FR2860518A1

FR2860518A1 - Procede pour le diagnostic/pronostic du neuroblastome

Info

Publication number: FR2860518A1
Application number: FR0311483A
Authority: FR
Inventors: Alexander Krause; Valerie Combaret; Bruno Lacroix; Alain Puisieux
Original assignee: Biomerieux SA; Centre Leon Berard
Current assignee: Biomerieux SA; Centre Leon Berard
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2005-04-08
Anticipated expiration: 2023-10-01
Also published as: WO2005030992A3; US20060263784A1; EP1668163A2; FR2860518B1; WO2005030992A2

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour le pronostic du neuroblatome chez un patient atteint du neuroblastome caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélévé chez le patient,b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N°11, 17 ou 37, on met en contact le matériel biologique avec au moins deux réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N° 1 à 37,c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N°11, 17 ou 37, on détermine l'expression d'au moins deux desdit gènes cibles.

Description

La présente invention concerne un procédé pour le pronostic du neuroblastome.

Le neuroblastome est en fréquence la deuxième cause de tumeur solide chez l'enfant après les tumeurs cérébrales. Le neuroblastome est le plus fréquent des cancers de l'enfant avant cinq ans et représente environ 15 % des cancers avant cet âge.

Les neuroblastomes sont des tumeurs malignes développées à partir de neuroblastes nés de la crête neurale et migrant pour former les ganglions sympathiques et la médullo-surrénale durant la période embryonnaire et f#tale.

Lorsqu'un premier examen clinique permet de suspecter un neuroblastome (boule, hématome, endroit douloureux, difficulté à bouger les membres, etc...), un bilan complet est réalisé afin de confirmer le diagnostic.

Généralement, ce bilan comprend : > des examens par prélèvements (sang, urines), > différents examens radiologiques qui ont pour but de bien situer la tumeur, ses limites et sa taille (scintigraphie, échographie et/ou scanner et/ou IRM ), des examens au microscope de fragments de tumeurs afin de découvrir exactement de quel type de tumeur dont il s'agit.

A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement universel lorsqu'un neuroblastome est diagnostiqué, et un traitement spécifique doit être adapté en fonction de l'âge du patient. On distingue alors principalement les traitements loco-régionaux (chirurgie et radiothérapie) afin d'enlever ou détruire la tumeur directement à l'endroit où elle se trouve et les traitements généraux (chimiothérapie), qui agissent dans tout l'organisme du patient à la fois sur la tumeur et mais aussi là où peuvent se trouver les métastases.

Le traitement du patient peut être adapté selon le pronostic du neuroblastome et la stratégie thérapeutique peut s'avérer très différente selon le stade et la caractérisation génétique des cellules tumorales. Ainsi, dans les formes localisées dont les cellules tumorales ne portent aucun caractère de mauvais pronostic, le traitement est essentiellement chirurgical alors que dans les formes localisées dont les cellules

tumorales sont de mauvais pronostic, le traitement doit être plus agressif, reposant sur la chimiothérapie et une radiothérapie locale.

Il existe a l'heure actuelle différentes classifications du neuroblastome permettant de définir de la façon la plus précise possible des groupes pronostiques. Ces groupes permettent théoriquement de définir les indications thérapeutiques de façon adaptée au risque de la maladie. On peut citer notamment la classification de l'International Neuroblastoma Staging System (Brodeur et al. (1993) J. Clin. Oncol. 11, 1466-77), qui tient compte des données anatomiques actuellement reconnues comme ayant une valeur pronostique. Selon cette classification, on distingue les stades suivants : # stade 1 : localisée totalement enlevée macroscopiquement ; homo et controlatéraux examinés et négatifs microscopiquement # stade 2A : tumeur unilatérale enlevée incomplètement avec des ganglions homo et controlatéraux examinés et négatifs.

# stade 2B : unilatérale avec atteinte ganglionnaire homolatérale et non controlatérale.

# stade 3 : unilatérale non opérable montrant un dépassement de la ligne médiane ou tumeur unilatérale avec atteinte ganglionnaire controlatérable ou tumeur à cheval sur la ligne médiane avec extension bilatérale par infiltration ou par adénopathie.

>stade 4 : primitive s'accompagnant d'une dissémination à distance : ganglionnaire, osseuse, médullaire, hépatique.

>stade 4S : de stade local 1 ou 2 avec une dissémination limitée au foie, à la peau ou à la moelle osseuse. Les stades 4S sont des enfants ayant un âge inférieur à 1 an.

Actuellement, le pronostic d'un neuroblatome peut être établi par l'étude de différents facteurs:
1) l'amplification de l'oncogène N-myc est considérée comme un outil de référence, et est utilisée par la plupart des oncologues pédiatriques pour définir, au moment du diagnostic, les malades qui doivent recevoir une chimiothérapie intensive suivie de greffe de moelle (Seeger et al, N Engl J

Med. 1985 ; 313(18):1111-6 ; Rubie et al J Clin Oncol. 1997 Mar;15(3):1171-
82. ).

2) il existerait également une corrélation entre le pronostic du neuroblastome et le rapport des catécholamines VMA (vanilmandelic acid)/ HVA (homovanillic acid), au moment du diagnostic. Dans les stades avancés, une excrétion urinaire élevée d'HVA et basse de VMA, voire normale, signerait un mauvais pronostic (Laug et al Pediatrics. 1978 ; 62(1):77-83).

3) l'augmentation de la ferritine sérique dans les neuroblastomes est également considérée comme un facteur de mauvais pronostic (Evans et al, Cancer.

1987 ; 59(11):1853-9).

4) le taux de LDH (lactate deshydrogénase) pourrait également être un facteur de pronostic indépendant et prédominant pour les stades localisés I à III chez l'enfant de plus d'un an, et de façon moins importante chez l'enfant de moins d'un an avec un stade IV (Berthold et al, Am J Pediatr Hematol Oncol. 1994 ;
16 (2):107-15).

Toutefois, la corrélation entre l'amplification de l'oncogène N-myc et le pronostic du neuroblastome n'est pas absolue (Maris & Matthay, J Clin Oncol, 1999, 17(7) : 2264-2279). De plus la LDH et la ferritine étant deux facteurs corrélés entre eux, la fiabilité de ces facteurs pour le pronostic du neuroblastome reste discutée (Berthold et al, 1992, Am J Pediatr Hamtol Oncol, 14(3) : 207-215). Enfin, l'utilisation du rapport VMA/HVA donne une sensibilité et une spécificité insuffisantes pour le pronostic du neuroblastome.

La présente invention se propose de résoudre l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil de pronostic du neuroblastome.

D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le pronostic d'un neuroblastome peut être déterminé par l'analyse de l'expression de gènes cibles sélectionnés parmi 37 gènes tel que présenté dans le tableau 1 ci après, qui sont exprimés différentiellement selon que le patient soit de bon ou de mauvais pronostic.

