FR2868953A1 - COMPOSITION FOR THE INTRACELLULAR TRANSFER OF A NUCLEIC ACID. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une composition utile pour le transfert intracellulaire d'au moins un acide nucléique, ladite comprenant :- une quantité efficace d'au moins un acide nucléique,- une quantité efficace d'au moins un copolymère polyoxyéthylène/polyoxypropylène, et- une quantité efficace d'au moins un sel de cation divalent inorganique.The present invention relates to a composition useful for the intracellular transfer of at least one nucleic acid, said composition comprising: - an effective amount of at least one nucleic acid, - an effective amount of at least one polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymer, and- an effective amount of at least one divalent inorganic cation salt.
Description
La présente invention concerne une composition pour la transfectionThe present invention relates to a composition for transfection
intracellulaire d'acide(s) nucléique(s) à des fins d'expression de protéines, peptides, d'ARNs antisens ou de polypeptides. intracellular nucleic acid (s) for expression of proteins, peptides, antisense RNAs or polypeptides.
L'invention est tout particulièrement intéressante pour la thérapie génique in vivo, l'administration de protéines, de peptides et polypeptides à effet thérapeutique, ou encore la vaccination. The invention is particularly interesting for in vivo gene therapy, the administration of proteins, peptides and polypeptides with a therapeutic effect, or even vaccination.
La thérapie génique constitue à ce jour un axe de recherche important pour la mise au point de nouvelles thérapies curatives ou préventives. Toutefois, un des obstacles majeurs à son développement clinique réside dans la non disponibilité à ce jour de méthodes efficaces et dotées d'une totale innocuité pour délivrer in vivo un matériau génétique. Gene therapy is currently an important area of research for the development of new curative or preventive therapies. However, one of the major obstacles to its clinical development lies in the unavailability to date of effective and completely safe methods for delivering genetic material in vivo.
On sait aujourd'hui que l'injection in vivo de gènes nus, c'est-à-dire non associés à un véhicule quelconque dans le muscle squelettique ou cardiaque, est capable de conduire à l'expression d'une protéine. Toutefois, la quantité en protéine ainsi exprimée demeure beaucoup trop faible pour être exploitable à l'échelle clinique. Pour suppléer à ce défaut de l'ADN nu, il a donc été proposé de lui associer un vecteur de transfection de nature virale ou non virale. It is now known that the in vivo injection of naked genes, that is to say, not associated with any vehicle in skeletal or cardiac muscle, is capable of leading to the expression of a protein. However, the amount of protein thus expressed remains far too low to be clinically exploitable. To compensate for this defect of naked DNA, it has therefore been proposed to associate a transfection vector of a viral or non-viral nature.
La présente invention concerne plus particulièrement le domaine de la vectorisation non virale. The present invention relates more particularly to the field of non-viral vectorization.
Les systèmes de vecteurs non viraux actuellement disponibles reposent pour la plupart sur une complexation de l'acide nucléique avec des molécules cationiques caractérisées par une densité de charge positive élevée à l'image des lipides cationiques, du polyéthylèneimine ou de la polylysine. Toutefois, ces composés, très efficaces pour le transfert de gène in vitro, se sont révélés inefficaces ou inappropriés pour la transfection in vivo. The currently available non-viral vector systems are based for the most part on a complexation of the nucleic acid with cationic molecules characterized by a high positive charge density such as cationic lipids, polyethyleneimine or polylysine. However, these compounds, highly effective for gene transfer in vitro, have been shown to be ineffective or inappropriate for in vivo transfection.
Plus récemment, il a été proposé des copolymères blocs non ioniques amphiphiles constitués de motifs oxyde de polyéthylène (POE) et oxyde de polypropylène (PPO). La nature amphiphile de ces copolymères blocs a pour avantage de favoriser le franchissement de barrières cellulaires et nucléaires. Comme exemples de ces copolymères blocs, on peut plus particulièrement citer les copolymères triblocs POE-POP-POE, encore appelés Poloxamers , Pluronics ou Synperonics et qui sont commercialisés notamment par la société BASF. Apparentés à ces familles de copolymères, les poloxamines ont également été proposés. Ces molécules sont constituées de segments hydrophobes (à base d'oxyde de polypropylène), de segments hydrophiles (à base d'oxyde de polyéthylène) et d'une partie centrale dérivant du motif éthylène diamine, susceptible d'être chargée positivement. More recently, it has been proposed amphiphilic nonionic block copolymers consisting of polyethylene oxide (POE) and polypropylene oxide (PPO) units. The amphiphilic nature of these block copolymers has the advantage of promoting the crossing of cellular and nuclear barriers. As examples of these block copolymers, there may be mentioned more particularly triblock copolymers POE-POP-POE, also called Poloxamers, Pluronics or Synperonics and which are marketed in particular by BASF. Related to these families of copolymers, poloxamines have also been proposed. These molecules consist of hydrophobic segments (based on polypropylene oxide), hydrophilic segments (based on polyethylene oxide) and a central part deriving from the ethylene diamine unit, which can be positively charged.
L' ensemble de ces copolymères ont généralement été mis en oeuvre sous une forme cationique pour le transfert d'acide(s) nucléique(s). Ainsi, le brevet US 6 353 055 propose des complexes polycationiques de polynucléotides liés covalemment à des Poloxamers ou Poloxamines possédant des segments polycationiques, pour le transfert de gènes. De même, la demande internationale WO 00/51645 décrit des Poloxamers et Poloxamines chargés positivement pour le transfert de gènes. Cette charge positive est obtenue par fonctionnalisation du polymère considéré à l'aide de groupements aminés et/ou glycosylés. All of these copolymers have generally been used in a cationic form for the transfer of nucleic acid (s). Thus, US Pat. No. 6,353,055 proposes polycationic complexes of polynucleotides covalently bound to poloxamers or poloxamines having polycationic segments, for the transfer of genes. Similarly, International Application WO 00/51645 discloses positively charged Poloxamers and Poloxamines for gene transfer. This positive charge is obtained by functionalization of the polymer in question by means of amino and / or glycosyl groups.
Plus récemment, la demande WO 02/67990 a montré que des copolymères POE/POP/POE spécifiques, c'est-à-dire possédant une proportion en poids de motif POE plus réduite comparativement aux copolymères usuels, permettaient d'obtenir des taux de transfection significativement améliorés. Enfin, la demande WO 03/066104 propose de mettre en oeuvre à titre de vecteur synthétique des poloxamines spécifiques, sous forme cationique. More recently, the application WO 02/67990 has shown that specific POE / POP / POE copolymers, that is to say having a proportion by weight of POE unit more reduced compared to the usual copolymers, made it possible to obtain transfection significantly improved. Finally, the application WO 03/066104 proposes to use, as a synthetic vector, specific poloxamines, in cationic form.
Bien que s'avérant nettement plus efficaces que l'ADN nu, ces copolymères ne 20 permettent pas toutefois d'atteindre un niveau d'expression à ce jour suffisant pour envisager des applications thérapeutiques. Although they prove to be significantly more effective than naked DNA, these copolymers do not, however, make it possible to reach an expression level to date that is sufficient to envisage therapeutic applications.
La présente invention a précisément pour objectif de proposer une formulation originale pour les vecteurs non viraux de type copolymère polyoxyéthylène/polyoxypropylène permettant d'accroître significativement le taux d'expression in vivo d'une protéine à partir de son acide nucléique. The present invention is specifically intended to provide an original formulation for non-viral vectors of the polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymer type to significantly increase the in vivo expression level of a protein from its nucleic acid.
Plus précisément, les inventeurs ont découvert que l'association d'une quantité efficace de cation inorganique divalent à ce type de copolymères avait un effet déterminant sur leur efficacité pour la transfection intracellulaire d'acide(s) nucléique(s). More specifically, the inventors have discovered that the combination of an effective amount of divalent inorganic cation with this type of copolymers has a determining effect on their efficiency for intracellular transfection of nucleic acid (s).
