FR2857364A1 - Dosage des acides techoiques des bacteries gram+ - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet une méthode de dosage des acides téchoïques présents le plus souvent sous forme résiduelle, dans une préparation d'antigène de bactéries Gram+.Cette méthode requiert tout d'abord une hydrolyse ménagée par l'acide fluorhydrique à une température inférieure ou égale à 40°C afin de libérer les oligosaccharides spécifiques des acides téchoïques. Le dosage des oligosaccharides spécifiques peut alors être mis en oeuvre par diverses techniques, notamment par chromatographie haute performance couplée à une détection ampérométrique en champs pulsés (HPAEC-PAD).La méthode selon l'invention peut être notamment mise à profit pour doser les quantités résiduelles des acides téchoïques présents dans des préparations contenant des polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae, pouvant être utiles en tant que vaccins.

Description

L'invention a pour objet un procédé de dosage des acides téchoïques,

notamment dans des préparations d'antigènes de bactéries Gram +.

Les acides téchoïques sont des polysaccharides, notamment connus pour être des constituants du complexe constitué de la membrane et de la paroi des bactéries Gram+. Il existe une grande variété d'acides téchoïques, la plupart spécifiques d'espèce.

Comme tous les polysaccharides, les acides téchoïques sont constitués d'un enchaînement d'unités répétitives. Ces unités répétitives sont ellesmêmes constituées (i) d'un enchaînement d'au moins deux sucres différents, substitués ou non, et (ii) d'un groupement phosphate lié à l'un des sucres. Ce groupement phosphate est impliqué dans les liaisons assurant la constitution de l'enchaînement. En outre, le polysaccharide peut être conjugué par liaison covalente, e.g. de type phosphodiester, à d'autres structures chimiques telles qu'une protéine, un lipide, une lipoprotéine ou un glycolipide. Les acides téchoïques sont en étroit contact avec le peptidoglycane de la paroi. Des liaisons covalentes renforcent ce lien. Parmi les acides téchoïques, on distingue les acides lipotéchoïques qui, en raison de leur queue lipidique, peuvent s'ancrer dans la membrane externe par liaisons hydrophobes.

La structure des acides téchoïques peut être très différente selon les espèces bactériennes. Un grand nombre d'entre eux ont une structure simple; mais certains possèdent une structure beaucoup plus complexe. Ainsi, le complexe constitué de la membrane et de la paroi de Streptococcus pneumoniae contient au moins deux acides téchoïques ubiquitaires de structure complexe. Il s'agit du polysaccharide C et de l'acide lipotéchoïque (encore dénommé antigène de Forssmann).

Le polysaccharide C est constitué d'un enchaînement d'unités répétitives, chacune formée de quatre résidus monosaccharidiques, un résidu de glucopyrannose (Glcp), un résidu de 2 acétamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D galactose (AAT) et deux résidus de N-acétyl galactopyrannose (GalpNAc), suivis d'un résidu de ribitol-5-phosphate (ribitol-5-P). Au moins un des deux résidus de GalpNAc est substitué par de la phosphocholine (P-Cho) La formule développée de cette unité répétitive est la suivante: [6)3-D-Glcp-(143)-a-AATp-(144)-a-D-GaIpNAc-(143)-[3-D-GaIpNAc-(141)-oRibitol-5-P-(O4] 6 6 1 1 O)-P-Cho O)-P-Cho C Karlsson et coll., Eur. J. Biochem. (1999) 265: 1091 ont montré que l'unité répétitive pouvait exister sous deux formes: (i) une forme bi-substituée avec deux résidus phosphocholine, comme représentée ci dessus; et (ii) une forme monosubstituée avec un seul résidu de phosphocholine. Par conséquent, la chaîne du polysaccharide C contient en proportion variable des unités répétitives monosubstituées et bi-substituées. Ces proportions varient notamment en fonction des conditions de culture et du sérotype du pneumocoque.