Tableau 1 - liste des 37 gènes cibles selon l'invention

<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> Description <SEP> de <SEP> la <SEP> séquence <SEP> N <SEP> Genbank
<tb> N
<tb> 1 <SEP> Flap <SEP> structure-specific <SEP> endonuclease <SEP> 1 <SEP> (FEN1) <SEP> NM <SEP> 004111
<tb> 2 <SEP> Ubiquitin-conjugating <SEP> enzyme <SEP> E2C <SEP> (UBE2C) <SEP> NM <SEP> 007019
<tb> 3 <SEP> Insulin-like <SEP> growth <SEP> factor <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 7 <SEP> (IGFBP7) <SEP> NM <SEP> 001553
<tb> 4 <SEP> Collagen, <SEP> type <SEP> I, <SEP> alpha <SEP> 2 <SEP> (COL1A2) <SEP> NM <SEP> 000089
<tb> 5 <SEP> Nucleolin <SEP> (NCL) <SEP> NM <SEP> 005381
<tb> 6 <SEP> Interleukin <SEP> enhancer <SEP> binding <SEP> factor <SEP> 3, <SEP> 90kDa <SEP> (ILF3), <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 2 <SEP> NM <SEP> 004516
<tb> 7 <SEP> cDNA <SEP> FLJ30781 <SEP> fis, <SEP> clone <SEP> FEBRA2000874 <SEP> AK055343
<tb> g <SEP> TIF1 <SEP> bêta <SEP> zinc <SEP> fingerprotein <SEP> X97548
<tb> 9 <SEP> Likely <SEP> ortholog <SEP> of <SEP> mouse <SEP> tumor <SEP> differentially <SEP> expressed <SEP> 1, <SEP> like <SEP> (TDE <SEP> 1 <SEP> L) <SEP> NM <SEP> 020755
<tb> 10 <SEP> DKFZp434D1112~s1 <SEP> 434 <SEP> (synonym: <SEP> htes3) <SEP> cDNA <SEP> clone <SEP> DKFZp434D1112 <SEP> 3' <SEP> AL039831
<tb> v-myc <SEP> myelocytomatosis <SEP> viral <SEP> related <SEP> oncogene, <SEP> neuroblastoma <SEP> derived
<tb> 11 <SEP> (avian)(MYCN) <SEP> NM <SEP> 005378
<tb> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> D2 <SEP> polypeptide <SEP> 16.5kDa <SEP> (SNRPD2), <SEP> transcript
<tb> 12 <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 004597
<tb> 13 <SEP> MCM2 <SEP> minichromosome <SEP> maintenance <SEP> déficient <SEP> 2, <SEP> mitotin <SEP> (S. <SEP> cerevisiae) <SEP> NM <SEP> 004526
<tb> 14 <SEP> RuvB-like <SEP> 2 <SEP> (E. <SEP> coli) <SEP> (RUVBL2) <SEP> NM <SEP> 006666 <SEP>
<tb> 15 <SEP> Immédiate <SEP> early <SEP> protein <SEP> ETR101 <SEP> NM <SEP> 004907
<tb> 16 <SEP> RNA <SEP> binding <SEP> protein <SEP> SI, <SEP> serine-rich <SEP> domain <SEP> (RNPS1), <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 006711
<tb> 17 <SEP> Ornithine <SEP> decarboxylase <SEP> 1 <SEP> (ODC1) <SEP> NM <SEP> 002539
<tb> 18 <SEP> Activity-regulated <SEP> cytoskeleton-associated <SEP> protein <SEP> (ARC) <SEP> NM <SEP> 015193
<tb> 19 <SEP> Secretogranin <SEP> II <SEP> (chromogranin <SEP> C) <SEP> (SCG2) <SEP> NM <SEP> 003469 <SEP>
<tb> 20 <SEP> Structure <SEP> spécifie <SEP> récognition <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> (SSRP1) <SEP> NM <SEP> 003146
<tb> 21 <SEP> Collagen, <SEP> type <SEP> VI, <SEP> alpha <SEP> 3 <SEP> (COL6A3), <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 004369
<tb>

22 Small nuclear ribonucleoprotein polypeptides B and B (SNRPB) NM 003091

<tb>
<tb> 23 <SEP> Acidic <SEP> (leucine-rich) <SEP> nuclear <SEP> phosphoprotein <SEP> 32 <SEP> family, <SEP> member <SEP> B <SEP> (ANP32B) <SEP> NM <SEP> 006401
<tb> 24 <SEP> Non-POU <SEP> domain <SEP> containing, <SEP> octamer-binding <SEP> (NONO) <SEP> NM <SEP> 007363
<tb> 25 <SEP> Peripheral <SEP> myelin <SEP> protein <SEP> 22 <SEP> (PMP22), <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 000304
<tb> 26 <SEP> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptide <SEP> E <SEP> (SNRPE) <SEP> NM <SEP> 003094
<tb> 27 <SEP> KIAA0436 <SEP> mRNA, <SEP> partial <SEP> cds <SEP> AB007896
<tb> 28 <SEP> Fibrillarin <SEP> (FBL) <SEP> NM <SEP> 001436 <SEP>
<tb> 29 <SEP> Tripartite <SEP> motif-containing <SEP> 2 <SEP> (TRIM2) <SEP> NM <SEP> 015271
<tb> MCM6 <SEP> minichromosome <SEP> maintenance <SEP> deficient <SEP> 6 <SEP> (MIS5 <SEP> homolog, <SEP> S. <SEP> pombe)
<tb> 30 <SEP> (S. <SEP> cerevisiae) <SEP> (MCM6) <SEP> NM <SEP> 005915
<tb> 31 <SEP> Polypyrimidine <SEP> tract <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> (PTBP <SEP> 1 <SEP> ), <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 002819
<tb> 32 <SEP> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptide <SEP> A <SEP> (SNRPA) <SEP> NM <SEP> 004596
<tb> 33 <SEP> Creatine <SEP> kinase, <SEP> brain <SEP> (CKB) <SEP> ~~~ <SEP> NM <SEP> 001823
<tb> 34 <SEP> Erythrocyte <SEP> membrane <SEP> protein <SEP> band <SEP> 4.1-like <SEP> 3 <SEP> (EPB41L3) <SEP> NM <SEP> 012307 <SEP>
<tb> 35 <SEP> Hypothetical <SEP> protein <SEP> MGC3077 <SEP> NM <SEP> 024051
<tb> 36 <SEP> Tissue <SEP> alpha-L-fucosidase <SEP> 1 <SEP> (FUCA <SEP> 1) <SEP> NM <SEP> 000147 <SEP>
<tb> 37 <SEP> Secreted <SEP> protein <SEP> acidic <SEP> and <SEP> rich <SEP> in <SEP> cysteine <SEP> (SPARC) <SEP> NM <SEP> 003118
<tb>

Parmi ces gènes, on peut distinguer des gènes dont la fonction est connue mais qui n'ont jamais été mis en relation avec le neuroblastome ( SEQ ID N 1 à 8 ; 12 à 16 ; 18 à 26 ; 30 à 34 ; ainsi que des gènes dont la fonction est inconnue (SEQ ID N 9 ; 10 ; 27 ; 29 ; 35). Il est bien entendu que si différentes isofonnes de ces gènes existent, toutes les isoformes sont relevantes pour la présente invention, et pas uniquement celles présentées dans le précèdent tableau.

A cet effet, la présente invention concerne un procédé pour le pronostic du neuroblastome chez un patient atteint du neuroblastome caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélevé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID
N 1 à 37, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N 11, 17 ou 37, on met en contact le matériel biologique avec au moins deux réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37, c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N 11, 17 ou 37, on détermine l'expression d'au moins deux desdit gènes cibles Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive, tissu, de tumeur, de moelle osseuse, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de

l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire, préférentiellement un échantillon de tumeur ou de moelle osseuse.

Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrit du gène cible, mais également transcrit de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible.

Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de l'échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques bien connus de l'homme du métier.

A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par : # une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet: o WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO 99/53304 sur la lyse électrique, o WO 99/15321 sur la lyse mécanique.

L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809).

# une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adapté à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US
5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet : et WO-A-99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n 28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSil Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société
Xtrana : matrice Xtra-Bind).

Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'éthanol 100%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en solution .

Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement les ARN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter les ARN

avec de l'éthanol 100%. Les ARN peuvent alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en solution.

Au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C).

L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence.

La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température

d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P. E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'amorce d'amplification comprend une séquence choisie parmi les SEQ ID N 38 à 41 et SEQ ID N 44 à 45. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un

processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes :
PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159,
LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, - 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995, - NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et
TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491.

Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques d'un gène cible, et permettent l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifique d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible).

Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend préférentiellement une sonde d'hybridation.

Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du

gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n 45 (4), p. 453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p. 173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter.

Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 1251.

Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les

matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A-94/12670, d'une particule. On peut également immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. En particulier, on peut utiliser comme support une biopuce sur laquelle peuvent être immobilisées un grand nombre de sondes. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où sont fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, ou puce à ADN, date du début des années 90. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro- électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique.

Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation, c'est-à-dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser une biopuce portant de très nombreuses sondes qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. On hybride alors par exemple les ADNc ou les ARNc spécifiques d'un gène cible que l'on souhaite analyser sur des sondes de capture spécifique. Après hybridation, le support ou puce est lavé (e), les complexes ADNc ou ARNc marquées/ sondes de capture sont révélés par un ligand de forte affinité lié par

exemple à un marqueur de type fluorochrome. La fluorescence est lue par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Chee et al., Science, 1996,274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de 25 nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 40-44 ; Ginot, Human Mutation, 1997, n 10, p.l- 10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n 22 (15), p. 2915-2921 ; Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 541-546 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A- 5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A-5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection.

Pour l'immobilisation des sondes sur le support, on distingue trois grands types de fabrication.

Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par un dispositif de type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille allant de quelques bases (5 à 10) jusqu'à des tailles relativement importantes de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) :
L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jet d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluide (volume <1 ni) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface sur laquelle il est déposé.

La micro-déposition consiste à fixer des sondes longues de quelques dizaines à plusieurs centaines de bases à la surface d'une lame de verre. Ces sondes sont généralement extraites de bases de données et se présentent sous forme de produits amplifiés et purifiés. Cette technique permet de réaliser des puces dénommées microarrays portant environ dix mille spots, dit zones de reconnaissance, d'ADN sur une surface d'un peu moins de 4 cm2. Il ne faut toutefois pas oublier l'emploi de membranes de Nylon, dites macroarrays , qui portent des produits amplifiés, généralement par PCR, avec un diamètre de 0,5 à 1 mm et dont la densité maximale est de 25 spots/cm2. Cette technique très flexible est utilisée par de nombreux laboratoires. Dans la présente invention, cette dernière technique est considérée comme faisant partie des biopuces. On peut toutefois déposer en fond de plaque de microtitration un certain volume d'échantillon dans chaque puits, comme c'est le cas dans les demandes de brevet WO-A-00/71750 et FR 00/14896, ou déposer au fond d'une même boîte de Pétri un certain nombre de gouttes séparées les unes des autres, selon une autre demande de brevet FR00/14691.

La deuxième technique de fixation des sondes sur le support ou puce est appelée la synthèse in situ. Cette technique aboutit à l'élaboration de sondes courtes directement à la surface de la puce. Elle repose sur la synthèse d'oligonucléotides in situ (voir notamment les demandes de brevet WO 89/10977 et WO 90/03382), et est fondée sur le procédé des synthétiseurs d'oligonucléotides. Elle consiste à déplacer une chambre de réactions, où se déroule la réaction d'élongation d'oligonucléotides, le long de la surface de verre.

Enfin, la troisième technique est appelée la photolithographie, qui est un procédé à l'origine des biopuces développées par Affymetrix. Il s'agit également d'une synthèse in situ. La photolithographie est dérivée des techniques des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiée par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant être activés par la lumière. Une fois illuminés, ces groupes sont susceptibles de réagir avec l'extrémité 3' d'un oligonucléotide. En protégeant cette surface par des masques de formes définies, on peut illuminer et donc activer sélectivement des zones de la puce où l'on souhaite fixer l'un ou l'autre des quatre nucléotides. L'utilisation successive de masques différents permet

d'alterner des cycles de protection/réaction et donc de réaliser les sondes d'oligonucléotides sur des spots d'environ quelques dizaines de micromètre carré ( m2). Cette résolution permet de créer jusqu'à plusieurs centaines de milliers de spots sur une surface de quelques centimètres carré (cm2). La photolithographie présente des avantages : massivement parallèle, elle permet de créer une puce de Nmères en seulement 4 x N cycles. Toutes ces techniques sont bien entendues utilisables avec la présente invention. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le au moins un réactif spécifique de l'étape b) définie précédemment comprend au moins une sonde d'hybridation, qui est préférentiellement immobilisée sur un support. Ce support est préférentiellement une biopuce telle que définie précédemment.

Lors de l'étape c) la détermination de l'expression d'un gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier.

D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm.

L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible selon tous les protocoles bien connus de l'homme du métier. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on détermine simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, par la détection de plusieurs ARNm différents, chaque ARNm étant issus d'un gène cible.

Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification, on peut, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse afin d'obtenir les ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre indicatif, cette réaction de transcription reverse peut

être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription reverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).

2) on met en contact la ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient alors une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' ADNc spécifiques du gène cible ou d' ADNc provenant des ARNm issus du gène cible . Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment. En PCR, on peut également amplifier simultanément plusieurs ADNc différents, chacun étant spécifique de différent gène cible par l'utilisation de plusieurs couples d'amorces d'amplification différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible : parle alors d'amplification en multiplex.

3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre

du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc spécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifique du gène cible est importante. Ces techniques d'électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réalisant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001,25 : 386- 401.

Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).

2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc

spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqué précédemment. Selon un mode préféré de réalisation, la sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. Préférentiellement, le support est une biopuce. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifique d'un gène cible s'hybride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. L'ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers préférentiels de marquage et/ou clivage d'acides nucléiques sont décrit dans les demandes WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319.

3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridés les sondes de capture spécifique du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur.

Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:

1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique telle que présentée précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymerase de type T7 polymérase qui fonctionnent sous la dépendance d'un promoteur et qui permettent d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible.

2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. Lorsque l'on souhaite analyser simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, on peut immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment.

3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybridés un grand nombre de sondes.

L'analyse de l'expression d'un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37 permet alors de disposer d'un outil pour le pronostic du neuroblatome. On

peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas le pronostic, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de bon pronostic et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de mauvais pronostic. Ceci permet de déterminer si le patient est de bon ou de mauvais pronostic afin de lui proposer un traitement adapté.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 37 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 37 desdits gènes cibles.

Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, ou au moins 36 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20, au moins 21, au moins 22, au moins 23, au moins 24, au moins 25, au moins 26, au moins 27, au moins 28, au moins 29, au moins 30, au moins 31, au moins 32, au moins 33, au moins 34, au moins 35, ou au moins 36 desdits gènes cibles.

Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 19 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID

N 1 ; SEQ ID N 2; SEQ ID N 3; SEQ ID N 7; SEQ ID N 8; SEQ ID N 9; SEQ ID N 10; SEQ ID N 14; SEQ ID N 16; SEQ ID N 20; SEQ ID N 21; SEQ ID N 22; SEQ ID N 25; SEQ ID N 27; SEQ ID N 29; SEQ ID N 31; SEQ ID N 34; SEQ ID N 36 ou SEQ ID N 37 on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 19 desdits gènes cibles.

Selon un autre mode préféré de réalisation, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, ou au moins 19 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N 1 ; SEQ ID N 2; SEQ ID N 3; SEQ ID N 7; SEQ ID N 8; SEQ ID N 9; SEQ ID N 10; SEQ ID N 14; SEQ ID N 16; SEQ ID N 20; SEQ ID N 21; SEQ ID N 22; SEQ ID N 25; SEQ ID N 27; SEQ ID N 29; SEQ ID N 31; SEQ ID N 34; SEQ ID N 36 ou SEQ ID N 37 on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 2, au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 11, au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, ou au moins 19 desdits gènes cibles.

Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemples explicatifs et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention.

