FR2841565A1 - Moyens pour identifier des genes specifiques de neisseria meningitidis - Google Patents
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Abstract
L'invention vise un procédé de détection exhaustif de gènes de bactéries pathogènes, en particulier de Nm, exprimant un phénotype recherché, caractérisé en ce que- on utilise une banque de mutants générée à partir d'une souche bactérienne donnée de manière à ce qu'au moins 70% des gènes non essentiels, et notamment au moins 80%, voire plus de 90%, soient mutagénisés par insertion d'un transposon dans une phase de lecture,- on met ensuite en contact les mutants, soit individuellement, soit en pools, avec un environnement, tel que milieu, animal ou cellules, capable d'interagir avec les bactéries mutantes exprimant le phénotype recherché,- on récupère, dans le cas de l'utilisation de pools, les bactéries n'ayant pas interagi avec le phénotype recherché,- on identifie les gènes mutés de ces bactéries et on vérifie leur implication dans ledit phénotype. L'invention vise également les gènes ainsi identifiés et leurs applications, notamment, comme cibles d'antipathogénicité, consistant à inhiber la croissance de Neisseria meningitidis in vivo dans le sérum, pour permettre l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique à des principes thérapeutiques. Elle vise également, l'application des gènes essentiels de Neisseria meningitidis comme cibles pour développer des antibiotiques.
Description
Moyens pour identifier des gènes spécifiques de Neisseria meningitidis.
L'invention se rapporte à des moyens pour identifier des gènes spécifiques de Neisseria meningitidis (Nm en abrégé). Elle concerne également ces gènes et leurs applications biologiques.
Nm est une bactérie strictement humaine qui ne survit pas dans le milieu extérieur.
Son seul réservoir connu est le nasopharynx de l'homme. Dans certaines circonstances méconnues à ce jour, cette bactérie va quitter le nasopharynx, envahir le sang circulant et être responsable de septicémies et/ou de méningites. L'existence d'une méningite suppose que la 1 0 bactérie franchisse la barrière hémato-encéphalique, une des barrières les plus infranchissables de l'organisme. Neisseria meningitidis est une bactérie à multiplication extracellulaire, c'est à dire qu'in vivo sa dissémination s'accompagne d'une multiplication dans le secteur interstitiel. Très peu de bactéries à multiplication extra-cellulaire sont capables de franchir la barrière hémato-encéphalique après la période néonatale, il s'agit essentiellement de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae et Neisseria meningitidis. Cette propriété suppose donc des attributs spécifiques qui permettent à ces microorganismes de
franchir cette barrière.
Neisseria meningitidis présente deux spécificités pour une bactérie à multiplication extra20 cellulaire: (i) Elle est responsable de bactériémies importantes avec un nombre élevé de bactéries dans le sang. Ainsi, la comparaison, dans un modèle animal utilisant le rat nouveau né, du niveau de bactériémie induite par l'injection du même nombre de bactéries appartenant à deux espèces différentes (Neisseria meningitidis et Klebsiella pneumoniae) montre que N.meningitidis induit une bactériémie qui peut être 50-100 fois plus importante que celle induite par Kpneumonîae. Ceci souligne la parfaite adaptation de N.meningitidis à la croissance dans le secteur extra-cellulaire. Certains attributs bactériens ont déjà été identifiés comme participant à cette croissance extra-cellulaire. Il s'agit essentiellement de la capsule polysaccharidique, du lipo-oligosaccharide et des systèmes de captation du fer. Les deux premiers attributs permettent la résistance au complément et à la phagocytose par les polynucléaires et la troisième attribut permet à la bactérie de se procurer le fer essentiel à sa croissance. (ii) La deuxième particularité de N.meningitidis est liée à sa capacité à franchir la barrière hémato-encéphalique. Cette propriété résulte d'une interaction avec les cellules endothéliales cérébrales. Le seul attribut bactérien identifié à ce jour comme étant impliqué dans l'interaction de N.meningitidis au niveau de l'endothélium cérébral sont les pili de type IV. Une molécule faisant partie de ces pili appelée PilC, impliquée dans cette interaction, est
l'adhésine des pili.