En conséquence, la présente invention concerne, selon un premier de ses aspects, une composition utile pour le transfert intracellulaire d'au moins un acide nucléique, ladite composition comprenant au moins: - une quantité efficace d'au moins un acide nucléique, - une quantité efficace d'au moins un copolymère polyoxyéthylène/polyoxypropylène répondant à l'une des formules générales suivantes: HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH (I) ou HO(CH(CH3)CH2O) b(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)dH (II) et dans lesquelles b et d représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier différent de zéro tel que le fragment hydrophobe représenté par (CH(CH3)CH2O)b en formule (I) ou (CH(CH3)CH2O)b+d en formule (II) possède un poids moléculaire de 750 à 15000, en particulier de 1000 à 10000 et plus particulièrement de 1200 à 5000 et a et c représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier différent de zéro tel que la proportion hydrophile figurée par (CH2CH2O)a en formule (II) ou (CH2CH2O)a+c en formule (I) représente de 10 % à 90 % en poids et en particulier de 40 % à 80 % en poids du poids total du copolymère, et - une quantité efficace d'au moins un sel de cation divalent inorganique. Accordingly, the present invention relates, according to a first of its aspects, a composition useful for the intracellular transfer of at least one nucleic acid, said composition comprising at least: an effective amount of at least one nucleic acid, effective amount of at least one polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymer having one of the following general formulas: HO (CH2CH2O) a (CH (CH3) CH2O) b (CH2CH2O) CH (I) or HO (CH (CH3) CH2O) b (CH2CH2O) a (CH (CH3) CH2O) dH (II) and wherein b and d represent, independently of one another, an integer other than zero such that the hydrophobic moiety represented by (CH (CH 3) CH2O) b in formula (I) or (CH (CH3) CH2O) b + d in formula (II) has a molecular weight of 750 to 15000, in particular from 1000 to 10000 and more particularly from 1200 to 5000 and a and c represent, independently of one another, an integer other than zero such that the hydrophilic proportion represented by (CH 2 CH 2 O) a in formula (II) or (CH 2 CH 2 O) a + c in formula (I) represents from 10% to 90% by weight and in particular from 40% to 80% by weight of the total weight of the copolymer, and an effective amount of at least an inorganic divalent cation salt.
Elle concerne, selon un autre de ses aspects, une méthode pour transférer in vivo un acide nucléique à l'intérieur de cellules eucaryotiques comprenant la mise en contact des cellules avec une composition telle que définie ci-dessus. It relates, according to another of its aspects, a method for transferring in vivo a nucleic acid inside eukaryotic cells comprising contacting the cells with a composition as defined above.
Elle concerne selon un autre de ses aspects, un procédé pour préparer une composition utile pour le transfert intracellulaire d'au moins un acide nucléique comprenant la mise en présence, dans un milieu de formulation, dudit acide nucléique avec au moins un copolymère tel que défini cidessus et au moins un sel de cation divalent inorganique, la quantité dudit copolymère étant ajustée pour complexer l'intégralité dudit acide nucléique sous forme de complexe acide nucléique/copolymère de potentiel zêta égal à ou proche de zéro, et la quantité en sel de cation étant ajustée pour procurer un arrangement structurel dudit copolymère propice à la complexation dudit acide nucléique. According to another of its aspects, it relates to a process for preparing a composition that is useful for the intracellular transfer of at least one nucleic acid comprising placing, in a formulation medium, said nucleic acid with at least one copolymer as defined above and at least one inorganic divalent cation salt, the amount of said copolymer being adjusted to complex the entirety of said nucleic acid as nucleic acid / zeta potential copolymer complex equal to or close to zero, and the amount of cation salt. being adjusted to provide a structural arrangement of said copolymer conducive to the complexation of said nucleic acid.
Au sens de l'invention, une quantité efficace en acide nucléique couvre les quantités usuellement considérées comme compatibles pour une administration in vivo à un mammifère et en particulier à l'homme. Bien entendu, cette quantité est susceptible de varier significativement selon le poids de l'organisme hôte considéré et de l'effet thérapeutique recherché à savoir curatif ou préventif, comme par exemple à des fins de vaccination. Within the meaning of the invention, an amount effective in nucleic acid covers the quantities usually considered compatible for in vivo administration to a mammal and in particular to humans. Of course, this amount is likely to vary significantly depending on the weight of the host organism considered and the therapeutic effect sought to be curative or preventive, such as for vaccination purposes.
A titre illustratif, la quantité d'ADN considérée dans la composition selon l'invention peut varier de quelques g à quelques mg. As an illustration, the amount of DNA considered in the composition according to the invention may vary from a few g to a few mg.
Au sens de l'invention, une quantité efficace de copolymère désigne une quantité suffisante en copolymère pour formuler l'intégralité de l'acide nucléique associé sous la forme d'un complexe acide nucléique/copolymère. Cette complexation efficace semble notamment être atteinte lorsque le complexe ainsi formé manifeste un potentiel zêta égal ou proche de zéro. Sans vouloir être lié à une théorie, cette complexation semble correspondre à la neutralisation de l'intégralité de la charge négative associée à l'acide nucléique sous sa forme libre. En d'autres termes, elle correspond au piégeage de l'intégralité de l'acide nucléique avec le copolymère. Cette concentration doit par ailleurs demeurer inférieure ou égale à la concentration micellaire critique, CMC, concentration au-delà de laquelle les segments d'oxyde de propylène cherchent à s'associer entre eux pour former des micelles pures de copolymère. Dans ce cas, ils ne participent plus au piégeage de l'acide nucléique et des micelles de copolymères et des molécules d'acide nucléique sont alors présents sous une forme non associée dans la solution, conduisant ainsi à un potentiel zêta de valeur négative. Il est entendu que cette CMC est susceptible de varier significativement d'un copolymère à l'autre dans la mesure où ceuxci possèdent un nombre de motifs POP et POE différents. Généralement, les copolymères blocs POE/POP forment des micelles sphériques en solution aqueuse au-dessus d'une certaine concentration en polymère (CMC) variable selon la température de la solution (CMT, température critique de micellisation), ces deux valeurs dépendant du poids moléculaire du copolymère, de la composition des blocs (rapport hydrophile/hydrophobe) et de l'architecture du copolymère bloc. Within the meaning of the invention, an effective amount of copolymer designates a sufficient amount of copolymer to formulate the entirety of the associated nucleic acid in the form of a nucleic acid / copolymer complex. This effective complexation seems particularly to be achieved when the complex thus formed has a zeta potential equal to or close to zero. Without wishing to be bound to a theory, this complexation seems to correspond to the neutralization of the entirety of the negative charge associated with the nucleic acid in its free form. In other words, it corresponds to the trapping of the entirety of the nucleic acid with the copolymer. This concentration must also remain less than or equal to the critical micelle concentration, CMC, concentration above which the propylene oxide segments seek to associate with each other to form pure micelles of copolymer. In this case, they no longer participate in the trapping of the nucleic acid and micelles of copolymers and nucleic acid molecules are then present in a non-associated form in the solution, thus leading to a negative zeta potential. It is understood that this CMC is likely to vary significantly from one copolymer to another insofar as these have a number of different POP and POE patterns. Generally, POE / POP block copolymers form spherical micelles in aqueous solution above a certain polymer concentration (CMC) variable according to the temperature of the solution (CMT, critical temperature of micellisation), these two values depending on the weight molecular structure of the copolymer, the composition of the blocks (hydrophilic / hydrophobic ratio) and the architecture of the block copolymer.
Dans la mesure où le potentiel zêta manifesté par l'ADN nu dans une solution de NaCl usuel est inférieur à la valeur -20, on considère au sens de l'invention comme valeur proche de zéro, ou encore "potentiel zêta qualifié de zéro", une valeur telle que définie ci-après. Cette valeur est généralement représentative sur un graphique dans lequel figurent, en axe abscisse, l'échelle en concentration en copolymère et, en axe ordonné, l'échelle des valeurs de potentiel zêta, d'un plateau parallèle à l'axe des abscisses figuré par la plage de concentrations en copolymère à laquelle est affectée une valeur de potentiel zêta quasi- identique, cette valeur étant la plus proche du potentiel zêta de valeur zéro. Elle peut être également considérée comme représentant le point neutralisant de l'ensemble des charges négatives de l'acide nucléique associé. Insofar as the zeta potential manifested by the naked DNA in a usual NaCl solution is less than the value -20, the meaning of the invention is considered to be a value close to zero, or else a "zeta potential qualified as zero". , a value as defined below. This value is generally representative on a graph in which, in the abscissa axis, the copolymer concentration scale and, in the ordered axis, the scale of the zeta potential values, of a plate parallel to the abscissa axis are shown. by the range of copolymer concentrations to which a substantially identical zeta potential value is assigned, which value is closest to the zeta potential of zero value. It can also be considered as representing the neutralizing point of the set of negative charges of the associated nucleic acid.
Comme il ressort de l'exemple 1 ci-après, la concentration en copolymère permettant d'obtenir une telle valeur de potentiel zêta à savoir égale ou proche de zéro 5 varie significativement selon la nature chimique du copolymère. As is apparent from Example 1 below, the copolymer concentration making it possible to obtain such a value of zeta potential that is equal to or close to zero varies significantly according to the chemical nature of the copolymer.
Par exemple, cette valeur de potentiel zêta proche de 0 est observée pour les copolymères PE6400 , F68 et F127 à respectivement une concentration de 1,72 mM (0,5 % pds/vol) pour le PE 6400 , une concentration de 3,5 mM (3 % pds/vol) pour le F68 et une concentration de 3,49 x 10-2 mM (0,044 % pds/vol) pour le F127 , et ceci pour une concentration de 101.1g/ml en ADN plasmidique associé. Ces valeurs de potentiels zêta ont été mesurées directement à partir de la formulation commerciale des polymères considérés. For example, this zeta potential value close to 0 is observed for the copolymers PE6400, F68 and F127 at a concentration of 1.72 mM (0.5% w / v) for PE 6400, a concentration of 3.5 mM (3% w / v) for F68 and a concentration of 3.49 x 10-2 mM (0.044% w / v) for F127, and this for a concentration of 101.1g / ml in associated plasmid DNA. These zeta potential values were measured directly from the commercial formulation of the polymers under consideration.
