille de dioxyde de silicium avec de l'isocyanatopropyltriméthoxysilane afin d'obtenir des propriétés hydrophobes.

Couche formée à la surface de la pastille (R = isocyanatopropyl) Les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 20. On observe des structures organisées de type dendritique. Les ramifications sont orientées dans deux directions perpendiculaires. La taille des dendrites ainsi que leur longueur sont aléatoires et la rugosité moyenne superficielle est de 3 nm.

Exemple 21
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 sur une surface traitée avec de l'aminopropyltriméthyoxysilane.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 17 à ceci près que la surface de la pastille de dioxyde de silicium a été traitée avec de l'aminopropyltriméthyoxysilane.
H2N (CH2)2 CH2 Si OMe OMe OMe Les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 21. On observe une structure très organisée. La rugosité moyenne superficielle de la surface est élevée (259 nm) en raison des structures cristallines régulières. Elles présentent la forme de triangles équilatéraux et une taille de 12 Microm. Les blocs cristallins sont formés de plusieurs plans superposés et sont légèrement orientés.

Exemple 22
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température variable, surface fixe, produits par la BSA en présence de NaN03 à 37[deg]C, sur une surface traitée avec de l'aminopropyltriméthyoxysilane.
On a opéré de la même manière que dans l'exemple 21 à l'exception de la température d'évaporation qui a été fixée à 37[deg]C. Les images obtenues en AFM sont illustrées par la figure 22. On observe un film plutôt amorphe. Les particules en blocs présentent une légère tendance à une organisation pseudo-dendritique. Les ramifications principales sont parallèles et les distances entre elles sont d'environ 15 um mais présentent une taille variable. Elles sont en outre plus ou moins ramifiées. La valeur de la rugosité moyenne superficielle est de 489 nm.

Exemple 23
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 à 20[deg]C, sur une surface traitée avec de l'aminopropyltriméthyoxysilane.
La figure 23 illustre une analyse structurelle faite sur des micro-motifs produits par la BSA en présence de NaN03 sur une surface traitée avec de l'aminopropyltriméthyoxysilane et obtenus à 20[deg]C. On a obtenu les caractéristiques superficielles par des mesures topographiques en trois dimensions telles que les mesures d'angle, de hauteur et de distances, ainsi que la mesure de rugosité en utilisant un logiciel SPMlab, version 5.01. On a traité les images brutes avec un sous-programme de nivellement, dans lesquelles on a éliminé les points ou lignes relatives au bruit. Si nécessaire, on a amélioré le contraste en utilisant un sous-programme de masquage. Les caractéristiques superficielles ainsi que l'analyse de la surface, l'analyse particulaire, les dimensions critiques et les mesures d'angle sont permises par un sous-programme d'analyse.La structure des micro-motifs est fortement organisée. La rugosité moyenne superficielle est élevée (259 nm) en raison des structures cristallines régulières. Ces structures présentent la forme de triangles équilatéraux individuels ou empilés. L'analyse détaillée donne une longueur moyenne d'arête de 8,5 Microm, les arêtes forment un angle de 55 [deg]. Les blocs cristallins sont formés de plusieurs plans superposés et sont légèrement orientés.

Exemple 24
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 à 20[deg]C, sur une surface traitée avec du n-octyltriméthoxysilane.
On a suivi le même protocole d'analyse que dans l'exemple 23. L'étude est illustrée par la figure 24. On observe des structures pseudo-dendritiques régulières. Le développement des pseudo-dendrites est fractal et se produit de manière constante du même côté. Les ramifications primaires ainsi que secondaires et tertiaires sont parfaitement parallèles. Une ramification latérale se produit à des angles de 110[deg]. Des distances de 14 Microm et de 3,5 Microm se forment entre les dendrites principales et les ramifications latérales, respectivement. La rugosité moyenne superficielle est de 237,2 nm.

Exemple 25
Cet exemple illustre la formation et l'étude de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface variable, produits par la BSA en présence de NaN03 à 20[deg]C, sur une surface traitée avec du mercaptopropyltriméthoxysilane.
On a suivi le même protocole d'analyse que dans l'exemple 23. L'étude est illustrée par la figure 25. On observe de structures pseudo-dendritiques régulières. Le développement des pseudo-dendrites se produit du même côté et sont parallèles, et leur longueur ainsi que leur taille sont variables. La distance entre les dendrites principales, secondaires et tertiaires sont de 20,6 Microm, 7,4 Microm et 2,4 Microm respectivement. L'angle de ramification est de 103[deg]. Les dendrites sont élargies par de petites molécules individuelles, motifs que l'on trouve également sur les ramifications principales. La rugosité moyenne superficielle atteint 72 nm.