Les travaux des inventeurs ont porté sur la recherche de moyens permettant d'identifier les gènes de Nm capables de croître spécifiquement dans le sérum et de franchir la barrière hémato- encéphalique. > L'application à Nm de la technique décrite par Pelicic et al, 2000 pour construire une banque de mutants a permis de mutagéniser plus de 70% des gènes mutagénisables et donc
non essentiels.
Cet outil s'est révélé particulièrement précieux pour détecter de façon exhaustive l'ensemble des mutants pour un phénotype donné, par exemple ceux importants pour la croissance dans le sérum, et pour identifier des adhésines importantes pour l'interaction avec les cellules endothéliales et donc le passage de la barrière hémato-encéphalique, et ce sans
nécessairement tester les mutants individuellement pour ce phénotype.
L'invention a donc pour but l'utilisation d'une telle banque pour détecter des gènes de
Nm exprimant un phénotype particulier.
Elle vise également les gènes impliqués dans un tel phénotype.
L'invention a également pour but, la mise à profit des gènes ainsi identifiés comme
cibles pour l'antipathogénicité de Nm.
Elle vise aussi l'utilisation des gènes codant pour des adhésines pour permettre le
passage de la barrière hémato-encéphalique à des principes thérapeutiques.
L'invention vise en outre les gènes essentiels de N.meningitidis, et leurs homologues dans les autres espèces bactériennes et leur utilisation comme cibles pour développer des antibiotiques. Conformément à l'invention, on détecte des gènes de bactéries pathogènes, en particulier de Nm, exprimant un phénotype recherché, selon un procédé caractérisé en ce que - on utilise une banque de mutants générée à partir d'une souche bactérienne donnée de manière à ce qu'au moins 70% des gènes non essentiels, et notamment au moins 80%, voire plus de 90%, soient mutagénisés par insertion d'un transposon dans une phase de lecture, - on met ensuite en contact les mutants, soit individuellement, soit en pools, avec un environnement, tel que milieu, animal ou cellules, capable d'interagir avec les bactéries mutantes exprimant le phénotype recherché, - on récupère, dans le cas de l'utilisation de pools, les bactéries n'ayant pas interagi avec le phénotype recherché, - on identifie les gènes mutés de ces bactéries et on vérifie leur implication dans ledit phénotype. La banque de mutants est avantageusement générée selon la méthode décrite par
Pelicic et al ci-dessus.
L'étape de la mise en contact est réalisée par passage sur du sérum, ou un modèle animal in vivo ou des cellules capables de réagir avec les bactéries exprimant le phénotype recherché et, dans le cas de l'utilisation de pools de mutants, on récupère les bactéries n'ayant
pas interagi avec le phénotype recherché.
Pour identifier les gènes mutés de ces bactéries, et vérifier leur implication dans ledit phénotype, on organise les mutants en pools. Pour chaque mutant, on amplifie à l'aide d'oligonucléotides appropriés les sites d'insertions. On dépose les produits d'amplification sur une membrane par exemple en nylon. Les pools de mutants sont placés dans des conditions pour lesquelles des mutants sont recherchés. De l'ADN total est préparé à l'aide des bactéries obtenues de chaque pool de sortie et une amplification est réalisée à l'aide des oligonucléotides qui ont servi à amplifier les sites d'insertion dans les mutants du pool. Le produit d'amplification sert ensuite à hybrider les membranes qui correspondent à chaque pool. Les mutants pour lesquels aucune amplification n'est détectée sont des mutants pour le phénotype considéré. On observera que cette technique permet de conserver les mutants en
question, permettant de retransformer chaque mutation pour confirmer le phénotype.
L'invention vise également les gènes conférant à une bactérie la capacité de croître ou
d'interagir avec un environnement donné tel que sérum, modèle animal in vivo, cellules.
Ces gènes sont caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par le procédé
défini ci-dessus.
L'invention vise en particulier les gènes impliqués dans la croissance des bactéries dans le sérum, choisis parmi les gènes de la figure 3, identifiés par rapport au numéro du pool
de mutants de la figure 2.
L'invention vise tout spécialement, en tant que nouveaux produits, les gènes Nm 83
dxr, Nm 229, Nm 356, Nm 848 galU et les gènes du sérogroupe B, Nm 1771 et Nm B65.