En conséquence, pour un copolymère donné, la détermination de cette valeur implique de procéder au préalable à la mesure des potentiels zêta de différents mélanges de copolymère/acide nucléique à des concentrations variables en copolymère dans un milieu de composition ionique déterminé et à une température donnée et à l'identification des concentrations en copolymère pour lesquelles la valeur de potentiel zêta associée aux mélanges correspondants est qualifiée de zéro. Therefore, for a given copolymer, the determination of this value involves first measuring the zeta potentials of different copolymer / nucleic acid mixtures at varying concentrations of copolymer in a specific ionic composition medium and at a given temperature. and identifying copolymer concentrations for which the zeta potential value associated with the corresponding mixtures is qualified as zero.
Au sens de l'invention, une quantité efficace en sel de cation divalent désigne une quantité suffisante pour conférer une organisation structurelle dudit copolymère propice à la complexation de l'intégralité de l'acide nucléique. Sans vouloir être liée à une théorie, il semble que la présence d'un tel sel conditionne l'organisation structurelle de l'intégralité de l'acide nucléique présent dans la composition avec le copolymère POE/POP sous une forme complexe/copolymère dans laquelle l'acide nucléique est présent à un état plus complexé. Par ailleurs, la concentration en ce sel de cation divalent inorganique semble avoir une incidence déterminante sur les valeurs des CMC et CMT du copolymère considéré. Ainsi, en milieu fortement ionique, la CMC manifestée par un copolymère s'avère généralement plus faible que celle possédée par ce même copolymère dans un milieu non ionique. En conséquence, elle privilégie une réactivité plus immédiate des motifs POP du copolymère avec l'acide nucléique associé, et donc l'obtention d'un potentiel zêta égal à ou qualifié de zéro pour une concentration en copolymère inférieure à la quantité requise en l'absence de sel de cation divalent. Within the meaning of the invention, an effective amount of divalent cation salt means an amount sufficient to confer a structural organization of said copolymer conducive to the complexation of the entirety of the nucleic acid. Without wishing to be bound to a theory, it seems that the presence of such a salt conditions the structural organization of the entirety of the nucleic acid present in the composition with the POE / POP copolymer in a complex / copolymer form in which the nucleic acid is present in a more complexed state. Moreover, the concentration of this inorganic divalent cation salt seems to have a determining influence on the CMC and CMT values of the copolymer under consideration. Thus, in a strongly ionic medium, the CMC exhibited by a copolymer generally proves to be lower than that possessed by this same copolymer in a nonionic medium. Consequently, it favors a more immediate reactivity of the POP units of the copolymer with the associated nucleic acid, and thus obtaining a zeta potential equal to or qualified for zero for a copolymer concentration lower than the amount required in the absence of divalent cation salt.
Selon une variante particulière, les compositions selon l'invention sont exemptes d'acide nucléique sous forme libre et/ou de lipide cationique. According to one particular variant, the compositions according to the invention are free of nucleic acid in free form and / or of cationic lipid.
Comme il ressort des exemples soumis ci-après, les compositions conformes à la présente invention permettent d'obtenir un taux de transfection au moins cinq fois, voire dix fois supérieur à celui observé avec une composition formulée sans ce sel divalent mais par exemple avec du NaCl à l'image des solutions isotoniques généralement utilisées pour formuler l'acide nucléique à administrer. As can be seen from the examples given below, the compositions in accordance with the present invention make it possible to obtain a transfection rate at least five times, or even ten times greater than that observed with a composition formulated without this divalent salt, but for example with NaCl in the image of the isotonic solutions generally used to formulate the nucleic acid to be administered.
Conviennent tout particulièrement à l'invention les cations divalents comme les cations Ca et Mgr et leurs mélanges. Divalent cations such as Ca and Mg cations and mixtures thereof are particularly suitable for the invention.
Les cations divalents organiques à l'image de l'éthylène diamine dicationique peuvent également avoir un effet bénéfique toutefois cet effet n'est pas aussi significatif qu'avec les cations inorganiques précités. Organic divalent cations such as ethylene diamine dicationic may also have a beneficial effect however this effect is not as significant as with the above inorganic cations.
En ce qui concerne l'anion associé, il peut être de natures très diverses. Conviennent tout particulièrement à l'invention les anions de type nitrates ou chlorures. With regard to the associated anion, it can be of very diverse natures. Particularly suitable for the invention anions of the nitrate or chloride type.
Toutefois, d'autres anions, de type sulfates par exemple, sont également susceptibles d'être mis en oeuvre. However, other anions, such as sulfates for example, are also likely to be implemented.
Comme précisé précédemment, il semble que les sels de cations divalents inorganiques considérés selon l'invention aient une incidence sur l'organisation structurelle du copolymère et par ce biais sur la complexation de l'acide nucléique. As previously stated, it appears that the inorganic divalent cation salts considered according to the invention have an impact on the structural organization of the copolymer and thereby on the complexation of the nucleic acid.
La quantité efficace de ces sels est bien entendu susceptible de varier significativement d'une part en fonction de la nature du polymère qui leur est associée et d'autre part les concentrations en ces copolymère et acide nucléique dans la composition selon l'invention. A titre illustratif, ces sels de cation divalent peuvent être présents à raison de 0,5 mmol/1 à 6 mmol/1 de la composition. The effective amount of these salts is of course likely to vary significantly on the one hand depending on the nature of the polymer associated with them and on the other hand the concentrations of these copolymers and nucleic acid in the composition according to the invention. By way of illustration, these divalent cation salts may be present in a proportion of 0.5 mmol / l to 6 mmol / l of the composition.
Par exemple, pour une composition comprenant, à titre de copolymère: - un copolymère possédant un poids moléculaire variant de 2500 à 3000 et un pourcentage de motifs d'oxyde d'éthylène de 30 à 50 % comme par exemple le L64 , ou - un copolymère possédant un poids moléculaire variant de 7000 à 9000 et un pourcentage de motifs oxyde d'éthylène de 60 à 85 % comme par exemple le F68 , - un copolymère possédant un poids moléculaire variant de 9 000 à 13 000 et un pourcentage de motif oxyde d'éthylène variant de 60 à 85 % en poids, en particulier présent à une concentration ajustée pour conférer à ladite composition un potentiel zêta égal à ou qualifié de zéro, les sels de cations divalents en particulier des cations choisis parmi Ça++, Mg++ et leurs mélanges peuvent être présents à raison de 0,5 mmol/1 à 6 mmol/l, en particulier de 1 mmol/l à 5 mmol/l et plus particulièrement de 2 mmol/l à 5 mmol/l. For example, for a composition comprising, as copolymer: a copolymer having a molecular weight ranging from 2500 to 3000 and a percentage of ethylene oxide units of 30 to 50%, for example L64, or a copolymer having a molecular weight ranging from 7000 to 9000 and a percentage of ethylene oxide units of 60 to 85%, for example F68, a copolymer having a molecular weight ranging from 9000 to 13000 and a percentage of oxide unit of ethylene ranging from 60 to 85% by weight, in particular present at a concentration adjusted to give said composition a zeta potential equal to or qualified by zero, the divalent cation salts, in particular cations chosen from Ca ++, Mg ++ and their The mixtures may be present in an amount of from 0.5 mmol / l to 6 mmol / l, in particular from 1 mmol / l to 5 mmol / l and more particularly from 2 mmol / l to 5 mmol / l.
Les compositions selon l'invention peuvent notamment comprendre de 10 à 100 g/ml d'acide nucléique. The compositions according to the invention may in particular comprise from 10 to 100 g / ml of nucleic acid.
Ces sels de cations divalents inorganiques peuvent être introduits en tant que tels dans les compositions selon l'invention ou par le biais d'un mélange préexistant à l'image par exemple du milieu Tyrode qui est un mélange de 140 mM NaCl, 6 mM KC1, 3 mM CaC12, 2 mM MgC12, 10 mM HEPES, pH7,4 et 10 mM glucose, le cas échéant complémenté en un ou plusieurs de ses sels, et en particulier en CaC12 et MgCl2. En particulier, les sels de cations divalents selon l'invention, peuvent être présents en tout ou partie sous la forme d'un mélange Tyrode. On peut également envisager de préparer une composition selon l'invention à partir d'un milieu conventionnel et en particulier contenant 150 mM NaCl, et en le complémentant en sels de cations divalents inorganiques, c'est-à- dire cations de Ça++ et/ou Mgr et/ou en milieu Tyrode. These inorganic divalent cation salts can be introduced as such into the compositions according to the invention or by means of an image-preexisting mixture, for example Tyrode medium which is a mixture of 140 mM NaCl, 6 mM KCl , 3 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7.4 and 10 mM glucose, optionally supplemented with one or more of its salts, and in particular CaCl 2 and MgCl 2. In particular, the divalent cation salts according to the invention may be present wholly or partly in the form of a Tyrode mixture. It is also conceivable to prepare a composition according to the invention from a conventional medium and in particular containing 150 mM NaCl, and supplementing it with salts of divalent inorganic cations, that is to say cations of Ca ++ and / or or Mgr and / or Tyrode environment.