L'acide lipotéchoïque, quant à lui, possède la structure primaire du polysaccaride C associée à un glycolipide, de formule (3-D-Glcp(1-4)-13-DAAT (1-3)- a-D-Glcp(1-3)acyl2Gro, dans laquelle Glcp désigne un résidu de glucopyrannose, AAT désigne un résidu de 2 acétamido-4-amino-2,4,6trideoxy-D-galactose, acyl désigne un résidu d'acide gras et Gro un résidu de glycérol. Ce glycolipide est lié par liaison phosphodiester au ribitol terminal de la chaîne.

Certaines bactéries Gram+, telles Streptococcus pneumoniae, possèdent une capsule et/ou sont responsables de graves infections. A l'encontre d'une telle bactérie, il existe des vaccins constitués par des polysaccharides de capsule sous forme purifiée. Les procédés utilisés pour purifier les polysaccharides capsulaires éliminent autant que possible les polysaccharides de la paroi (acides téchoïques). En effet, bien que très immunogènes, les acides téchoïques sont faiblement protecteurs et leur présence dans un vaccin augmente inutilement la charge antigénique.

Selon les exigences des autorités de santé, le contenu d'un vaccin de haute qualité doit être caractérisé avec précision. Il faut pouvoir doser non seulement l'antigène vaccinal mais aussi tous les contaminants éventuels, au rang desquels se trouvent les acides téchoïques, notamment pour ce qui concerne les vaccins à base de polysaccharides capsulaires. Le dosage des contaminants est d'autant plus difficile et délicat qu'il porte sur de très petites quantités. Les méthodes de dosage doivent donc être sensibles, performantes et spécifiques.

Cette dernière exigence de spécificité est particulièrement difficile à respecter. En effet, il existe de fortes analogies de structure entre les acides téchoïques et les polysaccharides de capsule. Par exemple, pour ce qui concerne Streptococcus pneumoniae, l'unité répétitive du polysaccharide C contient un groupement phosphate tout comme celle des polysaccharides capsulaires des sérotypes 6B, 10A, 11A, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 23F. Le groupement phosphate de l'unité répétitive du polysaccharide C intervient directement dans l'enchaînement des unités répétitives par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester, tout comme ceux des polysaccharides capsulaires de sérotype 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20. Les polysaccharides capsulaires des sérotypes 6B et 10A sont ceux qui présentent la plus forte analogie avec les acides téchoïques du pneumocoque dans la mesure où ils possèdent un ribitol phosphate impliqué dans l'enchaînement des unités répétitives.

Jones C. et coll. ont décrit dans Biologicals (1991) 19: 41 une méthode de dosage du polysaccharide C par résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette méthode évalue la résonance du radical N-méthyl des groupements phosphocholine du polysaccharide C. Cette technique n'est pas précise car, comme indiqué plus haut, la proportion des groupements phosphocholine n' est pas constante.

Talaga P. et coll. proposent dans Vaccine (2001) 19: 2987 une méthode de dosage basée sur la quantification du ribitol libéré lors de l'hydrolyse du polysaccharide C à la suite de deux traitements successifs: le premier avec l'acide fluorhydrique (HF) à 48 % pendant 2 heures à 65 C, le deuxième avec l'acide trifluoroacétique 2N pendant 2 heures à 120 C. Ce double traitement entraîne la rupture des liaisons osidiques. L'hydrolysat contient essentiellement des monosaccharides. Le ribitol est ensuite séparé des autres constituants par chromatographie haute performance échangeuse d'anions (HPAEC) sur une colonne de chromatographie analytique CarboPacTM MAl en utilisant pour l'élution, une solution de soude isocratique 480 mM. Le ribitol est ensuite quantifié par un système de détection ampérométrique en champs pulsés (PAD). Même si cette technique de dosage du ribitol permet une évaluation juste et sensible de la quantité de polysaccharide C, elle est incompatible avec la présence dans le milieu, d'un polysaccharide capsulaire qui contient du ribitol.

Or, certains polysaccharides capsulaires d'intérêt vaccinal contiennent du ribitol.