L'invention vise également l'application des gènes sélectionnés par rapport au phénotype de croissance dans le sérum, comme cibles d'antipathogénicité, consistant à inhiber la croissance de Nm in vivo dans le sérum. D'autres gènes de grand intérêt selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont
impliqués dans l'interaction avec les cellules endothéliales.
L'invention vise donc également l'application de ces gènes pour permettre l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique à des principes thérapeutiques, tels que les anti10 Parkinsoniens, anti-Alzheimer, antimitotiques, anti-sclérose en plaque, antiviraux,
antimycotiques et antibiotiques.
L'invention vise en outre les gènes essentiels de Nm pour lesquels aucun mutant n'est présent dans la banque et l'application de ces gènes comme cibles pour développer des antibiotiques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 24 qui représentent: - la figure 1, la liste des gènes présentant dans les 2 souches séquencées de Nm plus de 65% de similarité sur une base protéique, - la figure 2A, la liste des gènes pour lesquels il existe un mutant dans la banque et la figure 2B la liste des mutants classés en 96 pools de 48 mutants, - la figure 3, la liste des mutants altérés dans la croissance dans le sérum, et - les figures 4 à 24, les courbes de croissance dans le sérum complémenté et le sérum
décomplémenté des mutants de la figure 3.
25. Construction d'une banque de mutants de Nm 8013 1. On construit une banque de mutants à partir de la souche de N.meningitidis 8013 de sérogroupe C. On opère selon la technique décrite par Pelicic et al, Journal ofBacteriology,
2000, 182:5391-5398. On obtient une banque ordonnée de 4547 mutants.
Statistiquement 80% des. insertions sont dans des phases ouvertes de lecture puisqu'il s'agit du % de régions codantes dans le génome des 2 souches séquencées, à savoir Z2491, souche de sérogroupe A séquencée par le Sanger Center, et MC58, souche de sérogroupe B séquencée par TIGR. On dispose donc d'environ 3600 mutants dans des phases ouvertes de lecture et dans la plupart des cas, de plusieurs insertions par gène. Compte tenu de la taille du
génome, la mutagénèse concerne donc 93% des gènes mutagénisables.
La formule statistique permettant de calculer la probabilité (P) qu'un gène sera muté est la suivante: P=1 - e-i/P n: nombre de mutants dans la banque p: nombre de gènes mutagénisables (non-essentiels) Le deuxième nombre ne peut être qu'estimé. Mais d'après des études chez des bactéries mieux caractérisées que Neisseria meningitidis, il est raisonnable d'estimer que 350
gènes sont essentiels à la survie de la bactérie. En conséquence, il y aurait 1750 gènes nonessentiels chez le méningocoque dont 92,6 % (1619) devraient être mutés dans la banque.
2. L'ensemble des insertions de cette banque est séquencé selon la technique utilisée pour le séquençage des insertions, déjà décrite et publiée (Prod'hom et al. 1998. FEMS Microbiol Lett. 1858: 75-81). Cette technique utilise une amorce spécifique pour la séquence connue, dans ce cas le transposon, et une deuxième amorce spécifique d'un linker synthétique ligué à l'ADN génomique réduit. L'utilisation de l'AmpliTaq Gold polymérase Perkin-Elmer
est importante pour minimiser une hybridation non spécifique des amorces.
Détermination des gènes essentiels.
Un gène essentiel ne peut pas être présent que dans une seule souche. On considère alors comme essentiel tout gène présent dans les deux souches dont le génome a été séquencé
et pour lequel il n'existe pas un mutant dans la banque de l'invention.
Les gènes présents dans les deux souches sont donnés sur la figure 1. La nomenclature utilisée est celle de la souche Z2491 (séquencée par le Sanger). La liste donnée sur la figure 1 a été obtenue en faisant un TblastN de chaque phase de lecture de Z2491 dans MC58, puis en
gardant toutes les phases de Z2491 qui avaient un pourcentage d'homologie supérieur à 65%.
La liste des gènes pour lesquels un mutant est présent dans la banque est représentée sur la figure 2A. La liste de gènes différentielle, c-à-d présents dans la figure 1 et non dans la figure 2A, est enrichie en gènes essentiels. Cette liste de gènes différentielle comprend des gènes homologues dans d'autres bactéries pathogènes à Gram négatif, telles que les entérobactéries, Pseudomonas, Acinetobacter, voire certaines bactéries à Gram positif. Ces gènes constituent des cibles pour développer des antibiotiques à large spectre contre ces bactéries à Gram négatif et des antibiotiques à plus large spectre lorsque ces gènes sont
homologues à certains gènes de bactéries à Gram positif.
