FR2840922A1 - Triacylglycerol lipase recombinante d'arabidopsis thaliana, sequences nucleotidiques codant pour cette derniere ou correspondant a des antisens, et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet la triacylglycérol (TAG) lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana, ainsi que les séquences nucléotidiques codant pour cette dernière ou pour des séquences dérivées ou des fragments de cette lipase, ou les séquences antisens de ces dernières, et leurs utilisations
Description
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TRIACYLGLYCEROL LIPASE RECOMBINANTE D'ARABIDOPSIS THALIANA, SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR CETTE DERNIERE OU CORRESPONDANT A DES ANTISENS, ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet la triacylglycérol (TAG) lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana, ainsi que les séquences nucléotidiques codant pour cette dernière ou pour des séquences dérivées ou des fragments de cette lipase, ou les séquences antisens de ces dernières, et leurs utilisations.
La présente invention a pour objet la triacylglycérol (TAG) lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana, ainsi que les séquences nucléotidiques codant pour cette dernière ou pour des séquences dérivées ou des fragments de cette lipase, ou les séquences antisens de ces dernières, et leurs utilisations.
Les TAG lipases sont des enzymes capables d'hydrolyser les huiles. Ces enzymes ont de multiples utilisations industrielles dans le domaine des bioconversions d'huiles, de la résolution de composés racémiques, de la fabrication des lessives, etc...Elles peuvent également être utilisées dans le domaine de la santé humaine comme supplément pour des patient déficients en lipases digestives par exemple.
Dans le domaine des plantes oléagineuses (comme le soja, le colza, le tournesol, etc...), elles jouent un rôle crucial dans la régulation métabolique de la germination. Leurs gènes pourraient être utilisés, par exemple, comme marqueur de la germination dans les processus de sélection des variétés ou encore pour faciliter la germination de plantes transgéniques dont la composition en huile serait modifiée. D'une façon plus générale, les gènes de lipase de plantes pourraient être utilisés pour modifier la quantité et la qualité des huiles de plantes oléagineuses transgéniques.
Aucun gène codant pour des TAG lipases de plantes n'a été identifié avec certitude jusqu'à présent. L'analyse des séquences de lipases connues (d'origine microbienne, fungique ou animale) montre qu'il existe de nombreuses familles de lipases qui ne présentent parfois aucune similarité de séquence évidente. En fait, une séquence plus ou moins consensuelle est retrouvée dans la plupart des lipases connues autour de la sérine catalytique. Néanmoins, cette séquence est également présente dans d'autres protéines ne possédant pas d'activité TAG lipase. Il n'existe donc aucun moyen d'affirmer qu'une protéine est une lipase en se basant uniquement sur sa séquence protéique. Seule la mesure d'une activité enzymatique permet de dire si une protéine est une lipase. Pour pouvoir prouver qu'un gène code pour une lipase, il est donc nécessaire d'exprimer ce gène de façon appropriée afin que celui ci produise une protéine active dont on pourra mesure l'activité lipase.
Les techniques utilisées pour essayer d'identifier et d'obtenir des lipases de plantes relèvent essentiellement des techniques de biochimie utilisées pour purifier des protéines.
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Plusieurs groupes de chercheurs ont publié des protocoles qui permettaient, entre leurs mains, de purifier ou d'enrichir fortement des fractions protéiques, issues de plantules en germination, en activité lipase. La plupart de ces résultats sont décrits dans une mise au point de Huang en 1993 (Huang, 1993, Lipases. In Lipid Metabolism in Plants, Moore TS, Editor, CRC Press Inc., Boca Raton. pp473-502). Néanmoins, aucune identification formelle de ces protéines n'a été apportée sous forme de séquence polypeptidique ou de séquence nucléotidique. Ces travaux ne permettent donc pas d'envisager des expériences de transgénèse pour modifier le métabolisme des huiles de plantes. Par ailleurs, les quantités de lipases obtenues par ces techniques de purification sont très faibles (généralement inférieures à 1 microgramme).