La figure 1 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic (BP) ou de mauvais pronostic (MP), et l'utilisation d'un panel de 40 sondes permettant l'analyse de l'expression des 37 gènes présentés précédemment dans le tableau 1. On retrouve sur ce dendograme 23 colonnes correspondant aux 23 échantillons de tumeurs, et 40 lignes correspondant aux 40 sondes utilisées pour l'analyse de l'expression des 37 gènes. Les échantillons de tumeurs, ainsi que les gènes ayant un profil d'expression comparable, mis en évidence par une corrélation de type Pearson, ont été placés côte à côte. Les échantillons de tumeurs ont été classés selon la méthode de moyenne non-pondérée (Spotfire Decision Site for Functional Genomics V7. 1, manual) alors que les gènes

ont été classés selon la valeur moyenne d'expression obtenue dans l'ensemble des échantillons. Le niveau d'expression de chaque gène, calculé par le logiciel Microarray Suite (MAS5.0, Affymetrix) est représenté par différents niveaux de couleur. Ainsi, la couleur blanche correspond à un faible niveau d'expression, la couleur grise correspond à un niveau d'expression intermédiaire, alors que la couleur noire correspond à un fort niveau d'expression. La longueur des branches du dendograme est corrélée au profil d'expression et la ligne en pointillée qui divise le dendograme permet de distinguer deux groupes de patients : un premier groupe de patients de mauvais pronostic "MP" et un deuxième groupe de patients de bon pronostic "BP". Les six tumeurs "MP-test"et BP-test sont des tumeurs qui ont été analysées en aveugle , c'est à dire sans connaître leur pronostic.

La figure 2 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 19 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1.

La figure 3 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 16 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1.

La figure 4 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 12 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1.

La figure 5 présente un dendogramme obtenu à partir de 23 échantillons de tumeurs issus de patients de bon pronostic ou de mauvais pronostic, et l'analyse de l'expression de 9 gènes. Ce dendogramme a été obtenu comparablement à ce qui est décrit pour la figure 1.

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.

Exemple 1: Recherche d'un profil d'expression pour le pronostic du neuroblastome Caractéristiques des échantillons biologiques (tumeurs localisées ou ponctions de moelles osseuses) : 23 échantillons de neuroblatome, obtenus auprès du Centre Léon Bérard (CLB) de Lyon, France, ont été utilisées dans cette étude. Ces échantillons de neuroblastome ont été prélevés préalablement à tout traitement thérapeutique.

Chaque tumeur a été classée suivant la classification INSS (International Neuroblastoma Staging System; Brodeur et al ; (1993) J. Clin. Oncol. 11, 1466-77).

On distinguait alors 12 tumeurs de stade 1/2, 4 tumeurs de stade 4s et 7 échantillons de stade 4. (2 ponctions tumorales, 1 biopsie, 4 ponctions médullaires massivement envahies. L'analyse histochimique montrait dans les tumeurs localisées la présence d'environ 80% de cellules tumorales. L'analyse immunocytochimique montrait également dans les ponctions de moelle osseuse la présence d'environ 80% de cellules tumorales. L'âge médian des patients au moment du diagnostic du neuroblastome était de 10 mois et demi, et 5 patients sont décédés au cours de la période de suivi médian de 75 mois. Les patients ayant décédé au cours de l'étude, et les patients présentant un neuroblatome de stade IV étaient qualifiés de patients de mauvais pronostic (MP), alors que les patients en vie, ayant developpé un neuroblastome de stade 1,2 et 4s étaient qualifiés de patients de bon pronostic (BP) (qualification selon Brodeur, 2003, Nat Rev Cancer, 203-216). Cette analyse a ainsi été réalisée sur 8 patients MP et 15 patients BP.

Extraction du matériel biologique (ARN totaux) de l'échantillon biologique: les ARN totaux ont été extraits de chaque tumeur ou ponction de moelle osseuse selon un protocole bien connu de l'homme du métier (Voir notamment Ausubel et al (1997), Current protocols in Molecular Biology, Volume 1, John Wiley and Sons, New York). Pour cela, chaque échantillon biologique a été homogénéisé dans 1 ml de Trizol (Invitrogen, Cergy Pointoise, France), et traité avec 300 l de chloroforme afin d'éliminer tout contaminant protéique et lipophile. Les ARN totaux ont ensuite été précipités avec 750 1 d'isopropanol, lavés deux fois avec une solution à 80 % en ethanol (vol/vol) et remis en solution dans de l'eau DEPC. Les ARN totaux ont

ensuite été purifiés sur colonne Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Germany) conformément aux instructions du fabriquant, à l'exception de l'élution finale qui a été réalisée dans 200 l d'eau RNAse-free après 1 min d'incubation à 65 C.

Préalablement à l'étape de transcription reverse, une étape de précipitation par de l'acétate d'ammonium (0,5 vol, 7. 5M) et de l'éthanol (2,5 vol) a été réalisée pour garantir la purification des ARN totaux. La qualité des ARN totaux a été analysée par le bio analyseur AGILENT 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm) et les ARN ribosomaux.

Synthèse d'ADNc, obtention des ARNc et marquage des ARNc et quantification : Afin d'analyser l'expression des gènes cibles selon l'invention, les ADN complémentaires (ADNc) des ARNm contenus dans les ARN totaux tels que purifiés ci dessus, ont été obtenus à partir de 10 g d'ARN totaux par l'utilisation de 400 unités de l'enzyme de transcription reverse SuperScriptII (Invitrogen) et 100 pmol d'amorce poly-T contenant le promoteur de la T7 promotor (T7-oligo(dT)24-primer, Proligo, Paris, France). Les ADNc ainsi obtenus ont ensuite été extraits avec du phénol/chloroforme, et précipités tels que décrit précédemment par de l'acétate d'ammonium et de l'éthanol, et remis en solution dans 24 l d'eau DEPC. Un volume de 20 l de cette solution purifiée d'ADNc a fait l'objet ensuite d'une transcription in vitro par l'utilisation d'une ARN polymérase T7 qui reconnaît spécifiquement le promoteur de la T7 polymérase tel que mentionné ci dessus. Cette transcription permet d'obtenir l'ARNc de l'ADNc. Cette transcription a été réalisée par l'utilisation d'un kit Bioarray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY), qui permet non seulement d'obtenir l'ARNc mais également l'incorporation de bases cytidine et uridine biotinylées lors de la synthèse de l'ARNc .

Les ARNc purifiés ont ensuite été quantifiés par spectrophotométrie, et la solution d'ARNc a été ajustée à une concentration de 1 g/ l d'ARNc. L'étape de clivage de ces ARNc a ensuite été réalisée à 94 C pendant 35 min, par l'utilisation d'un tampon de fragmentation (40 mM de Tris acétate, pH 8,1,100 mM d'acétate de potassium, 30 mM d'acétate de magnesium) afin de provoquer l'hydrolyse des ARNc et obtenir

des fragments de 35 à 200 bp. Le succès d'une telle fragmentation a été vérifié par une électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%).

Mise en évidence d'un profil d'expression différentiel entre les patients BP et MP L'expression d'environ 10 000 gènes a été analysée et comparée entre les patients BP et MP. Pour cela, 10 g d'ARNc fragmentés issus de chaque échantillon ont été ajoutés à un tampon d'hybridation (Affymetrix) et 200 l de cette solution ont été mis en contact pendant 16 h à 45 C sur une puce d'expression (Human Genome U95Av2 GeneChip (Affymetrix), qui comporte 12 625 groupes de sondes représentant environs 10 000 gènes selon le protocole d'Affymetrix tel que décrit sur le site internet d'Affymetrix (voir notamment à l'adresse suivante http://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression~s2~manual.pdf). Afin d'enregistrer les meilleures performances d'hybridation et de lavage, des ARN qualifiés de contrôle biotinylés (bioB, bioC, bioD et cre) et des oligonucléotides (oligo B2) ont également été inclus dans le tampon d'hybridation. Après l'étape d'hybridation, la solution d'ARNc biotinylée et hybridée sur la puce, a été révélée par l'utilisation d'une solution de streptavidine-phycoerythrine et le signal a été amplifié par l'utilisation d'anticorps anti-streptavidine. L'hybridation a été réalisée dans une étuve d'hybridation GeneChip Hybridisation oven (Affymetrix), et le protocole Euk GE-WS2 du protocole d'Affymetrix a été suivi. Les étapes de lavage et de révélation ont été réalisées sur une station Fluidics Station 400 (Affymetrix).