Comme on vient de le voir, il s'agit par exemple des polysaccharides de capsule des sérotypes 6B et 10A de Streptococcus pneumoniae. La technique de Talaga et coll. ne convient donc pas pour effectuer le dosage du polysaccharide C e.g. dans les vaccins pneumocoque du commerce.

En bref, les méthodes de dosage des acides téchoïques connues à ce jour présentent des inconvénients. Il n'existe pas encore de méthode qui soit précise, sensible, fiable et applicable à toute préparation d'antigène bactérien.

La présente invention pallie ce manque en proposant une nouvelle méthode de dosage des acides téchoïques, qui recherche les oligosaccharides spécifiques des acides téchoïques libérés par rupture des liaisons phosphodiester, au cours du traitement par l'acide fluorhydrique (HF), selon la méthode de Jennings & Lugowski, Can. J. Chem. (1980) 58: 2610. Lorsque l'unité répétitive renferme une molécule de (3-D GalpNac ou une molécule de (3-D GlcpNac, il peut également se produire une rupture secondaire.

Autrement dit, selon la structure de l'acide téchoïque, l'oligosaccharide spécifique sera substantiellement identique à l'unité répétitive ou bien s'en distinguera.

Ainsi, dans le cas du polysaccharide C, l'oligosaccharide spécifique a pour formule: R-D-GIcp-(143)-a-AATp-(144)-a-D-GaIpNAc (143) -R-D-GaIpNAc Après hydrolyse, restent alors des oligosaccharides spécifiques qui sont par la suite séparés les uns des autres et dosés.

Par ailleurs, on indique par souci d'exhaustivité, que cette définition s'applique mutatis mutandis aux oligosaccharides spécifiques des polysaccharides capsulaires possédant des unités répétitives incorporant des groupements phosphate impliqués dans la chaîne, tels les polysaccharides des sérotypes 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20 du pneumocoque.

Ainsi la présente invention a pour objet une méthode de dosage des acides téchoïques dans une préparation d'antigène de bactérie Gram+, selon laquelle: (i) on traite la préparation par l'acide fluorhydrique (HF) à une température inférieure ou égale à 40 C, afin de libérer les oligosaccharides spécifiques des acides téchoïques présent dans la préparation; et (ii) on dose les oligosaccharides spécifiques obtenus en (i).

Le traitement par l'acide fluorhydrique (HF) est avantageusement mis en oeuvre à une température allant de -70 C à 40 C, de préférence allant de 0 C à 20 C, de façon encore plus préférée ente 4 C et 10 C. D'une manière générale, plus la température augmente, plus la sélectivité d'action de l'acide fluorhydrique sur les liaisons phosphodiesters diminue. C'est pourquoi, il est important de ne pas dépasser 40 C.

De manière typique, on utilise l'acide fluorhydrique à une concentration finale comprise entre 10 et 73 % (poids / poids), bornes incluses; de préférence entre 40 et 60 % ; de manière tout à fait préférée entre 45 et 50 % ; e.g. à une concentration de 48 %.

La durée du traitement à l'acide fluorhydrique n'est pas critique. Elle est inversement proportionnelle à la température. L'homme du métier est à même d'adapter cette durée en fonction de la température choisie et de la concentration à laquelle est utilisé l'acide fluorhydrique. Toutefois, on indique que plus la température est élevée, plus la durée du traitement doit être courte pour assurer autant que possible l'intégrité des liaisons osidiques. D'une manière générale, il est préférable que le traitement n'excède pas 96 heures. Lorsque la température est comprise entre 20 et 40 C, on préconise une durée de traitement n'excèdant pas 1 heure; entre 0 et 10 C, n'excédant pas 2 heures. A l'inverse lorsque la température est inférieure à 0 C, la durée du traitement peut dépasser 24 heures.

De bons résultats sont obtenus lorsque l'on utilise l'HF à une concentration de 48 %, à 4 C pendant 48 heures. Dans ces conditions, les taux de recouvrement en oligosaccharide spécifique peuvent atteindre 90 % de la valeur théorique.

