FR2857598A1 - ANTI-ANGIOGENIC COMPOUNDS, PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME, AND USE THEREOF - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée d'une séquence s'étendant au minimum des résidus :- 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou- 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou- 456 à 531 (SEQ ID NO : 8),de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10,pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde.The present invention relates to the use of a peptide sequence comprising or consisting of a sequence extending at least from the residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or 456 to 531 (SEQ ID NO: 8), of SEQ ID NO: 10, and at most a sequence corresponding to SEQ ID NO: 10, for the preparation of a medicament intended for prevention or treatment of diseases related to angiogenesis, such as cancers, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, psoriasis, or rheumatoid arthritis.
Description
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COMPOSES ANTI-ANGIOGENIQUES, COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES COMPRENANT, ET LEUR UTILISATION
La présente invention concerne des protéines ayant une activité anti-angiogénique, les acides nucléiques les codant, ainsi que les compositions pharmaceutiques les comprenant. ANTI-ANGIOGENIC COMPOUNDS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING SAME, AND USE THEREOF
The present invention relates to proteins having anti-angiogenic activity, the nucleic acids encoding them, as well as pharmaceutical compositions comprising them.
L'angiogenèse est un processus de croissance de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Trois phénomènes particuliers sont notamment à la base de ce processus : la prolifération, la migration et la différenciation (la tubulogenèse) des cellules endothéliales. L'angiogenèse est activée par certains facteurs de croissances, dits facteurs angiogéniques, tels que le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, facteur de croissance endothélial vasculaire), le FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1, facteur de croissance des fibroblastes 1) ou le FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, facteur de croissance des fibroblastes 2). Angiogenesis is a process of growing new blood capillaries from preexisting vessels. Three particular phenomena are at the base of this process: proliferation, migration and differentiation (tubulogenesis) of endothelial cells. Angiogenesis is activated by certain growth factors, called angiogenic factors, such as VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), FGF-1 (Fibroblast Growth Factor 1), or Fibroblast Growth Factor 1. FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2, growth factor of fibroblasts 2).
En temps normal, l'angiogenèse est essentiellement restreinte au système reproducteur femelle et à la cicatrisation des plaies. Cependant, l'angiogenèse est également impliquée dans de nombreux cas pathologiques, tels que la rétinopathie diabétique, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, et les cancers. En effet, dans ce dernier cas il a été montré que la croissance tumorale était grandement favorisée par l'apparition au sein de ces tumeurs d'une néo-vascularisation sanguine résultant en particulier de la sécrétion par les tumeurs de facteurs angiogéniques. In normal times, angiogenesis is essentially restricted to the female reproductive system and wound healing. However, angiogenesis is also implicated in many pathological cases, such as diabetic retinopathy, psoriasis, rheumatoid arthritis, age-related macular degeneration, and cancers. Indeed, in the latter case it has been shown that tumor growth was greatly favored by the appearance in these tumors of neovascularization blood resulting in particular from the secretion by tumors of angiogenic factors.
De nombreuses tentatives de traitements thérapeutiques basées sur l'utilisation de protéines anti-angiogéniques sont en cours. Parmi ces composés, l'un des plus prometteur est l'endostatine (O'Reilly et al., Cell (1997) 88 :277-285), est actuellement en essais cliniques de phase I (Herbst et al., J Clin. Oncol. (2002) 20:3804-3814). L'endostatine est une protéine de 20 kDa correspondant à un fragment du collagène XVIII. L'activité antiangiogénique de cette protéine est due à une inhibition spécifique des cellules endothéliales. Many attempts at therapeutic treatments based on the use of anti-angiogenic proteins are in progress. Among these compounds, one of the most promising is endostatin (O'Reilly et al., Cell (1997) 88: 277-285), is currently in phase I clinical trials (Herbst et al., J Clin. Oncol (2002) 20: 3804-3814). Endostatin is a 20 kDa protein corresponding to a fragment of collagen XVIII. The antiangiogenic activity of this protein is due to a specific inhibition of endothelial cells.
Un des principaux inconvénients lié à l'utilisation de ces protéines en tant qu'antiangiogéniques réside dans les quantités nécessaires au traitement d'un individu. Ainsi, il a été estimé que dans le cas de l'endostatine jusqu'à plusieurs grammes de protéine recombinante devaient être administrés au patient chaque jour (Cao, Int. J Biochem. Cell Biol. (2001) 33 :357-369). Cet inconvénient pourrait être aboli par exemple en disposant d'inhibiteurs de l'angiogenèse plus puissants. One of the main drawbacks associated with the use of these proteins as antiangiogenic lies in the quantities necessary for the treatment of an individual. Thus, it has been estimated that in the case of endostatin up to several grams of recombinant protein should be administered to the patient each day (Cao, Int J Biochem Cell Biol (2001) 33: 357-369). This disadvantage could be abolished for example by having more powerful angiogenesis inhibitors.
La fibronectine est une protéine fibreuse constitutive de la matrice extracellulaire (Hynes (1990) in Fibronectins (Springer, New York)). Certains fragments dérivés de cette Fibronectin is a constituent fibrous protein of the extracellular matrix (Hynes (1990) in Fibronectins (Springer, New York)). Some fragments derived from this
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protéine semblent également avoir une activité anti-angiogénique (Yi & Ruoslathi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2001) 98 :620-624) d'autres fragments une activité d'inhibition de la croissance endothéliale in vitro (Homandberg et al., Am. J. Pathol. (1985) 120:327-332). Toutefois, dans certains cas il a pu être montré que d'autres fragments de fibronectine favorisaient l'adhésion de cellules métastasiques à la matrice extracellulaire (Mould & Humphries, EMBO J (1991) 10 :4089-4095). ailleurs, ces fragments ne sont pas en essais cliniques. protein also appear to have anti-angiogenic activity (Yi & Ruoslathi, Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 620-624) of other fragments endothelial growth inhibition activity in vitro (Homandberg et al. al., Am. J. Pathol (1985) 120: 327-332). However, in some cases it has been shown that other fibronectin fragments promote the adhesion of metastatic cells to the extracellular matrix (Mold & Humphries, EMBO J (1991) 10: 4089-4095). elsewhere, these fragments are not in clinical trials.
La présente invention a pour objet de fournir des composés ayant une activité antiangiogénique et/ou anti-tumorale pouvant être dans certains cas supérieure à celles des composés anti-angiogéniques de l'art antérieur. The object of the present invention is to provide compounds having an antiangiogenic and / or anti-tumor activity which may in certain cases be greater than those of the anti-angiogenic compounds of the prior art.
La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455(SEQ ID NO : 6), et/ou
456 à 531 (SEQ ID NO: 8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID
NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, , pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde. The present invention relates to the use of a peptide sequence comprising or consisting of: - a sequence extending at least residues: - 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 ( SEQ ID NO: 6), and / or
456 to 531 (SEQ ID NO: 8), of SEQ ID NO: 10, and at most to a sequence corresponding to SEQ ID
NO: 10, or a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 binding activity, or of a sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 factor binding activity, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of angiogenesis-related diseases, such as cancers, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, psoriasis, or rheumatoid arthritis.
SEQ ID NO : 10 correspond aux acides aminés 1447 à 1991 de la séquence peptidique de la fibronectine (SEQ ID NO : 2) (référence P02751 de la base de données SwissProt) codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1. SEQ ID NO : 4 correspond aux acides aminés 1721 à 1812 de la fibronectine, SEQ ID NO : 6 correspond aux acides aminés 1813 à 1901 de la fibronectine, et SEQ ID NO : 8 correspond aux acides aminés
1902 à 1977 de la fibronectine. SEQ ID NO: 10 corresponds to amino acids 1447 to 1991 of the peptide sequence of fibronectin (SEQ ID NO: 2) (reference P02751 of the SwissProt database) encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO : 4 corresponds to amino acids 1721 to 1812 of fibronectin, SEQ ID NO: 6 corresponds to amino acids 1813 to 1901 of fibronectin, and SEQ ID NO: 8 corresponds to amino acids
1902 to 1977 of fibronectin.
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Avantageusement les séquences peptidiques de l'invention possèdent la propriété de se lier au facteur FGF-2, notamment au facteur FGF-2 de poids moléculaire 18 kDa, et d'inhiber son fonctionnement. Advantageously, the peptide sequences of the invention possess the property of binding to FGF-2 factor, especially FGF-2 of molecular weight 18 kDa, and of inhibiting its operation.
Avantageusement les séquences peptidiques de l'invention ont une activité antiangiogénique en bloquant l'action du facteur FGF-2, grâce à leur liaison avec ce dernier. Advantageously, the peptide sequences of the invention have antiangiogenic activity by blocking the action of factor FGF-2, thanks to their binding with the latter.
Plusieurs tests permettant de mesurer la liaison des séquences peptidiques de l'invention au facteur FGF-2 sont décrits dans les exemples suivants, ils font notamment appel à des méthodes bien connues de l'homme de l'art tels que le double hybride ou l'ELISA. Several tests making it possible to measure the binding of the peptide sequences of the invention to FGF-2 factor are described in the following examples, in particular using methods that are well known to those skilled in the art, such as the double hybrid or the ELISA.
Le test de liaison en double hybride peut être réalisé selon la méthodologie générale décrite par Van den Berghe et al. (Mol. Endocrinol. (2000) Nov, 14(11), 1709-1724). Un fragment d'ADN codant pour le facteur FGF-2 est introduit dans le plasmide pAS2 (Clontech, numéro d'accès à Genebank : U30497) et un fragment d'ADN codant pour les séquences peptidiques dont on souhaite évaluer la liaison au facteur FGF-2 est introduite dans le plasmide pACT2 (Clontech, numéro d'accès à Genebank : U29899). The double hybrid binding assay can be performed according to the general methodology described by Van den Berghe et al. (Mol Endocrinol (2000) Nov, 14 (11), 1709-1724). A DNA fragment coding for the FGF-2 factor is introduced into the plasmid pAS2 (Clontech, Genebank accession number: U30497) and a DNA fragment coding for the peptide sequences whose FGF binding is to be evaluated. -2 is introduced into the plasmid pACT2 (Clontech, Genebank access number: U29899).
Les deux plasmides sont alors introduits dans la souche Y190 de Saccharomyces cerevisiae (Clontech ; Harper et al., Cell, 1993 ; 75:805-816 ; Flick & Johnston, Mol. Cell. Biol., 1990 ; 10 (9):4757-4769) dont l'activité p-galactosidase est mesurée. La présence d'une activité p-galactosidase traduit l'existence d'une liaison entre ladite séquence peptidique et le facteur FGF-2. Both plasmids are then introduced into Saccharomyces cerevisiae strain Y190 (Clontech, Harper et al., Cell, 1993, 75: 805-816, Flick & Johnston, Mol Cell Biol., 1990; 10 (9): 4757). 4769) whose β-galactosidase activity is measured. The presence of β-galactosidase activity reflects the existence of a link between said peptide sequence and the FGF-2 factor.