Exemple 26
Cet exemple illustre la formation de micro-motifs à cosoluté variable, protéine fixe, température fixe, surface fixe, produits par un mélange de CSA et de fibrine en présence de NaCl, ainsi qu'une étude de la résistivité électrique pendant la formation de micro-motifs.
On a préparé une solution de CSA (Chicken Serum Albumin) (10 g/1) et de chlorure de sodium NaCI (0,154 M) ainsi que de fibrine dans différentes proportions. Cette solution a été déposée entre deux électrodes concentriques en cuivre d'épaisseur 35 Microm ayant subi un dépôt d'or électrolytique sur un support en verre époxy. La résistivité électrique pendant la formation des micro-motifs a été mesurée en utilisant un multimètre, de marque Fluke modèle 189, associé à un ordinateur équipé du logiciel Flukeview Forms , les mesures de résistance étant effectuées toutes les cinq secondes.La variation de la résistivité est illustrée sur les courbes de la figure 26a qui montre en outre une courbe correspondant à la CSA seule, une courbe correspondant à un mélange de CSA et de sel, et deux courbes correspondant à des pourcentages respectifs de 2 et 4 % de fibrine ajouté en cosolution. Il apparaît que la résistivité varie en fonction du temps selon la présence et la concentration de la protéine ainsi que selon la présence ou l'absence du sel.
Dans l'exemple illustré par la figure 26b, on a remplacé la CSA par de la BSA et la fibrine par de la caséine. Les courbes obtenues indiquent l'évolution de la résistivité du mélange entre les électrodes en fonction de différents rapports de mélange entre les protéines.

Exemple 27
Cet exemple illustre la formation de micro-motifs à cosoluté fixe, protéine fixe, température fixe, surface fixe, fréquence variable, produits par la BSA en présence de NaCl, ainsi qu'une étude de la résistivité électrique en fonction de la fréquence pendant la formation des_micro-motifs.
On a préparé, dans les mêmes conditions que dans l'exemple 26, une solution de BSA (10 g/1) et de NaCI (0,154 M). La solution a été déposée comme expliqué dans l'exemple 26. Elle a été laissée pendant 24 heures à 20[deg]C pour élimination de la phase liquide avant toute mesure. La mesure de résistivité électrique du micro-motif obtenu a été effectuée par un analyseur HP Network Analyser. La courbe obtenue est représentée sur la figure 27 qui montre la résistivité en fonction de la fréquence et révèle l'existence d'un premier pic caractéristique à une fréquence de 1,5 MHz et d'un second pic caractéristique à une fréquence de 3 MHz.

Exemple 28
Cet exemple concerne une utilisation d'une banque de données de micro-motifs de référence pour l'identification de protéines et des complexes de protéines. Dans cet exemple on illustre la mise en u̇vre de l'invention dans une expérience dont le but est la détection d'un complexe protéique (MRP-GG-GM2) dont la présence dans un échantillon de fluide corporel signe la maladie de la sclérose en plaque.
Pour ce faire on constitue préalablement une base de données contenant les images des micro-motifs issus de toutes les combinaisons des protéines concernées, prises isolément, deux par deux et en complexe triple et ceci sur trois surfaces de dépôt ayant des caractéristiques chimiques de surface différentes (verre, mica et Concavaline A). On voit que pour une ou deux surfaces de dépôt différentes, il existe des ressemblances entre les micro-motifs obtenus qui ne permettraient pas l'identification de tous les éléments protéiques, par exemple (MRP-GG-GM2) sur verre très proche de (MRP-GG-GM2) sur mica et de (GG- MRP) sur ConA, ou les micro-motifs de (MRP-GG-GM2) sur Con A ressemblent aux micro-motifs de (GG-GM2) sur mica.
En revanche, on constate qu'avec un nombre d'au moins trois surfaces de dépôt distinctes judicieusement choisies en fonction du but recherché, l'invention permet de discriminer de manière certaine tous les arrangement possibles des composants protéiques concernés et en particulier le complexe d'intérêt recherché. Des expériences complémentaires ont même démontré la capacité de l'invention à pourvoir discriminer nettement des protéines presque identiques à une mutation près.