Chaque puce U95Av2 a ensuite été analysée sur un scanner Agilent G2500A GeneArray Scanner à une résolution de 3 microns afin de repérer les zones hybridées sur la puce. Ce scanner permet la détection du signal émis par les molécules fluorescentes après excitation par un laser argon en utilisant la technique du microscope à épifluorescence. On obtient ainsi pour chaque position, un signal proportionnel à la quantité de ARNc fixés. Le signal a ensuite été analysé par le logiciel Microarray Suite 5. 0 software (MAS5.0, Affymetrix).

Afin de prévenir les variations obtenues par l'utilisation de différentes puces, il a été réalisé une approche de normalisation globale utilisant le logiciel MAS5.0 (Affymetrix), qui permet de convertir les données brutes obtenues pour chaque puce en un signal moyen d'une intensité de 500. Les résultats obtenus sur une puce

peuvent alors être comparés aux résultats obtenus sur une autre puce. Le logiciel MAS5. 0 permettait aussi d'inclure un algorithme statistique pour considérer si un gène était exprimé ou non. Chaque gène représenté sur la puce U95Av2 était couvert par 16 à 20 couples de sondes de 25 oligonucléotides. Par couple de sondes, on entend une première sonde qui s'hybridait parfaitement (on parle alors de sondes PM ou perfect match) avec un des ARNc issus d'un gène cible, et une deuxième sonde, identique à la première sonde à l'exception d'un mésappariement (on parle alors de sonde MM ou mismatched) au centre de la sonde. Chaque sonde MM servait à estimer le bruit de fond correspondant à une hybridation entre deux fragments nucléotidiques de séquence non complémentaire. (Affymetrix technical note "Statistical Algorithms Reference Guide" ; Lipshutz, et al (1999) Nat. Genet. 1 Suppl., 20-24). Deux tumeurs de stade IV présentant un faible pourcentage de gènes exprimés, du à un biais soit dans la qualité des ARNc soit dans l'étape d'hybridation, ont été exclues de l'analyse. Les 23 échantillons restant montraient une moyenne de 48 % de gènes exprimés.

L'analyse des données d'expression a été réalisée par le logiciel Microsoft Excel, le logiciel Spotfire Decision Site for Functionnal Genomics V7. 1 (Spotfire AB, Gothenburg, Sweden), ainsi que le module PAM (Prediction Analysis in Microarrays) du logiciel de statistiques R (Ihaka & Gentleman (1996) Journal of Computational and Graphical Statistics 5,299-314. ; Tibshirani, et al (2002) Proc.

Natl. Acad. Sci. 99,6567-6572).

A partir des 12625 groupes de sondes, représentant environ 10 000 gènes, de la puce, les inventeurs ont sélectionné les gènes pertinents qui étaient corrélés à un mauvais pronostic du neuroblastome.

Pour cela, une première étape a consisté à exclure les gènes présentant un niveau d'expression comparable entre tous les groupes de patients [Tibshirani, et al Proc.

Natl. Acad. Sci. 99,6567-6572]. Les gènes non exprimés chez l'ensemble des patients ont également été exclus (logiciel MAS5. 0). Enfin, certains gènes ont été exclus si la moyenne d'expression des 2 groupes (patients de bon pronostic et patient de mauvais pronostic) était inférieur à 500 ou si le rapport des moyennes

d'expression entre les patients de mauvais et de bon pronostics étaient compris entre 0,7 et 1,3.

L'expression des 1488 gènes restants a ensuite été analysée (algorithme PAM, Tibshirani, R., Hastie, T., Narasimhan, B. and Chu, G. (2002) Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6567-6572).

Résultats obtenus: Dans un premier temps, 37 gènes permettant de différencier les patients de bon et de mauvais pronostic ont été identifiés. L'augmentation ou la diminution d'expression de chacun de ces gènes, observée chez les patients de mauvais pronostic par rapport aux patients de bons pronostics est indiquée dans le tableau 2.

Tableau 2 - liste des 37 gènes exprimés différentiellement dans les neuroblatomes patients BP et MP

<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> Description <SEP> de <SEP> la <SEP> séquence <SEP> N <SEP> Genbank <SEP> Expression <SEP> MP <SEP> vs <SEP> BP
<tb> 1 <SEP> Flap <SEP> structure-specific <SEP> endonuclease <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 004111 <SEP> augmentée
<tb> 2 <SEP> Ubiquitin-conjugating <SEP> enzyme <SEP> E2C <SEP> NM <SEP> 007019 <SEP> augmentée
<tb> Insulin-like <SEP> growth <SEP> factor <SEP> binding <SEP> protein
<tb> 3 <SEP> 7 <SEP> (MAC25) <SEP> 001553 <SEP> diminuée
<tb> 4 <SEP> Collagen <SEP> type <SEP> I, <SEP> alpha <SEP> 2 <SEP> chain <SEP> NM <SEP> 000089 <SEP> diminuée
<tb> 5 <SEP> Nucleolin <SEP> NM <SEP> 005381 <SEP> augmentée
<tb> 6 <SEP> Interleukin <SEP> enhancer <SEP> binding <SEP> factor <SEP> 3 <SEP> NM <SEP> 004516 <SEP> augmentée
<tb> 7 <SEP> cDNA <SEP> clone <SEP> FLJ30781 <SEP> fis <SEP> AK055343 <SEP> diminuée
<tb> 8 <SEP> TIF <SEP> 1 <SEP> beta <SEP> zinc <SEP> finger <SEP> protein <SEP> X97548 <SEP> augmentée
<tb> Likely <SEP> ortholog <SEP> of <SEP> mouse <SEP> tumor <SEP> differentially
<tb> 9 <SEP> expressed <SEP> 1 <SEP> TDE1L <SEP> NM <SEP> 020755 <SEP> diminuée
<tb> DKFZp434D1112~s1 <SEP> 434 <SEP> (synonym: <SEP> htes3) <SEP> cDNA
<tb>