Pour doser le(s) oligosaccharide(s) spécifique(s) des acides téchoïques obtenus après traitement avec l'HF, il convient avantageusement de le(s) séparer des autres constituants et de le(s) caractériser. Séparation, caractérisation et quantification peuvent être mises en oeuvre selon différentes techniques, e.g. biochimiques, accessibles à l'homme du métier. On indique toutefois que les méthodes connues pour permettre la séparation et/ou le dosage des monosaccharides sont tout particulièrement appropriées.

Selon un mode particulier, on a recours à une technique de chromatographie par échange 10 d'anions hautement résolutive (HPAEC), éventuellement couplée à une détection ampérométrique en champs pulsés (PAD).

A cette fin, un support de chromatographie approprié doit permettre une bonne résolution et être compatible avec un milieu de pH très élevé (>_ 12). En pratique, dans ces conditions de pH, le support doit rester intact, exempt de dégradation. Il peut être constitué par une résine e.g., de polystyrène-divinyl-benzène sulfonaté, ayant par exemple un degré de réticulation variant entre 1 et 5 %. La résine est avantageusement sous forme de microbilles dont le diamètre varie de préférence entre 450 et 550 nm. Si le milieu issu du traitement à l'HF contient un nombre certain d'éléments différents, il peut être utile d'optimiser la résolution. A cette fin, la résine e.g., de polystyrène-divinylbenzène sulfonaté peut être conditionnée sous forme de colonne et être complétée en sa partie supérieure par une couche d'un matériau porteur de charges positives, e.g., d'un sel d'amine primaire, d'un sel d'amine secondaire, d'un sel d'amine tertiaire, d'un sel d'ammonium quaternaire, ou d'un groupement ammonium. Ce matériau peut se présenter sous forme de billes ayant avantageusement un diamètre de 5 à 15 m, e.g.10 m environ. Ce matériau peut être poreux ou non. A titre d'exemple on indique qu'un matériau approprié peut être constitué par du latex ayant avantageusement un degré de réticulation de 3 à 7 %, e.g., 5 % environ.

Le matériel de chromatographie (e.g. colonne analytique) commercialisé par les sociétés Dionex et Metrohm sous les marques de commerce respectives CarboPacTM et Metrosep Carb répond aux critères requis. Ce matériel est couramment désigné comme étant de type CarboPacTM . La colonne CarboPacTM PA1 est tout particulièrement préférée.

Une fois la préparation issue du traitement par l'HF déposée sur la colonne de chromatographie, on élue avec une solution d'élution possédant un pH ? 12, notamment pour que les fonctions hydroxyles des sucres s'ionisent et soient sous forme d'oxyanions séparables par chromatographie d'échange d'anions. Si la technique PAD est utilisée par la suite pour la détection, la solution d' élution doit être aussi compatible avec cette dernière. A cet égard, la solution d'élution est avantageusement dépourvue de carbonate.

De manière avantageuse, la solution d'élution est une solution de soude dont la molarité 10 est comprise entre 10 et 300 mM, de manière préférée entre 20 et 150 mM, de façon encore plus préférée entre 40 et 100 mM.

Le débit de la solution d'élution est fonction du type de colonne utilisée, mais est généralement compris entre 0.1 et 4 mUmin.

Les oligosaccharides spécifiques sont décelés sur le chromatogramme sous la forme de pics de chromatographie ayant des temps de rétention caractéristiques dans des conditions opératoires déterminées (même colonne de chromatographie, même solution et vitesse d'élution, etc).

Enfin on recherche et on quantifie l'oligosaccharide spécifique de l'acide téchoïque que l'on cherche à doser à l'aide d'un système de détection, par exemple par ampérométrie en champs pulsés (PAD). Cette méthode de détection est basée sur l'oxydation des sucres sur une électrode de travail entraînant la formation d'un courant électrique qui est mesuré. Des potentiels de régénération et de nettoyage sont souvent appliqués à l'électrode de travail.