Le test de liaison en ELISA peut être réalisé comme suit. Les parois des puits d'une plaque de microtitration standard sont recouverts de facteur FGF-2. Les séquences peptidiques dont on souhaite mesurer la liaison au facteur FGF-2, couplées à une étiquette histidine, sont ajoutées aux puits en concentrations variables, puis un anticorps marqué dirigé contre l'étiquette histidine est ajouté. Après lavage, la quantité d'anticorps par puits est alors déterminée à l'aide du marqueur, qui peut être une enzyme, un chromophore ou bien un composé radioactif. La quantité d'anticorps par puits est représentative de la liaison entre lesdites séquences peptidiques et le facteur FGF-2. The ELISA binding assay can be performed as follows. The well walls of a standard microtiter plate are covered with FGF-2 factor. The peptide sequences whose FGF-2 binding to histidine tag is desired to be measured are added to the wells in varying concentrations, and then a labeled antibody directed to the histidine tag is added. After washing, the amount of antibody per well is then determined using the marker, which may be an enzyme, a chromophore or a radioactive compound. The amount of antibody per well is representative of the binding between said peptide sequences and FGF-2 factor.
On désigne par homologie le pourcentage d'acides aminés similaires pour deux séquences peptidiques alignées acide aminé par acide aminé, tel que cela peut être obtenu par la mise en #uvre de l'algorithme défini par Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25 :3389-3402 exemple. By homology is meant the percentage of similar amino acids for two amino acid amino acid-aligned peptide sequences, as may be achieved by the implementation of the algorithm defined by Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402 example.
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On désigne par angiogenèse le phénomène de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce phénomène permet notamment la croissance tumorale. L'angiogenèse se trouve sous la dépendance de facteurs angiogéniques tels que le facteur FGF-2 par exemple. Angiogenesis refers to the phenomenon of formation of new blood vessels from preexisting vessels. This phenomenon allows tumor growth in particular. Angiogenesis is dependent on angiogenic factors such as FGF-2, for example.
L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, et/ou possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité anti-angiogénique et ou une activité anti-tumorale. The invention also relates to the aforementioned use of a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, and / or having a homology of at least 85% with one sequences defined above, provided that said peptide sequence has anti-angiogenic activity and or anti-tumor activity.
On désigne par activité anti-angiogénique, une activité d'inhibition de l'angiogenèse. By antiangiogenic activity is meant an activity of inhibition of angiogenesis.
Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la tubulogenèse, de cellules endothéliales par les séquences peptidiques de l'invention. La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence de la séquence peptidique dont on souhaite évaluer l'activité. This activity can for example be demonstrated in vitro by demonstrating the inhibition of both the multiplication, migration and tubulogenesis of endothelial cells by the peptide sequences of the invention. Measurement of the inhibition of endothelial cell multiplication can be achieved by culturing endothelial cells in the presence of the peptide sequence whose activity is to be evaluated.
La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une blessure sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence de la séquence peptidique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure. La mesure de l'inhibition de la tubulogenèse des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tubules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence de la séquence peptidique à tester. Measurement of inhibition of endothelial cell migration can be accomplished by wounding an endothelial cell mat and then incubating the cells in the presence of the peptide sequence to be tested. The number of cells that migrated to the wound is then measured. Measurement of inhibition of endothelial cell tubulogenesis can be performed by measuring the length of tubules formed by gel-grown endothelial cells in the presence of the peptide sequence to be tested.
On désigne par activité anti-tumorale, une activité permettant d'inhiber la croissance tumorale et/ou d'induire la régression voir la disparition de tumeurs. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vivo en mesurant la masse de tumeurs, dont on a induit le développement chez la souris par injection de cellules tumorales, en présence et en absence d'administration de séquences peptidiques de l'invention et/ou d'acides nucléiques exprimant les séquences peptidiques de l'invention. By anti-tumor activity is meant an activity that makes it possible to inhibit tumor growth and / or to induce regression or the disappearance of tumors. This activity can be demonstrated, for example, in vivo by measuring the mass of tumors, which have been induced in the mouse by injection of tumor cells, in the presence and absence of the peptide sequences of the invention and / or nucleic acids expressing the peptide sequences of the invention.
L'invention concerne notamment l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455 (SEQ ID NO : 6), et/ou - 456 à 531 (SEQ ID NO : 8), The invention relates in particular to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: a sequence extending at least residues: 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or - 456 to 531 (SEQ ID NO: 8),
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de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de
SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. - SEQ ID NO : 12 correspond aux acides aminés 1447 à 1981 de la fibronectine. of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of
SEQ ID NO: 10, or a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 binding activity, or a sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 factor binding activity. SEQ ID NO: 12 corresponds to amino acids 1447 to 1981 of fibronectin.
L'invention concerne en particulier l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531 (SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO: 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. The invention relates in particular to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: a sequence extending at least residues 367 to 531 (SEQ ID NO: 14) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or - a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least an amino acid, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 binding activity, or - a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 factor binding activity.
SEQ ID NO : 14 correspond aux acides aminés 1813 à 1977 de la fibronectine. SEQ ID NO: 14 corresponds to amino acids 1813 to 1977 of fibronectin.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation telle que définie ci-dessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO: 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. The invention relates more particularly to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: a sequence extending at least residues 270 to 531 (SEQ ID NO: 16) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or - a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least an amino acid, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 binding activity, or - a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 factor binding activity.
SEQ ID NO : 16 correspond aux acides aminés 1716 à 1977 de la fibronectine. SEQ ID NO: 16 corresponds to amino acids 1716 to 1977 of fibronectin.
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L'invention concerne encore plus particulièrement l'utilisation telle que définie cidessus, d'une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 4, ou - de SEQ ID NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou -de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou -deSEQIDNO: 16, ou - de SEQ ID NO: 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30. The invention relates more particularly to the use as defined above, of a peptide sequence comprising or consisting of: - SEQ ID NO: 4, or - SEQ ID NO: 6, or - SEQ ID NO: 8 or - SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 20, or - SEQ ID NO: 22, or - SEQ ID NO: 24, or - SEQ ID NO: 26, or - SEQ ID NO: 28, or - SEQ ID NO: 30.
SEQ ID NO : 18 correspond à la séquence peptidique du clone A dans la suite, elle correspond aux acides aminés 1 à 531 de SEQ ID NO : 10 et aux acides aminés 1447 à 1977 de la fibronectine. SEQ ID NO: 18 corresponds to the peptide sequence of clone A in the following, it corresponds to amino acids 1 to 531 of SEQ ID NO: 10 and amino acids 1447 to 1977 of fibronectin.
SEQ ID NO : 20 est désignée fibstatine (Fib) dans la suite, elle correspond aux acides aminés 270 à 535 de SEQ ID NO : 10 et aux acides aminés 1716 à 1981 de la fibronectine. SEQ ID NO: 20 is designated fibstatin (Fib) in the following, it corresponds to amino acids 270 to 535 of SEQ ID NO: 10 and amino acids 1716 to 1981 of fibronectin.
SEQ ID NO : 22 correspond aux acides aminés 275à 455 de SEQ ID NO : 10 et 1721 à 1901 de la fibronectine, elle correspond à la séquence peptidique du clone C dans la suite. SEQ ID NO: 22 corresponds to amino acids 275 to 455 of SEQ ID NO: 10 and 1721 to 1901 of fibronectin, it corresponds to the peptide sequence of clone C in the following.
SEQ ID NO : 24 correspond aux acides aminés 275 à 531 de SEQ ID NO : 10 et 1721 à 1977 de la fibronectine. SEQ ID NO: 24 corresponds to amino acids 275 to 531 of SEQ ID NO: 10 and 1721 to 1977 of fibronectin.
SEQ ID NO : 26 correspond aux acides aminés 367 à 531 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à à 1977 de la fibronectine. SEQ ID NO: 26 corresponds to amino acids 367 to 531 of SEQ ID NO: 10 and 1813 to 1977 of fibronectin.
SEQ ID NO :28 correspond à la séquence peptidique du clone D dans la suite, elle correspond aux acides aminés 367 à 535 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à 1981 de la fibronectine. SEQ ID NO: 28 corresponds to the peptide sequence of clone D in the following, it corresponds to amino acids 367 to 535 of SEQ ID NO: 10 and 1813 to 1981 of fibronectin.
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SEQ ID NO : 30 correspond à la séquence peptidique du clone E dans la suite, elle correspond aux acides aminés 367 à 545 de SEQ ID NO : 10 et 1813 à 1991 de la fibronectine. SEQ ID NO: 30 corresponds to the peptide sequence of clone E in the following, it corresponds to amino acids 367 to 545 of SEQ ID NO: 10 and 1813 to 1991 of fibronectin.
L'utilisation des séquences peptidiques SEQ ID NO : 26 et 28 est avantageuse, car ces séquences présentent une taille inférieure à celle de SEQ ID NO : 20 et peuvent s'avérer plus solubles et plus stables que cette dernière. The use of the peptide sequences SEQ ID NO: 26 and 28 is advantageous because these sequences have a size smaller than that of SEQ ID NO: 20 and can be more soluble and more stable than the latter.
SEQ ID NO : 30 peut exercer une activité anti-angiogénique suite à sa digestion partielle par une protéase in vitro ou in vivo pour générer une protéine ayant une activité anti-angiogénique de SEQ ID NO : 26 ou 28 par exemple. SEQ ID NO: 30 may exert an anti-angiogenic activity following its partial digestion with a protease in vitro or in vivo to generate a protein having an anti-angiogenic activity of SEQ ID NO: 26 or 28 for example.
SEQ ID NO :22 peut exercer une activité anti-angiogénique suite à son association avec une ou plusieurs séquences peptidiques, in vitro ou in vivo, pour former un complexe protéique ayant une organisation semblable à une protéine ayant une activité anti-angiogénique de SEQ ID NO : 20 ou 24 par exemple. SEQ ID NO: 22 can exert an anti-angiogenic activity following its association with one or more peptide sequences, in vitro or in vivo, to form a protein complex having a protein-like organization having an anti-angiogenic activity of SEQ ID NO: 20 or 24 for example.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, ou de son complémentaire, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde. The present invention also relates to the use of a nucleic acid encoding a peptide sequence as defined above, or its complement, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of diseases related to the angiogenesis, such as cancers, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, psoriasis, or rheumatoid arthritis.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de maladies liées à l'angiogenèse, telles que les cancers, la The present invention also relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to sequences extending from nucleotides: 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 9, or - to a sequence derived from sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one nucleotide, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits FGF-2 binding activity, or - a sequence having a homology of at least 75% with one of the sequences defined above, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits FGF-2 factor binding activity, or its complement, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of angiogenesis-related diseases e, such as cancers,
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dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, le psoriasis, ou l'arthrite rhumatoïde. age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, psoriasis, or rheumatoid arthritis.
On désigne par homologie le pourcentage de nucléotides identiques pour deux séquences nucléotidiques alignées nucléotide par nucléotide, tel que cela peut être obtenu par la mise en #uvre de l'algorithme défini par Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25 :3389-3402 exemple. By homology is meant the percentage of identical nucleotides for two nucleotide nucleotide nucleotide nucleotide sequences, as can be obtained by the implementation of the algorithm defined by Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402 example.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 3,5, 7 et 9 codent respectivement pour les séquences peptidiques SEQ ID NO : 4,6, 8 et 10. The nucleotide sequences SEQ ID NO: 3.5, 7 and 9 respectively code for the peptide sequences SEQ ID NO: 4,6, 8 and 10.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO :11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. According to an advantageous embodiment, the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to sequences extending from nucleotides: 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3) ), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 11, or a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
SEQ ID NO : 11 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 1 à 1605 de la séquence SEQ ID NO : 9 et à la séquence s'étendant des nucléotides 4339 à 5943 de la fibronectine. SEQ ID NO: 11 corresponds to the sequence extending from nucleotides 1 to 1605 of the sequence SEQ ID NO: 9 and to the sequence extending from nucleotides 4339 to 5943 of fibronectin.