En ce qui concerne, les copolymères blocs considérés selon l'invention, ils peuvent posséder des groupements alkylènes de longueurs et/ou de conformations 20 différentes ou non, au sein du polymère. With regard to the block copolymers considered according to the invention, they may have alkylene groups of different lengths and / or conformations, within the polymer.
Plus particulièrement, il répond à la formule générale suivante: HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH (I) Dans laquelle a, b et c sont tels que définis précédemment. More particularly, it has the following general formula: HO (CH 2 CH 2 O) a (CH (CH 3) CH 2 O) b (CH 2 CH 2 O) CH (I) wherein a, b and c are as defined above.
En particulier, a, b et c représentent indépendamment l'un de l'autre des 25 nombres entiers pouvant varier entre 10 et 110 inclusivement. In particular, a, b and c represent, independently of each other, integers ranging from 10 to 110 inclusive.
De tels copolymères poly(oxyéthylène)-poly(oxypropylène) ont notamment été décrits par SANTON, Am. Perfumer cosmet. 72(K)..54-58 (1958) ; SCHMOKA, Loc. cit. 82(7)-25-30 (1967) ; Non ionic surfactance, Schick, Ed. (Dekker, NY, 1976) pp. 300-371. Such poly (oxyethylene) -poly (oxypropylene) copolymers have in particular been described by SANTON, Am Perfumer cosmet. 72 (K), 54-58 (1958); SCHMOKA, Loc. cit. 82 (7) -25-30 (1967); Nonionic surfactance, Schick, Ed. (Dekker, NY, 1976) pp. 300-371.
Un grand nombre de ces composés sont commercialement disponibles sous le nom commercial Poloxamers , Pluronics et Synperonics . Many of these compounds are commercially available under the trade name Poloxamers, Pluronics and Synperonics.
Le copolymère bloc selon l'invention possède un poids moléculaire pouvant varier de 1000 à environ 15000, voire de 2000 à environ 15000, en particulier de 2500 à 13000. The block copolymer according to the invention has a molecular weight ranging from 1000 to about 15000, even from 2000 to about 15000, in particular from 2500 to 13000.
A titre illustratif des copolymères blocs polyoxyéthylène/polyoxypropylène 5 susceptibles d'être utilisés selon la présente invention, on citera tout particulièrement ceux commercialisés par la société BASF et figurant dans le tableau ci-après. As an illustration of the polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymers 5 that may be used according to the present invention, mention will be made especially of those sold by BASF and listed in the table below.
Dénomination Poids moléculaire % POE commerciale en POP (en poids) L42 1200 20 % L61 1750 = 10 % L62 1750 20 % L63 1750 30 % L64 1750 40 % P65 z' 1750 50 % F68 1750 80 % L72 z' 2050 20 % L81 2250 10 % L92 2750 = 20 % L101 3250 10 % P103 3250 30 % P105 3250 50 % F108 3250 80 % F127 3780 70 % L121 4000 10 % L122 = 4000 20 % P123 z- 4000 30 % L141 4400 -= 10 % Conviennent tout particulièrement à l'invention: - les copolymères possédant un poids moléculaire variant de 2500 à 3500 et un pourcentage de motif oxyde d'éthylène variant de 30 à 50 % en poids, - les copolymères possédant un poids moléculaire variant de 7000 à 9000 et un pourcentage de motif oxyde d'éthylène variant de 60 à 85 % en poids, et - les copolymères possédant un poids moléculaire variant de 9 000 à 13 000 et un pourcentage de motif oxyde d'éthylène variant de 60 à 85 % en poids. Denomination Molecular weight% Commercial POE in POP (by weight) L42 1200 20% L61 1750 = 10% L62 1750 20% L63 1750 30% L64 1750 40% P65 z '1750 50% F68 1750 80% L72 z' 2050 20% L81 2250 10% L92 2750 = 20% L101 3250 10% P103 3250 30% P105 3250 50% F108 3250 80% F127 3780 70% L121 4000 10% L122 = 4000 20% P123 z- 4000 30% L141 4400 - = 10% Suitable very particularly to the invention: copolymers having a molecular weight ranging from 2500 to 3500 and a percentage of ethylene oxide unit varying from 30 to 50% by weight, the copolymers having a molecular weight ranging from 7000 to 9000 and a percentage of ethylene oxide unit ranging from 60 to 85% by weight, and copolymers having a molecular weight ranging from 9000 to 13000 and a percentage of ethylene oxide unit ranging from 60 to 85% by weight.
Comme précisé précédemment, le copolymère considéré est mis en oeuvre selon l'invention à une concentration suffisante pour ajuster le potentiel zêta du complexe 15 copolymère/acide nucléique qu'il forme avec l'intégralité de l'acide nucléique présent dans ladite composition, à une valeur égale à ou qualifiée de zéro. As specified above, the copolymer in question is used according to the invention at a concentration which is sufficient to adjust the zeta potential of the copolymer / nucleic acid complex which it forms with the entirety of the nucleic acid present in said composition. a value equal to or qualified as zero.
Cette concentration peut au préalable avoir été déterminée selon le protocole décrit précédemment. This concentration may have previously been determined according to the protocol described above.
A titre illustratif et non limitatif des compositions conformes à l'invention, on peut plus particulièrement citer celles comprenant - une quantité efficace en acide(s) nucléique(s) notamment variant de 10 g à 100 g/ml, - de 0,1 à 0,6% (pds/vol) d'un copolymère POE/POP/POE pour lequel (a + c) varie de 20 à 30, en particulier est égal à environ 26 et b varie de 20 à 50, et en particulier est égal à 30, - de 2 à 4% (pds/vol) d'un copolymère POE/POP/POE pour lequel (a + c) varie de 125 à 200, en particulier est égal à environ 150 et b varie de 20 à 50, et en particulier est égal à 30, - de 0,03 à 0,06 % (pds/vol) d'un copolymère POE/POP/POE pour lequel (a + c) varient de 150 à 250, en particulier est égal à environ 200, et b varie de 50 à 75, en particulier est égal à 65, et - une quantité efficace en sel de cations divalents notamment de 0,5 mmol/l à 6 mmol/1(pds/vol) de Cam et/ou Mg++. By way of non-limiting illustration of the compositions in accordance with the invention, mention may be made more particularly of those comprising an effective amount of nucleic acid (s), in particular ranging from 10 g to 100 g / ml, of 0.1. at 0.6% (w / v) of a POE / POP / POE copolymer for which (a + c) varies from 20 to 30, in particular is equal to about 26 and b varies from 20 to 50, and in particular is equal to 30, - 2 to 4% (w / v) of a POE / POP / POE copolymer for which (a + c) varies from 125 to 200, in particular is equal to about 150 and b varies from 20 at 50, and in particular is equal to 30, - from 0.03 to 0.06% (w / v) of a POE / POP / POE copolymer for which (a + c) vary from 150 to 250, in particular is equal to about 200, and b varies from 50 to 75, in particular is equal to 65, and - an effective amount of divalent cation salt, in particular from 0.5 mmol / l to 6 mmol / l (w / v) of Cam and / or Mg ++.
Conviennent tout particulièrement, le F68 , le PE6400 , et le F127 et leurs mélanges. The F68, PE6400, and F127 and their mixtures are particularly suitable.
Selon une variante particulière, les compositions de l'invention possèdent un potentiel zêta égal ou qualifié de zéro. According to one particular variant, the compositions of the invention have an equal or zero zeta potential.