6 2841565
Criblage de la banque pour différents phénotypes.
Pour le criblage, on met à profit la connaissance de la séquence de chaque insertion.
Pour ce faire, les mutants sont organisés en pools de 48. Pour chaque mutant, on amplifie à l'aide d'oligonucléotides appropriés les sites d'insertions. Chaque produit d'amplification est déposé sur une membrane de nylon. Les pools de 48 mutants sont ensuite placés dans les conditions pour lesquelles des mutants sont recherchés. De l'ADN total est préparé à l'aide des bactéries obtenues de chaque pool de sortie et une amplification est réalisée à l'aide des oligonucléotides qui ont servi à amplifier les 48 sites d'insertion. Le produit d'amplification va ensuite servir à hybrider les membranes qui correspondent à chaque pool. Les mutants pour lesquels aucune amplification n'est détectée sont des mutants pour le phénotype considéré. * Recherche de mutants importants pour la croissance dans le sérum Comme mentionné ci-dessus, N. meningitidis est une bactérie à multiplication extra 1 5 cellulaire parfaitement adaptée à ce compartiment. L'invention vise donc à identifier de façon
exhaustive les attributs et les gènes nécessaires à cette croissance.
1 - Isolement des souches: On isole la souche sauvage 2C43 wt (contrôle positif) et Z5463 CPS- (souche non capsulée, contrôle négatif) sur boîte GCB (agar 5g/l); les mutants réalisés à partir de la
souche 8013 sont isolés sur boîte GCB + Kanamycine 100 >ag/,ul.
La culture est réalisée pendant 14-18h, à 370C, sous 5% de CO2.
2 - Sérum: Le sérum humain complémenté est conservé à -80'C. Après chauffage 30 min. à 560C, le sérum est décomplémenté. La croissance est réalisée pour les témoins et les mutants avec du
sérum complémenté et décomplémenté systématiquement.
Chaque mutant est testé avec un témoin positif et négatif pour comparer les courbes de
croissance réalisées sur différents jours.
3 - Inoculum:
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On prélève l dose de colonies bien isolées et on les dissocie dans 5 ml de RPMI (GIBCO: RPMI 1640 medium avec glutamaxl; préalablement mis 5-10 min. à température ambiante avant ensemencement, pour préserver les bactéries des variations brusques de températures). L'amas de bactéries est repris à l'aide d'une Pl 000, puis vortexé. La préculture est mise sous agitation à 370C, pendant 2h. On mesure alors la DO à 600 nm (le témoin blanc étant du RMPI) et on ramène l'inoculum à 0,J dans du RPMI (préalablement mis durant 5-10
min. à température ambiante).
4 - Milieu de croissance: On dépose 98 ffl de sérum et 292 yll de RPMI (25% sérum, 75% RMPI) par puits. On
laisse 5 min. à température ambiante avant inoculation.
Dans les puits éventuellement vides, on introduit 400 jll d'eau.
5 - Inoculation: Après agitation, on prélève 10 pl d'inoculum ajusté à 0, 1 de DO, et on le dépose dans un puits contenant du milieu de croissance, puis on mélange à l'aide d'une PlION. On place les puits dans une étuve à 370C, sous 5% de CG2. On dose l'inoculum à TO et la croissance
bactérienne à différents temps, en étalant 50pl de différentes dilutions sur des boîtes GCB.
6 - Prélèvements On remet en suspension (avec une P1000) avant de prélever au temps Oh, lh, 5h post inoculation. On prélève 20 pil de milieu de culture inoculé que l'on met dans 180 ffl de RPMI (Dl; tube 1,5 ml, préalablement mis a température ambiante 10 min., avant de prélever, afin
d'éviter un grande différence de température). L'ensemble est vortéxé.
7 - Dilutions: Le tube Dl est vortéxé, puis on prélève 50 pl de Dl qu'on ajoute dans 450 pil de RPMI (D2; tude de 2ml, préalablement mis à température ambiante 10 min.). On vortexe entre chaque étape de dilution et on change de cône. On réalise les dilutions jusqu'à la dilution
D4 pour le temps TO, D3 pour le temps TI, et D5 pour le temps T5.