SEQ ID NO : 11code pour SEQ ID NO : 12. SEQ ID NO: 11code for SEQ ID NO: 12.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 1593 (SEQ ID NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. According to another advantageous embodiment, the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to the sequence extending from nucleotides 1099 to 1593 (SEQ ID NO: 13) of SEQ ID NO: 9, and at most at SEQ ID NO: 11, or - at a sequence derived from the sequences defined above or at a homologous sequence.
SEQ ID NO : 13 code pour SEQ ID NO : 14. SEQ ID NO: 13 code for SEQ ID NO: 14.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO : 15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. According to another advantageous embodiment, the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to the sequence extending from nucleotides 808 to 1593 (SEQ ID NO: 15 ) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 11, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
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SEQ ID NO : 15 code pour SEQ ID NO :16. SEQ ID NO: 15 code for SEQ ID NO: 16.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 3, ou - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou - à SEQ ID NO : 11, ou - à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO: 21, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire. According to yet another advantageous embodiment, the invention relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding to: - SEQ ID NO: 3, or - SEQ ID NO: 5, or - at SEQ ID NO: 7, or - at SEQ ID NO: 9, or - at SEQ ID NO: 11, or - at SEQ ID NO: 13, or - at SEQ ID NO: 15, or - at SEQ ID NO: 17, or - at SEQ ID NO: 19, or - at SEQ ID NO: 21, or - at SEQ ID NO: 23, or - at SEQ ID NO: 25, or - at SEQ ID NO: 27, or - at SEQ ID NO: 29, or its complement.
SEQ ID NO : 17 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 4339 à 5931 de la fibronectine. SEQ ID NO: 17 corresponds to the sequence extending from nucleotides 4339 to 5931 of fibronectin.
SEQ ID NO : 19 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5146 à 5943 de la fibronectine. SEQ ID NO: 19 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5146 to 5943 of fibronectin.
SEQ ID NO : 21 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5161 à 5703 de la fibronectine. , SEQ ID NO : 23 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5161 à 5931 de la fibronectine. SEQ ID NO: 21 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5161 to 5703 of fibronectin. , SEQ ID NO: 23 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5161 to 5931 of fibronectin.
SEQ ID NO : 25 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5931 de la fibronectine. SEQ ID NO: 25 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5437 to 5931 of fibronectin.
SEQ ID NO : 27 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5943 de la fibronectine. SEQ ID NO: 27 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5437 to 5943 of fibronectin.
SEQ ID NO : 29 correspond à la séquence s'étendant des nucléotides 5437 à 5973 de la fibronectine. SEQ ID NO: 29 corresponds to the sequence extending from nucleotides 5437 to 5973 of fibronectin.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising as active substance a peptide sequence comprising or consisting of:
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- d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : - 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455(SEQ ID NO : 6), et/ou
456 à 531 (SEQ ID NO: 8), de la SEQ ID NO : 10, et au maximum à une séquence correspondant à SEQ ID NO : 10, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. a sequence extending at least residues: 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or -367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or
456 to 531 (SEQ ID NO: 8), of SEQ ID NO: 10, and at most to a sequence corresponding to SEQ ID NO: 10, or - of a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutating at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 binding activity, or - a sequence having at least 85% homology with one of the sequences defined herein above, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 factor binding activity, in association with a pharmaceutically acceptable carrier.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables pouvant être utilisés pour des séquences peptidiques dans le cadre de l'invention sont bien connus de l'homme de l'art. Pharmaceutically acceptable carriers that can be used for peptide sequences within the scope of the invention are well known to those skilled in the art.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également comprendre d'autres composés, notamment protéiques, ayant une action anti-angiogénique, tels que l'endostatine, l'angiostatine, PF-4, la thrombospondine ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple, ces protéines sont notamment définies dans Cao Int. J. Biochem. The pharmaceutical compositions of the invention may also comprise other compounds, in particular protein compounds, having an anti-angiogenic action, such as endostatin, angiostatin, PF-4, thrombospondin or prolactin fragment of 16 kDa for example, these proteins are in particular defined in Cao Int. J. Biochem.
Cell Biol. (2001) 33:357-369. Cell Biol. (2001) 33: 357-369.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent notamment pour l'administration à un patient d'une dose de 15 à 600 mg/m2/jour d'une séquence peptidique selon l'invention. The pharmaceutical compositions according to the invention are particularly suitable for the administration to a patient of a dose of 15 to 600 mg / m 2 / day of a peptide sequence according to the invention.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent également pour une administration par voie topique, transdermique, intrapéritonéale, intracrânienne, intracéréboventriculaire, intracérébrale, intravaginale, intra-utérine, orale, rectale ou parentérale (par exemple, par voie intraveineuse, intrarachidienne, sous-cutanée ou intramusculaire). The pharmaceutical compositions according to the invention are also suitable for topical, transdermal, intraperitoneal, intracranial, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterine, oral, rectal or parenteral (e.g., intravenous, intraspinal, subcutaneous) administration. or intramuscular).
Les compositions avantageuses selon la présente invention, destinées à une administration parentérale, comprennent des solutions d'injections stériles aqueuses et non aqueuses qui peuvent contenir des anti-oxydants, des tampons, des agents bactériostatiques et des solutés qui rendent la composition isotonique ; ainsi que des suspensions stériles aqueuses et non aqueuses qui peuvent comprendre des agents de suspension et des épaississants. Advantageous compositions according to the present invention for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injection solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostatic agents and solutes which render the composition isotonic; as well as aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may include suspending agents and thickeners.
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Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus : 5- 275 à 366 (SEQ ID NO : 4), et/ou - 367 à 455(SEQ ID NO : 6), et/ou -456à531(SEQIDNO:8), de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou 10- d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. According to an advantageous embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a peptide sequence comprising or consisting of: a sequence extending at least residues: 5- 275 to 366 (SEQ ID NO: 4), and / or - 367 to 455 (SEQ ID NO: 6), and / or -456 to 531 (SEQ ID NO: 8), SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 6) NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or 10- of a sequence derived from the sequences defined above or from a homologous sequence.
Selon un autre mode de réalisation pharmaceutique comprend, à titre de comprenant ou étant constituée : avantageux de l'invention, la composition substance active, une séquence peptidique 15- d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 367 à 531(SEQ ID NO : 14) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de SEQ ID NO : 10, ou . d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. According to another pharmaceutical embodiment comprises, as comprising or consisting of: advantageous of the invention, the active substance composition, a peptide sequence of a sequence extending at least residues 367 to 531 (SEQ ID No. NO: 14) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12) of SEQ ID NO: 10, or. a sequence derived from the sequences defined above or from a homologous sequence.
20 Selon un autre mode de réalisation pharmaceutique comprend, à titre de comprenant ou étant constituée : avantageux de l'invention, la composition substance active, une séquence peptidique - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10, et au maximum des résidus 1 à 535(SEQ ID NO : 12), ou 25- d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou d'une séquence homologue. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique comprend, à titre de comprenant ou étant constituée : 30 - de SEQ ID NO : 4, ou
- de SEQ NO : 6, ou - de SEQ ID NO : 8, ou - de SEQ ID NO : 10, ou - de SEQ ID NO : 12, ou According to another pharmaceutical embodiment comprising, as comprising or consisting of: advantageous of the invention, the active substance composition, a peptide sequence - of a sequence extending at least residues 270 to 531 (SEQ ID NO: 16) of SEQ ID NO: 10, and at most residues 1 to 535 (SEQ ID NO: 12), or a sequence derived from the sequences defined above or a homologous sequence. According to yet another advantageous embodiment of the invention, the pharmaceutical composition comprises, as comprising or consisting of: - SEQ ID NO: 4, or
- SEQ NO: 6, or - SEQ ID NO: 8, or - SEQ ID NO: 10, or - SEQ ID NO: 12, or
<Desc/Clms Page number 12><Desc / Clms Page number 12>
- de SEQ ID NO : 14, ou - de SEQ ID NO : 16, ou - de SEQ ID NO : 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 22, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO : 26, ou - de SEQ ID NO : 28, ou - de SEQ ID NO : 30. - SEQ ID NO: 14, or - SEQ ID NO: 16, or - SEQ ID NO: 18, or - SEQ ID NO: 20, or - SEQ ID NO: 22, or - SEQ ID NO: : 24, or - SEQ ID NO: 26, or - SEQ ID NO: 28, or - SEQ ID NO: 30.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique codant pour une séquence peptidique telle que définie dans les compositions pharmaceutiques ci-dessus, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising as active substance a nucleic acid encoding a peptide sequence as defined in the above pharmaceutical compositions, or its complement, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables pouvant être utilisés pour des acides nucléiques dans le cadre de l'invention sont bien connus de l'homme de l'art. Pharmaceutically acceptable carriers that can be used for nucleic acids in the context of the invention are well known to those skilled in the art.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également comprendre d'autres acides nucléiques, ayant une action anti-angiogénique, soit directement, soit par le biais d'une protéine pour laquelle ils codent, telle que l'endostatine, l'angiostatine, PF-4, la thrombospondine ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple, ces protéines sont notamment définies dans Cao Int. J Biochem. Cell Biol. (2001) 33:357- 369. The pharmaceutical compositions of the invention may also comprise other nucleic acids, having an anti-angiogenic action, either directly or by means of a protein for which they encode, such as endostatin, angiostatin, PF -4, thrombospondin or the prolactin fragment of 16 kDa for example, these proteins are in particular defined in Cao Int. J. Biochem. Cell Biol. (2001) 33: 357-369.
Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent pour l'administration d'une dose unitaire de 0,5 à 20 mg d'acide nucléique. Advantageously, the pharmaceutical compositions according to the invention are suitable for the administration of a unit dose of 0.5 to 20 mg of nucleic acid.
L'administration des compositions pharmaceutiques peut être, en particulier réalisée par injection intramusculaire puis électrotransfert selon des méthodologies bien connues de l'homme de l'art. The administration of the pharmaceutical compositions may in particular be carried out by intramuscular injection then electrotransfer according to methodologies well known to those skilled in the art.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 9, ou The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to sequences extending from nucleotides: 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 9, or
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- à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one nucleotide, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits FGF-2 binding activity, or sequence having a homology of at least 75% with one of the sequences defined above, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits FGF-2 binding activity, or its complement, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
Selon un mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum aux séquences s'étendant des nucléotides : - 823 à 1098 (SEQ ID NO : 3), et/ou - 1099 à 1365 (SEQ ID NO : 5), et/ou - 1366 à 1593 (SEQ ID NO : 7), de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. According to an advantageous embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to the sequences extending from nucleotides: 823 to 1098 (SEQ ID NO: 3), and / or - 1099 to 1365 (SEQ ID NO: 5), and / or - 1366 to 1593 (SEQ ID NO: 7), SEQ ID NO: 9, and to SEQ at most ID NO: 11, or - to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 1099 à 1593 (SEQ ID
NO : 13) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. According to another advantageous embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to the sequence extending from nucleotides 1099 to 1593 (SEQ ID
NO: 13) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 11, or - a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend, à titre de substance active, un acide nucléique comprenant ou étant constituée d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID NO :
15) de SEQ ID NO : 9, et au maximum à SEQ ID NO : 11, ou -, à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus ou à une séquence homologue. According to another advantageous embodiment, the pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active substance, a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to the sequence extending from nucleotides 808 to 1593 (SEQ ID NO:
15) of SEQ ID NO: 9, and at most SEQ ID NO: 11, or -, to a sequence derived from the sequences defined above or to a homologous sequence.