10 clone DKFZ 34D1112 3' AL039831 diminuée

<tb>
<tb> 11 <SEP> N-MYC <SEP> proto-oncogene <SEP> NM <SEP> 005378 <SEP> augmentée
<tb> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> D2
<tb> 12 <SEP> polypeptide <SEP> 16.5kDa <SEP> NM <SEP> 004597 <SEP> augmentée
<tb> 13 <SEP> DNA <SEP> replication <SEP> licensing <SEP> factor <SEP> MCM2 <SEP> NM <SEP> 004526 <SEP> augmentée
<tb> 14 <SEP> RuvB-like <SEP> DNA <SEP> helicase <SEP> TIP49b <SEP> NM <SEP> 006666 <SEP> augmentée
<tb> 15 <SEP> Immédiate <SEP> early <SEP> protein <SEP> ETR101 <SEP> NM <SEP> 004907 <SEP> augmentée
<tb> 16 <SEP> RNA <SEP> binding <SEP> protein <SEP> S <SEP> 1, <SEP> serine-rich <SEP> domain <SEP> NM <SEP> 006711 <SEP> augmentée
<tb> 17 <SEP> Ornithine <SEP> decarboxylase <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 002539 <SEP> augmentée
<tb> Activity-related <SEP> cytoskeleton-asso. <SEP> protein
<tb> 18 <SEP> (KIAA0278) <SEP> NM <SEP> 015193 <SEP> augmentée
<tb> 19 <SEP> Secretogranin <SEP> II <SEP> (chromogranin <SEP> C) <SEP> NM <SEP> 003469 <SEP> diminuée
<tb> 20 <SEP> Structure <SEP> spécifie <SEP> récognition <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 003146 <SEP> augmentée
<tb> 21 <SEP> Collagen <SEP> type <SEP> VI, <SEP> alpha <SEP> 3 <SEP> chain <SEP> NM <SEP> 004369 <SEP> diminuée
<tb> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptides <SEP> B
<tb> 22 <SEP> andBl <SEP> NM <SEP> 003091 <SEP> augmentée
<tb> Acidic <SEP> nuclear <SEP> phosphoprotein <SEP> 32 <SEP> family,
<tb> 23 <SEP> member <SEP> B <SEP> NM <SEP> 006401 <SEP> augmentée
<tb> 24 <SEP> Non-POU <SEP> domain <SEP> containing, <SEP> octamer-binding <SEP> NM <SEP> 007363 <SEP> augmentée
<tb> 25 <SEP> Peripheral <SEP> myelin <SEP> protein <SEP> 22 <SEP> NM <SEP> 000304 <SEP> diminuée
<tb> 26 <SEP> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptide <SEP> E <SEP> NM <SEP> 003094 <SEP> augmentée
<tb> Putative <SEP> L-type <SEP> neutral <SEP> amino <SEP> acid <SEP> transporter
<tb> 27 <SEP> (KIAA0436) <SEP> AB007896 <SEP> diminuée
<tb> 28 <SEP> Fibrillarin <SEP> NM <SEP> 001436 <SEP> augmentée
<tb> 29 <SEP> Tripartite <SEP> motif-containing <SEP> 2 <SEP> NM <SEP> 015271 <SEP> diminuée
<tb> 30 <SEP> 0 <SEP> DNA <SEP> replication <SEP> licensing <SEP> factor <SEP> MCM6 <SEP> NM <SEP> 005915 <SEP> augmentée
<tb> 31 <SEP> Polypyrimidine <SEP> tract <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 002819 <SEP> augmentée
<tb> 32 <SEP> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptide <SEP> A <SEP> NM <SEP> 004596 <SEP> augmentée
<tb> 33 <SEP> Creatine <SEP> kinase, <SEP> brain <SEP> NM <SEP> 001823 <SEP> augmentée
<tb> 34 <SEP> Erythrocyte <SEP> membrane <SEP> protein <SEP> band <SEP> 4.1 <SEP> like3 <SEP> NM <SEP> 012307 <SEP> diminuée <SEP>
<tb>

35 H othetical rotein MGC3077 NM 024051 augmentée

<tb>
<tb> 36 <SEP> Tissue <SEP> alpha-L-fucosidase <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 000147 <SEP> diminuée
<tb> 37 <SEP> Secreted <SEP> protein <SEP> acidic <SEP> and <SEP> rich <SEP> in <SEP> cysteine <SEP> NM <SEP> 003118 <SEP> diminuée
<tb>

Ces résultats ont également été validés par l'utilisation d'une autre technique de biologie moléculaire dans laquelle l'analyse de l'expression de gènes tel que présentés dans le tableau 2 a été réalisée par RT-PCR.

Pour cela, une réaction de reverse transcription (RT) a été réalisée à partir d'1 g d'ARN total tel qu'obtenu précédemment (kit Amersham, First strand cDNA synthesis kit). La transcription reverse a été effectuée pendant 1 h à 37 C. Chaque solution de cDNA a été diluée 6 fois avant la réalisation de la PCR.

L'expression des ARNm de gènes du tableau 2 (Peripheral myelin protein ou PMP22 (SEQ ID N 25) ; Insulin-like growth factor binding protein ou IGFBP7 (SEQ ID N 3 ; SPARC (SEQ ID N 37); EPB41L3 (SEQ ID N 34)) a ensuite été analysé par PCR (polymerase chain réaction) et l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amplification du gène PMP22 : brin sens : 5'-AGGGAGGAAG GGAAAACAGA-3' (SEQ ID N 38); brin antisens: 5'-TTAAGGCTCA ACACGAGGCT-3' (SEQ ID N 39) ; gène IGFBP7 : brin sens : 5'-CTTGAGCTGT GAGGTCATCG-3' (SEQ ID N 40); brin antisens :5'-TATAGCTCGG CACCTTCACC-3' (SEQ ID N 41); gène SPARC : brin sens : 5'-CTGCCTGCCA CTGAGGGTTCC-3' (SEQ ID N 42) ; brin antisens: 5'-TCCAGGCAGA ACAACAAACC ATCC-3' (SEQ ID N 43) ; gène EPB41L3: brin sens: 5'ACCACCACCA CTACCCACAT-3' (SEQ ID N 44) ; brin antisens: 5'TGGTTTTCCT AACGGTTTGC-3' (SEQ ID N 45); gène beta actine : brin sens : 5'TGTTGGCGTA CAGGTCTTTG C-3' (SEQ ID N 46); brin antisens: 5'-
GCTACGAGCT GCCTGACGG-3' (SEQ ID N 47). L'expression du gène codant la P-actine a été utilisée comme contrôle. Trente cycles de PCR sont ensuite été réalisé en présence des différentes amorces d'amplification (0,2M); de dNTPs (0,15mM,
Euromedex) et d'enzyme polymérase (Taq Polymerase ; 0,027U/ l; Perkin Elmer) (dénaturation 30" à 94 C, hybridation l' à 60 C ; polymérisation l' à 72 C).

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci dessous, qui montre la corrélation existant entre les résultats obtenues par l'utilisation d'une biopuce et ceux obtenues par RT-PCR.

Patients <SEP> BP <SEP> Patients <SEP> MP
<tb> Résultats <SEP> Résultats <SEP> RT <SEP> Résultats <SEP> Résultats
<tb> biopuce <SEP> PCR <SEP> biopuce <SEP> RT <SEP> PCR
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N 37 <SEP> : <SEP> 0,04
<tb> SPARC <SEP> 3498 <SEP> 2,2 <SEP> 709 <SEP> 0,87
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N 3 <SEP> 0,003
<tb> IGFBP7 <SEP> 4112 <SEP> 3,7 <SEP> 691 <SEP> 1,87
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 34 <SEP> 0,001
<tb> EPB41 <SEP> L3 <SEP> 6041 <SEP> 4,2 <SEP> 986 <SEP> 1,5
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N 25 <SEP> 0,003
<tb> PMP22 <SEP> 9051 <SEP> 3,8 <SEP> 2282 <SEP> 2,75
<tb>

Tableau 3 Les résultats de RT-PCR, obtenus à partir de 15 patients BP et 8 patients MP, sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène ss-actine qui servait de contrôle. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La corrélation des résultats obtenus d'une part avec la biopuce et d'autre part avec la technique en RT-PCR a été établie grâce au test de corrélation du Tau-B de Kendall. Les patients MP présentaient un niveau d'expression diminuée pour les gènes SPARC , IGFBP7 , EPB41L3, et PMP22, confirmant les résultats présentés dans le tableau 2.

Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée des 37 gènes du tableau 2 pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 1.

On observe sur ce dendograme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).

Dans l'objectif de valider le pouvoir de discrimination du profil d'expression de ces 37 gènes, 6 tumeurs supplémentaires de patients test ont été analysées sans connaissance préalable de leur pronostic, et classées comme étant de bon pronostic BP-test ou de mauvais pronostic MP-test en fonction de l'analyse de leur profil d'expression. Leur bon classement a été vérifié ensuite selon leurs propriétés cliniques : tous les échantillons tests analysés en aveugle par l'analyse de

l'expression de 37 gènes avaient été correctement classés dans le groupe de patients de mauvais pronostic test-MP ou dans le groupe de patients de bon pronostic test-BP . Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 37 gènes est un bon outil pour le pronostic du neuroblastome.