Au sens de l'invention, le potentiel zêta est distinct de la charge de surface. La charge de surface d'une particule dépend de sa nature et du milieu qui l'entoure. Dans le cas de particules dispersées en milieu liquide, cette charge est essentiellement liée à l'ionisation de groupes chimiques situés à la surface ainsi qu'à l'adsorption de tensioactifs ioniques. L'apparition d'une charge à la surface d'une particule affecte la distribution ionique dans la région interfaciale entre la particule et le liquide. Il en résulte une augmentation de la concentration en contreions près de la surface. Il existe donc une double couche électrique autour de chaque particule. La première couche correspond à la région la plus proche de la surface et comporte des ions solidement liés à cette dernière. La seconde, externe, est plus diffuse et présente une distribution ionique déterminée par les forces électriques mais aussi par les mouvements thermiques aléatoires. Le plan externe glissant de la particule est situé à la surface extérieure de cette seconde couche. Lorsque la particule bouge dans le milieu (sous l'influence d'un flux provoqué ou mouvement Brownien), on considère que la structure de ces couches reste stable. C'est au niveau du plan glissant que les particules interagissent réellement entre elles, et c'est à ce niveau que l'on mesure le potentiel zêta. Le potentiel zêta est proportionnel à une densité de charge exprimée en coulomb/m2. Le potentiel électrostatique décroît de manière exponentielle lorsque l'on s'éloigne de la surface de la particule, jusqu'à atteindre une valeur nulle au coeur de la solution. Le potentiel zêta, à l'inverse d'autres caractéristiques (forme taille, surface spécifique) ou chimiques n'est pas figé. Il présente la particularité de varier en fonction de l'environnement de la particule. For the purposes of the invention, the zeta potential is distinct from the surface charge. The surface charge of a particle depends on its nature and the surrounding environment. In the case of particles dispersed in a liquid medium, this charge is essentially related to the ionization of chemical groups located on the surface as well as the adsorption of ionic surfactants. The appearance of a charge on the surface of a particle affects the ion distribution in the interfacial region between the particle and the liquid. This results in an increase in the concentration of counterions near the surface. There is therefore a double electric layer around each particle. The first layer corresponds to the region closest to the surface and has ions firmly bound to the latter. The second, external, is more diffuse and presents an ion distribution determined by the electric forces but also by the random thermal movements. The outer sliding surface of the particle is located on the outer surface of this second layer. When the particle moves in the medium (under the influence of a provoked flow or Brownian motion), we consider that the structure of these layers remains stable. It is at the level of the sliding plane that the particles actually interact with each other, and it is at this level that the zeta potential is measured. The zeta potential is proportional to a charge density expressed in coulomb / m2. The electrostatic potential decreases exponentially when one moves away from the surface of the particle, until reaching a zero value in the heart of the solution. The zeta potential, unlike other characteristics (shape size, specific surface) or chemical is not fixed. It has the particularity of varying according to the environment of the particle.
Le principe de la mesure du potentiel zêta est le suivant: Quand un champ électrique est appliqué à travers un électrolyte, les particules possédant une charge électrique qui sont en suspension dans cet électrolyte, sont attirées vers l'électrode de charge opposé. La force de frottement subie par les particules tend à s'opposer à ce mouvement. Quand l'équilibre entre ces deux forces opposées est atteint, les particules se déplacent à vitesse constante. La vitesse dépend de la force du champ électrique, de la constante diélectrique, de la viscosité du milieu et du potentiel zêta. Le potentiel zêta est déduit de la mobilité electrophorétique par la loi de Henry. Le potentiel zêta dépend d'un facteur qui correspond au rapport entre l'épaisseur de la double couche ionique et le diamètre de la particule et de la forme de la particule. The principle of zeta potential measurement is as follows: When an electric field is applied through an electrolyte, particles having an electric charge that are suspended in that electrolyte are attracted to the opposite charge electrode. The friction force experienced by the particles tends to oppose this movement. When the balance between these two opposing forces is reached, the particles move at a constant speed. The speed depends on the strength of the electric field, the dielectric constant, the viscosity of the medium and the zeta potential. The zeta potential is deduced from electrophoretic mobility by Henry's law. The zeta potential depends on a factor that corresponds to the ratio of the thickness of the ionic double layer to the diameter of the particle and the shape of the particle.
La technique retenue aujourd'hui pour mesurer la vitesse sur un échantillon est la suivante: une tension alternative est appliquée à l'électrode contenu dans une cellule de mesure grâce à deux électrode provoquant la migration des particules. La vitesse des particules est évaluée par mesure de fluctuation temporelle de l'intensité diffusée par la particule en mouvement dans le réseau d'interférences. The technique adopted today for measuring the speed on a sample is as follows: an AC voltage is applied to the electrode contained in a measurement cell by virtue of two electrodes causing the migration of the particles. The velocity of the particles is evaluated by measuring the temporal fluctuation of the intensity diffused by the moving particle in the interference network.
Dans le cadre de la présente invention, cette mesure est réalisée par interférométrie Laser Doppler (zêtasizer 3000HSA) selon le protocole précisé par le 30 fabricant. In the context of the present invention, this measurement is performed by Laser Doppler interferometry (zetesizer 3000HSA) according to the protocol specified by the manufacturer.
Dans les compositions de la présente invention, l'acide nucléique peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNi, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement. In the compositions of the present invention, the nucleic acid may be both a deoxyribonucleic acid and a ribonucleic acid. It can be sequences of natural or artificial origin, and in particular genomic DNA, cDNA, mRNA, tRNA, RNAi, rRNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences. -synthetics of modified or unmodified oligonucleotides. These nucleic acids can be of human, animal, plant, bacterial, viral origin, etc. They can be obtained by any technique known to those skilled in the art, and in particular by screening libraries, by chemical synthesis or by mixed methods including the chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening libraries. They can be chemically modified.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin de même que les oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire. As regards more particularly deoxyribonucleic acids, they may be single or double-stranded as well as short oligonucleotides or longer sequences. These deoxyribonucleic acids may carry therapeutic genes, transcriptional or replication regulatory sequences, modified or unmodified antisense sequences, binding regions to other cellular components, etc. For the purposes of the invention, the term "therapeutic gene" is intended to mean, in particular, any gene coding for a protein product having a therapeutic effect. The protein product thus coded may be a protein, a peptide, etc. This protein product may be homologous to the target cell (i.e., a product that is normally expressed in the target cell when it has no pathology). In this case, the expression of a protein makes it possible for example to overcome insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or to overexpress said protein. The therapeutic gene may also encode a mutant of a cellular protein, having increased stability, altered activity, etc. The protein product may also be heterologous with respect to the target cell. In this case, an expressed protein may for example supplement or provide a deficient activity in the cell, enabling it to fight against a pathology, or to stimulate an immune response.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines; interleukines, interférons, TNF, etc. (FR 92 03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrohine, etc., la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 11947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. (FR 9304745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation: Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenants dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et Apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7-alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaison des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger, l' érythropoïétine (EPO), l'alpha-1-antitrypsine, etc. L'acide nucléique thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, responsable d'interférence, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201). Among the therapeutic products within the meaning of the present invention, mention may be made more particularly of enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines; interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 92 03120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotroin, etc., dystrophin or a minidystrophin (FR 91 11947), CFTR protein associated with cystic fibrosis, tumor suppressor genes: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. (FR 9304745), the genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, the genes involved in DNA repair, the suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), the genes of the hemoglobin or other protein transporters, the genes corresponding to the proteins involved in lipid metabolism, of the apolipoprotein type chosen from apolipoproteins AI, A-II, A-IV, B, CI, C-II, C-III, D , E, F, G, H, J and Apo (a), metabolic enzymes such as lipoprotein lipase, hepatic lipase, lecithin cholesterol acyltransferase, 7-alpha cholesterol hydroxylase, phosphatidic acid phosphatase, or lipid transfer proteins such as the cholesterol ester transfer protein and the phospholipid transfer protein, an HDL binding protein or a receptor selected for example from LDL receptors, chylomicro receptors ns-remnants and scavenger receptors, erythropoietin (EPO), alpha-1-antitrypsin, etc. The therapeutic nucleic acid may also be a gene or antisense sequence, responsible for interference, whose expression in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs. Such sequences may, for example, be transcribed into the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308. Therapeutic genes also comprise sequences coding for ribozymes, which are capable of selectively killing target RNAs (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générerchez l'homme ou l'animale une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Ban, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du syncitia forming virus , d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). As indicated above, the nucleic acid may also comprise one or more genes encoding an antigenic peptide, capable of generating a human or animal immune response. In this particular mode of implementation, the invention therefore allows the production of either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, especially against microorganisms, viruses or cancers. It may be in particular antigenic peptides specific for Epstein Ban virus, HIV virus, hepatitis B virus (EP 185 573), pseudo-rabies virus, syncitia-forming virus, others viruses or tumor-specific (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir de séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSF, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible. Preferably, the nucleic acid also comprises sequences allowing the expression of the therapeutic gene and / or the gene coding for the antigenic peptide in the cell or the desired organ. These may be sequences that are naturally responsible for the expression of the gene when these sequences are likely to function in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). In particular, they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences derived from the genome of the cell that it is desired to infect. Similarly, they may be promoter sequences derived from the genome of a virus. In this respect, mention may be made, for example, of the promoters of the genes El A, MLP, CMV, RSF, etc. In addition, these expression sequences can be modified by addition of activation sequences, regulation, etc. It can also be promoter, inducible or repressible.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule. Moreover, the nucleic acid may also comprise, in particular upstream of the therapeutic gene, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell. This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence. The nucleic acid may also include a signal sequence directing the synthesized therapeutic product to a particular compartment of the cell.