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ou étant constituée d'une séquence correspondant : -àSEQIDNO: 3, ou
5 - à SEQ ID NO : 5, ou - à SEQ ID NO : 7, ou - à SEQ ID NO : 9, ou - à SEQ ID NO: 11, ou - à SEQ ID NO: 13, ou 10 - à SEQ ID NO: 15, ou -àSEQIDNO: 17, ou -àSEQIDNO: 19, ou -àSEQIDNO: 21, ou - à SEQ ID NO : 23, ou 15 - à SEQ ID NO : 25, ou -àSEQIDNO: 27, ou - à SEQ ID NO : 29, ou son complémentaire. or consisting of a sequence corresponding to -SEQIDNO: 3, or
5 - at SEQ ID NO: 5, or - at SEQ ID NO: 7, or - at SEQ ID NO: 9, or - at SEQ ID NO: 11, or - at SEQ ID NO: 13, or 10 - at SEQ ID NO: 15, or -SEQIDNO: 17, or -SEQIDNO: 19, or -SEQIDNO: 21, or -SEQ ID NO: 23, or 15-SEQ ID NO: 25, or -SEQIDNO: 27, or at SEQ ID NO: 29, or its complement.
Selon une autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition 20 pharmaceutique telle que définie ci-dessus, comprenant à titre de substance active un vecteur d'expression eucaryote comprenant un acide nucléique tel que défini dans les compositions pharmaceutiques ci-dessus, ou son complémentaire, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. According to another embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, comprising as active substance a eukaryotic expression vector comprising a nucleic acid as defined in the above pharmaceutical compositions, or its complementary, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
Les vecteurs d'expression selon l'invention peuvent également comprendre en plus des 25 acides nucléiques codant pour des séquences peptidiques ayant également une activité anti-angiogénique, telles que l'endostatine ou l'angiostatine ou PF4 ou le fragment de prolactine de 16 kDa par exemple
Selon encore un autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active une cellule 30 eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans les The expression vectors according to the invention may also comprise, in addition, nucleic acids coding for peptide sequences also having an anti-angiogenic activity, such as endostatin or angiostatin or PF4 or the 16 kDa prolactin fragment. for example
According to yet another embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising as active substance a eukaryotic or prokaryotic cell transformed with a nucleic acid as defined in US Pat.
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La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre substance active un anticorps anti-idiotypique dirigé contre le paratope d'un anticorps dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des utilisations ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising, as an active substance, an anti-idiotypic antibody directed against the paratope of an antibody directed against a peptide sequence as defined in one of the above uses, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle. acceptable.
On désigne par paratope la partie d'un anticorps responsable de son interaction avec un épitope d'un antigène reconnu par ledit anticorps. Paratope is the part of an antibody responsible for its interaction with an epitope of an antigen recognized by said antibody.
Un anticorps anti-idotypique selon l'invention peut être préparé selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art, notamment-par injection d'un anticorps dirigé contre une séquence peptidique selon l'invention à un animal, tel qu'un lapin ou une souris par exemple. An anti-idotypic antibody according to the invention may be prepared according to methods well known to those skilled in the art, in particular by injection of an antibody directed against a peptide sequence according to the invention to an animal, such as a rabbit or a mouse for example.
Avantageusement, l'anticorps anti-idiotypique selon l'invention, possède des propriétés de liaison au FGF-2. Advantageously, the anti-idiotypic antibody according to the invention has FGF-2 binding properties.
L'anticorps anti-idiotypique de l'invention peut être humanisé, par des méthodes bien connues de l'homme de l'art. Des fragments de cet anticorps peuvent également être utilisés dans les compositions pharmaceutiques de l'invention, tels que des fragments scFv, Fab ou F(ab)'2 bien connu de l'homme de l'art. The anti-idiotypic antibody of the invention can be humanized by methods well known to those skilled in the art. Fragments of this antibody can also be used in the pharmaceutical compositions of the invention, such as scFv, Fab or F (ab) '2 fragments well known to those skilled in the art.
La présente invention concerne également une séquence peptidique comprenant ou étant constituée : - d'une séquence s'étendant au minimum des résidus 270 à 531 (SEQ ID NO : 16) de SEQ ID NO : 10 et au maximum des résidus 1 à 535 (SEQ ID NO : 12) de
SEQ ID NO : 10, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 12 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO: 12 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou - d'une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un acide aminé, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - d'une séquence possédant une homologie d'au moins 85 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ladite séquence peptidique présente une activité de liaison au facteur FGF-2. The present invention also relates to a peptide sequence comprising or consisting of: a sequence extending at least residues 270 to 531 (SEQ ID NO: 16) of SEQ ID NO: 10 and at most residues 1 to 535 ( SEQ ID NO: 12) of
SEQ ID NO: 10, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 12 in the total sequence of said peptide sequence being different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 12 in the sequence of human fibronectin, or - from a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one amino acid, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 factor binding activity, or - a sequence having a homology of at least 85% with one of the sequences defined above, provided that said peptide sequence exhibits FGF-2 binding activity.
L'invention concerne notamment une séquence peptidique telle que définie ci-dessus, comprenant ou étant constituée : - de SEQ ID NO : 12, ou - de SEQ ID NO : 14, ou The invention relates in particular to a peptide sequence as defined above, comprising or consisting of: - SEQ ID NO: 12, or - SEQ ID NO: 14, or
<Desc/Clms Page number 16><Desc / Clms Page number 16>
-deSEQIDNO: 16, ou - de SEQ ID NO: 18, ou - de SEQ ID NO : 20, ou - de SEQ ID NO : 24, ou - de SEQ ID NO: 26, ou - de SEQ ID NO : 28, les séquences adjacentes aux extrémités des SEQ ID NO : 12,14, 16,18, 20,24, 26 et 28 dans la séquence totale de ladite séquence peptidique étant différentes de celles qui sont respectivement adjacentes à SEQ ID NO : 12,14, 16,18, 20,24, 26 et 28 dans la séquence de la fibronectine humaine. -deSEQIDNO: 16, or - SEQ ID NO: 18, or - SEQ ID NO: 20, or - SEQ ID NO: 24, or - SEQ ID NO: 26, or - SEQ ID NO: 28, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 12,14, 16,18, 20,24, 26 and 28 in the total sequence of said peptide sequence being different from those which are respectively adjacent to SEQ ID NO: 12,14, 16,18, 20,24, 26 and 28 in the sequence of human fibronectin.
La présente invention concerne également un acide nucléique, comprenant ou étant constitué d'une séquence codant pour l'une des séquence peptidiques telles que définies ci-dessus, ou son complémentaire. The present invention also relates to a nucleic acid comprising or consisting of a sequence coding for one of the peptide sequences as defined above, or its complement.
L'invention concerne aussi un acide nucléique s'hybridant à un acide nucléique tel que définis ci-dessus, ou à son complémentaire, dans les conditions d'hybridation suivantes : 0,75 M NaCl, 0,75 mM citrate de sodium, 60 C . The invention also relates to a nucleic acid hybridizing to a nucleic acid as defined above, or to its complement, under the following hybridization conditions: 0.75 M NaCl, 0.75 mM sodium citrate, 60 VS .
La présente invention concerne également un acide nucléique comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - au minimum à la séquence s'étendant des nucléotides 808 à 1593 (SEQ ID
NO : 15) de SEQ ID NO : 9 et au maximum à la séquence SEQ ID NO : 11, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11dans ledit acide nucléique étant différentes de celles qui sont adjacentes à SEQ ID NO : 11dans la séquence de la fibronectine humaine, ou - à une séquence dérivée des séquences définies ci-dessus par insertion, suppression ou mutation d'au moins un nucléotide, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou - à une séquence possédant une homologie d'au moins 75 % avec l'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique code une séquence peptidique qui présente une activité de liaison au facteur FGF-2, ou son complémentaire. The present invention also relates to a nucleic acid comprising or consisting of a sequence corresponding: at least to the sequence extending from nucleotides 808 to 1593 (SEQ ID
NO: 15) of SEQ ID NO: 9 and at the most at the sequence SEQ ID NO: 11, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 11in said nucleic acid being different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 11in the human fibronectin sequence, or - a sequence derived from the sequences defined above by insertion, deletion or mutation of at least one nucleotide, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits FGF binding activity. -2, or - a sequence having a homology of at least 75% with one of the sequences defined above, provided that said nucleic acid encodes a peptide sequence which exhibits FGF-2 binding activity, or its complementary.
L'invention concerne plus particulièrement un acide nucléique tel que défini ci-dessus, comprenant ou étant constitué d'une séquence correspondant : - à SEQ ID NO : 11, ou The invention relates more particularly to a nucleic acid as defined above, comprising or consisting of a sequence corresponding to: - SEQ ID NO: 11, or
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- à SEQ ID NO : 13, ou - à SEQ ID NO : 15, ou - à SEQ ID NO : 17, ou - à SEQ ID NO : 19, ou - à SEQ ID NO : 23, ou - à SEQ ID NO : 25, ou - à SEQ ID NO : 27, les séquences adjacentes aux extrémités de SEQ ID NO : 11, 13,15, 17, 19, 23,
25 et 27 dans ledit acide nucléique étant respectivement différentes de celles qui sont adjacentes aux SEQ ID NO : 11, 13,15, 17,19, 23,25 et 27 dans la séquence de la fibronectine humaine, ou son complémentaire. - at SEQ ID NO: 13, or - at SEQ ID NO: 15, or - at SEQ ID NO: 17, or - at SEQ ID NO: 19, or - at SEQ ID NO: 23, or - at SEQ ID NO : 25, or - at SEQ ID NO: 27, the sequences adjacent to the ends of SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 23,
25 and 27 in said nucleic acid being respectively different from those which are adjacent to SEQ ID NO: 11, 13,15, 17,19, 23,25 and 27 in the sequence of human fibronectin, or its complement.
L'invention concerne notamment un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus. The invention relates in particular to a eukaryotic or prokaryotic expression vector comprising a nucleic acid as defined above.
Selon un autre mode de réalisation la présente invention concerne une cellule eucaryote ou procaryote transformée par un acide nucléique tel que défini dans les compositions décrites ci-dessus. According to another embodiment, the present invention relates to a eukaryotic or prokaryotic cell transformed with a nucleic acid as defined in the compositions described above.
L'invention concerne également un anticorps dirigé contre une séquence peptidique telle que définie dans l'une des utilisations ci-dessus. The invention also relates to an antibody directed against a peptide sequence as defined in one of the above uses.
Cet anticorps peut notamment être préparé selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art, par injection des séquences peptidiques selon l'invention à des animaux tels que des chevaux, des lapins, des rats ou des souris et l'extraction du sérum desdits animaux. This antibody can in particular be prepared according to methods well known to those skilled in the art, by injection of the peptide sequences according to the invention into animals such as horses, rabbits, rats or mice and the extraction of the serum of said animals.
