FR2867565A1 - Identification de contaminants biologiques par analyse proteomique differentielle et empreinte de masse peptidique (apdemp) - Google Patents
Identification de contaminants biologiques par analyse proteomique differentielle et empreinte de masse peptidique (apdemp) Download PDFInfo
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Abstract
L'invention a pour objet un procédé d'identification de contaminants biologiques naturels ou génétiquement modifiés susceptibles d'être présents dans des matières premières alimentaires par extraction et mise en solution de l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon, séparation desdites protéines de la solution par électrophorèse bidimensionnelle, localisation desdits contaminants, digestion par une enzyme protéolytique, et détermination de la masse moléculaire des peptides obtenus par spectrométrie de masse. L'invention a également pour objet un procédé d'établissement d'une banque de données constituée d'un ensemble d'empreintes de masses peptidiques.
Description
L'invention a pour objet un procédé d'identification de contaminants
biologiques naturels ou génétiquement modifiés susceptibles d'être présents dans des matières premières alimentaires par extraction et mise en solution de l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon, séparation desdites protéines de la solution
par électrophorèse bidimensionnelle, localisation desdits contaminants, digestion par une enzyme protéolytique, et détermination de la masse moléculaire des peptides obtenus par spectrométrie de masse. L'invention a également pour objet un procédé d'établissement d'une banque de données constituée d'un ensemble d'empreintes de masses peptidiques.
La demande sociétale est très forte en matière de sécurité alimentaire. Il est réclamé aux agro-industriels, d'une part, et à l'État, de l'autre, de garantir la mise sur le marché de produits alimentaires exempts de risques pour le consommateur.
Ces risques sont de deux ordres, toxicologique et biologique. Le premier peut résulter de la présence dans l'aliment (ou dans les matières premières qui ont servi à sa fabrication) d'organismes vivants producteurs de toxines. Le second est directement lié à la présence d'organismes ou de molécules issues de ces derniers, réputés néfastes à la santé du consommateur.
La contamination des matières premières d'origine biologique par un microorganisme implique la présence de protéines exogènes codées par des gènes étrangers; il peut en être de même si le génome a été modifié par insertion d'un gène étranger, ce qui est le cas des organismes génétiquement modifiés (OGM).
Dans tous les cas, la contamination se traduit par une modification de la nature et de l'abondance d'une partie des protéines exprimées (c'est à dire du protéome) de cet organisme. Cette modification du protéome est révélée par la présence d'une ou plusieurs protéines codées par les gènes de l'organisme contaminant ou par les gènes insérés dans le ou les tissus où ils s'expriment.
L'approche protéomique qui vise à identifier et à quantifier l'ensemble des protéines présentes dans un matériau biologique, ou analyse protéomique différentielle et empreinte de masse peptidique (APDEMP), est une méthode innovante de révélation et d'identification de contaminants biologiques dans les matières premières et les produits agro-alimentaires.
Cette méthode de portée générale ne repose sur aucun présupposé quant à l'origine et la nature des contaminants, contrairement aux techniques immunochimiques ou celles fondées sur l'emploi de sondes d'oligonucléotides qui impliquent de disposer d'anticorps ou de sondes conçus et obtenus pour identifier individuellement chacun des contaminants potentiels, préalablement attendus.
Elle permet notamment de mettre en évidence la présence d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Il convient de souligner que, même si les protéines ont été dégradées (protéolyse) au cours des processus de transformation et de conservation, la méthode APDEMP permet de révéler la présence d'une protéine étrangère à travers la mise en évidence de ses fragments.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire comprenant les étapes consistant à : a) Extraire et mettre en solution l'ensemble des protéines présentes dans la matière première agro-alimentaire à tester, b) Séparer l'ensemble des protéines présentes dans la solution obtenue à l'étape a), c) Caractériser les protéines séparées selon un profil et comparer ce profil avec le profil d'un échantillon témoin en vue de localiser, le cas échéant, le contaminant biologique, d) Récupérer ledit contaminant biologique et le cliver au moyen d'une ou plusieurs enzymes protéolytiques, e) Déterminer l'empreinte de masse peptidique du contaminant biologique, ladite empreinte correspondant à la masse moléculaire des peptides obtenus à l'étape d) par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol) ou par spectrométrie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol (ou Q-TOF pour quadrupole- time-of-flying ), ou temps de vol temps de vol (TOFTOF).
f) Comparer cette empreinte à celle obtenue, expérimentalement ou in silico dans les bases de données de séquences, pour une protéine connue et identifier, le cas échéant, le contaminant biologique comme étant identique ou similaire à celui d'une protéine connue lorsque son empreinte est identique ou similaire à celle de ladite protéine connue.