A titre indicatif, l'oncogène N-MYC a également été utilisée comme outil de pronostic. L'utilisation de ce gène mettait en évidence 5 patients de mauvais pronostic (MP). Toutefois, 3 patients étaient également de mauvais pronostic alors qu'aucune augmentation de l'expression de l'oncogène N-MYC n'ait été observée, suggérant que l'analyse unique de ce gène n'est pas suffisant pour le pronostic du neuroblastome.

Les inventeurs ont également défini des panels de gènes plus restreint permettant également de discriminer les patients de bon et de mauvais pronostic.

Un premier panel comportait 19 gènes qui sont présentés dans le tableau 4. Les résultats sont exprimés par le ratio obtenu entre l'expression moyenne du gène chez des patients MP et l'expression du gène chez des patients BP (ratio MP/ BP).

Tableau 4 - liste des 19 gènes exprimés différentiellement dans les neuroblatomes de patients BP et MP

<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> . <SEP> Description <SEP> de <SEP> la <SEP> séquence <SEP> N <SEP> Genbank <SEP> Ratio <SEP> MP/BP
<tb> 1 <SEP> Flap <SEP> structure-specific <SEP> endonuclease <SEP> 1 <SEP> (FEN1) <SEP> NM <SEP> 004111 <SEP> 2,7
<tb> 2 <SEP> Ubiquitin-conjugating <SEP> enzyme <SEP> E2C <SEP> (UBE2C) <SEP> NM <SEP> 007019 <SEP> 2,9
<tb> Insulin-like <SEP> growth <SEP> factor <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 7
<tb> 3 <SEP> (IGFBP7) <SEP> NM <SEP> 001553 <SEP> 0,2
<tb> 7 <SEP> cDNA <SEP> FLJ30781 <SEP> fis, <SEP> clone <SEP> FEBRA2000874 <SEP> AK055343 <SEP> 0,3
<tb> 8 <SEP> TIF <SEP> 1 <SEP> beta <SEP> zinc <SEP> finger <SEP> protein <SEP> X97548 <SEP> 1,8
<tb> Likely <SEP> ortholog <SEP> of <SEP> mouse <SEP> tumor <SEP> differentially
<tb> 9 <SEP> expressed <SEP> 1, <SEP> like <SEP> (TDEIL) <SEP> NM <SEP> 020755 <SEP> 0,5 <SEP>
<tb> DKFZp434D1112~sl <SEP> 434 <SEP> (synonym: <SEP> htes3)
<tb> 10 <SEP> cDNA <SEP> clone <SEP> DKF#p434D1112 <SEP> 3' <SEP> AL039831 <SEP> 0,4 <SEP>
<tb> 14 <SEP> RuvB-like <SEP> 2 <SEP> (E. <SEP> coli)(RUVBL2) <SEP> NM <SEP> 006666 <SEP> 2,1
<tb> RNA <SEP> binding <SEP> protein <SEP> SI, <SEP> serine-rich <SEP> domain
<tb> 16 <SEP> (RNPS <SEP> 1), <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 006711 <SEP> 1,6 <SEP>
<tb> Structure <SEP> spécifie <SEP> recognition <SEP> protein <SEP> 1
<tb> 20 <SEP> (SSRP1) <SEP> NM <SEP> 003146 <SEP> 2,0
<tb> Collagen, <SEP> type <SEP> VI, <SEP> alpha <SEP> 3 <SEP> (COL6A3),
<tb> 21 <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 004369 <SEP> 0,2
<tb> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptides
<tb> 22 <SEP> B <SEP> and <SEP> BI <SEP> (SNRPB) <SEP> NM <SEP> 003091 <SEP> 1,7
<tb> Peripheral <SEP> myelin <SEP> protein <SEP> 22 <SEP> (PMP22),
<tb> 25 <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 000304 <SEP> 0,3
<tb> 27 <SEP> KIAA0436 <SEP> mRNA, <SEP> partial <SEP> cds <SEP> AB007896 <SEP> 0,5
<tb> 29 <SEP> Tripartite <SEP> motif-containing <SEP> 2 <SEP> (TRIM2) <SEP> NM <SEP> 015271 <SEP> 0,4
<tb> Polypyrimidine <SEP> tract <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 1
<tb> 31 <SEP> (PTBP1), <SEP> transcript <SEP> variant <SEP> 1 <SEP> NM <SEP> 002819 <SEP> 2,1
<tb> 34 <SEP> Erythrocyte <SEP> membrane <SEP> protein <SEP> band <SEP> 4.1-like <SEP> 3 <SEP> NM <SEP> 012307 <SEP> 0,2
<tb> 36 <SEP> Fucosidase, <SEP> alpha-L- <SEP> 1, <SEP> tissue <SEP> (FUCA1) <SEP> NM <SEP> 000147 <SEP> 0,2
<tb> Secreted <SEP> protein, <SEP> acidic, <SEP> cysteine-rich
<tb>

37 osteonectin) SPARC NM 003118 0,2 Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 19 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 2. On observe sur ce dendogramme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).

Dans l'objectif de valider le pouvoir de discrimination de ces 19 gènes, 6 tumeurs de patients test ont été analysées sans connaissance préalable de leur pronostic.

Ainsi, les six tumeurs "MP-test" et BP-test présentées dans la figure 3 sont des tumeurs qui ont été analysés en aveugle . Leur bon classement a été vérifié selon

leur propriété clinique : tous les patients MP-test classés en fonction de leur profil d'expression comme patients de mauvais pronostic s'avéraient être des patients de mauvais pronostic et tous les patients BP-test classés en fonction de leur profil d'expression comme patients de bon pronostics s'avéraient être des patients de bon pronostic.

D'une façon comparable, un deuxième panel comportait 16 gènes tels que présentés dans le tableau 5.

Tableau 5 - liste des 16 gènes exprimés différentiellement dans les neuroblatomes de patients BP et MP

<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> Description <SEP> de <SEP> la <SEP> séquence <SEP> N <SEP> Genbank
<tb> 1 <SEP> Flap <SEP> structure-specific <SEP> endonuclease <SEP> 1 <SEP> (FEN1) <SEP> NM <SEP> 004111
<tb> 2 <SEP> Ubiquitin-conjugating <SEP> enzyme <SEP> E2C <SEP> (UBE2C) <SEP> NM <SEP> 007019
<tb> 3 <SEP> Insulin-like <SEP> growth <SEP> factor <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 7 <SEP> NM~001553
<tb> (IGFBP7)
<tb> 7 <SEP> cDNA <SEP> FLJ30781 <SEP> fis, <SEP> clone <SEP> FEBRA2000874 <SEP> AK055343
<tb> 8 <SEP> TIF <SEP> 1 <SEP> beta <SEP> zinc <SEP> finger <SEP> protein <SEP> X97548
<tb> 9 <SEP> Likely <SEP> ortholog <SEP> of <SEP> mouse <SEP> tumor <SEP> differentially <SEP> NM~020755
<tb> expressed <SEP> 1, <SEP> like <SEP> (TDE1L)
<tb> 10 <SEP> DKFZp434D1112~s1 <SEP> 434 <SEP> (synonym: <SEP> htes3) <SEP> AL039831
<tb> cDNA <SEP> clone <SEP> DKFZp434D1112 <SEP> 3'
<tb> 20 <SEP> Structure <SEP> spécifie <SEP> récognition <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> (SSRP1) <SEP> NM <SEP> 003146
<tb> 21 <SEP> Collagen, <SEP> type <SEP> VI, <SEP> alpha <SEP> 3 <SEP> (COL6A3), <SEP> transcript <SEP> NM~004369
<tb> variant <SEP> 1
<tb> 22 <SEP> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptides <SEP> B <SEP> NM~003091
<tb> and <SEP> B1 <SEP> (SNRPB)
<tb> 25 <SEP> Peripheral <SEP> myelin <SEP> protein <SEP> 22 <SEP> (PMP22), <SEP> transcript <SEP> NM~000304
<tb> variant <SEP> 1
<tb> 29 <SEP> Tripartite <SEP> motif-containing <SEP> 2 <SEP> (TRIM2) <SEP> NM <SEP> 015271
<tb> 31 <SEP> Polypyrimidine <SEP> tract <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> (PTBP1), <SEP> NM~002819
<tb> transcript <SEP> variant <SEP> 1
<tb> 34 <SEP> Erythrocyte <SEP> membrane <SEP> protein <SEP> band <SEP> 4. <SEP> 1 <SEP> -like <SEP> NM~012307
<tb> (EPB41L3)
<tb> 36 <SEP> Fucosidase, <SEP> alpha-L- <SEP> 1, <SEP> tissue <SEP> (FUCA1) <SEP> NM <SEP> 000147
<tb> 37 <SEP> Secreted <SEP> protein, <SEP> acidic, <SEP> cysteine-rich <SEP> (osteonectin) <SEP> NM-003118
<tb> (SPARC)
<tb>
Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 16 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 3. On observe sur ce dendogramme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).