Exemple 29
Cet exemple illustre une mise en oeuvre du procédé selon l'invention, et une comparaison de micro-motifs issus d'une analyse avec des micro-motifs de référence. Dans cet exemple, le cosoluté est connu et on recherche une protéine.
On réalise l'expérience suivante : on prend une protéine en aveugle dont on prépare une solution à raison de 10 g/1 à laquelle on ajoute un sel en cosolution : Na03 (0,154 M). On dépose des gouttes de 20 Microl de solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, on observe les micro-motifs qui se sont formés au moyen d'un microscope optique d'entrée de gamme qui a été modifié pour démontrer la faisabilité d'une solution de lecture optique à faible coût. Il s'agit d'un microscope d'initiation PERL équipé d'un objectif x40 et d'un oculaire x10. Un capteur et une électronique de webcam ont été montés sur l'oculaire pour capturer l'image et produire un fichier dans un format compatible avec des outils logiciels de traitement d'image numérique sur PC.
On obtient l'image de la figure 29aECH. On la compare avec toutes les images préalablement mises en mémoire et provenant d'équipements d'imagerie directe donnant des résultats compatibles tels qu'AFM et microscopes optiques. L'image trouvée présentant des micro-motifs ayant une resemblance suffisante avec ceux de l'échantillon et obtenue dans des conditions similaires (même protéine, même surface de dépôt et même température de séchage) est celle qu'illustre la figure 29aREF, qui correspond à une protéine connue, la fibrine.
On procède de la même manière dans le cadre de deux autres expériences illustrées par les figures 29b et 29c, en changeant de cosoluté le cas échéant.