Pour connaître la quantité absolue de l'acide téchoïque que l'on cherche à doser, on se reporte avantageusement à une courbe d'étalonnage établie à partir d'une préparation purifiée de l'acide téchoïque en question, dans les même conditions de traitement et d'analyse.

Selon un mode de réalisation particulier, la méthode selon l'invention s'applique au dosage d'un acide téchoïque dans une préparation contenant La. majoritairement, des polysaccharides de capsules de bactéries Gram+. En effet, du fait du mode de purification de ces polysaccharides, les préparations purifiées que l'on obtient, contiennent des quantités résiduelles d'acide téchoïque qu'il convient de doser.

Les polysaccharides capsulaires peuvent être sous leur forme native libre ou sous une forme modifiée par dépolymérisation partielle, activation ou conjugaison à un peptide ou une protéine porteuse comme l'anatoxine tétanique ou l'anatoxine diphtérique.

Selon un mode de réalisation d'un intérêt particulier, la méthode selon l'invention s'applique au dosage des acides téchoïques de Streptoccocus pneumoniae.

Les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) sont des bactéries encapsulées Gram positif, responsables de pathologies infectieuses notamment de méningites, de bronchites, de rhinites et otites à complications chez l'adulte comme chez l'enfant. Les pneumocoques sont divisés en sérotypes selon la structure des polysaccharides qui forment la capsule. Le sérotypage des pneumocoques est réalisé à l'aide d'une batterie d'immun sérums, chaque immunsérum étant spécifique d'un seul type de polysaccharide capsulaire (immun sérums monospécifiques). Plus de 90 sérotypes différents, ont été recensés jusqu'à présent.

Les vaccins contre le pneumocoque actuellement commercialisés contiennent tous des polysaccharides de capsule. Du fait du mode de purification de ces polysaccharides, ces vaccins contiennent des quantités résiduelles d'acides téchoïques qu'il convient de doser.

Ainsi, sous un aspect particulier, l'invention a pour objet une méthode de dosage des acides téchoïques du pneumocoque dans une préparation contenant un polysaccharide 30 caspulaire d'au moins un sérotype du pneumocoque.

Ce sérotype peut être notamment choisi dans le groupe constitué par les sérotypes (valences) les plus répandus; Soient les sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F.

Grâce à la méthode de dosage selon l'invention, il est en particulier possible de quantifier les acides téchoïques du pneumocoque dans n'importe quelle préparation contenant un ou des polysaccharide(s) capsulaire(s), quels que soient le nombre et le type de valence. La préparation peut notamment contenir une ou plusieurs des valences caractérisées par un polysaccharide capsulaire dont la structure présente des analogies avec celles des acides téchoïques, soit les valences 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20. En effet, la présence des polysaccharides capsulaires des sérotypes sus-nommés dont l'hydrolyse dans les conditions de l'invention entraîne la production d'oligosaccharides spécifiques, est sans incidence sur le dosage des acides téchoïques.

La préparation peut aussi contenir une ou plusieurs des valences 11A, 15B, 18C et 23F. En bref, la préparation peut contenir les 23 valences les plus répandues ou n'importe quelle combinaison possible à partir de ces 23 valences. A titre d'exemple, une telle préparation peut contenir les valences les plus répandues 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. Elle peut aussi contenir une ou plusieurs des valences additionnelles 1, 3, 5 et 7F.

A titre indicatif, on soumet les remarques suivantes: Les oligosaccharides spécifiques du polysaccharide C et de l'acide lipotéchoïque libérés lors du traitement par HF à froid selon l'invention, sont identiques. En effet, les 25 deux acides téchoïques possèdent la même unité répétitive. On ne peut donc pas doser le polysaccharide C et l'acide lipotéchoïque séparément.

- Les polysaccharides capsulaires des sérotypes 6B, 10A, 17F, 19A, 19F et 20, dont l'enchaînement des unités répétitives fait intervenir des liaisons phosphodiesters, 30 sont dégradés essentiellement sous la forme d'oligosaccharides spécifiques.