Les compositions selon l'invention peuvent également mettre en oeuvre un ou plusieurs éléments de ciblage permettant de diriger les complexes nucléiques vers des récepteurs ou des ligands à la surface de la cellule. A titre d'exemple, la composition de la présente invention peut comprendre un ou plusieurs anticorps dirigés contre des molécules de la surface cellulaire, ou encore un ou plusieurs ligands de récepteurs membranaires comme l'insuline, la transferrine, l'acide folique ou tout autre facteur de croissance, cytokines ou vitamines. Avantageusement, la composition peut utiliser des lectines, modifiées ou non, afin de cibler des polysaccharides particuliers à la surface de la cellule ou sur la matrice extracellulaire avoisinante. Des protéines à motif RGD, des peptides contenant un tandem de motifs RGD, cyclique ou non, ainsi que des peptides polylysine peuvent ainsi être utilisés. Il a également été décrit des peptides ligands, naturels ou synthétiques, intéressants notamment pour leur sélectivité vis-à-vis de cellules spécifiques et capable de promouvoir efficacement l'internalisation au niveau de ces cellules (Bary et al. Nature Medecine, 2, 1996, 299-305). Ces agents de ciblages sont généralement conjugués au copolymère considéré. The compositions according to the invention can also implement one or more targeting elements for directing the nucleic complexes to receptors or ligands on the surface of the cell. By way of example, the composition of the present invention may comprise one or more antibodies directed against cell surface molecules, or one or more membrane receptor ligands such as insulin, transferrin, folic acid or any other growth factor, cytokines or vitamins. Advantageously, the composition may use lectins, modified or otherwise, in order to target particular polysaccharides on the surface of the cell or on the neighboring extracellular matrix. Proteins with RGD motif, peptides containing a tandem of RGD motifs, cyclic or otherwise, as well as polylysine peptides can thus be used. It has also been described ligand peptides, natural or synthetic, interesting in particular for their selectivity with respect to specific cells and capable of effectively promoting internalization at these cells (Bary et al., Nature Medecine, 2, 1996). , 299-305). These targeting agents are generally conjugated to the copolymer under consideration.
On peut aussi citer à titre d'exemple des sucres de type galactose pour le ciblage des récepteurs des asiologlycoproteines présent à la surface des hépatocytes. By way of example, mention may be made of galactose type sugars for the targeting of the asiologlycoprotein receptors present on the surface of hepatocytes.
Les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intrapulmoniare, intraveineuse, intramusculaire, intracardiaque, intracérébral, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Elles se présentent sous la forme d'une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, dans un muscle squelettique par exemple, ou sous une forme appropriée à une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse) . Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptés en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellule en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. The compositions according to the invention can be formulated for administration by the topical, cutaneous, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intrapulmonary, intravenous, intramuscular, intracardiac, intracerebral, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. routes. They are in the form of an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, into a skeletal muscle for example, or in a form suitable for topical administration (on skin and / or mucosa ). It may be in particular sterile solutions, isotonic, or dry compositions, including freeze-dried, which, by the addition of sterilized water or saline, allow the constitution of injectable solutions. The nucleic acid doses used for the injection as well as the number of administrations may be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or the duration of the desired treatment. As regards more particularly the mode of administration, it can be either a direct injection into the tissues or the circulatory ways, or a cell treatment in culture followed by their reimplantation in vivo, by injection or graft.
Les compositions selon l'invention sont particulièrement avantageuses sur le plan thérapeutique et notamment pour la vaccination. The compositions according to the invention are particularly advantageous therapeutically and in particular for vaccination.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. The present invention will be more fully described with the aid of the examples and figures which follow, which should be considered as illustrative and not limiting.
Figure 1: Elle illustre les variations de potentiel zêta de différents complexes ADN/copolymères POE/POP pour différentes concentration en copolymères, à une température donnée. Les copolymères testés sont PE6400 , F68 et F127 . Figure 1: It illustrates the zeta potential variations of different POE / POP DNA / copolymer complexes for different copolymer concentrations at a given temperature. The copolymers tested are PE6400, F68 and F127.
Figure 2: Elle illustre l'efficacité de transfection d'un gène dans le muscle 30 squelettique pour différents complexes ADN/copolymères POE/POP. Figure 2: It illustrates the efficiency of transfection of a gene into skeletal muscle for different POE / POP DNA / copolymer complexes.
Figure 3: Elle illustre l'influence de la composition du milieu de formulation sur l'efficacité de transfection de différents copolymères POE/POP. Figure 3: It illustrates the influence of the composition of the formulation medium on the transfection efficiency of different POE / POP copolymers.
Figure 4: Elle rend compte de l'incidence des quantités en acide nucléique et en concentration du copolymère F68 sur l'efficacité d'une transfection intramusculaire. Figure 4: It reports the incidence of nucleic acid and F68 copolymer concentrations on the efficiency of intramuscular transfection.
Figure 5: Elle rend compte de l'efficacité de transfection du copolymère P25R2 sur la transfection d'ADN plasmidique. Figure 5: It reports the transfection efficiency of the P25R2 copolymer on plasmid DNA transfection.
Figure 6: Elle rend compte de l'expression de la protéine CAT à partir de l'administration endotrachéale chez la souris d'ADN formulé dans une composition conforme à l'invention. Figure 6: It reports the expression of CAT protein from endotracheal administration in mice of DNA formulated in a composition according to the invention.
Figure 7: Elle rend compte de l'efficacité de transfection de compositions conformes à l'invention contenant des sels de cations divalents de quantité et nature variables. FIG. 7: It reports on the transfection efficiency of compositions in accordance with the invention containing divalent cation salts of variable quantity and nature.
MATERIEL ET METHODES Animaux Des souris femelles Swiss (élevage Janvier), âgées de 8 semaines, sont utilisées. MATERIAL AND METHODS Animals Swiss female mice (January rearing), 8 weeks old, are used.
Plasmides Le plasmide utilisé est le pCMV-luc (Ferrari et al., Gene Ther. 4, 1100-1106, 1997). Il s'agit d'un vecteur d'expression contenant le gène reporter luciférase sous le 20 contrôle du promoteur du cytomegalovirus. Les plasmides sont purifiés à partir d' E. coli recombinante à l'aide de colonnes de purification plasmidiques EndoFree (Qiagen, Chatsworth, CA). Plasmids The plasmid used is pCMV-luc (Ferrari et al., Gene Ther, 4, 1100-1106, 1997). It is an expression vector containing the luciferase reporter gene under the control of the cytomegalovirus promoter. Plasmids were purified from recombinant E. coli using EndoFree plasmid purification columns (Qiagen, Chatsworth, CA).
Formulations Les copolymères POE/POP utilisés sont PE6400 , F68 , F127 et P25R2 commercialisés par la société BASF. Formulations The POE / POP copolymers used are PE6400, F68, F127 and P25R2 sold by the company BASF.
Le milieu Tyrode dit Tyrode 1X est un mélange de 140 mM NaCl, 6 mM KC1, 3 mM CaCl2, 2 mM Mg C12, 10 mM HEPES pH7,4 et 10 mM glucose. Dans les formulations préparées ci-après, le milieu utilisé avec l'ADN, est dénommé Tyrode 2X dans la mesure où ces composants sont présents à une concentration multipliée par 2. Tyrode medium, Tyrode 1X, is a mixture of 140 mM NaCl, 6 mM KCl, 3 mM CaCl 2, 2 mM Mg C12, 10 mM HEPES pH 7.4 and 10 mM glucose. In the formulations prepared hereinafter, the medium used with the DNA, is called Tyrode 2X insofar as these components are present at a concentration multiplied by 2.
Mesures du potentiel zêta La charge globale d'une formulation est évaluée par Interférométrie Laser Doppler (zêtasizer 3000HSA) selon le protocole précisé par le fabricant( Malvern). Zeta potential measurements The overall load of a formulation is evaluated by Doppler Laser Interferometry (zetesizer 3000HSA) according to the protocol specified by the manufacturer (Malvern).
La valeur ainsi mesurée est appréciée cinq fois pour 20 secondes avec une 5 correction de champ zéro dans une cellule capillaire aqueuse. The thus measured value is evaluated five times for 20 seconds with a zero field correction in an aqueous capillary cell.
Méthode de transfection in vivo Les souris Swiss sont anesthésiées avec de l'hypnomidate (40 mg/kg injectés par voie intrapéritonéale). 50 l de formulation à tester contenant 5 g de pCMVLuc sont injectés dans le muscle tibial anterior en un point unique, en utilisant une seringue microfine (U100; Becton Dickinson Infusion Therapy Systems, Sandy, UT). Au moins six muscles tibial anterior ont été mis en oeuvre pour chaque groupe d'expérience. In Vivo Transfection Method Swiss mice are anesthetized with hypnomidate (40 mg / kg injected intraperitoneally). 50 μl of the test formulation containing 5 g of pCMVLuc are injected into the anterior tibial muscle at a single point using a microfine syringe (U100) (Becton Dickinson Infusion Therapy Systems, Sandy, UT). At least six anterior tibial muscles were used for each experimental group.
Pour les injections intrapulmonaires, les souris sont anesthésiées avec un mélange kétamine (70 mg/kg) et de Xylasine (15mg/kg) en injection intrapéritonéale. For intrapulmonary injections, the mice are anesthetized with a ketamine mixture (70 mg / kg) and Xylasine (15 mg / kg) by intraperitoneal injection.