Exemple 30
Cet exemple illustre une mise en oeuvre du procédé selon l'invention, et une comparaison de micro-motifs issus d'une analyse avec des micro-motifs de référence. Dans cet exemple, la protéine connue, le cosoluté inconnu, et on recherche un élément chimique.
On réalise l'expérience suivante : on prend une protéine connue, par exemple la BSA, dont on prépare une solution à raison de 10 g/1 à laquelle on ajoute un sel en cosolution que l'on choisie en aveugle. On dépose des gouttes de 20 Microl de solution sur des lames de verre optique. Après évaporation à 20[deg]C pendant 24 heures, on observe les micromotifs qui se sont formés au moyen d'un microscope à force atomique atomique AFM On obtient l'image de la figure 30ECH. On la compare avec toutes les images préalablement mises en mémoire et provenant d'équipements d'imagerie directe donnant des résultats compatibles tels qu'AFM et microscopes optiques.L'image trouvée présentant des micromotifs ayant une resemblance suffisante avec ceux de l'échantillon et obtenue dans des conditions similaires (même protéine, même surface de dépôt et même température de séchage) est celle qu'illustre la figure 30REF, elle correspond à la présence de Na2HP04 en cosolution. L'invention permet donc d'identifier la nature d'un élément chimique présent dans un échantillon.
La figure 31 illustre de façon schématique les principaux éléments d'un système d'analyse d'échantillon selon l'invention permettant la mise en oeuvre du procédé d'analyse de l'invention. Tel qu'illustré sur la figure 31, un échantillon liquide référencé 1 sous la forme d'un mélange d'au moins une protéine et un solvant, ou encore d'un cosoluté à analyser comme indiqué précédemment, a été déposé sur la surface d'un support 2 d'état de surface prédéterminé. Un tel support peut par exemple, comme dans le mode de réalisation illustré sur la figure 31, faire partie d'un dispositif d'analyse référencé 3 dans son ensemble. Le dispositif 3 peut également comprendre des moyens pour recevoir le support 2 muni de l'échantillon 1. Le dispositif 3 comporte par ailleurs des moyens pour provoquer l'auto formation des micro-motifs sur le support 2.
Si l'on choisit la voie de l'autoformation des micro-motifs par élimination au moins partielle de la phase liquide, ces moyens peuvent être par exemple un dispositif de séchage. Si l'on choisit la voie de l'auto formation des micro-motifs par déphasage dans un milieu qui reste liquide, ces moyens peuvent être des moyens chimiques tels que l'ajout d'un ligand approprié ou des moyens physiques tels qu'une source de courant et des électrodes pour la mise en u̇vre d'une solution électrolytique par exemple.
Le dispositif d'analyse 3 comprend également des moyens d'examen du micromotif pendant sa formation ou après sa formation, par exemple, un microscope électronique à balayage ou tout autre moyen tel que décrit précédemment.
Un dispositif 4 est associé au dispositif d'analyse 3 de façon à contrôler le déroulement du procédé et en particulier l'élimination de la phase liquide. Le dispositif 4 comporte dans une mémoire 5 des données de référence stockées qui peuvent par exemple être constituées par des micro-motifs formés préalablement à partir d'échantillons de composition connue dans des conditions sensiblement identiques avec celles mise en u̇vre pour l'analyse.Les données de référence ainsi stockées dans la mémoire 5 peuvent, par exemple, comprendre des images de micro-motifs de référence telles que celles illustrées sur les figures 2 à 22, des paramètres géométriques de micro-motifs de référence tels qu'illustrés sur les figures 23 à 25 ou encore des caractéristiques de résistivité électrique de micro-motifs de référence comme illustré sur les figures 26 et 27. D'une manière générale, les données ainsi stockées dans la mémoire 5 constituent une base de données permettant de détecter et d'analyser par comparaison l'échantillon à analyser.
A cet effet, le dispositif 4 comporte des moyens de comparaison entre le résultat de l'examen de l'échantillon 1 effectué dans le dispositif d'analyse 3 et les résultats de référence stockés dans la mémoire 5.
Un dispositif d'exploitation des résultats, référencé 6 dans son ensemble, peut par exemple permettre l'affichage du résultat sous la forme d'une probabilité ou d'une information de premier niveau résultant de la présence ou de l'absence d'une protéine, d'un complexe protéique ou d'un co-soluté dans l'échantillon à analyser. Un dispositif, référencé 7 dans son ensemble, exploite les résultats de l'analyse produits par le dispositif 6 en relation avec une base de connaissances adéquate pour fournir une information qualitative et/ou quantitative en rapport avec une problématique humaine telle qu'un diagnostic de pathologie, des recommandations, un niveau de danger, des tests en rapport avec l'alimentation humaine ou animale, ou des tests portant sur le contrôle de l'environnement.
Le dispositif d'exploitation des résultats de premier niveau 6 peut être virtuel dans des modes de réalisation simplifiés où des moyens fournissant directement des résultats en rapport avec une problématique humaine à partir des informations de comparaison sont mis en oeuvre. Les dispositifs 6 et 7 peuvent également êtres fusionnés sans sortir du cadre de la présente invention.
La problématique dans laquelle s'inscrit l'utilisation de l'invention peut aussi être plus directement en rapport avec la biologie animale ou végétale comme par exemple des applications dans le domaine vétérinaire ou agricole.
La base de données de référence mémorisée dans la mémoire 5 du dispositif 4 peut également se trouver partiellement ou entièrement à l'extérieur du système d'analyse comme dans la variante illustrée sur la figure 32 sur laquelle les éléments identiques portent les mêmes références.