Dans la présente demande, l'expression méthode d < analyse protéomique différentielle et d'empreinte de masse peptidique ou méthode APDEMP sera également utilisée pour désigner le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention.
Les expressions contaminant biologique ou protéine exogène sont utilisées de manière indifférente dans la présente demande pour désigner un peptide, un polypeptide ou encore une protéine, susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire. 15
Le contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire que l'on cherche à identifier selon le procédé de l'invention peut être de tout type.
Ce peut être une toxine ou toute autre protéine produite par ou présente à la surface d'un organisme vivant présent de manière non souhaitée dans l'aliment (ou dans les matières premières qui ont servi à sa fabrication).
On peut citer comme exemple de contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire les protéines issues d'organismes génétiquement modifiés (OGM) tels que des plantes génétiquement modifiées: dans la mesure où une protéine transgénique est exprimée dans le tissu biologique constituant tout ou partie de la matière première agro-alimentaire, sa présence peut être révélée, voire quantifiée, par la méthode APDEMP.
On peut également citer les protéines naturelles de l'organisme génétiquement modifié (OGM) sur- et/ou sous-exprimés sous l'effet de la transgénèse. Dans ce cas, le procédé d'identification du contaminant biologique, en l'occurrence l'OGM, se fait de manière indirecte. En effet, la modification génétique n'a pas toujours comme objectif de produire une protéine en quantité, elle permet aussi de conférer des propriétés nouvelles à l'organisme transformé qui sont fondées sur des modifications de son métabolisme, notamment pour résister aux stress environnementaux d'ordre climatique ou pathologique.
Il est par exemple possible de faire acquérir à une plante une résistance nouvelle à des insectes, des nématodes ou des pathogènes (champignons, virus, bactéries). Les nouvelles voies métaboliques mises alors en jeu, qui modifient les réponses physiologiques de l'organisme, se traduisent par une diminution ou une augmentation du taux de certaines protéines naturelles. La méthode d'analyse protéomique différentielle et d'empreinte de masse peptidique peut alors éventuellement permettre de quantifier et de visualiser les effets de la transgenèse sur la sur- et/ou sous-expression du génome codant les protéines naturelles de l'organisme génétiquement modifié.
On peut encore citer comme exemple de contaminant biologique susceptible d'être identifié de manière indirecte par le procédé d'identification selon l'invention, une protéine naturelle sur- et/ou sous-exprimée, ladite sur- et/ou sous-expression étant révélatrice non pas d'une transgénèse, mais d'une altération métabolique dérivée de la présence d'un agent (phyto)pathogène dans la matière première agro-alimentaire.
Si la contamination biologique s'est produite sur l'organisme vivant (parasitisme, pathogénie), son métabolisme est détourné vers les voies de défense. Il y a alors expression de gènes jusqu'alors silencieux, qui vont donner naissance à des protéines nouvelles. C'est notamment le cas des protéines de pathogénicité des végétaux (protéines PR) qui sont abondamment synthétisées, quel que soit le type d'agression à laquelle la plante est soumise (bactérienne, mycologique, virale).
Dans ces conditions, le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention permet de corroborer la présence de protéines exogènes, et, en plus, de préciser si la contamination a eu lieu avant ou après récolte, élément de traçabilité important.
On entend désigner par l'expression matière première agro-alimentaire dans la présente demande tout produit comestible destiné à l'alimentation humaine ou animale. Ce produit peut être en début ou en cours d'élaboration, ou peut être un aliment ou l'un des composants d'un aliment.
Ainsi, selon un mode préféré de réalisation, le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention permet de suivre la composition de la matière première agro-alimentaire tout au long de sa chaîne de transformation.
En effet, l'empreinte de masse peptidique est représentative de la qualité d'un produit agro-alimentaire et en garantit la traçabilité. Outre la détection d'éventuelles protéines incriminables, elle assure une stabilité dans la composition du produit. La traçabilité lot à lot peut ainsi être assurée par l'analyse et le rapprochement d'images d'analyses protéomiques électrophorétiques (ou chromatographiques). En cas d'anomalie, il est possible de repérer et d'identifier la ou les protéines inhabituelles. Ceci permet de suivre l'évolution du produit lot par lot et assure une traçabilité de la matière première (par exemple: farines animales, farines végétales, viandes...).
La méthode d'extraction et de mise en solution réalisée à l'étape a) du procédé d'identification selon l'invention est une technique bien connue de l'homme du métier, qui saura la mettre en oeuvre de manière appropriée.