8 - Ensemencement:
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L'ensemencement se fait sur boîte GCB pour les témoins, et GCB+ kanamycine i00Otg/gl pour les mutants. On vortexe, puis on prélève 50 ffl de chaque dilution. On incube à l'envers dans une étuve à 370C, sous 5% de C02, pendant 14-18h, avant comptage des colonies. On ensemence D4, 3 pour le temps TO; DOl, 2, 3 pour le temps TI; D5,4,3,2,1 pour le temps
T5.
9 - Gènes de Nm permettant la croissance dans le sérum: comptage des bactéries survivantes dans le sérum en fonction du temps Une courbe de croissance représentant le nombre de bactéries survivantes dans le sérum en fonction du temps a été établie pour chacun des clones (loglo CFU en fonction du temps
d'incubation en heures).
Deux souches contrôles ont été inclues à chaque fois dans le test: la souche sauvage correspondant à une souche de Neisseria meningitidis, sérogroupe C et une souche témoin correspondant à Neisseria meningitidis, sérogroupe A dépourvue de capsule. Pour chaque
gène un seul mutant est représenté.
Les résultats sont donnés sur les figures 4 à 24, qui représentent les courbes de croissance des
mutants de la figure 3 dans le sérum complémenté et le sérum décomplémenté.
* Identification des adhésines pour cellules endothéliales.
Les adhésines importantes pour l'interaction sur cellules endothéliales peuvent être utilisées pour permettre l'ouverture de la barrière hématoencéphalique et faire passer des
médicaments dans le cerveau.
Des cellules HUVEC à confluence sont ensemencées dans des microplaques de culture cellulaire à 24 puits à une densité de 1 05/puits. Les cellules sont lavées le jour suivant dans du sérum 10%/RPMI, et sont incubées 2h à 37 C. Simultanément, les bactéries sont remises en suspension dans le même milieu à une DO550 de 0,1 à 0,01 et mises à incuber pendant 2h à
37 C. La suspension de bactéries est utilisée pour infecter les cellules 30 min à 37 C.
L'infection est ensuite poursuivie 4-5h avec les cellules lavées chaque heure.
Claims (4)
1/ Gènes de Nm, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi dxr (1-deoxyD-xylulose5 5-phosphate reductoisomerase), galU (UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase), et le
gène de sérotype B hisC (histidinol-phosphate amino transferase).
2/ Application des gènes sélectionnés selon un procédé de détection exhaustif de gènes de bactéries pathogènes, en particulier de Nm, exprimant un phénotype recherché, dans lequel - on utilise une banque de mutants générée à partir d'une souche bactérienne donnée de manière à ce qu'au moins 70% des gènes non essentiels, et notamment au moins 80%, voire plus de 90%, soient mutagénisés par insertion d'un transposon dans une phase de lecture, - on met ensuite en contact les mutants, soit individuellement, soit en pools, avec un environnement, tel que milieu, animal ou cellules, capable d'interagir avec les bactéries mutantes exprimant le phénotype recherché, - on récupère, dans le cas de l'utilisation de pools, les bactéries n'ayant pas interagi avec le phénotype recherché, - on identifie les gènes mutés de ces bactéries et on vérifie leur implication dans ledit phénotype, ou de gènes selon la revendication 1, comme cibles d'antipathogénicité, consistant
à inhiber la croissance de Nm dans le sérum.
3/ Application des gènes sélectionnés selon la revendication 2 pour le criblage et la fabrication de médicaments permettant l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique à des
principes thérapeutiques tels que les anti-Parkinsoniens, anti-Alzheimer, antimitotiques, antisclérose en plaque, antiviraux, antimycotiques et antibiotiques.
4/ Application selon la revendication 2 o 3, des gènes essentiels de Nm comme cibles
pour le criblage et la fabrication d'antibiotiques.
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|---|---|---|---|
| FR0306927A FR2841565A1 (fr) | 2001-12-31 | 2003-06-10 | Moyens pour identifier des genes specifiques de neisseria meningitidis |
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- 2003-06-10 FR FR0306927A patent/FR2841565A1/fr not_active Withdrawn
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| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20061230 |