Un tel anticorps est notamment utile pour la fabrication de kis permettant de doser les séquences peptidiques selon l'invention, par exemples dans des fluides ou des tissus naturels, tels que du sang, du sérum, du plasma ou des extraits de muscles par exemple Le dosage peut par exemple être réalisé selon la méthode ELISA. Such an antibody is particularly useful for the manufacture of kis for dosing the peptide sequences according to the invention, for example in fluids or natural tissues, such as blood, serum, plasma or muscle extracts, for example The assay can for example be carried out according to the ELISA method.
L'invention concerne également des fragments de l'anticorps ci-dessus, tels que des fragments Fab, F(ab)'2 ou scFv par exemple. The invention also relates to fragments of the above antibody, such as Fab, F (ab) '2 or scFv fragments for example.
L'invention concerne également un anticorps anti-idiotypique dirigé contre le paratope de l'anticorps défini ci-dessus. The invention also relates to an anti-idiotypic antibody directed against the paratope of the antibody defined above.
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DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 La Figure 1 représente les résultats d'un test ELISA mesurant l'interaction établie entre le facteur FGF-2 fixé sur les parois des puits d'une plaque de microtitration et la fibstatine, la présence de fibstatine étant révélée par un anticorps marqué à la péroxydase de raifort. L'axe des ordonnées représente la densité optique à 490 nm. L'axe des abscisses représente la concentration en fibstatine (en g/ml). DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 FIG. 1 represents the results of an ELISA test measuring the interaction established between the FGF-2 factor fixed on the walls of the wells of a microtiter plate and the fibstatin, the presence of fibstatin being revealed by an antibody labeled with horseradish peroxidase. The y-axis represents the optical density at 490 nm. The abscissa axis represents the fibstatin concentration (in g / ml).
10 Figure 2
La Figure 2 représente l'effet de milieu conditionné dilué au 3/4 (colonne noire) ou au 1/2 (colonne blanche) contenant de la fibstatine (Fib) ou de l'endostatine (Endo) sur la croissance de cellules endothéliales en culture, par comparaison avec des cellules endothéliales témoins (colonne hachurée). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de croissance par rapport 15 à la croissance des cellules témoins. 10 Figure 2
Figure 2 shows the effect of conditioned media diluted to 3/4 (black column) or 1/2 (white column) containing fibstatin (Fib) or endostatin (Endo) on the growth of endothelial cells in culture, compared with control endothelial cells (hatched column). The y-axis represents the percentage of growth relative to the growth of the control cells.
Figure 3
La Figure 3 représente l'effet de la fibstatine recombinante (colonnes noires) ou de l'endostatine recombinante (colonnes blanches) sur la croissance de cellules endothéliales en 20 culture. L'axe des ordonnées représente le pourcentage d'inhibition de croissance par rapport à la croissance de cellules témoins, l'axe des abscisses représente la concentration en protéine recombinante (en g/ml). Figure 3
Figure 3 shows the effect of recombinant fibstatin (black columns) or recombinant endostatin (white columns) on growth of endothelial cells in culture. The ordinate axis represents the percentage of growth inhibition relative to the growth of control cells, the abscissa axis represents the concentration of recombinant protein (in g / ml).
Figure 4 @ 25 La Figure 4 représente l'effet de la fibstatine (colonne blanche) sur la croissance de cellules non-endothéliales B16 et NIH-3T3 par rapport à un témoin (colonne noire). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de croissance cellulaire. Figure 4 represents the effect of fibstatin (white column) on the growth of non-endothelial cells B16 and NIH-3T3 compared to a control (black column). The y-axis represents the percentage of cell growth.
Figure 5 30 La Figure 5 représente l'effet de la fibstatine sur la migration cellulaire de cellules endothéliales. L'effet de la fibstatine et du FGF-2 est comparé à l'effet du FGF-2 seul. L'axe des ordonnées,représente le nombre de cellules ayant migré. Figure 5 shows the effect of fibstatin on endothelial cell cell migration. The effect of fibstatin and FGF-2 is compared to the effect of FGF-2 alone. The y-axis represents the number of cells that have migrated.
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Figure 6A, Figure 6B, Fleure 6C et Figure 6D
Les Figures 6A, B, C et D représentent l'effet de la fibstatine sur la différenciation cellulaire en tubules des cellules endothéliales. Figure 6A, Figure 6B, Figure 6C and Figure 6D
Figures 6A, B, C and D show the effect of fibstatin on cell differentiation into tubules of endothelial cells.
La Figure 6A est une photographie représentant des cellules endothéliales (points noirs)
5 cultivées en MatriGel (Becton et Dickinson, Bedford, MA) en absence de FGF-2 et de fibstatine. Figure 6A is a photograph showing endothelial cells (blackheads)
Grown in MatriGel (Becton and Dickinson, Bedford, MA) in the absence of FGF-2 and fibstatin.
La Figure 6B est une photographie représentant des cellules endothéliales (traits noirs) cultivées en MatriGel en présence de FGF-2 et en absence de fibstatine. Figure 6B is a photograph showing endothelial cells (black lines) cultured in MatriGel in the presence of FGF-2 and in the absence of fibstatin.
La Figure 6C est une photographie représentant des cellules endothéliales (points noirs) 10 cultivées en MatriGel en présence de FGF-2 et de fibstatine. Figure 6C is a photograph showing endothelial cells (blackheads) cultured in MatriGel in the presence of FGF-2 and fibstatin.
La Figure 6D représente la tailles des tubules formés à partir des cellules endothéliales cultivées en absence de FGF-2 et de fibstatine (colonne de gauche), en présence de FGF-2 et en absence de fibstatine (colonne du milieu) et en présence de FGF-2 et de fibstatine (colonne de droite). L'axe des ordonnées représente la taille des tubules (en unités arbitraires). Figure 6D shows the size of tubules formed from endothelial cells cultured in the absence of FGF-2 and fibstatin (left column), in the presence of FGF-2 and in the absence of fibstatin (middle column) and in the presence of FGF-2 and fibstatin (right column). The y-axis represents the size of the tubules (in arbitrary units).
15
Figure 7
La Figure 7 représente l'effet de la fibstatine sur la migration de cellules endothéliales in vivo. 15
Figure 7
Figure 7 shows the effect of fibstatin on endothelial cell migration in vivo.
Le nombre de cellules endothéliales (x 10-4) ayant colonisé 100 mg de MatriGel est représenté en ordonnée, en fonction de l'ajout dans le gel de FGF-2 (colonne noire), de FGF-2 20 et de fibstatine (colonne hachurée) et de FGF-2 et d'endostatine (colonne blanche). The number of endothelial cells (x 10-4) having colonized 100 mg of MatriGel is represented on the ordinate, according to the addition in the gel of FGF-2 (black column), FGF-2 and fibstatin (column hatched) and FGF-2 and endostatin (white column).
Figure 8
La Figure 8 représente le schéma du plasmide pSCT-Fib. Les sites de restriction sont représentés avec leur localisation en kb. Amp représente le gène de résistance à l'ampicilline, 25 CMV représente le promoteur du cytomégalovirus, pT7 représente le promoteur du phage T7,
PS représente la séquence codant le peptide signal du VEGF, HA représente la séquence codant un épitope dérivé de l'hémaglutinine A, Fib His représente la séquence codante de la fibstatine fusionnée avec une étiquette hexahistidine, IVS2-P représente l'intron de la ss- globine de lapin, Ori SV40 représente l'origine de réplication du virus SV40 et ORI 30 représente une origine de réplication bactérienne. Figure 8
Figure 8 shows the scheme of plasmid pSCT-Fib. The restriction sites are represented with their location in kb. Amp represents the ampicillin resistance gene, CMV represents the cytomegalovirus promoter, pT7 represents the T7 phage promoter,
PS represents the sequence encoding the signal peptide of VEGF, HA represents the sequence encoding an epitope derived from hemaglutinin A, Fib His represents the coding sequence of fibstatin fused with a hexahistidine tag, IVS2-P represents the intron of ss rabbit globin Ori SV40 represents the origin of replication of SV40 virus and ORI represents an origin of bacterial replication.
Figure 9A et Figure 9B La Figure 9A représente l'activité ss-galactosidase (en ordonnées, unités arbitraires) exprimée par un plasmide co-injecté dans un muscle de souris avec un plasmide codant pour la 9A represents the β-galactosidase activity (ordinate, arbitrary units) expressed by a plasmid co-injected into a mouse muscle with a plasmid encoding the
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fibstatine (colonne hachurée), l'endostatine (colonne blanche) ou un plasmide témoin (colonne noire). fibstatin (hatched column), endostatin (white column) or a control plasmid (black column).
La Figure 9B représente la concentration sérique en endostatine (en ordonnée, ng/ml) pour une souris témoins (colonne noire) ou ayant reçu une injection de plasmide codant pour 5 l'endostatine (colonne blanche). Figure 9B shows the serum concentration of endostatin (ordinate, ng / ml) for a control (black-column) or endostatin-encoding plasmid (white column) mice.
Figure 10
La Figure 10 représente l'effet de la fibstatine sur la croissance tumorale. La masse de tumeurs de mélanome B16 (en ordonnées, mg) a été mesurée pour des souris ayant reçu une 10 injection de cellules B16 et ayant été traitées par l'injection d'un plasmide témoin (colonne noire), ou d'un plasmide codant pour la fibstatine (colonne hachurée) ou l'endostatine (colonne blanche). Figure 10
Figure 10 shows the effect of fibstatin on tumor growth. The mass of B16 melanoma tumors (ordinate, mg) was measured for mice injected with B16 cells and treated by injection of a control plasmid (black column), or a plasmid. coding for fibstatin (hatched column) or endostatin (white column).
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EXEMPLE 1 Identification de fragments de fibronectine se liant au facteur FGF-2 par la méthode du double hybride
Le système de clonage et d'expression double-hybride a été réalisé comme décrit par
Van den Berghe et al. Brièvement la forme de 18 kDa du facteur FGF-2 a été utilisée comme appât, et l'ADNc correspondant a été inséré dans le vecteur pAS2 (Clontech). Une banque 10 humaine de placenta (Clontech, Palo Alto, CA) clonée dans le vecteur pACT2 (Clontech) a été criblée dans la souche Y190 (Clontech) de Saccharomyces cerevisiae. L'activité B-galactosidase d'extraits obtenus à partir de 10 colonies de levures poussées sur la nuit dans
4 ml de milieu de sélection (DOB-Trp/-Leu) (milieu "Drop Out Base" : sans tryptophane, sans leucine), a été mesurée à l'aide du test Galacto-Light (Tropix Inc. Bedford, MA) dans les 15 conditions décrites par le fabriquant. EXAMPLE 1 Identification of fibronectin fragments binding to factor FGF-2 by the double hybrid method
The cloning and double-hybrid expression system was performed as described by
Van den Berghe et al. Briefly the 18 kDa form of FGF-2 was used as bait, and the corresponding cDNA was inserted into the pAS2 vector (Clontech). A human placenta library (Clontech, Palo Alto, CA) cloned into the pACT2 vector (Clontech) was screened in Saccharomyces cerevisiae strain Y190 (Clontech). The β-galactosidase activity of extracts obtained from 10 colonies of yeasts grown on the night in
4 ml of selection medium (DOB-Trp / -Leu) ("Drop Out Base" medium: without tryptophan, without leucine), was measured using the Galacto-Light test (Tropix Inc. Bedford, MA) in the conditions described by the manufacturer.