Dans le procédé d'identification selon l'invention, l'étape b) de séparation des protéines présentes dans la solution peut être réalisée selon toute méthode appropriée par ailleurs bien connue de l'homme de l'art. Notamment, on pourra se référer à l'ouvrage Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel et al., publié par J. Wiley & Sons, NY (1992) .
Selon un autre mode de réalisation préférée, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou capillaire, notamment multi-dimensionnelle.
Ainsi, on obtiendra un profil après l'étape b) de séparation des protéines, tel qu'un profil électrophorétique ou un profil chromatographique.
De manière préférée, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que, lorsque l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle, le contaminant biologique caractérisé à l'étape c) est récupéré à l'étape d) par excision du spot protéique obtenu sur le profil électrophorétique.
De préférence, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape f) de comparaison est réalisée par rapport à un ensemble de protéines connues répertoriées dans des banques de données spécifiques de chaque type de matière première agro-alimentaire, notamment d'une matière première agro-alimentaire susceptible de contenir un ou plusieurs organismes génétiquement modifiés.
Par exemple, le procédé d'identification selon l'invention vise à détecter un contaminant sélectionné dans le groupe suivant: - Toxine cryl Ab [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki] ; adresse dans Swiss-Prot:P06578.
- Toxine crylAC [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki; adresse dans Swiss-Prot] :P05068.
- Toxine crylF [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Aizawai] ; adresse dans Swiss-Prot: Q03746.
- Toxine cry3Bb1 [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kumamotoensis] ; adresse dans Swiss-Prot: Q06117.
- Toxine cry9C [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Tolworthi] ; adresse dans Swiss-Prot: Q45733.
- Adénine méthylase [gène d'Escherichia coli] ; adresse dans Swiss-Prot: P21311.
- Ribonucléase Barnase [gène de Bacillus amyloliquefaciens] ; adresse dans Swiss-Prot: P00648.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces viridochromogene] ; adresse dans Swiss-Prot: Q57146.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces hygroscopicus] ; adresse dans Swiss-Prot: P16426.
- 5-énolpyruvyle shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) [gène d'Agrobacterium tumefaciens souche CP4] ; adresse dans Swiss-Prot: Q9R4E4.
Ce groupe est extensible aux protéines introduites dans de nouveaux OGM dont la culture sera légalement autorisée.
Selon encore un autre mode de réalisation, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'empreinte de masse peptidique de la protéine connue est obtenue après clivage protéolytique in silico de ladite protéine connue.
L' expression empreinte de masse peptidique de chaque spot correspond à un ensemble de masses moléculaires de peptides résultant d'une digestion protéolytique à l'aide d'une ou plusieurs protéases telles que par exemple la trypsine.
De préférence, dans le procédé d'identification selon l'invention, lorsque la matière première à tester est une farine végétale, l'étape a) d'extraction des protéines présentes dans la farine végétale comprend la délipidation de ladite farine.
Selon encore un autre mode de réalisation préféré, le procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique selon l'invention permet la mise au point d'anticorps nouveaux pour faire de la recherche systématique de contaminants par immunochimie.
Les techniques d'immunochimie sont bien connues de l'homme de l'art, et sont notamment décrites dans Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel et al., publié par J. Wiley & Sons, NY (1992).
Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation du procédé d'identification selon l'invention pour caractériser la présence d'un contaminant biologique dans une matière première agro-alimentaire.
De préférence, l'utilisation du procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que ledit contaminant est une protéine issue d'un organisme génétiquement modifié.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé d'établissement d'une banque de données constituée d'un ensemble d'empreintes de masse peptidique correspondant à une matière première agro-alimentaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Extraire et mettre en solution l'ensemble des protéines présentes dans la matière première agro-alimentaire à tester, b) Séparer l'ensemble des protéines présentes dans la solution obtenue à l'étape a), c) Caractériser les protéines séparées selon un profil, d) Récupérer chaque protéine séparée et cliver chacune de ces protéines au moyen d'une ou plusieurs enzymes protéolytiques, e) Déterminer l'empreinte de masse peptidique de chaque protéine, ladite empreinte correspondant à la masse moléculaire des peptides obtenus à l'étape d) par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol) ou par spectrométrie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol (ou Q-TOF pour quadrupoletime-of-flying ), ou temps de vol temps de vol (TOF- TOF).
f) Répertorier chaque empreinte correspondant à chaque protéine dans une 30 banque de données, g) Optionnellement, réitérer les étapes précédentes en vue de compléter la banque de données.
Les étapes mises en oeuvre dans ce procédé d'établissement d'une banque de données correspondent à celles du procédé d'identification selon l'invention.
De préférence, le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou capillaire, notamment multi-dimensionnelle.