Seule une lipase purifiée par Moulin et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, Vol 91, 11328-32) à partir de latex d'Euphorbe est abondante et a été identifiée par une séquence Nterminale. Cette séquence ne présente aucune homologie avec celle de la présente invention (encore désignée protéine L25).
Une autre approche consiste à identifier des gènes de lipases en recherchant des séquences d'ADN obtenues après séquençage au hasard de gènes ou d'ADNc qui présentent des homologies de séquences avec des lipases connues. Il est ainsi possible d'identifier plus de 35 gènes chez la plante modèle Arabidopsis thaliana qui présentent des identités de séquences allant de 10 à 30% avec des lipases connues. Ainsi, le gène AC006298~2 code pour une protéine qui présente 30% d'identité de séquence avec la lipase gastrique. Un brevet décrivant des séquences proches a été déposé par la société DuPont (W099/55883, PCT/US99/09280). Néanmoins, aucune preuve de l'activité lipase du produit de ces gènes n'a été apporté par les auteurs. L'utilisation de tels gènes dont l'activité du produit n'a pas été démontrée.
Une approche bioinformatique a permis à Brick et al. (FEBS Lett, 1995, vol.
377 (3):475-80) d'identifier des gènes d'Arabidopsis codant pour des lipases putatives. Ces auteurs ont exprimé une protéine recombinante dans E. coli et ne sont pas parvenus à détecter de façon quantitative une activité TAG lipase. Quoi qu'il en soit, cette lipase putative ne contient pas d'identité de séquence avec la protéine L25.
Une autre lipase putative de plante a été décrite par Hong et al., ( Proc Natl Acad Sci U S A 2000, vol 97 (15):8717-22). auteurs ont exprimé l'ADNc dans E. coli et ont obtenu une protéine ayant une activité lipase sur TAG. Cette activité est particulièrement faible (environ 0,001 unité par mg d'enzyme contre environ 5 unités pour la protéine L25 produite dans le baculovirus). Cette protéine ne présente pas d'identité de séquence avec la protéine L25.
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La présent invention a consisté à identifier une triacylglycérol (TAG) lipase de plante et à en produire une forme active dans des cellules d'insectes en culture. Cette lipase peut être utilisée pour diverses applications industrielles et thérapeutiques. Les Inventeurs ont également construit des lignées de plantes transgéniques d'Arabidopsis thaliana surexprimant le gène de lipase dans les orientations sens et antisens afin de pouvoir produire des lignées de plantes ayant une qualité/quantité d'huile modifiée. Ainsi, la présente invention permet de produire des quantités importantes de lipase active de plante, et d'altérer le métabolisme des triglycérides par transgénèse pour modifier qualitativement et quantitativement les huiles de plantes oléagineuses.
La présente invention a pour objet une triacylglycérol (TAG) lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana représentée par la séquence SEQ ID NO : 2 comprenant un peptide signal de 21 acides aminés situés aux positions 1 à 21 de SEQ ID NO : 2, et caractérisée en ce que sa forme mature est représentée par la séquence peptidique SEQ ID NO : 4, ou un fragment de cette lipase, ou un variant de cette lipase ou dudit fragment par substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ledit variant ayant un pourcentage d'identité d'au moins environ 60 %, et de préférence d'au moins environ 70 %, ou un pourcentage de similarité d'au moins environ 80 %, avec ladite TAG lipase ou ledit fragment de cette dernière, ledit fragment ou variant ayant une activité enzymatique de TAG lipase telle que représentée par SEQ ID NO : 2, à savoir une activité d'hydrolyse des huiles tels que les triacylglycérols à longues chaînes, notamment la trioléine (ladite activité lipase pouvant être mesurée selon la méthode décrite ciaprès dans la description détaillée de l'invention).