Le criblage de la banque de placenta en utilisant comme appât la forme du FGF-2 de
18 kDa (155 a. a.) a permis d'isoler deux clones A et B contenant chacun un ADNc codant pour une protéine susceptible d'interagir avec le FGF-2. Après séquençage et recherche 20 d'homologie dans les banques de données, il a pu être mis en évidence que les deux ADNc isolés étaient identiques à 100 % à une région particulière de l'ADNc codant pour la fibronectine
L'un des fragments clonés, le fragment A, présente une taille .de 1593 paires de bases 25 et code pour un fragment de fibronectine de 531acides aminés tandis que le fragment B de
798 paires de bases code pour un fragment de 266 acides aminés, qui a été nommé fibstatine (Fib). Ces deux clones correspondent à la même région de la fibronectine. Le clone A correspond aux acides aminés 1447 à 1977 de la fibronectine (SEQ ID NO : 2) et le clone B aux acides aminés 1716 à 1981. Screening of the placenta library using as bait the form of FGF-2
18 kDa (155 aa) isolated two A and B clones each containing a cDNA encoding a protein that could interact with FGF-2. After sequencing and homology search in the data banks, it could be demonstrated that the two isolated cDNAs were 100% identical to a particular region of the cDNA encoding fibronectin.
One of the cloned fragments, fragment A, has a size of 1593 base pairs and encodes a fibronectin fragment of 531 amino acids while fragment B of
798 base pairs code for a fragment of 266 amino acids, which was named fibstatin (Fib). These two clones correspond to the same region of fibronectin. Clone A corresponds to amino acids 1447 to 1977 of fibronectin (SEQ ID NO: 2) and clone B to amino acids 1716 to 1981.
30
Afin de définir plus précisément la région responsable de la liaison au FGF-2, divers fragments dérivés du clone B ont été générés par PCR, clonés dans le plasmide pACT2 et testés en double hybride comme décrit ci-dessus. Ces fragments sont les suivants: - un fragment issu d'un clone C correspondant aux résidus 1721 à 1901 de la fibronectine, 30
In order to further define the region responsible for FGF-2 binding, various fragments derived from clone B were generated by PCR, cloned into plasmid pACT2 and tested in double hybrid as described above. These fragments are as follows: a fragment derived from a clone C corresponding to residues 1721 to 1901 of fibronectin,
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- un fragment issu d'un clone D correspondant aux résidus 1813 à 1981 de la fibronectine, - un fragment issu d'un clone E correspondant aux résidus 1813 à 1991 de la fibronectine. a fragment derived from a clone D corresponding to residues 1813 to 1981 of fibronectin; a fragment derived from a clone E corresponding to residues 1813 to 1991 of fibronectin.
Les résultats obtenus sont portés dans le tableau 1 ci-dessous :
Clone testé Interaction avec FGF-2 A +
B +
C
D +
E Tableau 1 : du test en double hybride de l'interaction entre des fragments de fibronectine et le facteur FGF-2
Le sous-fragment D de la fibstatine semble donc être porteur de l'activité de liaison au
FGF-2. The results obtained are shown in Table 1 below:
Clone tested Interaction with FGF-2 A +
B +
VS
D +
E Table 1: Double Hybrid Test of the Interaction Between Fibronectin Fragments and FGF-2 Factor
The subfragment D of fibstatin therefore seems to carry the binding activity of
FGF-2.
10 Par ailleurs, il est envisageable que in vivo le fragment E ait une activité de liaison à
FGF-2 suite à une coupure protéolytique, a contrario il semble également possible que le fragment C puisse s'associer à un autre fragment protéique pour reconstituer un fragment actif. Furthermore, it is conceivable that in vivo the fragment E has a binding activity at
FGF-2 following a proteolytic cleavage, on the other hand it also seems possible that the fragment C can associate with another protein fragment to reconstitute an active fragment.
15 Afin de vérifier la spécificité d'interaction du FGF-2 avec la fibstatine, l'interaction de ce fragment avec d'autres membres de la famille des FGF : le FGF-l, le FGF-3 et le FGF-6, a été testée en double hybride. Pour cela, les ADNc codant pour différents membres de la famille des FGF et la fibstatine ont été fusionnés au domaine de liaison à l'ADN (DB) ou au domaine d'activation (AD) de Gal4 et co-transfectés dans la levure. Les intensités 20 d'interactions évaluées par la mesure de l'activité ss-galactosidase ont révélé que la fibstatine interagissait de manière spécifique avec le FGF-2. In order to verify the interaction specificity of FGF-2 with fibstatin, the interaction of this fragment with other members of the FGF family: FGF-1, FGF-3 and FGF-6, tested in double hybrid. For this, the cDNAs encoding different members of the FGF family and fibstatin were fused to the DNA binding domain (DB) or activation domain (AD) of Gal4 and co-transfected into yeast. The intensities of interactions evaluated by measurement of? -Galactosidase activity revealed that fibstatin specifically interacted with FGF-2.
EXEMPLE 2
Effets anti-angiogénique in vitro de fragments de fibronectine se liant au facteur FGF-2 25
1. Clonage du gène de la Fibstatine
La séquence@codante de la fibstatine a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pACT2 contenant l'ADNc de la fibstatine isolé par le criblage en double-hybride. L'amorce sens était EXAMPLE 2
In vitro anti-angiogenic effects of fibronectin fragments binding to FGF-2 factor 25
1. Cloning of the Fibstatin gene
The coding sequence of fibstatin was amplified by PCR from plasmid pACT2 containing the isolated fibstatin cDNA by double hybrid screening. The meaning primer was
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5'-AAACTCGAGACCATGGGAACCCAGTCCACAGCT-3' (SEQ ID NO : 31) et l'amorce antisense 5'-AAAGGATCCTTACTTCAGGGCAATGACATA-3' (SEQ ID N0:32). La séquence codante de l'endosatine (Endo) a été amplifiée par RT-PCR à partir d'ARN de cellules NIH-3T3. L'amorce sens était 5'-AAACCATGGGAATTCATACTCATCAGGAC
5 TTTCAGCC-3' (SEQ ID N0:33) et l'amorce antisens 5'-GGATCCTTAC
TATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3' (SEQ ID NO : 34). Les séquences codantes de la fibstatine et de l'endostatine ont alors été insérées dans le plasmide pET-15b (Novagen) en phase avec l'étiquette histidine pour la production de protéines recombinantes dans
Escherichia coli, pour donner les plasmides pET-Fib et pET-Endo. Les ADNc de la fibstatine 10 et de l'endostatine ont également été clonés dans les vecteurs d'expression eucaryotes, pUHDlO-3 (Grossen & Bujard, 1992, PNAS (1992) June 15 ; 5547-5551) pour former pUHD-Fib et pUHD-Endo, et pSCT (Prats, 1992, Mol. Cell. Biol. (1992) Octobre ; 12 (10)
4796-4805), pour former pSCT-Fib (Fleure 8) et pSCT-Endo, en phase avec le peptide signal de VEGF-A (Huez et al., 2001, Mol. Endocrinol. (2001) décembre 15 (12) et 15 l'épitope HA (épitope hémagglutinine), utilisables respectivement pour une expression en milieu conditionné et en électrotransfert. Toutes les séquences ont été vérifiées par séquençage à l'aide du kit ABI Prism Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). 5'-AAACTCGAGACCATGGGAACCCAGTCCACAGCT-3 '(SEQ ID NO: 31) and the antisense primer 5'-AAAGGATCCTTACTTCAGGGCAATGACATA-3' (SEQ ID NO: 32). The coding sequence of endosatin (Endo) was amplified by RT-PCR from NIH-3T3 cell RNA. The meaning primer was 5'-AAACCATGGGAATTCATACTCATCAGGAC
TTTCAGCC-3 '(SEQ ID NO: 33) and antisense primer 5'-GGATCCTTAC
TATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3 '(SEQ ID NO: 34). The coding sequences of fibstatin and endostatin were then inserted into the plasmid pET-15b (Novagen) in phase with the histidine tag for the production of recombinant proteins in
Escherichia coli, to give the plasmids pET-Fib and pET-Endo. The fibstatin and endostatin cDNAs were also cloned into eukaryotic expression vectors, pUHD10 -3 (Grossen & Bujard, 1992, PNAS (1992) June 15: 5547-5551) to form pUHD-Fib and pUHD-Endo, and pSCT (Prats, 1992, Mol Cell Biol (1992) Oct; 12 (10)
4796-4805), to form pSCT-Fib (Fleure 8) and pSCT-Endo, in phase with the VEGF-A signal peptide (Huez et al., 2001, Mol. Endocrinol. (2001) December 15 (12) and The HA epitope (hemagglutinin epitope), usable respectively for conditioned medium expression and electrotransfer, were sequenced using the ABI Prism Dye Terminator kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).
2. Production de la fibstatine 20 a. Production en milieu conditionné
Des cellules HeLa HT (Cayrol, Journal of Virology, July 1995; 69 (7) 4206-4212) ensemencées à 1,2 x 106 par boîte de diamètre 100 mm ont été transfectées au Fugene (Roche,
Allemagne) le lendemain, par 17 g de plasmide pUHD-Fib, pUHD-Endo ou pUHDlO-3. 24h après la transfection, les cellules ont été incubées dans 6 ml de milieu DMEM (Dulbecco 25 Modified Eagle Medium)(Invitrogen) + 1 % SVF (Sérum de Veau F#tal). Le milieu conditionné a été récupéré 24h après, centrifugé 5 min à 1700 tpm, filtré (sur filtre de 45 m) et congelé à - 80 C. b. Production par Escherichia coli 30 Des bactéries E. coli BL21 ont été transformées avec les plasmides pET-Fib, pET-Endo ou un plasmide contrôle permettant l'expression de la GST (Glutathion S Transférase) fusionnée aux 6 histidines. 100 ml de culture bactérienne sur la nuit a ensuite été diluée dans un litre de milieu LB (Luria-Bertani). L'expression des protéines a été induite à une DO600 nm de 0,6-0,8 par addition d'IPTG (isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside) à la concentration de 0,5 mM. 2. Production of fibstatin 20 a. Production in conditioned medium
HeLa HT cells (Cayrol, Journal of Virology, July 1995; 69 (7) 4206-4212) seeded at 1.2 x 10 6 per 100 mm diameter dish were transfected with Fugene (Roche,
Germany) the next day with 17 g of plasmid pUHD-Fib, pUHD-Endo or pUHD10-3. 24 hours after transfection, the cells were incubated in 6 ml of Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen) + 1% FCS (Fetal Calf Serum). The conditioned medium was recovered 24h after, centrifuged for 5 min at 1700 rpm, filtered (on a 45 m filter) and frozen at -80 C. Production by Escherichia coli E. coli BL21 bacteria were transformed with the plasmids pET-Fib, pET-Endo or a control plasmid permitting the expression of GST (glutathione S transferase) fused to the 6 histidines. 100 ml of overnight bacterial culture was then diluted in one liter of LB medium (Luria-Bertani). Protein expression was induced at an OD 600 nm of 0.6-0.8 by addition of IPTG (isopropyl-pD-thiogalactopyranoside) at the concentration of 0.5 mM.