Ensuite, 100 gl de formulation contenant 20 gg de plasmide codant la chloramphenicol acétyl transferase (CAT) en présence de 2% de F68 ou de 0. 1% de PE6400 sont administrés par injection endotrachéale àl'aide d'un catheter de 22-gauge. Next, 100 μl of formulation containing 20 μg of plasmid encoding chloramphenicol acetyl transferase (CAT) in the presence of 2% F68 or 0.1% PE6400 are administered by endotracheal injection using a 22-gauge catheter. .
Méthode de dosage de l'expression du gène reporter Sept jours après l'injection intramusculaire, les muscles tibial anterior sont disséqués, congelés dans de l'azote liquide et homogénéisés dans un 1 ml de tampon de lyse reporter (Promega, Madison, WI), complémenté avec un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Après centrifugation à 10000 tr/min. pendant quatre minutes, l'activité luciférase est mesurée sur un échantillon de surnageant avec VICTOR2 (PerkinElmer, Norwalk, MA) en utilisant un système de dosage luciférase (Promega). Chaque extrait de muscle est analysé deux fois. L'activité luciférase est déterminée en mesurant l'émission de lumière après addition de 100 l de substrat de dosage luciférase à 10 gl de surnageant. Une courbe standard est établie avec un muscle tibial anterior de souris non traité pour chaque microplaque de lecture en utilisant une luciférase purifiée (Sigma, St. Louis, MO). La teneur en protéines est mesurée avec un kit de dosage protéine à l'acide bicinchoninique (BCA). Method for assaying reporter gene expression Seven days after intramuscular injection, anterior tibial muscles are dissected, frozen in liquid nitrogen and homogenized in 1 ml of reporter lysis buffer (Promega, Madison, WI) , supplemented with a cocktail of protease inhibitors (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). After centrifugation at 10,000 rpm. for four minutes, luciferase activity was measured on a supernatant sample with VICTOR2 (PerkinElmer, Norwalk, MA) using a luciferase assay system (Promega). Each muscle extract is analyzed twice. Luciferase activity is determined by measuring the light emission after addition of 100 μl of luciferase assay substrate to 10 μl of supernatant. A standard curve is established with anterior untreated mouse tibial muscle for each reading microplate using purified luciferase (Sigma, St. Louis, MO). The protein content is measured with a bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit.
Deux jours après l'injection dans les poumons, les souris sont sacrifiées et les poumons sont disséqués puis congelés dans l'azote liquide. Les poumons sont ensuite broyés dans 1 ml de tampon de lyse reporter (Promega, Madison, WI), complémenté avec un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Après centrifugation à 10000 tr/min. pendant cinq minutes, l'activité chloramphénicol acétyl transferase est mesurée sur un échantillon de surnageant avec VICTOR2 (PerkinElmer, Norwalk, MA) en utilisant un kit de dosage par ELISA (Roche diagnostics). Chaque poumon est analysé en duplicate. Une courbe standard est établie avec un poumon de souris non traité pour chaque microplaque de lecture en utilisant une Chloramphénicol acétyl transférase purifiée. Two days after injection into the lungs, the mice are sacrificed and the lungs are dissected and frozen in liquid nitrogen. The lungs are then ground in 1 ml of reporter lysis buffer (Promega, Madison, WI), supplemented with a cocktail of protease inhibitors (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). After centrifugation at 10,000 rpm. for five minutes, chloramphenicol acetyl transferase activity was measured on a supernatant sample with VICTOR2 (PerkinElmer, Norwalk, MA) using an ELISA assay kit (Roche Diagnostics). Each lung is analyzed in duplicate. A standard curve is established with an untreated mouse lung for each reading microplate using a purified chloramphenicol acetyl transferase.
Exemple 1Example 1
Caractérisation physicochimique des complexes ADN/Poloxamers Les Poloxamers utilisés sont les Poloxamers L64 , F68 et F127 dont les caractéristiques sont les suivantes: Poloxamer Poids moléculaire % d'oxyde d'éthylène L64 ou PE6400 2900 40 F68 ou Lutrol 8600 80 F127 12600 70 Les solutions sont préparées à raison de 20 % (poids par volume) dans l'eau et stockées à 4 C. Les formulations comprennent des concentrations variables du copolymère considéré et 10 g/ml d'une solution d'ADN plasmidique dans une solution Tyrode 2X. Physicochemical Characterization of DNA / Poloxamers Complexes Poloxamers used are Poloxamers L64, F68 and F127 with the following characteristics: Poloxamer Molecular Weight% L64 Ethylene Oxide or PE6400 2900 40 F68 or Lutrol 8600 80 F127 12600 70 Solutions are prepared at a rate of 20% (weight per volume) in water and stored at 4 C. The formulations comprise varying concentrations of the copolymer under consideration and 10 g / ml of a plasmid DNA solution in Tyrode 2X solution.
Les potentiels zêta des complexes copolymères/ADN sont mesurés pour chaque formulation. Les résultats obtenus sont présentés en figure 1. Y est également représentée, une courbe témoin obtenue avec un polymère à base uniquement de motifs POE. The zeta potentials of the copolymer / DNA complexes are measured for each formulation. The results obtained are shown in FIG. 1. There is also shown a control curve obtained with a polymer based solely on POE units.
Il apparaît, qu'en l'absence de Poloxamer, le potentiel zêta mesuré est égal à -22 mV ce qui est en accord avec les valeurs de l'ADN nu figurant dans la littérature. Le potentiel zêta augmente et atteint une valeur proche de zéro avec une concentration croissante en copolymère. It appears that, in the absence of Poloxamer, the measured zeta potential is equal to -22 mV, which is in agreement with the values of naked DNA in the literature. The zeta potential increases and reaches a value close to zero with increasing copolymer concentration.
Dans le Tyrode, cette valeur qualifiée de zéro est atteinte pour le PE6400 , F68 et F127 à des concentrations respectives de 1,72 mM (0,5 % pds/vol), 3,5 mM (3 % pds/vol) et 3,49 x 10-2 (0,044 % pds/vol). In the Tyrode, this value qualified as zero is reached for PE6400, F68 and F127 at concentrations of 1.72 mM (0.5% w / v), 3.5 mM (3% w / v) and 3, respectively. 49 x 10-2 (0.044% w / v).
Dans le NaCl, cette valeur qualifiée de zéro est atteinte pour le F68 et F127 à des concentrations respectives de 6 % (pds/vol) et 0,25 % (pds/vol) qui sont des concentrations beaucoup plus élevées en copolymères. In NaCl, this qualified zero value is reached for F68 and F127 at concentrations of 6% (w / v) and 0.25% (w / v), respectively, which are much higher concentrations of copolymers.
Par opposition aux copolymères selon l'invention, un homopolymère d'oxyde d'éthylène ne modifie pas le potentiel zêta de l'ADN et ce quelle que soit la concentration en polymère. In contrast to the copolymers according to the invention, a homopolymer of ethylene oxide does not modify the zeta potential of the DNA whatever the polymer concentration.
Exemple 2Example 2
Essais de transfection in vivo des complexes copolymères/ADN de l'exemple 1 gg de plasmide codant le gène luciférase formulé dans un milieu contenant du Tyrode nécessaire à l'ajustement de la tonicité sont associés avec le F68 ou le F127 . In vivo transfection assays of the copolymer / DNA complexes of Example 1 gg of plasmid encoding the luciferase gene formulated in Tyrode-containing medium necessary for the adjustment of tonicity are associated with F68 or F127.
Deux concentrations sont retenues pour chaque Poloxamer, l'une correspondant au point de neutralisation c'est-à-dire au potentiel zêta qualifié de zéro et l'autre à un potentiel zêta négatif, pour une concentration plus faible. Les formulations correspondantes complexes/ADN sont injectées intramusculairement dans le tibial antérieur de la souris selon le protocole décrit précédemment. Sept jours après l'injection, les muscles sont analysés pour l'expression de gène reporter. Les résultats obtenus sont illustrés en figure 2. Two concentrations are selected for each Poloxamer, one corresponding to the neutralization point, that is to say to the zeta potential qualified zero and the other to a negative zeta potential, for a lower concentration. The corresponding complex formulations / DNA are injected intramuscularly into the anterior tibial of the mouse according to the protocol described above. Seven days after the injection, the muscles are analyzed for reporter gene expression. The results obtained are illustrated in FIG.
On note que les formulations contenant le F68 à 3 % soit la concentration associée à un potentiel zêta qualifié de zéro, manifeste une activité luciférase nettement supérieure (d'au moins un facteur de 3) comparativement à une formulation de F68 à une concentration de 0,03 % en poids par volume correspondant à un potentiel zêta négatif Ce même comportement est observé en utilisant le F127 à la concentration associée à un potentiel zêta qualifié de zéro. It is noted that formulations containing 3% F68 is the concentration associated with a zeta potential of zero, exhibits significantly higher luciferase activity (at least a factor of 3) compared to an F68 formulation at a concentration of 0. , 03% by weight per volume corresponding to a negative zeta potential This same behavior is observed using the F127 at the concentration associated with a zeta potential qualified zero.
Exemple 3Example 3
Essais de transfection avec des compositions conformes à l'invention Les trois milieux de formulation suivants sont testés. Transfection assays with compositions according to the invention The following three formulation media are tested.