L'invention concerne pus particulièrement la TAG lipase, ou fragment ou variant de cette dernière définis ci-dessus, tels qu'obtenus par transformation de cellules d'insectes à l'aide de vecteurs contenant une séquence d'ADN codant pour ladite TAG lipase, notamment la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, ou codant pour un fragment ou un variant de cette dernière définis ci-dessus, et récupération, le cas échéant après purification, de la TAG lipase ou fragment ou variant de cette dernière définis ci-dessus, produits par lesdites cellules ainsi transformées.
L'invention a plus particulièrement pour objet la TAG lipase, ou fragment ou variant de cette dernière définis ci-dessus, tels qu'obtenus à partir de cellules de la lignée Sf9 de Sporoptera frugiperda infectées par un baculovirus lui-même transformé à l'aide d'un plasmide contenant la séquence d'ADN codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant de cette dernière définis ci-dessus.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant tels que définis ci-dessus.
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A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, correspondant : - à la séquence représentée par SEQ ID NO : 1, codant pour la TAG lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana sous forme mature représentée par la séquence peptidique SEQ ID NO : 2, - ou à la séquence représentée par SEQ ID NO : 3, codant pour la TAG lipase susmentionnée précédée d'un peptide signal représentée par SEQ ID NO : 4, ou toute séquence dérivée de SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3, par dégénérescence du code génétique, et codant pour SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4 respectivement.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante comprenant une séquence nucléotidique susmentionné codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant tels que définis ci-dessus, en association avec les éléments essentiels à la transcription de cette dernière, notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
L'invention a également pour objet des vecteurs, tels que plasmides ou baculovirus, contenant une séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également des cellules hôtes transformées à l'aide d'un vecteur susmentionné.
L'invention a plus particulièrement pour objet les cellules hôtes susmentionnées, choisies parmi les cellules d'insectes, telles que la lignée Sf9 de Sporoptera frugiperda, transformées par un baculovirus en tant que vecteur.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une TAG lipase recombinante, ou fragment ou variant de cette dernière tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules hôtes transformées définies ci-dessus, et la récupération, le cas échéant après purification, de la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés produits dans lesdites cellules.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques antisens complémentaires des séquences nucléotidiques définies ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les ADN ou ARN antisens définis ci-dessus, capables de s'hybrider in vitro et in planta respectivement avec l'ADN ou l'ARN codant pour la TAG lipase représentée par SEQ ID NO : 2 ou 4.
L'invention concerne plus particulièrement les ADN ou ARN antisens définis ci-dessus, caractérisés en ce que leur taille est comprise entre environ 200 et environ 1500 nucléotides, et en ce qu'ils s'hybrident avec la région de la séquence SEQ ID NO : 1 ou 3 constituée des nucléotides complémentaires de ces derniers.
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L'invention a également pour objet les vecteurs, tels que plasmides ou Agrobacterium tumefaciens, contenant une séquence nucléotidique antisens telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également les cellules transgéniques de plantes, ou fragments de plantes, telles que racines, tiges, feuilles, notamment de plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, transformées avec une séquence nucléotidique codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés, ou avec une séquence nucléotidique antisens, telles que définies ci-dessus, le cas échéant à l'aide d'un vecteur susmentionné.
L'invention a également pour objet les plantes transgéniques transformées avec une séquence nucléotidique codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés, ou avec une séquence nucléotidique antisens, telles que définies ci-dessus, notamment plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, telles qu'obtenues à partir de cellules ou fragments de plantes susmentionnées.
L'invention concerne également les semences transgéniques transformées avec une séquence nucléotidique codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés, ou avec une séquence nucléotidique antisens, telles que définies ci-dessus, notamment semences de plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, telles qu'obtenues à partir du croisement de plantes transgéniques telles que définies ci-dessus.