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Après 4h d'expression à 37 C, les bactéries ont été récupérées par centrifugation 10 min à
5000 tpm. Le culot bactérien a alors été lysé par resuspension dans 30 ml de tampon A (Tris
20 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, chlorure de guanidinium 6 M, octyglucoside 4 mM, imidazole 10 mM). La suspension de bactéries a été soniquée puis centrifugée à 13000 tpm durant 30 min. After 4 hours of expression at 37 ° C., the bacteria were recovered by centrifugation for 10 minutes at
5000 rpm. The bacterial pellet was then lysed by resuspension in 30 ml of buffer A (Tris
20 mM pH 7.4, 0.5 M NaCl, 6 M Guanidinium Chloride, 4 mM Octyglucoside, 10 mM Imidazole). The bacterial suspension was sonicated and then centrifuged at 13000 rpm for 30 min.
5 Le surnageant obtenu a été incubé avec 0,75 ml de billes de nickel-agarose préalablement équilibrées dans le tampon A. Après 2 h d'incubation sur une roue à 4 C, les billes ont été lavées successivement par 50 ml de Tampon B (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 2 M, urée 6 M, imidazole 20 mM) puis par 100 ml de Tampon C (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, imidazole 20 mM). Après le dernier lavage, les billes ont été déposées sur une colonne de 10 chromatographie Polyprep (Biorad) et éluées avec des fractions de 500 l de Tampon C contenant 200 mM d'imidazole. La présence de protéine a été vérifiée par dosage de Bradford (BioRad 500-0114, Californie) et SDS-PAGE suivi d'une coloration au bleu de Coomassie. c. Production en cellules d'insecte 15 Les ADNc codant pour la fibstatine et l'endostatine fusionnées avec 6 histidines ont été clonés dans un vecteur permettant leur expression et leur sécrétion par le système
Baculovirus. Les protéines sécrétées dans le milieu de culture des cellules d'insecte, dépourvu de sérum, ont été purifiées par précipitations successives au sulfate d'ammonium (20,50 puis
80 %). La majorité des protéines recombinantes se trouvant dans la fraction 50 %, celle-ci a 20 été dialysée dans du PBS à 4 C et les protéines ont été purifiées sur colonne de nickel agarose. Après plusieurs lavages au PBS + 20 mM imidazole, les protéines ont été éluées par du PBS + 200 mM imidazole. La présence de protéine est vérifiée par dosage de Bradford et
SDS-PAGE suivi d'une coloration au bleu de Coomassie. The supernatant obtained was incubated with 0.75 ml of pre-equilibrated nickel-agarose beads in buffer A. After 2 hours of incubation on a 4 C wheel, the beads were washed successively with 50 ml of Buffer B. (20 mM Tris pH 7.4, 2 M NaCl, 6 M urea, 20 mM imidazole) followed by 100 ml of Buffer C (20 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, 20 mM imidazole). After the last wash, the beads were spotted on a Polyprep (Biorad) chromatography column and eluted with 500 l Buffer C fractions containing 200 mM imidazole. The presence of protein was verified by Bradford assay (BioRad 500-0114, California) and SDS-PAGE followed by staining with Coomassie blue. vs. Production in insect cells The cDNAs coding for fibstatin and endostatin fused with 6 histidines were cloned into a vector allowing their expression and secretion by the system.
Baculovirus. Proteins secreted in the insect cell culture medium, devoid of serum, were purified by successive precipitations with ammonium sulphate (20, 50
80%). The majority of the recombinant proteins in the 50% fraction were dialyzed in 4 C PBS and the proteins were purified on a nickel agarose column. After several washes with PBS + 20 mM imidazole, the proteins were eluted with PBS + 200 mM imidazole. The presence of protein is verified by Bradford assay and
SDS-PAGE followed by staining with Coomassie blue.
25 3. Interaction de la fibstatine avec le facteur FGF-2
Une plaque de 96 puits a été tapissée sur la nuit à 4 C par du FGF-2 ou de la SAB (Sérum
Albumine Bovine) à 10 g/ml. La plaque a été rincée avec du PBS-tween 0,2% et 100 l de solution de blocage ont été ajoutés par puits pendant 1 h à 37 C. La solution de blocage a été évacuée et la plaque rincée. Des concentrations variables de fibstatine avec une étiquette 30 histidine ont été ajoutées pendant 2 h à 37 C. Après trois rinçages, des anticorps dirigés contre l'étiquette histidine conjugués à de la peroxydase de raifort (1/1000) ont été ajoutés pendant 1 h à 37 C. Trois rinçages ont alors été effectués et les complexes ont été révélés à l'aide de 100 l par puits de o-phénylènediamine (4 mg/ml) contenant 0,03% (v/v) de 3. Interaction of fibstatin with factor FGF-2
A 96-well plate was lined on the night at 4 C with FGF-2 or BSA (Serum
Bovine Albumin) at 10 g / ml. The plate was rinsed with 0.2% PBS-tween and 100 l of blocking solution was added per well for 1 h at 37 C. The blocking solution was removed and the plate rinsed. Variable concentrations of fibstatin with a histidine tag were added for 2 hours at 37 C. After 3 rinses, horseradish peroxidase-conjugated antibodies to the histidine tag (1/1000) were added for 1 hour. at 37 C. Three rinses were then carried out and the complexes were revealed using 100 l per well of o-phenylenediamine (4 mg / ml) containing 0.03% (v / v) of
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peroxyde d'hydrogène dans 0,1 M de tampon citrate, pH 5,0. Après 20 minutes, les réactions ont été arrêtées avec 50 l de H2S04 2 M et l'absorbance a été mesurée à 490 nm. hydrogen peroxide in 0.1 M citrate buffer, pH 5.0. After 20 minutes, the reactions were stopped with 50 l of 2 M H 2 SO 4 and the absorbance measured at 490 nm.
Les résultats obtenus après soustraction du signal non spécifique (interaction Fib/BSA) révèlent que la fibstatine est capable d'interagir de manière directe et dose dépendante avec le FGF-2 (Figure 1). 4. Effets de la fibstatine sur les cellules endothéliales a. Culture des cellules 10 Les cellules ont été cultivées dans du DMEM supplémenté en glutamine (1 %), amphotéricine
B (1 %), gentamicine (0,5 %) et par 10 % SVF ou 10 % SV (Sérum de Veau nouveau né) pour les cellules HeLa (numéro ATCC : CCL2) et ABAE respectivement (Couderc, 1991,
Cell. Regul., vol 2, pages 709-718). Les cellules ABAE ont par ailleurs été cultivées en présence de 1 ng/ml de FGF-2. Les cellules B16 (ATCC CRL6475) ont été cultivées en RPMI 15 (Roswell Park Memorial Institute) supplémenté en glutamine (1 %), amphotéricine B (1 %), gentamicine (0,5 %) et en 10 % SV. Les cellules ont été cultivées dans des étuves à 5 % CO2 pour les cellules HeLa et B 16 et 10 % CO2 pour les ABAE. b. Inhibition de la prolifération 20 Pour le test de prolifération, les cellules ABAE ont été ensemencées à 5 x 104 cellules/ml de milieu. Le lendemain le milieu a été changé et les cellules ont été incubées en présence de milieu conditionné préparé selon le paragraphe 2a et dilué au 1/4 ou au 1/2 en présence de 0,5 ng/ml de FGF-2.72h après, les cellules ont été trypsinées et comptées. The results obtained after subtraction of the non-specific signal (Fib / BSA interaction) reveal that fibstatin is able to interact directly and dose-dependent with FGF-2 (FIG. 1). 4. Effects of fibstatin on endothelial cells a. Cells Culture The cells were cultured in DMEM supplemented with glutamine (1%), amphotericin
B (1%), gentamicin (0.5%) and by 10% FCS or 10% SV (Newborn Calf Serum) for HeLa cells (ATCC number: CCL2) and ABAE respectively (Couderc, 1991,
Cell. Regul., Vol 2, pp. 709-718). ABAE cells were further cultured in the presence of 1 ng / ml of FGF-2. B16 cells (ATCC CRL6475) were cultured in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) supplemented with glutamine (1%), amphotericin B (1%), gentamicin (0.5%) and 10% SV. The cells were cultured in 5% CO2 incubators for HeLa and B 16 cells and 10% CO2 for ABAE. b. Inhibition of Proliferation For the proliferation assay, ABAE cells were seeded at 5x104 cells / ml medium. The next day the medium was changed and the cells were incubated in the presence of conditioned medium prepared according to paragraph 2a and diluted to 1/4 or 1/2 in the presence of 0.5 ng / ml of FGF-2.72h after, the cells were trypsinized and counted.
Les résultats obtenus représentés Figure 2 montrent que la présence de Fib dans le milieu 25 inhibe la prolifération des ABAE de manière comparable à celle de l'endostatine. The results obtained shown in FIG. 2 show that the presence of Fib in the medium inhibits the proliferation of ABAE in a manner comparable to that of endostatin.
Des expériences similaires ont été réalisées avec de la fibstatine recombinante préparée chez
E. coli. Similar experiments were carried out with recombinant fibstatin prepared in
E. coli.
Les résultats obtenus après comptage des cellules et représentés Figure 3 confirment l'effet inhibiteur et dose-dépendant de la fibstatine sur la prolifération des ABAE stimulées par FGF- 30 2. En effet, à 1 ug/ml Fib inhibe à 50% la prolifération des cellules induite par FGF-2. De plus, dans nos conditions expérimentales, l'effet de la fibstatine paraît supérieur à celui de l'endostatine. The results obtained after counting of the cells and represented in FIG. 3 confirm the inhibitory and dose-dependent effect of fibstatin on the proliferation of ABAE stimulated by FGF-2. In fact, at 1 μg / ml Fib inhibits proliferation by 50%. cells induced by FGF-2. Moreover, in our experimental conditions, the effect of fibstatin appears to be greater than that of endostatin.
Les fragments anti-angiogéniques décrits jusqu'à présent inhibent de manière spécifique la prolifération des cellules endothéliales. Afin de vérifier si Fib présente cette The anti-angiogenic fragments described so far specifically inhibit the proliferation of endothelial cells. In order to check if Fib presents this
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même caractéristique, l'effet de Fib a été testé sur la prolifération de fibroblastes NIH-3T3 et sur celle de cellules de mélanome B16. Les résultats présentés Figure 4 révèlent que la fibstatine ne provoque aucune inhibition de la prolifération de ces cellules, suggérant que l'effet anti-prolifératif de Fib est spécifique des cellules endothéliales. same characteristic, the effect of Fib was tested on the proliferation of NIH-3T3 fibroblasts and that of B16 melanoma cells. The results presented in FIG. 4 reveal that fibstatin does not cause any inhibition of the proliferation of these cells, suggesting that the anti-proliferative effect of Fib is specific for endothelial cells.
5 c. Inhibition de la migration
3 x 105 cellules ABAE ont été ensemencées dans des boîtes de diamètre 35 mm dans leur milieu de culture supplémenté en FGF-2 (1 ng/ml). Après 48h, les cellules ont été cultivées en absence de sérum durant 24h. Une "blessure" a ensuite été réalisée sur le tapis cellulaire à 10 l'aide d'un cône, les cellules ont été lavées et incubées dans du milieu sans sérum supplémenté en FGF-2 (5 ng/ml) en présence ou non de 1 g/ml de Fib ou d'endostatine. Les cellules ayant migré sur la "blessure" ont été comptabilisées 14 h plus tard. 5 c. Inhibition of migration
3 x 10 5 ABAE cells were seeded in 35 mm diameter dishes in their FGF-2 supplemented culture medium (1 ng / ml). After 48h, the cells were cultured in the absence of serum for 24 hours. "Injury" was then performed on the cell mat with a cone, the cells were washed and incubated in serum-free medium supplemented with FGF-2 (5 ng / ml) in the presence or absence of 1 g / ml Fib or endostatin. The cells that migrated to the "injury" were counted 14 hours later.