En référence à la figure 32, les informations provenant d'une banque de données externe peuvent être transmises, par exemple par l'intermédiaire d'un réseau de type Internet au dispositif de comparaison 4 pour fournir comme précédemment un signal représentatif du résultat de l'analyse et son exploitation par le dispositif d'exploitation 6.
On va maintenant décrire, en référence à la figure 33, un exemple de réalisation d'un système d'analyse selon l'invention. Ce système d'analyse comprend : - un dispositif 10 de lecture selon l'invention incluant : - un sous-ensemble microscope optique 20, - un sous-ensemble 30 capteur d'image et électronique de traitement associé. - un dispositif 40 de calage assurant une mise au point toujours nette du microscope, par construction, sur les micro-motifs qui se sont formés sur la surface de dépôt ; - une source de lumière 50, par exemple une ou plusieurs diode(s) électroluminescente(s) blanche(s) ;- un sous-ensemble 60 d'entraînement du support d'échantillon(s) assurant à la fois le transport du support d'échantillon(s) dans les différentes zones de travail du dispositif, le balayage du code associé devant un lecteur fixe si ce code est matérialisé par un code à barres, ainsi que les micro-déplacements dans l'axe principal, en avant et en arrière, pendant l'étape d'observation des micro-motifs ; - un logement 80 pour recevoir un support d'échantillons ; - une connectique optionnelle 70 comprenant un ensemble de micro contacts à pointes montées sur pistons à ressort solidaires d'un support pouvant être appliqués par des moyens mécaniques ou électromécaniques sur les zones de contacts correspondantes du support d'échantillons lorsque est mis en u̇vre une extraction d'information électrique pendant la phase d'autoformation des micro-motifs ;- un dispositif 90 d'entraînement du support d'échantillon(s) pour assurer les micro déplacement dans un axe perpendiculaire à l'axe principal pendant l'étape d'observation des micro-motifs ; - un support d'échantillon(s) 100 ; - une zone 11 d'introduction du support d'échantillons et de lecture du code associé au support d'échantillon(s) ; - une zone 12 de dépôt du/des échantillon(s) sur la/les surface(s) prévues à cet effet sur le support d'échantillon(s) ; - une zone 13 d'autoformation des micro-motifs, dans cet exemple par séchage au contact d'une plaque thermostatée à la température de consigne exigée par l'analyse à réaliser; - une zone 14 d'observation des micro-motifs ; et - une zone 15 d'éjection du support d'échantillon(s) 10.
Le dispositif d'entraînement 9 peut par exemple être réalisé au moyen d'un moteur pas à pas entraînant un guide bordant latéralement le support d'échantillon(s) par une vis transformant la rotation de l'axe du moteur en un mouvement de translation.
Le support d'échantillons 100 est ici constitué d'une plaque de verre ou en matière plastique translucide sur laquelle des zones de dépôt discoïdes ont été délimitées au moyen d'un vernis hydrophobe. Si l'option de mesure de grandeurs électriques pendant la formation des micro-motifs est mise en u̇vre, alors les surfaces de dépôt sont dotées d'électrodes annulaires concentriques. Les électrodes, le réseau de conducteurs ainsi que les plages d'accueil des contacts du lecteur sont avantageusement réalisés par sérigraphie au moyen d'encres conductrices et isolantes couramment utilisées dans l'industrie pour réaliser des circuits hybrides en couche épaisse ou des claviers matriciels.Le cas échéant, les zones de dépôt peuvent recevoir des traitements de surface spécifiques additionnels pour apporter des effets de sélectivité tels que décrits dans l'invention. Selon que le code descriptif du support d'échantillon(s) sera lu par les mêmes moyens que ceux mis en u̇vre pour l'examen des micro-motifs ou par des moyens spécifiques, le code sera inscrit sur la face supérieure ou sur la face inférieure du support.
Dans une variante de réalisation d'un système d'analyse selon l'invention, on simplifie les manipulation des échantillons à analyser en faisant en sorte que le consommable livré à l'utilisateur contienne, outre les surfaces de dépôt et d'éventuelles électrodes, les éventuels produits chimiques ou biochimiques qu'un protocole d'analyse donné peut nécessiter en co-solution.
Le cas échéant, chaque zone de dépôt du support dont la surface a éventuellement fait l'objet d'un traitement spécifique, peut se voir dotée d'une capsule ou de tout autre moyen de rétention d'un produit prédéterminé qui se présente sous une forme telle que de la poudre, un liquide, une pâte, ou un gel. L'échantillon, au moment où il est déposé, contient le produit à analyser ainsi qu'un solvant apte à dissoudre également le produit additionnel.
Il serait également judicieux d'ajouter, dans le cas de co-solutés inclus dans le consommable, des moyens favorisant le mélange de la solution comprenant l'échantillon et le produit additionnel, pour l'homogénéiser avant que le processus d'autoformation des micro-motifs ne commence.
De tels moyens de mélange peuvent être d'ordre physique, par exemple des vibrations ou d'ordre physico-chimique, par exemple en pré-mélangeant avec chaque produit additionnel contenu dans le consommable un autre produit ayant la propriété de devenir effervescent en présence du solvant de l'échantillon.
L'effervescence du mélange, qui a lieu dans les premiers instants qui suivent le dépôt de l'échantillon, assure une solubilisation homogène des constituants du mélange. Le produit effervescent peut être soit neutre du point de vue de l'analyse et inerte lorsque mélangé avec les produits additionnels ou être aussi ajouté dans les mêmes proportions lors de la constitution des données de référence pour rester dans les conditions d'une relation biunivoque entre les données de référence et les données produites par l'analyse.
Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention.