L'invention a également pour objet les plantes transgéniques transformées avec une séquence nucléotidique codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés, ou avec une séquence nucléotidique antisens, telles que définies ci-dessus, notamment plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, telles qu'obtenues à partir de semences transgéniques susmentionnées.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés, ou de séquences nucléotidiques antisens, telles que définies ci-dessus, pour la mise en #uvre de procédés d'obtention de plantes transgéniques au sein desquelles l'activité TAG lipase est modulée, et la quantité et/ou la qualité des huiles biosynthétisées au sein desdites plantes transgéniques sont modifiées par rapport à la quantité et/ou la qualité de ces mêmes huiles chez les plantes sauvages.
L'invention concerne également un procédé d'obtention de plantes transgéniques au sein desquelles l'activité TAG lipase est modulée, et la quantité et/ou la qualité des huiles biosynthétisées au sein desdites plantes transgéniques sont modifiées par rapport à la quantité et/ou la qualité de ces mêmes huiles chez les plantes sauvages, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes susmentionnés jusqu'à l'obtention de plantes transformées entières telles que définies ci-dessus.
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L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention de plantes transgéniques telles que définies ci-dessus, au sein desquelles l'activité TAG lipase est augmentée, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes susmentionnés transformés avec une séquence nucléotidique telle que définie cidessus codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé d'obtention de plantes transgéniques telles que définies ci-dessus, au sein desquelles l'activité TAG lipase est diminuée, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes susmentionnés transformés avec une séquence nucléotidique antisens telle que définie ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention de plantes transgéniques telles que définies ci-dessus, au sein desquelles l'activité TAG lipase est diminuée selon un mécanisme de co-suppression, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes susmentionnés avec une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés.
L'invention a également pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés, comme marqueurs de la germination dans les procédés de sélection de variétés végétales.
L'invention concerne également l'utilisation de séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés, pour la mise en #uvre de procédés de contrôle de la germination des plantes.
L'invention a également pour objet l'utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un adjuvant de nutrition, ou d'un médicament, pour l'alimentation ou le traitement des sujets atteints de déficiences en lipases digestives, notamment en lipases gastriques.
L'invention concerne également tout adjuvant de nutrition, caractérisé en ce qu'il comprend une TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis ci-dessus.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne également l'utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis ci-dessus, dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de bioconversions enzymatiques d'huiles telles que l'huile de colza.
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L'invention a également pour objet l'utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis ci-dessus, dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de résolution de composés racémiques.
L'invention concerne également l'utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis ci-dessus, dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de fabrication de lessives.
L'invention a également pour objet les anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne également l'utilisation d'anticorps définis ci-dessus dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de détection et d'identification de lipases végétales.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de la TAG lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana, et de son activité enzymatique.
Le gène AC006298~2 d'Arabidopsis thaliana (dont la séquence est disponible dans des banques de données publiques) code pour une protéine qui présente une identité de séquence de 30% lorsqu'elle est comparée à la lipase gastrique humaine. Les inventeurs ont amplifié l'ADN complémentaire correspondant par la technique dite de RT-PCR à partir d'ARN messagers isolés de plantules d'Arabidopsis en germination. Les inventeurs ont utilisé pour ce faire les oligonucléotides A61 et A62. Le fragment d'ADN ainsi produit a été inséré dans le site EcoRV du plasmide pBluescriptII et cloné dans la souche d'E . coli DH5alpha pour donner le plasmide pAtlip25. Toutes les expériences suivantes ont été réalisées à l'aide de l'insert contenu dans ce plasmide.