De manière encore préférée, le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention est caractérisé en ce que, lorsque l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle, les protéines séparées caractérisées à l'étape c) sont récupérées à l'étape d) par excision du spot protéique obtenu sur le profil électrophorétique.
Selon un autre mode de réalisation le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention est caractérisé en ce que le clivage protéolytique de l'étape d) est réalisé in silico pour au moins l'un des spots du profil électrophorétique.
De préférence, dans le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention, lorsque la matière première à tester est une farine végétale, l'étape a) d'extraction des protéines présentes dans la farine végétale comprend la délipidation de ladite farine.
De manière encore préférée, le procédé d'établissement d'une banque de données selon la présente invention est caractérisé en ce que, lorsque la matière première agro-alimentaire est susceptible de contenir un organisme génétiquement modifié, la banque de données est complétée par les empreintes de masse peptidique de protéines issues d'organismes génétiquement modifiés.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation de la banque de données établie selon le procédé d'établissement d'une banque de données selon l'invention pour identifier au moins un contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agroalimentaire.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1: Vue schématique d'une électrophorèse bidimensionnelle comparative révélant des protéines contaminantes; Figure 2: Electrophorèse bidimensionnelle des protéines hydrosolubles des lots 1 et 2; Figure 3: Analyse du spot D83-02; Figure 4: Analyse du spot D86-02; Figure 5: Analyse du spot D86-04; Figure 6: Electrophorèse bidimensionnelle des protéines hydrosolubles du lot 2; duplication expérimentale (les spots d'intérêt sont encerclés) ; Figure 7: Analyse du spot D63-02; Figure 8: Electrophorèse bidimensionnelle des protéines hydrosolubles des lots 3 et 4 en gel à 9 % d'acrylamide (les spots encerclés indiquent les protéines OGM) ; Figure 9: Analyse du spot 98-06; Figure 10:Analyse du spot 81-04.
EXEMPLES
La comparaison de deux lots de farine de maïs de même variété, mais ayant subi des conditions de conservation différentes illustre une application de la méthode APDEMP à la révélation de parasites biologiques. La comparaison de deux lots de farine de maïs, de même variété originelle mais dont l'un est une variété génétiquement modifiée, montre comment la méthode APDEMP peut révéler un OGM.
EXEMPLE 1 - MATERIELS ET METHODES 1.1 Origine des lots de farine de maïs Pour la première expérience, il s'agit de farines de maïs de même variété ayant été conservées de manières différentes.
La deuxième expérience a été réalisée avec des farines de maïs de l'Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) de la Commission Européenne (Joint Research Center, Geel Belgique) : référence IRMM 413-0 (lot témoin contenant moins de 0,02% d'OGM) et référence IRMM 413-5 (lot OGM contenant 5% d'OGM). Le maïs génétiquement modifié est la variété MON 810 (Origine: Monsanto) dans lequel a été introduit le gène de la protéine Cryl Ab issu du génome de la bactérie Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki HD-1. La modification génétique confère au maïs une résistance aux attaques de pyrale.
1.2 Extraction des protéines Après délipidation des farines par agitation dans de l'acétone puis de l'éther éthylique, les protéines ont été extraites par agitation dans de l'eau pure. Après centrifugation, le surnageant a été concentré et dialysé. Un dosage des protéines a été effectué par une méthode utilisant le Bleu de Coomassie.
La première étape d'extraction des protéines est cruciale pour les farines végétales. Elle nécessite d'abord une délipidation des farines par agitation dans de l'acétone puis de l'éther éthylique.
Par exemple, la farine (quelques grammes), préalablement lyophilisée, est suspendue dans 10% (p/v) d'acétone pure pour analyse et soumise à agitation à 4 C pendant 60 minutes au moyen d'un agitateur magnétique. Après sédimentation pendant 10 minutes, l'acétone est séparée du culot qui est dilué dans 10% (p/v) du diéthyléther pur pour analyse. Après agitation et sédimentation dans les mêmes conditions que précédemment, le culot est récupéré et séché sous vide pendant 90 minutes. Les protéines du culot sont extraites par agitation orbitale dans de l'eau pure dans un rapport de 10% (p/v) pendant 90 minutes à température ambiante. Après sédimentation, le surnageant est récupéré et soumis à une centrifugation (3 minutes à 16 000 x g), puis le second surnageant est concentré 5 fois par dialyse (membrane de cut-off de 8 000) contre du poly éthylène glycol 20 000. Une seconde dialyse contre de l'eau pure est effectuée pendant 2 heures en changeant 3 fois l'eau (rapport volumétrique de 1/2 500).