REVENDICATIONS
1. Procédé d'analyse d'un échantillon comprenant un mélange d'au moins une protéine et un solvant, caractérisé en ce qu'il comprend: - une séquence de préparation et d'examen comportant : - une étape de dépôt de l'échantillon sur un support présentant un état de surface prédéterminé, - une étape d'autoformation, à partir de l'échantillon, de micro-motifs sur le support, et - une étape d'examen desdits micro-motifs et/ou d'effets induits pendant et/ou après leur formation, de façon à produire des résultats d'examen, ladite séquence de préparation et d'examen ayant été préalablement appliquée à un mélange d'une substance de référence et dudit solvant dans des proportions prédéterminées, de façon à produire des données de référence, et - une séquence de traitement comportant :- une étape pour comparer lesdits résultats d'examen avec lesdites données de référence, de façon à produire des données de comparaison, et - une étape pour traiter lesdites données de comparaison, de façon à produire des informations d'analyse dudit échantillon.

Claims

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'autoformation des micro-motifs sur le support, comprend une élimination au moins partielle de la phase liquide du mélange.
3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'élimination au moins partielle de la phase liquide du mélange résulte d'une opération de séchage de l'échantillon dans des conditions de température et éventuellement de pression contrôlées.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'opération de séchage comprend une décroissance de la température à laquelle est réalisé le séchage de l'échantillon, par palier ou selon une loi de variation continue de manière sensiblement identique à la manière dont la température à évolué au cours de l'étape de constitution des données de référence.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'autoformation des micro-motifs comprend une précipitation de matières solides sur la surface de dépôt au sein d'un volume d'échantillon qui reste liquide pendant l'autoformation desdits micromotifs.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'autoformation des micro-motifs est conditionnée à la présence d'un ou de plusieurs co-solutés déterminés dans le mélange initial.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'autoformation des micro-motifs comprend en outre une application d'un champ électrique et/ou magnétique sur l'échantillon pendant l'autoformation desdits micro-motifs.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'autoformation des micro-motifs comprend en outre une application d'ondes ultrasonores et /ou de vibrations sur l'échantillon pendant l'autoformation desdits micromotifs.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce la surface du support a été préalablement traitée par modification chimique et/ou biochimique superficielle dudit support, de façon à obtenir l'état de surface prédéterminé.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la surface du support a été préalablement traitée par modification physique superficielle dudit support, de façon à obtenir l'état de surface prédéterminé.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'examen des micro-motifs comprend un examen par microscopie optique, électronique, confocale ou à force atomique.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'étape d'examen des micro-motifs comprend une détection de la forme bi-et/ou tri-dimensionnelle d'une partie au moins desdits micro-motifs.
13. Procédé selon la revendication 11 à 12, caractérisé en ce que l'étape d'examen des micro-motifs comprend en outre une mesure des grandeurs géométriques d'éléments structuraux de parties desdits micro-motifs.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'étape d'examen des micro-motifs comprend un examen desdits micro-motifs par des moyens basés sur l'optique diffractive.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d' des micro-motifs comprend une détection et/ou une mesure de tensions mécaniques apparaissant à la surface du support, pendant et/ou après la formation desdits motifs.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la détection et/ou la mesure des tensions mécaniques apparaissant à la surface du support pendant la formation des micro-motifs met en u̇vre des microsystèmes mécaniques ou électromécaniques

(MEMS).
17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la détection et/ou la mesure des tensions mécaniques apparaissant à la surface du support pendant la formation des micro-motifs met en u̇vre un transducteur transformant la variation de tension mécanique en une variation d'un paramètre électrique.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'examen des micro-motifs pendant et/ou après leur formation comprend une mesure d'au moins une caractéristique électrique de l'échantillon.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les micro-motifs obtenus pendant l'étape d'autoformation présentent des éléments caractéristiques constitutifs avec dimensions comprises entre un millième de micromètre et dix micromètres.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les informations d'analyse obtenues à l'issue de la séquence de traitement comprennent une information relative à une protéine ou à un complexe protéique d'intérêt.