- Les polysaccharides capsulaires des sérotypes 11A, 15B, 18C et 23F, dont les liaisons phosphodiesters ne sont pas directement impliquées dans l'enchaînement des - 10 - unités répétitives, ne peuvent pas être hydrolysés sous forme d'oligosaccharides spécifiques. Soumis au traitement à l'HF, ils peuvent néanmoins se dépolymériser de manière partielle et aléatoire en des produits hétérogènes, incluant en particulier des molécules tels que le glycérol ou la choline, et des monosaccharides.

Enfin les autres polysaccharides capsulaires qui ne contiennent pas de groupements phosphate ne sont pas dépolymérisés ou sont dépolymérisés de façon partielle et aléatoire pour donner après traitement à l'HF, des produits hétérogènes, en majorité de haut poids moléculaire, nonidentifiables et non-quantifiables, ainsi qu'une minorité de monomères et des monosaccharides.

En définitive, le milieu issu du traitement à l'HF peut présenter une complexité plus ou moins importante en fonction du nombre et du type de polysaccharide capsulaire présent au départ. Il convient donc de séparer l'oligosaccharide spécifique des acides téchoïques, des autres produits d'hydrolyse (monomères, monosaccharides, polysaccharides non hydrolysés ou partiellement hydrolysés...).

L'oligosaccharide spécifique des acides téchoïques de S. pneumoniae se comporte comme un monosaccharide lorsqu'il est analysé et séparé par la technologie HPAEC- PAD. Pour le séparer et le quantifier par HPAEC-PAD de façon particulièrement résolutive, on recommande l'utilisation d'une colonne de chromatographie CarboPac PA1TM et une solution de soude isocratique 75 mM. Dans ces conditions, le pic de chromatographie correspondant a un temps de rétention de 4,30 min 10 % lorsque le débit de la solution d'élution est de 1 ml/min. La surface du pic de chromatographie reflète la quantité relative de polysaccharide C et d'acide lipotéchoïque présents dans la préparation.

Dans le cadre des travaux ayant concourus à la présente invention, on a découvert que S. pneumoniae de sérotype 5 ne possédait pas de polysaccharide C. Par contre, on trouve un acide téchoïque de substitution que l'on a appelé polysaccharide C5. La formule de son unité répétitive diffère légèrement de celle du polysaccharide C. Elle est la suivante: [6)-(3-D-Galp-(143)-a-AATp-(144)-a-D-GaIpNAc-(143)-13-D-GaIpNAc-(141)-oRibitol-5-P-(O4] 6 6 I 1 O)-P-Cho O)-P-Cho C'est pourquoi, selon un mode très particulier, l'invention s'applique également au dosage du polysaccharide C5, notamment dans une préparation contenant le polysaccharide caspulaire du sérotype 5 de S. pneumoniae. Le mode opératoire décrit ci- avant pour le dosage du polysaccharide C et l'acide lipotéchoïque convient également pour le dosage du polysaccharide C5. Son pic de chromatographie a dans ces conditions un temps de rétention de 3,30 min 10 %.

Pour déterminer les quantités absolues résiduelles en acides téchoïques, on se réfère à 10 des courbes-étalon réalisées à partir de préparations mère exprimant des quantités connues en fonction des surfaces des pics de chromatographie.

La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants qui servent à illustrer l'invention sans pour autant en limiter le contenu.

La figure 1 représente le chromatogramme HPAEC-PAD, après traitement à l'HF, du vaccin Pneumo 23TM contenant les polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F. Les pics surmontés d'une * correspondent aux monosaccharides provenant de l'hydrolyse des polysaccharides capsulaires. Le pic Rib correspond au ribitol. Le pic Fru correspond au fructose (étalon-interne). Les pics oligo C et oligo C5 et correspondent respectivement aux oligosaccharides spécifiques C et C5.