Un troisième panel comportait 12 gènes tels que présentés dans le tableau 6.

Tableau 6 - liste des 12 gènes exprimés différentiellement dans les neuroblatomes de patients BP et MP

<tb>
<tb> SE <SEP> ID <SEP> N <SEP> Description <SEP> de <SEP> la <SEP> séquence <SEP> N <SEP> Genbank
<tb> 2 <SEP> Ubiquitin-conjugating <SEP> enzyme <SEP> e <SEP> E2C <SEP> (UBE2C <SEP> NM <SEP> 007019 <SEP>
<tb> 3 <SEP> Insulin-like <SEP> growth <SEP> factor <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 7 <SEP> NM~001553
<tb> (IGFBP7)
<tb> 7 <SEP> cDNA <SEP> FLJ30781 <SEP> fis, <SEP> clone <SEP> FEBRA2000874 <SEP> AK055343
<tb> 8 <SEP> TIFlbeta <SEP> zinc <SEP> fm <SEP> er <SEP> rotein <SEP> X97548
<tb> 10 <SEP> DKFZp434D1112~s1 <SEP> 434 <SEP> (synonym: <SEP> htes3) <SEP> AL039831
<tb> cDNA <SEP> clone <SEP> DKFZ <SEP> 34D1112 <SEP> 3'
<tb> 20 <SEP> Structure <SEP> spécifie <SEP> récognition <SEP> rotein <SEP> 1 <SEP> (SSRP1) <SEP> NM <SEP> 003146
<tb> 22 <SEP> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptides <SEP> B <SEP> NM-003091
<tb> and <SEP> B1 <SEP> (SNRPB)
<tb> 25 <SEP> Peripheral <SEP> myelin <SEP> protein <SEP> 22 <SEP> (PMP22), <SEP> transcript <SEP> NM~000304
<tb> variant <SEP> 1
<tb> 29 <SEP> Tripartite <SEP> motif-containing <SEP> 2 <SEP> TRIM2) <SEP> NM <SEP> 015271
<tb> 31 <SEP> Polypyrimidine <SEP> tract <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> (PTBP <SEP> 1), <SEP> NM~002819
<tb> transcri <SEP> t <SEP> variant <SEP> 1
<tb> 34 <SEP> Erythrocyte <SEP> membrane <SEP> protein <SEP> band <SEP> 4.1-like <SEP> 3 <SEP> NM~012307
<tb> (EPB41L3)
<tb> 37 <SEP> Secreted <SEP> protein, <SEP> acidic, <SEP> cysteine-rich <SEP> (osteonectin) <SEP> NM <SEP> 003118 <SEP>
<tb> (SPARC)
<tb>
Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 12 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 4. On observe sur ce dendograme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).

Un quatrième panel comportait 9 gènes tels que présentés dans le tableau 7.

Tableau 7 - liste des 9 gènes exprimés différentiellement dans les neuroblatomes de patients BP et MP

SE ID N Description de la séquence~~~~~~~~~~? Genbank

<tb>
<tb> 2 <SEP> Ubiquitin-conjugating <SEP> enzyme <SEP> E2C <SEP> (UBE2C) <SEP> NM <SEP> 007019
<tb> 3 <SEP> Insulin-like <SEP> growth <SEP> factor <SEP> binding <SEP> protein <SEP> 7 <SEP> (IGFBP7) <SEP> NM <SEP> 001553
<tb> 7 <SEP> cDNA <SEP> FLJ30781 <SEP> fis, <SEP> clone <SEP> FEBRA2000874 <SEP> AK055343 <SEP>
<tb> 8 <SEP> TIFlbeta <SEP> zinc <SEP> finger <SEP> protein <SEP> X97548 <SEP>
<tb> 10 <SEP> DKFZp434D1112~s1 <SEP> 434 <SEP> (synonym: <SEP> htes3) <SEP> cDNA <SEP> clone <SEP> AL039831
<tb> DKFZp434D1112 <SEP> 3'
<tb> 22 <SEP> Small <SEP> nuclear <SEP> ribonucleoprotein <SEP> polypeptides <SEP> B <SEP> and <SEP> B1 <SEP> NM <SEP> 003091 <SEP>
<tb>

25 Peripheral myelin protein 22 (PMP22), transcript variant 1 NM 000304

29 Tripartite motif-contaùiing 2 (TRIM2) NM~015271 34 1 Erythrocyte membrane rotein band 4.1-like 3 EPB41L3) NM 012307 Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 9 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 5. On observe sur ce dendogramme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).

Le pouvoir de discrimination de tous ces panels de gènes a été validé avec des tumeurs tests tels que décrit précédemment : tous les patients MP-test classé en fonction de leur profil d'expression comme patients de mauvais pronostic s'avéraient être des patients de mauvais pronostic et tous les patients BP-test classés en fonction de leur profil d'expression comme patients de bon pronostics s'avéraient être des patients de bon pronostic.

Ces résultats démontrent que le pronostic d'un neuroblastome peut être déterminé par l'analyse de l'expression de tout ou partie des 37 gènes de séquence SEQ ID N 1 à 37.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé pour le pronostic du neuroblatome chez un patient atteint du neuroblastome caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. on extrait du matériel biologique d'un échantillon biologique prélévé chez le patient, b. on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N 11, 17 ou 37, on met en contact le matériel biologique avec au moins deux réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37, c. on détermine l'expression d'au moins un desdits gènes cibles, étant entendu que lorsque que le gène cible présente une séquence nucléique ayant l'une des SEQ ID N 11, 17 ou 37, on détermine l'expression d'au moins deux desdit gènes cibles.
2. Procédé pour le pronostic du neuroblatome selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon tissulaire.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques.
4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le au moins un réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation
5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la au moins une sonde d'hybridation est immobilisée sur un support.

<Desc/Clms Page number 37>
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le support est une biopuce.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 37 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à

37 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 37 desdits gènes cibles.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 19 réactifs spécifiques choisi parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant la SEQ ID N 1 ; SEQ ID N 2; SEQ

ID N 3; SEQ ID N 7; SEQ ID N 8; SEQ ID N 9; SEQ ID N 10; SEQ ID N 14; SEQ ID N 16; SEQ ID N 20; SEQ ID N 21; SEQ ID N 22; SEQ ID

N 25; SEQ ID N 27; SEQ ID N 29; SEQ ID N 31; SEQ ID N 34; SEQ ID

N 36 ou SEQ ID N 37 on détermine, lors de l'étape c) l'expression d'au moins 19 desdits gènes cibles.