21. Procédé selon la revendications 20, caractérisé en ce que la séquence de traitement comprend en outre une étape pour déduire, à partir de l'information sur la protéine ou sur le complexe protéique d'intérêt, une information qualitative et/ou quantitative en rapport avec une problématique humaine, animale ou végétale.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel l'échantillon peut comprendre en outre un produit à analyser, caractérisé en ce que la séquence de traitement comprend en outre une étape pour déduire de la comparaison effectuée entre les résultats d'examen et les données de référence, une information sur le produit à analyser.

23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la séquence de traitement comprend en outre une étape pour déduire, à partir de l'information sur le produit à analyser, une information qualitative et/ou quantitative en rapport avec une problématique humaine, animale ou végétale.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'accès aux données de référence nécessaires pour effectuer la comparaison avec les résultats d'examen des micro-motifs est conditionné par une obtention de droits d'accès auprès d'un détenteur desdits droits.

25. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'exécution de l'étape de comparaison entre les données de référence et les résultats d'examen des micro-motifs est conditionnée par l'obtention de droits d'accès auprès d'un détenteur desdits droits.
26. Procédé selon l'une des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que l'exécution de l'étape de traitement pour déduire une information relative à la protéine, au complexe protéique ou au produit à analyser, est conditionnée par l'obtention de droits d'accès auprès du détenteur desdits droits.

27. Procédé selon les revendications 20 ou 22, caractérisé en ce que l'accès aux moyens de déduction d'une information qualitative et/ou quantitative en rapport avec une problématique humaine, animale ou végétale est conditionné par l'obtention de droits d'accès auprès du détenteur des dits droits.

28. Système d'analyse d'échantillons comprenant un mélange d'au moins une protéine et un solvant, mettant en u̇vre le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend :

- des moyens pour recevoir un support (2) présentant un état de surface prédéterminé, sur lequel un échantillon (1) a été déposé,

- des moyens pour induire une autoformation de micro-motifs sur ledit support, à partir dudit échantillon,

- des moyens pour examiner lesdits micro-motifs et/ou des effets induits pendant et/ou après leur formation, de façon à produire des résultats d'examen,

- des moyens pour stocker et/ou accéder à des données de référence obtenues par un traitement et un examen préalables d'une substance de référence,

- des moyens pour comparer les résultats d'examen aux données de référence, de façon à produire des données de comparaison, et

- des moyens pour traiter lesdites données de comparaison de façon à produire des informations d'analyse dudit échantillon.
29. Système selon la revendication 28, caractérisé en ce que les moyens de traitement des données de comparaison (6) sont agencés pour déduire de la comparaison effectuée, une information sur une protéine ou un complexe protéique présent dans l'échantillon à analyser.
30. Système selon la revendication 28, pour l'analyse d'échantillons comprenant en outre un produit à analyser, caractérisé en ce que les moyens de traitement des données de comparaison (6) sont agencés pour déduire de la comparaison effectuée, une information sur le produit à analyser présent dans l' échantillon.

31. Système selon l'une des revendications 28 ou 31, pour l'analyse d'échantillons comprenant en outre un produit à analyser, caractérisé en ce que les moyens (7) de traitement des données de comparaison sont agencés pour déduire à partir de l'information sur le produit à analyser, une information qualitative et/ou quantitative en rapport avec une problématique humaine, animale ou végétale.
32. Système selon l'une quelconque des revendications 28 à 31, caractérisé en ce que les moyens récepteurs sont agencés pour recevoir un jeu de supports comprenant au moins une surface de dépôt dont l'état de surface est déterminé en relation avec les données de référence, pour l'analyse de différents échantillons.

33. Système selon la revendication 32, caractérisé en ce que le jeu de supports dont l'état de surface est déterminé en relation avec les données de référence, est pourvu de moyens d'identification associés.
34. Système selon la revendication 33, caractérisé en ce que les moyens d'identification associés au jeu de supports comprennent un code d'identification unique et/ou un codage représentatif de tout ou partie de caractéristiques en relation directe ou indirecte avec le dit support.

35. Système selon l'une des revendications 32 à 34, caractérisé en ce que le jeu de supports, qui comprend au moins une surface de dépôt, comprend en outre des moyens de rétention d'un ou plusieurs produits déterminés en relation avec les données de référence, ledit produit étant prévu pour devenir un co-soluté lorsqu'un échantillon est déposé sur la surface de dépôt correspondante.
36. Système selon l'une des revendications 28 à 35, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens physiques et/ou physico-chimiques pour homogénéiser le mélange d'un produit additionnel avec l'échantillon.