La figure 2 représente le chromatogramme HPAEC-PAD, après traitement à l'HF, d'une formulation vaccinale F3 telle que décrite dans WO 98/51339 contenant les conjugués Tt et Dt des polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F du pneumocoque.

- 12 - Exemple 1: Dosage des quantités résiduelles en polysaccharide C et C5 dans le vaccin Pneumo 23TM contenant les polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B1 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F du pneumocoque.

1.1. Solutions mère pour gamme étalon. 1.1.1. Polysaccharide C5: Ce dernier est purifié comme décrit dans le paragraphe suivant, à partir d'une préparation de polysaccharide capsulaire du pneumocoque de sérotype 5 obtenue par précipitation alcoolique fractionnée d'un extrait capsulaire, suivie d'une extraction phénolique pour éliminer les protéines, d'une précipitation fractionnée en présence de chlorure de calcium pour éliminer les acides nucléiques, et finalement d'une seconde précipitation alcoolique fractionnée. Le précipité obtenu, est lavé à l'alcool absolu puis séché sous vide. Le dessicat est remis en solution à une concentration de 10 mg/ml dans un tampon NaCl 200 mM.

On dépose 4 ml de cette solution sur une colonne de chromatographie (90 cm x 1,6 cm de diamètre) contenant du gel de sépharose CL 4B. On soumet la colonne à un flux d'une solution de NaCl 200 mM à un débit de 0,6 ml/min de manière à séparer le polysaccharide C5 du polysaccharide capsulaire. L'éluat est recueilli en fractions. La mesure de l'absorbance UV à 206 nm de chaque fraction est mesurée. Cela permet d'identifier deux séries de fractions bien distinctes: la première contenant le polysaccharide capsulaire de type 5; la seconde, éluée contenant le polysaccharide C5. Cette seconde série de fractions est dialysée contre de l'eau distillée, concentrée à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis conservée sous forme de lyophilisat. Le taux de pureté du lyophilisat est d'environ 70 %.

Par la suite on détermine la quantité exacte de polysaccharide C5 dans la préparation ainsi obtenue, en dosant le ribitol libéré après hydrolyse.

- 13 - Le lyophilisat est remis en solution en eau purifiée ultrafiltrée à raison de 10 g/ml (poids sec).

En parallèle, on réalise une gamme-étalon de ribitol de 0 à 4 g/ml dans de l'eau purifiée ultrafiltrée. Pour contrôler la reproductibilité de la chromatographie, on peut rajouter à tous les échantillons une quantité fixe de mannose qui joue le rôle d'étalon interne.

400 l de la solution de polysaccharide C5 préparée ci-dessus sont séchés sous azote. Le dessicat est traité par 200 l d'acide fluorhydrique à 48 % pendant 2 heures à 65 C. On sèche et on rajoute 400 l d'acide trifluoroacétique 2 N pendant 2 heures à 135 C. On sèche sous courant d'azote.

Pour analyse par chromatographie HPAEC-PAD, on dissout les dessicats obtenus à l'étape précédente dans 400 l d'eau purifiée ultrafiltrée.

On injecte une aliquote de 100 l de chacune des solutions sur une colonne analytique CARBOPAC MAI (4 X 250 mm) (DIONEX #44066) préalablement équilibrée par une solution de soude 480 mM. On soumet la colonne à un flux d'une solution de soude 480 mM pendant 60 minutes à un débit de 0,4 ml/min pour éluer les monosaccharides neutres tels que le ribitol et le mannose. La température de la colonne est maintenue à 30 C.

Dans ces conditions, le pic de chromatographie correspondant au ribitol apparaît à 19,9 5 % min tandis que le pic correspondant au mannose (étalon interne) apparaît à 25,2 25 5 % min. On établit alors la courbeétalon (quantité de ribitol en fonction de la surface des pics). Par interpolation, on détermine la quantité de ribitol contenu dans la préparation de départ. Puis on déduit alors la quantité exacte de polysaccharide C5, sachant que l'unité répétitive du polysaccharide C5 est constituée de 11,1% (p/p) de ribitol.