Les résultats présentés Figure 5 montrent que la fibstatine inhibe fortement l'effet activateur du FGF-2 sur la migration des ABAE. The results presented in FIG. 5 show that fibstatin strongly inhibits the activating effect of FGF-2 on the migration of ABAE.
15 d. Inhibition de la différenciation
La fibstatine a été testée dans un modèle d'angiogenèse in vitro permettant d'évaluer le niveau de tubulogénèse de cellules endothéliales. 15 d. Inhibition of differentiation
Fibrestatin was tested in an in vitro angiogenesis model to evaluate the endothelial cell tubulogenesis level.
Des plaques de 24 puits ont été tapissées avec 300 l de MatriGel par puits (mélange 20 de protéines issues de membranes basales de sarcomes murins à teneur réduite en facteurs de croissance, liquide à 4 C et solide à 37 C (Becton et Dickinson, Bedford, MA)), et laissées à polymériser pendant 1 h à 37 C. Des cellules ABAE (2 x 105 cellules/ml) en suspension dans
500 l de milieu de culture ont été ajoutées dans chaque puits. Du FGF-2 (0,5 ng/ml) avec ou sans fibstatine (1 g/ml) a été ajouté aux puits et les plaques ont été incubées sur la nuit à 25 37 C. Après le retrait du milieu, la culture a été fixée et la longueur du réseau de tubules a été mesurée à l'aide du système Q Win de Leica (Leica microsystem, Rueil-Malmaison, France). 24-well plates were lined with 300 l of MatriGel per well (protein mixture derived from baseline murine sarcoma membranes reduced in growth factors, liquid at 4 C and solid at 37 ° C (Becton and Dickinson, Bedford). , MA)), and allowed to polymerize for 1 h at 37 C. ABAE cells (2 x 10 5 cells / ml) suspended in
500 l of culture medium were added to each well. FGF-2 (0.5 ng / ml) with or without fibstatin (1 g / ml) was added to the wells and the plates were incubated overnight at 25 ° C. After removal of the medium, the culture was was fixed and the length of the tubule network was measured using Leica's Q Win system (Leica microsystem, Rueil-Malmaison, France).
Les résultats présentés Figures 6A, B, C et D révèlent que l'addition de 1 g de Fib inhibe la formation des tubules. L'absence de toxicité dans ces conditions a été vérifiée par mesure de LDH (Lactate déhydrogénase) libérée dans le milieu de culture à l'aide du Kit 30 CytoTox 96 (Promega). The results shown in FIGS. 6A, B, C and D reveal that the addition of 1 g of Fib inhibits tubule formation. The absence of toxicity under these conditions was verified by measuring LDH (Lactate dehydrogenase) released into the culture medium using the CytoTox 96 Kit (Promega).
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EXEMPLE 3 Effets anti-angiogénique et anti-tumoral in vivo de fragments de fibronectine se liant au facteur FGF-2 1. Animaux utilisés Des souris C57B1/6 âgées de 6 à 10 semaines ont été maintenues dans des cages en acier inoxydable en groupe de 5, à température contrôlée avec des cycles jour-nuit de 12 heures, et nourries avec de la nourriture de laboratoire standard. Toutes les procédures ont été réalisées selon les recommandations de l'European Accreditation of Laboratory Animal Care. EXAMPLE 3 Anti-angiogenic and anti-tumor effects in vivo of fibronectin fragments binding to factor FGF-2 1. Animals used C57B1 / 6 mice aged 6 to 10 weeks were maintained in stainless steel cages in groups of 5, at controlled temperature with 12-hour day-night cycles, and fed standard laboratory food. All procedures were performed according to the recommendations of the European Accreditation of Laboratory Animal Care.
2. Inhibition de l'angiogenèse in vivo
300 l de MatriGelTM supplémentés avec 100 ng de FGF-2 en présence ou non de 10 g de fibstatine ou d'endostatine (préparés dans des cellules d'insectes), ont été injectés en sous- cutané à des souris femelles C57B1/6. 1 semaine après, les implants de MatriGel ont été 15 récupérés, dissous par du MatriSperse (Beckton et Dickinson) et les cellules endothéliales comptées à la cellule de Malassez. 2. Inhibition of angiogenesis in vivo
300 l of MatriGelTM supplemented with 100 ng of FGF-2 in the presence or absence of 10 g of fibstatin or endostatin (prepared in insect cells), were injected subcutaneously into female C57B1 / 6 mice. 1 week later, the MatriGel implants were recovered, dissolved by MatriSperse (Beckton and Dickinson) and counted endothelial cells at Malassez cell.
Comme le montre la Figure 7, la fibstatine inhibe à 50 % l'angiogenèse induite par FGF-2, cet effet est supérieur à celui induit par l'endostatine. As shown in Figure 7, fibstatin inhibits FGF-2 induced angiogenesis by 50%, which is greater than that induced by endostatin.
20 3. Inhibition de la croissance tumorale in vivo
Afin d'évaluer l'effet anti-tumoral de la fibstatine, le plasmide l'exprimant a été électrotransféré in vivo à des souris porteuses de mélanomes B16. 3. Inhibition of tumor growth in vivo
In order to evaluate the anti-tumor effect of fibstatin, the plasmid expressing it was electrotransferred in vivo to mice bearing B16 melanomas.
Des souris femelles C57B1/6 anesthésiées par injection intra-péritonéale de kétamine (150 mg/kg) ont reçu une injection sous cutanée de 106 cellules tumorales B16 dans 100 l de PBS 25 (temps d'incubation : environ 10 minutes avant injection des plasmides). 50 g de plasmide (5 g de plasmide LacZ + 45 g de pSCT Fib (Figure 8\ pSCT Endo ou pSCT) préparés à l'aide du kit Maxiprep Endofree (Qiagen, France) et dilués dans 50 l de PBS ont été injectés dans le quadriceps des souris avec une seringue 26G 0,45x10. Les plasmides injectés ont alors été immédiatement électrotransférés par deux électrodes de 10 mm de diamètre, séparées de 4 30 mm, en contact avec la peau à l'aide d'un appareil ElectroSquare Porator ECM830 (BTX,
Genetronics, San Diego, CA) par 8 impulsions de 20 ms à 80V. L'efficacité de l'électroporation a été favorisée par l'utilisation d'un gel à ultrason appliqué sur la patte. Female C57B1 / 6 mice anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (150 mg / kg) were subcutaneously injected with 106 B16 tumor cells in 100 l of PBS (incubation time: approximately 10 minutes before plasmid injection). ). 50 g of plasmid (5 g of LacZ plasmid + 45 g of pSCT Fib (FIG. 8, pSCT Endo or pSCT) prepared using the Maxiprep Endofree kit (Qiagen, France) and diluted in 50 μl of PBS were injected into the quadriceps of the mice with a 0.45 × 10 26G syringe The injected plasmids were then immediately electrotransferred by two electrodes 10 mm in diameter, separated by 4 mm, in contact with the skin using an ElectroSquare Porator device. ECM830 (BTX,
Genetronics, San Diego, CA) by 8 pulses of 20 ms at 80V. The effectiveness of electroporation was promoted by the use of an ultrasound gel applied to the paw.
L'injection suivie de l'électrotransfert des plasmides a été recommencée 5 jours plus tard. 10 jours après la première injection, les tumeurs et les muscles électrotransférés ont été récupérés The injection followed by the electrotransfer of the plasmids was resumed 5 days later. 10 days after the first injection, electrotransfected tumors and muscles were recovered
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et pesés. Les muscles ont ensuite été lysés dans 350 l de tampon de lyse P-Gal (Tropix) et homogénéisés à l'aide d'un ultra-turax (Polylabo). La suspension a été centrifugée à 13000 tpm durant 10 min. Le dosage de l'activité ss-galactosidase a alors été réalisé sur 20 l de surnageant à l'aide du kit Galacto LightTM (Tropix). Le sérum des souris a également été
5 récupéré à l'aide de tubes Capiject (Terumo) contenant un gel de silice facilitant la récupération du sérum. L'endostatine circulante a été dosée à l'aide du kit ELISA Mouse
Endostatine Accucyte (Cytimmune). and weighed. The muscles were then lysed in 350 l of P-Gal lysis buffer (Tropix) and homogenized using an ultra-turax (Polylabo). The suspension was centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes. The assay of the β-galactosidase activity was then carried out on 20 l of supernatant using the Galacto LightTM kit (Tropix). The serum of the mice has also been
5 recovered using Capiject tubes (Terumo) containing a silica gel facilitating the recovery of serum. Circulating endostatin was assayed using the Mouse ELISA kit
Endostatin Accucyte (Cytimmune).
Les résultats présentés Figure 9A confirment que les plasmides codant pour LacZ, co-injectés avec pSCT-Fib, pSCT-Endo ou pSCT, ont bien été injectés dans le muscle et étaient 10 correctement exprimés. Les résultats obtenus pour l'endostatine circulante dans le sérum des souris électrotransférées avec pSCT-Endo confirment que la protéine est bien exprimée et sécrétée, atteignant une concentration moyenne de 15 ng/ml dans le sérum des souris (Figure
9B). The results presented in FIG. 9A confirm that the plasmids coding for LacZ, co-injected with pSCT-Fib, pSCT-Endo or pSCT, were well injected into the muscle and were correctly expressed. The results obtained for the circulating endostatin in the serum of the mice electrotransfers with pSCT-Endo confirm that the protein is well expressed and secreted, reaching an average concentration of 15 ng / ml in the serum of the mice (FIG.
9B).
L'analyse des tumeurs a permis de montrer que les souris ayant reçu une injection du 15 plasmide pSCT-Fib présentent une masse tumorale diminuée de moitié par rapport aux souris injectées avec le plasmide contrôle. Les souris ayant reçu une injection du plasmide pSCT-
Endo présentent également une diminution de leur masse tumorale mais statistiquement non significative (Figure 10). Les résultats ont été obtenus en utilisant 14 souris par groupe. Tumor analysis made it possible to show that the mice injected with the plasmid pSCT-Fib had a tumor mass halved compared to the mice injected with the control plasmid. Mice injected with the plasmid pSCT-
Endo also shows a decrease in their tumor mass but statistically insignificant (Figure 10). The results were obtained using 14 mice per group.
20 Par ailleurs ces résultats ont été complétés par une expérience similaire réalisée avec un plasmide pSCT-D exprimant le fragment D de l'Exemple I, correspondant aux résidus 1813 à
1981 de la fibronectine. Les résultats obtenus indiquent que l'injection intramusculaire de ce plasmide, suivie d'un électrotransfert, induisent également une diminution de la masse tumorale par rapport à des souris n'ayant reçu que le plasmide pSCT.Moreover, these results were supplemented by a similar experiment carried out with a plasmid pSCT-D expressing fragment D of Example I, corresponding to residues 1813 to
1981 of fibronectin. The results obtained indicate that the intramuscular injection of this plasmid, followed by electrotransfer, also induces a decrease in the tumor mass compared to mice receiving only the plasmid pSCT.
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