Avant le dépôt sur le strip d'électrofocalisation, les protéines sont dosées par une méthode sensible (Bradford modifié) utilisant le Bleu de Coomassie comme colorant, selon le protocole Pierce, en utilisant la sérum albumine humaine comme étalon.
1.3 Séparation électrophorétique - Electrophorèse bidimensionnelle Après extraction et mise en solution de tout ou partie des protéines, la révélation des protéines se fait par électrophorèse bidimensionnelle qui permet la séparation des protéines les unes des autres et leur repérage dans un système cartésien (point isoélectrique en abscisse et masse molaire apparente en ordonnée). Après coloration (bleu de coomassie colloïdal, nitrate d'argent ammoniacal, SYPRO RubyTM ou autre...), chaque protéine est visualisée sous forme d'un spot, répéré très précisément après digitalisation de l'image et normalisation. Grâce à la coloration relative des spots protéiques, on obtient ainsi des informations quantitatives sur l'abondance des protéines observées. Une alternative à l'électrophorèse bidimensionnelle est la chromatographie liquide haute performance, éventuellement multidimensionnelle, qui peut être directement couplée à la spectrométrie de masse (cf. paragraphe 1.4).
Première dimension sur bandes de gradient de pH: Un volume variable d'échantillon (afin d'obtenir la même quantité de protéines) a été déposé lors de la réhydratation du strip (bande de gradient de pH) dans une solution contenant de l'urée 9 M, du détergent CHAPS 4 %, des ampholytes 0.6 % et du DTT 20 mM afin d'obtenir un volume final de 550 l; la première dimension a lieu à 20 C et se décompose en plusieurs étapes afin d'obtenir au minimum 80 000 Volts.Heures.
Différentes bandes ont été utilisés selon les expériences: longueur de 17 ou 24 cm et gamme de points isoélectrique de pH allant de 3 à 6, de 5 à 8 et de 3 à 10. Avant transfert pour la deuxième dimension, les strips sont équilibrés en deux étapes: réduction par le DTT (130 mM, 15 mn) et alkylation des groupes sulfhydryles par l'iodoacétamide (135 mM, 20 mn).
Deuxième dimension sur gel d'acrylamide: La deuxième dimension a été effectuée à 20 C sur des gels de polyacrylamide. Différents pourcentages d'acrylamide ont été utilisés selon les expériences: 9, 12 ou 16 %. La migration a été effectuée à voltage constant (200 V à 10 C). Des marqueurs de masse molaire ont servi à étalonner les gels.
Coloration: Bleu de Coomassie colloïdal Numérisation des images: Les images des gels ont été acquises numériquement et une analyse des spots a été effectuée à l'aide du logiciel Melanie 4 (Genebio) pour la détection des spots et le rapprochement des images des lots à comparer.
1.4 Excision et digestion des spots différentiels; analyse par spectrométrie de masse Chaque spot révélé comme étant propre à l'échantillon par rapport au témoin (cf Figure 1) est alors excisé et soumis à l'action d'une enzyme protéolytique qui va cliver la protéine en fragments, nommés peptides. La masse moléculaire exacte (précision meilleure que 50 ppm) de ces fragments est déterminée simultanément par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol), et, si nécessaire (cas des génomes encore très mal connus, notamment), des informations partielles de la séquence des peptides peuvent être obtenues par fragmentation (spectrométie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol ou Q-Tof, voire temps de vol-temps de vol ou Tof-Tof). Cette technique permet d'obtenir l'empreinte de masse peptidique de chaque spot, c'est à dire un ensemble de masses moléculaires de peptides résultant d'une digestion protéolytique (ou chimique).
L'identification de la protéine est réalisée par comparaison de l'empreinte de masse peptidique mesurée avec celles issues de peptides virtuels obtenus par la digestion théorique des protéines des bases de données de séquences. Cette digestion virtuelle est réalisée in silico, en utilisant les propriétés de clivage de l'enzyme protéolytique ou de l'agent chimique utilisé. La démarche consiste à utiliser, dans un premier temps, des banques de données spécifiques de l'organisme constituant la matière première du produit agro-alimentaire à tester.
En cas de test révélant une protéine inconnue, donc exogène, il convient d'élargir progressivement la recherche aux banques d'autres organismes.