1.1.2. Polysaccharide C: - 14 - On dissout la poudre de polysaccharide C purifié (Staten Serum Institute, DanemarK) dans de l'eau ultrapurifiée puis on ajuste sa concentration la concentration en polysaccharide C à 10 g/ml sur la base du dosage du ribitol effectué selon la même méthode que celle détaillée au paragraphe 1.1.1.

1.2. Gammes-étalon: De 0 à 5 g/ml en acide téchoïques précisément dosés préparées à partir des solutions mères par dilution dans de l'eau purifiéeultrafiltrée. Les échantillons de la gamme sont ensuite séchés sous azote.

1.3. Préparation de l'échantillon à doser On dialyse 3 doses de vaccins (1,5 ml) contre de l'eau distillée puis on lyophilise le dialysat. Le lyophilisat est alors repris par 1,5 ml d'eau purifiée ultrafiltrée dont on prélève une aliquote de 40 l qui est ensuite séché sous azote.

Pour contrôler la reproductibilité de la chromatographie, on peut rajouter dans l'échantillon à analyser une quantité fixe de fructose qui sert d'étalon interne.

1.4. Hydrolyse par l'HF Tous les dessicats ( échantillon à doser et échantillons de la gamme étalon) sont traités par 400 pi d'acide fluorhydrique à 48 % pendant 48 heures à 5 C. On sèche sous courant d'azote et on reprend par 400 l d'eau purifiée ultrafiltrée au moment de l'analyse.

1.5. Analyse par chromatographie HPAEC-PAD On injecte 100 l de chacun des hydrolysats sur une colonne analytique CARBOPAC PAl (4 X 250 mm) (DIONEX #35391) préalablement équilibrée par une solution de soude 75 mM. On soumet la colonne à un flux d'une solution de soude 75 mM pendant min à un débit de 1 ml/min pour éluer les oligosaccharides spécifiques du polysaccharide C et du polysaccharide C5 ainsi que les monosaccharides neutres au pH de l'analyse. La température de la colonne est maintenue à 30 C. Pour parachever la chromatographie, on ajoute graduellement une solution de soude 75 mM contenant de - 15 - l'acétate de sodium de façon à éluer tous les monosaccharides, oligosaccharides et polysaccharides restants.

Dans ces conditions, le pic de chromatographie correspondant au ribitol libéré lors de l'hydrolyse du polysaccharide C, du polysaccharide C5 et des polysaccharides capsulaires 6B et 10A apparaît à 2,65 5% min. Les pics correspondant aux oligosaccharides spécifiques du polysaccharide C5 et du polysaccharide C ainsi que le pic de fructose (étalon interne) apparaissent respectivement à 3,30 5% min, 4,30 5% min et 8,5 5% min (voir figure 1).

On établit les courbes-étalon (quantité de polysaccharide C ou C5 en fonction de la surface des pics). Par interpolation, on détermine les quantités de polysaccharide C et C5 présentes dans la préparation de départ.

Exemple 2: Dosage des quantités résiduelles en polysaccharide C et C5 dans la formulation vaccinale F3 telle que décrite dans WO 98/51339 contenant les conjugués Dt et/ou Tt des polysaccharides capsulaires des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F du pneumocoque.

Pour préparer l'échantillon à doser on utilise le même protocole que celui décrit au paragraphe 1.3. Le volume de l'aliquote prélevée est ici de 1 ml. Le profil de chromatographie que l'on obtient est celui montré à la figure 2.

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Claims (2)

Revendications

1. Polysaccharide C5 purifié possédant une unité répétitive de formule: [6)-[i-D-Galp-(143)-a-AATp-(144)-a-D-GaIpNAc-(143)-R-D-GaIpNAc-(1 >1)-DRibitol-5-P-(O4] 6 6 1 1 O)-P-Cho O)-P-Cho

2. Utilisation du polysaccharide C5 selon la revendication 1, pour le dosage de ce polysaccharide dans une préparation contenant un polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae de sérotype 5.