(i) 150 mM NaCl, (ii) Tyrode contenant 3 mM CaCl2 et 2 mM MgC12, et (iii) Tyrode contenant 1 mM CaCl2 et 1 mM MgC12. (i) 150 mM NaCl, (ii) Tyrode containing 3 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2, and (iii) Tyrode containing 1 mM CaCl 2 and 1 mM MgCl 2.
gg d'ADN plasmidique codant pour le gène de la luciférase sont formulés dans 50 l de chacun des milieux précédents avec différents poloxamers. Ces derniers y sont respectivement présents aux concentrations déterminées dans l'exemple précédent pour obtenir un potentiel zêta qualifié de zéro, à savoir 3 % en pds/vol pour le F68 , 0,05 % en pds/vol pour le F127 et 0.5 % en pds/vol pour le PE6400 . gg of plasmid DNA encoding the luciferase gene are formulated in 50 μl of each of the previous media with different poloxamers. The latter are respectively present at the concentrations determined in the previous example to obtain a zeta potential of zero, namely 3% by weight / vol for F68, 0.05% by weight / vol for F127 and 0.5% by weight. pds / vol for the PE6400.
de chaque formulation sont injectés au niveau du muscle tibial antérieur des souris Swiss selon le protocole décrit précédemment. of each formulation are injected into the anterior tibial muscle of Swiss mice according to the protocol described above.
Les résultats d'expression, obtenus dans un délai de 7 jours post injection, sont 10 représentés en figure 3. The expression results, obtained within 7 days post injection, are shown in FIG.
On observe que seules les formulations possédant des sels cationiques divalents conduisent à une augmentation très significative en activité de luciférase. Cette augmentation va d'un facteur de 30 à 40 comparativement aux valeurs obtenues avec chaque copolymère en milieu isotonique, c'est-àdire sans sels de cations divalents. It is observed that only the formulations having divalent cationic salts lead to a very significant increase in luciferase activity. This increase is a factor of 30 to 40 compared to the values obtained with each copolymer in isotonic medium, that is to say without divalent cation salts.
Exemple 4Example 4
Influence de la quantité d'ADN sur l'efficacité de transfection Les formulations de l'exemple précédent, à base de poloxamer F68 présent à raison de 0,3 % (conduisant à une solution de potentiel zêta négatif), 3 % (conduisant à des particules de potentiel zêta qualifié de zéro) ou 9 % en pds/vol manifestant une viscosité du milieu très élevée avec observation au microscope électronique d'ADN condensés par de très grosses particules, sont reproduites pour différentes concentrations en ADN plasmidique dans un milieu de formulation contenant du Tyrode. Influence of the quantity of DNA on the transfection efficiency The formulations of the preceding example, based on poloxamer F68 present at a rate of 0.3% (leading to a solution of negative zeta potential), 3% (leading to Zeta potential particles of zero or 9% wt / vol exhibiting a very high viscosity of the medium with electron microscopic observation of DNAs condensed by very large particles are reproduced for different concentrations of plasmid DNA in a medium of formulation containing Tyrode.
Les concentrations en ADN plasmidique testées sont 50 g ADN/ml et 100 gg ADN/ml, soit respectivement 2,5 et 5 gg d'ADN injectés dans le tibial antérieur de souris. The concentrations of plasmid DNA tested are 50 g DNA / ml and 100 gg DNA / ml, respectively 2.5 and 5 g of DNA injected into the anterior tibial mouse.
Les résultats obtenus sont présentés en figure 4. Ils indiquent que seul les formulations ayant un potentiel zêta qualifié de zéro permettent l'expression maximale du transgène. The results obtained are presented in FIG. 4. They indicate that only the formulations having a zeta potential qualified with zero allow the maximal expression of the transgene.
Exemple 5Example 5
Incidence de la structure chimique des copolymères POE/POP Le poloxamer utilisé est le P25R2 à savoir [poly(propylèneoxyde)214[poly(éthylèneoxyde)140-poly(propylèneoxyde)214]. L'efficacité de ce poloxamer dit inverse a été testée dans un milieu de formulation standard à base de NaCl et dans un milieu à base de Tyrode, complémenté ou non en CaC12 et MgCl2 dans les conditions expérimentales précisées en exemple 3. L'expression a été mesurée sept jours après l'injection de l'ADN plasmidique. Les résultats obtenus sont présentés en figure 5. Impact of the chemical structure of POE / POP copolymers The poloxamer used is P25R2, namely [poly (propylene oxide) 214 [poly (ethylene oxide) 140-poly (propylene oxide) 214]. The effectiveness of this so-called inverse poloxamer was tested in a standard formulation medium based on NaCl and in a Tyrode-based medium, supplemented or not with CaCl 2 and MgCl 2 under the experimental conditions specified in Example 3. The expression measured seven days after injection of the plasmid DNA. The results obtained are presented in FIG.
On note, d'une part, que l'expression la plus élevée en luciférase est atteinte avec le milieu Tyrode complémenté en CaCl2 et MgC12 et que, d'autre part, ce poloxamer est totalement inefficace en l'absence de cation divalent. On the one hand, it is noted that the highest luciferase expression is reached with the Tyrode medium supplemented with CaCl 2 and MgCl 2 and that, on the other hand, this poloxamer is totally ineffective in the absence of a divalent cation.
Exemple 6Example 6
L'efficacité de transfection d'une composition conforme à l'invention a été 15 testée au niveau du poumon. The transfection efficiency of a composition according to the invention was tested in the lung.
Pour ce faire, des formulations à base de 20 g d'ADN plasmidique codant pour la chloramphénicol acetyl transferase (CAT) complexés avec soit 0,1 % (pds/vol) de PE6400 ou 2 % (pds/vol) de F68 , ont été préparées soit dans 10 mM de milieu HEPES pH7,4 ou de milieu Tyrode. For this purpose, formulations based on 20 g of plasmid DNA coding for chloramphenicol acetyl transferase (CAT) complexed with either 0.1% (w / v) of PE6400 or 2% (w / v) of F68, were prepared either in 10 mM HEPES pH 7.4 medium or Tyrode medium.
Les compositions ainsi préparées ont été administrées via la voie endotrachéale dans les voies respiratoires de souris. L'expression de la chloroamphénicol acétyl transférase, CAT a été déterminée quantitativement par un test CAT ELISA sur l'intégralité des voies respiratoires (trachée et poumons), deux jours après l'administration. The compositions thus prepared were administered via the endotracheal route into the respiratory tract of mice. The expression of chloroamphenicol acetyltransferase, CAT was quantitatively determined by a CAT ELISA test on the entire respiratory tract (trachea and lungs) two days after administration.
Les résultats sont présentés en figure 6. The results are presented in Figure 6.
On note que deux jours après l'administration, l'expression CAT est augmentée de manière très significative dans l'ensemble des voies lorsqu'un complexe acide nucléique/copolymère POE/POP est formulé en présence de sels cationiques inorganiques divalents. It is noted that two days after administration, CAT expression is increased very significantly in all pathways when a nucleic acid / POE / POP copolymer complex is formulated in the presence of divalent inorganic cationic salts.
Exemple 7Example 7
Influence de la concentration des cations divalents sur l'efficacité de transfection des vecteurs F68 Les résultats sont présentés en figure 7. Influence of the concentration of divalent cations on the transfection efficiency of the F68 vectors The results are presented in FIG.
Les quatre milieux de formulation suivants sont testés. The following four formulation media are tested.
(iv) 150 mM NaCl, (v) Tyrode contenant 0.5 mM CaCl2 et 0.5 mM MgC12, (vi) Tyrode contenant 1 mM CaC12 et 1 mM MgC12, et (vii) Tyrode contenant 3 mM CaC12 et 2 mM MgC12 5 g d'ADN plasmidique codant pour le gène de la luciférase sont soit injectés nu ou formulés dans 50 pl de chacun des milieux avec le poloxamer F68 à 3 % pds/vol. 50 l de chaque préparation sont injectés au niveau du muscle tibial antérieur des souris Swiss selon protocole décrit précédemment. (iv) 150 mM NaCl, (v) Tyrode containing 0.5 mM CaCl 2 and 0.5 mM MgCl 2, (vi) Tyrode containing 1 mM CaCl 2 and 1 mM MgCl 2, and (vii) Tyrode containing 3 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2, 5 g of Plasmid DNA encoding the luciferase gene are either naked or formulated in 50 μl of each of the media with F68 poloxamer at 3% w / v. 50 l of each preparation are injected into the anterior tibial muscle of the Swiss mice according to the protocol described above.
7 jours post-injection les muscles sont broyés et l'activité luciférase dosée. Les 15 résultats sont présentés en figure 7. 7 days post-injection the muscles are crushed and the luciferase activity dosed. The results are shown in Figure 7.
Seuls les mélanges conformes à l'invention manifestent une efficacité élevée de l'expression de la luciférase. Only the mixtures according to the invention show a high efficiency of the expression of luciferase.
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