Dans le cas d'une recherche d'OGM, l'originalité du procédé repose sur la constitution d'une banque bio-informatique de séquences protéiques dans laquelle seront recherchées les protéines analysées. Cette banque résulte de la fusion de la banque de protéines de l'organisme étudié à laquelle sont fusionnées les séquences des transgènes légalement autorisés (voir par exemple la conception de la banque Maïs + OGM au paragraphe 1.5) . La création de cette banque est décisive pour une analyse pertinente de l'échantillon. Cette identification indique non seulement la nature de la protéine (ou le code de l'EST), mais aussi et surtout son origine biologique, donc son statut soit de protéine intrinsèque (codée par le génome d'une des matières premières entrant dans la composition du produit analysé), soit de protéine exogène, révélant dans ce cas une contamination biologique ou un transgène. Dans certains cas, on peut, en complément de protéines étrangères, identifier une ou plusieurs protéines de l'organisme d'origine dont la sur- ou sous-expression est induite par la présence de l'organisme contaminant (cas des pathogènes, notamment).
Dans le cas le plus général dans lequel existe un échantillon témoin, l'analyse par empreinte de masse peptidique ne porte que sur les spotsprotéiques particuliers à l'échantillon testé. Cependant la méthode permet, en l'absence de témoin, de révéler et d'identifier des contaminants en caractérisant systématiquement chacun des spots pour en déterminer l'origine biologique. Ce peut être aussi un préalable pour valider le témoin et générer une carte protéique bidimensionnelle de référence.
La méthode APDEMP, associée à la constitution de bases de données pertinentes, permet de révéler la nature étrangère d'une protéine trouvée en mélange avec celles d'un produit biologique d'intérêt agro-alimentaire. Elle permet aussi d'indiquer sa provenance biologique, révélant l'organisme d'origine, voire de mettre en évidence un transgène, dans le cas des OGM. Dans ce cas elle repose notamment sur la conception de bases de données intégrant les séquences protéiques des transgènes autorisés. Elle peut s'appliquer aussi bien aux organismes entiers, aux tissus biologiques, aux cellules, d'origine animale, végétale ou microbienne, qu'à certains produits transformés (par exemple, les farines), pour autant que les protéines n'aient pas subi de traitements physico- chimiques trop dénaturants (cuisson à haute température...).
Dans l'exemple de réalisation, l'excision de spots a été réalisée manuellement. Les peptides issus de la trypsinolyse réalisée à 37 C en milieu alcalin ont été analysés après mélange avec la matrice (acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) à l'aide d'un spectromètre de masse MALDI-TOF (Applied Biosystems, Voyager DE super STR) équipé d'un laser a azote (337 nm, fréquence de tir de 20Hz). Le spectre de masse a été acquis en mode réflectron (mode positif) avec un délai d'extraction de 130 ns. Une calibration interne a été obtenue à l'aide des masses des peptides d'autolyse de la trypsine. La gamme de masses analysée s'étend de 500 Da à 5000 Da.
1.5 Conception et exploitation des bases de données Les interrogations en bases de données ont été réalisées par le logiciel PROFOUND avec une exigence de précision de 50 ppm. Avec la calibration interne obtenue grâce aux peptides trypsiques, les résultats sont acquis avec une précision inférieure a 20 ppm. Le minimum de peptides requis pour une identification en bases de données est fixé à 4 peptides.
Bases de données utilisées: Banques de données généralistes (Swiss-Prot, TrEMBL...) et banque de données d'EST (expressed sequenced tag) de Maïs auquelles nous avons adjoint une banque conçue spécialement pour révéler les OGM (Banque Maïs + OGM ).
Conception de la banque Maïs + OGM : Cette banque a été créée à partir d'une banque de protéines de maïs connues (environ 5000 entrées), à laquelle les protéines codées par les gènes autorisés pour produire les OGM de maïs commercialisés en juillet 2003 ont été ajoutés.
Liste des gènes étrangers introduits: - Toxine cryl Ab [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki] ; adresse dans Swiss-Prot:P06578.
- Toxine cryl AC [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki; adresse dans Swiss-Prot] :P05068.
- Toxine crylF [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Aizawai] ; adresse dans Swiss-Prot: Q03746.
- Toxine cry3Bb1 [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Kumamotoensis] ; adresse dans Swiss-Prot: Q06117.
- Toxine cry9C [gène de Bacillus thuringiensis ssp. Tolworthi] ; adresse dans Swiss-Prot: Q45733.
- Adénine méthylase [gène d'Escherichia coin; adresse dans Swiss-Prot: P21311.
- Ribonucléase Barnase [gène de Bacillus amyloliquefaciens] ; adresse dans Swiss-Prot: P00648.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces viridochromogene] ; adresse dans Swiss-Prot: Q57146.
- Phosphinothricine acétyltransférase (PAT) [gène de Streptomyces hygroscopicus] ; adresse dans Swiss-Prot: P16426.