L'ADNc du plasmide Atlip25 a été inséré au site EcoRV du plasmide pVL1393 pour former le plasmide pBACL25. L'ADNc y est inséré dans l'orientation sens, qui permettra la synthèse d'un ARNm codant pour la protéine L25. Le plasmide pBACL25 a été utilisé pour co-transfecter des cellules d'insectes de la lignée Sf9 en utilisant le kit Baculogold de Pharmingen selon les indications données par le fabricant. Après la lyse des cellules, un aliquot du milieu de culture a été prélevé et son activité a été mesurée en utilisant un triacylglycérol radioactif (la trioléine tritiée) selon un protocole décrit en annexe. Une activité TAG lipase de 13 nanomoles d'acides gras libérés par minute et par millilitre de milieu de culture a été détectée, tandis qu'aucune activité n'était détectable dans une expérience témoin réalisée de la même façon à l'exception que les cellules étaient infectées par un baculovirus sauvage. Ces résultats démontrent bien que l'ADNc du plasmide pAtlip25 code bien pour une TAG lipase.
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Un stock de virus recombinant a été obtenu par infections successives de cellules Sf9 et ces virus ont été utilisés pour infecter des cellules d'insecte de la lignée HighFive.
Typiquement, 25 + 5 unités d'enzymes sont produites par litre de milieu (Une unité d'enzyme catalyse l'hydrolyse de une micromole d'acide gras par minute). L'activité spécifique de cette protéine est de 5 Unités par milligramme de protéine. A partir de ce milieu de culture, la protéine L25 a été enrichie par chromatographie sur une colonne d'échange d'ions Macroprep. Les protéines ont alors été séparées sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes et transférées sur membrane de nylon. La bande correspondant à la protéine L25 a été excisée et sa séquence N-terminale déterminée. La lipase a une séquence commençant par les acides aminés HLLHGSP. Ces résultats montrent donc que la lipase active présente la séquence indiquée en annexe.
Deux oligonucléotides, A64 et A65, ont été utilisés pour amplifier la partie mature de la protéine. Le fragment ainsi obtenu a été cloné dans le vecteur pET14b aux sites NdeI et BamHI pour permettre l'expression d'une protéine fusion contenant une séquence polyhistidine à l'extrémité N-terminale. Cette protéine fusion a été purifiée sur colonne de Nickel après expression du plasmide dans la souche d'E. coli BL21 (DE3). Cette protéine recombinante a été utilisée pour obtenir des anticorps dirigés contre la protéine L25. Ces anticorps ont été purifiés sur colonne de protéine A sépharose. Ils sont capables de détecter moins de 1 nanogramme de protéine L25 par la technique dite de dot blot .
Chez Arabidopsis thaliana, une plante modèle à réserves oléagineuses, lorsque les graines sont mise à germer à 18 C, les TAG restent au même niveau pendant deux jours, puis leur teneur chute rapidement jusqu'au 5ème jour (figure 1). Si on mesure l'activité TAG lipase sur des extraits de plantules, on remarque que cette activité est nulle les deux premiers jours et se développe rapidement pour atteindre un maximum vers le 5ème jour (figure 1). Il est donc raisonnable de penser que la disparition des TAG est due à l'activité lipase que l'on mesure à partir du 3ème jour. Les inventeurs ont mené des expériences d'immuno-soustraction pour déterminer la part d'activité lipase due à la protéine L25 dans la plantule en germination. Des extraits protéiques de plantules en germination (6ème jour) sont incubés avec des anticorps anti-L25 puis avec de la protéine A sépharose. Le complexe protéine A sépharose-Anticorpsantigène est ensuite éliminé par centrifugation. Cette expérience a pour objectif d'éliminer de l'extrait la protéine L25 spécifiquement. Une expérience témoin est réalisée avec des anticorps ne reconnaissant pas la protéine L25. L'activité lipase est déterminée après ces traitements et on observe que la quantité d'activité lipase est réduite de 50% dans l'extrait traité avec l'anticorps anti L25 par rapport à celui traité par l'anticorps témoin. Ces résultats montrent qu'au moins 50% de l'activité lipase détectée dans des plantules en germination est
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due à L25. Ils suggèrent fortement que L25 est impliquée dans la mobilisation des TAG lors de la germination d'Arabidopsis.