- 5-énolpyruvyle shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) [gène d'Agrobacterium tumefaciens souche CP4] ; adresse dans Swiss-Prot: Q9R4E4.
EXEMPLE 2 - RESULTATS 2.1 Mise en évidence de contaminants biologiques Comparaison des électrophorèses des lots 1 et 2 L'observation des gels révèle un certain nombre de spots protéiques caractéristiques de chacun des lots (encerclés sur la figure 2), spots qui ont été découpés, hydrolysés à la trypsine et soumis à une analyse de masse MALDI-TOF (figure 2).
Particularité du lot 1 L'électrophorèse montre, par rapport au lot 2, quatre spots protéiques particuliers. Leur analyse par empreinte de masse peptidique révèle la présence d'une protéine chaperon provenant du parasite Ustilago maydis, identifié avec une grande certitude (96% de séquence homologue) (figure 3).
Particularités du lot 2 Le spot D86-02 met en évidence une protéine, la HC-toxine réductase, révélant une infection par un champignon du genre Helminthosporium (alternativement Cochliobolus) responsable de Phelminthosporiose du Maïs (figure 4). Ce genre sécrète en effet un peptide cyclique toxique spécifique qui induit chez son hôte une réaction de défense se traduisant par l'expression d'une peptidase spécifique, la HC-toxine réductase, qui détoxique la toxine HC en réduisant un groupe carboné.
Cette infection est corroborée par l'expression simultanée d'une protéine spécifique de la réaction d'hypersensibilité du maïs (réaction de défense des végétaux, analogue à la réaction inflammatoire des tissus animaux), protéine observée dans le spot D86-04 (figure 5).
Reproductibilité La répétition de la recherche de contaminant dans le lot 2, en refaisant entièrement l'expérience ex nihilo, a permis de retrouver les mêmes protéines (Figure 6). Les spots D63-01 et D63-05 mettent à nouveau en évidence la HC-toxine réductase, alors que le spot D63-05 révèle une autre protéine de défense, caractéristique de la réaction d'hypersensibilité, appartenant à la famille des protéines PR (pathogenesis related proteins) (figure 7).
2.2 Mise en évidence de protéines révélatrices d'OGM Cette analyse porte sur la comparaison de farines de maïs fournies par l'IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements, European Commission, Joint Resaerch Center). Le lot 3 est un témoin contenant moins de 0,02% d'OGM, le lot 4 est une farine contenant 5% d'OGM Monsanto 810.
Comparaison des électrophorèses des lots 3 et 4 Les spots 98-03, 98-04, 98-06 et 98-11 sont présents uniquement dans le lot 4 qui concerne une farine contenant 5% de la variété de maïs OGM Monsanto 810 (figure 8).
Révélation et identification des transgènes Après analyse par spectrométrie de masse des peptides trypsiques, le spot 98-06 s'avère être une protéine transgénique: c'est la toxine Cry de Bacillus thuringiensis répertoriée par les obtenteurs de l'OGM considéré (figure 9) . Les spots 98-03, 98-04 et 98-11 correspondent à des fragments protéolytiques de cette même protéine.
Reproductibilité Une électrophorèse des mêmes lots avec une concentration d'acrylamide à 12% (non figurée) montre que le lot 4 contient un spot (8104) dont l'analyse par spectrométrie de masse des peptides trypsiques révèle aussi une protéine transgénique de type toxine Cry de Bacillus thuringiensis (figure 10).
EXEMPLE 2 - CONCLUSIONS Ces exemples montrent que la méthode d'Analyse Protéomique Différentielle et d'Empreinte de Masse Peptidique permet de révéler une contamination de lots de maïs soit par la présence de protéines exogènes (cas de la chaperone d' Ustilago maydis), soit de protéines du maïs spécifiquement exprimées dans le cas d'une attaque parasitaire ou microbienne (HC toxin reductase) en complément de protéines de défense ubiquitaires (protéines d'hypersensibilité et de pathogénie).
Par ailleurs, le second exemple indique que, notamment lorsque l'on utilise une base de donnée spécialement conçue pour révéler des séquences de protéines transgéniques, la méthode APDEMP révèle la présence d'une contamination par un OGM.
2867565 22
Claims (17)
1. Procédé d'identification d'au moins un contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agro-alimentaire comprenant les étapes consistant à : a) Extraire et mettre en solution l'ensemble des protéines présentes dans la matière première agro-alimentaire à tester, b) Séparer l'ensemble des protéines présentes dans la solution obtenue à l'étape a), c) Caractériser les protéines séparées selon un profil et comparer ce profil avec le profil d'un échantillon témoin en vue de localiser, le cas échéant, le contaminant biologique, d) Récupérer ledit contaminant biologique et le cliver au moyen d'une ou plusieurs enzymes protéolytiques, e) Déterminer l'empreinte de masse peptidique du contaminant biologique, ladite empreinte correspondant à la masse moléculaire des peptides obtenus à l'étape d) par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol) ou par spectrométrie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol, ou temps de vol temps de vol. Comparer cette empreinte à celle obtenue, expérimentalement ou in silico dans les bases de données de séquences, pour une protéine connue et identifier, le cas échéant, le contaminant biologique comme étant identique ou similaire à celui d'une protéine connue lorsque son empreinte est identique ou similaire à celle de ladite protéine connue. f) 30
2. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape f) de comparaison est réalisée par rapport à un ensemble de protéines connues répertoriées dans des banques de données spécifiques de chaque type de matière première agro-alimentaire, notamment d'une matière première agro-alimentaire susceptible de contenir un ou plusieurs organismes génétiquement modifiés.
3. Procédé d'identification selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou capillaire, notamment multi-dimensionnelle.
4. Procédé d'identification selon la revendication 3 caractérisé en ce que, lorsque l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle, le contaminant biologique caractérisé à l'étape c) est récupéré à l'étape d) par excision du spot protéique obtenu sur le profil électrophorétique.
5. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'empreinte de masse peptidique de la protéine connue est obtenue après clivage protéolytique in silico de ladite protéine connue.
6. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, lorsque la matière première à tester est une farine végétale, l'étape a) d'extraction des protéines présentes dans la farine végétale comprend la délipidation de ladite farine.
7. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il permet de suivre la composition de la matière première agro-alimentaire tout au long de sa chaîne de transformation.
8. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il permet la mise au point d'anticorps nouveaux pour faire de la recherche systématique de contaminants par immunochimie.
9. Utilisation du procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 8 pour caractériser la présence d'un contaminant biologique dans une matière première agro-alimentaire.
10. Utilisation du procédé d'identification selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit contaminant est une protéine issue d'un organisme génétiquement modifié.
11. Procédé d'établissement d'une banque de données constituée d'un ensemble d'empreintes de masse peptidique correspondant à une matière première agro-alimentaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Extraire et mettre en solution l'ensemble des protéines présentes dans la matière première agro-alimentaire à tester, b) Séparer l'ensemble des protéines présentes dans la solution obtenue à l'étape a), c) Caractériser les protéines séparées selon un profil, d) Récupérer chaque protéine séparée et cliver chacune de ces protéines au moyen d'une ou plusieurs enzymes protéolytiques, e) Déterminer l'empreinte de masse peptidique de chaque protéine, ladite empreinte correspondant à la masse moléculaire des peptides obtenus à l'étape d) par spectrométrie de masse MALDI-TOF (ionisation/désorption par tir laser assisté par matrice et mesure par temps de vol) ou par spectrométrie de masse en tandem dite MS/MS, de type quadrupôle-quadrupôle, quadrupôle-temps de vol, ou temps de vol temps de vol. f) Répertorier chaque empreinte correspondant à chaque protéine dans une banque de données, g) Optionnellement, réitérer les étapes précédentes en vue de compléter la banque de données.
12. Procédé d'établissement d'une banque de données selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi-dimensionnelle ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC) ou capillaire, notamment multidimensionnelle.
13. Procédé d'établissement d'une banque de données selon la revendication 12 caractérisé en ce que, lorsque l'étape b) de séparation des protéines en solution est effectuée par électrophorèse bi- dimensionnelle, les protéines séparées caractérisées à l'étape c) sont récupérées à l'étape d) par excision du spot protéique obtenu sur le profil électrophorétique.
14. Procédé d'établissement d'une banque de données selon la revendication 11, caractérisé en ce que le clivage protéolytique de l'étape d) est réalisé in silico pour au moins l'un des spots du profil électrophorétique.
15. Procédé d'établissement d'une banque de données selon l'une des revendications 11 à 14 caractérisé en ce que, lorsque la matière première à tester est une farine végétale, l'étape a) d'extraction des protéines présentes dans la farine végétale comprend la délipidation de ladite farine.
16. Procédé d'établissement d'une banque de données selon l'une des revendications 11 à 15 caractérisé en ce que, lorsque la matière première agro-alimentaire est susceptible de contenir un organisme génétiquement modifié, la banque de données est complétée par les empreintes de masse peptidique de protéines issues d'organismes génétiquement modifiés.
17. Utilisation de la banque de données établie selon le procédé de l'une des revendications 11 à 16 pour identifier au moins un contaminant biologique susceptible d'être présent dans une matière première agroalimentaire.
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