L'ADNc Atlip25 a été inséré dans le vecteur pBI121 (Clôntech) au site Smal, dans les orientations sens et antisens. Les plasmides résultants ont été introduits dans la souche d'agrobactérie GV3101 par electroporation et utilisés pour obtenir des plantes transgéniques d'Arabidopsis surexprimant un ARNm sens ou antisens. 60 lignées transgéniques ont été obtenues dont certaines présentent des activités lipases modifiées.
Matériel et méthodes
Matériel biologique
Les souches d' E. coli LE392 et DH5alpha, BL21 (DE3) ont été utilisées pour les expériences de routine et pour les expériences d'expression, respectivement (Sambrook and Russell, 2001). Les lignées cellulaires d'insectes Sf9 et High Five, ont été achetées auprès d'Invitrogen et utilisées respectivement pour l'amplification des virus recombinants et la production de protéines recombinantes. L'écotype Col :2 thaliana a été utilisé tout au long de l' étude.
Matériel biologique
Les souches d' E. coli LE392 et DH5alpha, BL21 (DE3) ont été utilisées pour les expériences de routine et pour les expériences d'expression, respectivement (Sambrook and Russell, 2001). Les lignées cellulaires d'insectes Sf9 et High Five, ont été achetées auprès d'Invitrogen et utilisées respectivement pour l'amplification des virus recombinants et la production de protéines recombinantes. L'écotype Col :2 thaliana a été utilisé tout au long de l' étude.
Croissance des plantes
Arabidopsis a été cultivé en lumière continue (100 mol photons.m-2.s-1) à 22 C. Pour les études réalisées au cours de la germination, les graines ont été préalablement stérilisées dans 30% d'eau de Javel et semées sur du papier filtre saturé par de la solution de Murashige and Skoog (SIGMA) dans des boites de Pétri. Ces boites ont été placées 5 jours à 4 C et les plantes mises à germer pendant 5 jours à l'obscurité à 18 C.
Arabidopsis a été cultivé en lumière continue (100 mol photons.m-2.s-1) à 22 C. Pour les études réalisées au cours de la germination, les graines ont été préalablement stérilisées dans 30% d'eau de Javel et semées sur du papier filtre saturé par de la solution de Murashige and Skoog (SIGMA) dans des boites de Pétri. Ces boites ont été placées 5 jours à 4 C et les plantes mises à germer pendant 5 jours à l'obscurité à 18 C.
Extraction des protéines
Toutes les étapes ont été réalisées sur la glace ou à 4 C. Les plantules ont été broyées dans un mortier dans une solution contenant 50 mM Tris-HCl pH 7. 5, 150 mM NaCl (10 ml de solution par gramme de tissu) et l'extrait a été plus finement homogénéisé dans un broyeur de Potter. L'extrait a été centrifugé 10 minutes à 18 000g et le surnageant prélevé en faisant attention à éviter la couche grasse à la surface. Les protéines ont été quantifiées selon Bradford (1976) en utilisant la sérum-albumine bovine comme référence et analysées par électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide selon Sambrook et al. (1989).
Toutes les étapes ont été réalisées sur la glace ou à 4 C. Les plantules ont été broyées dans un mortier dans une solution contenant 50 mM Tris-HCl pH 7. 5, 150 mM NaCl (10 ml de solution par gramme de tissu) et l'extrait a été plus finement homogénéisé dans un broyeur de Potter. L'extrait a été centrifugé 10 minutes à 18 000g et le surnageant prélevé en faisant attention à éviter la couche grasse à la surface. Les protéines ont été quantifiées selon Bradford (1976) en utilisant la sérum-albumine bovine comme référence et analysées par électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide selon Sambrook et al. (1989).
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Activité lipase
La trioléine tritiée (22 Ci.mmor1, NEN) a été préalablement purifiée par chromatographie sur couche mince de silice et dispersée dans le tampon de réaction. Après l'addition de l'extrait protéique, les concentrations finales dans l'essai étaient : Tris HCl pH7.5 : 40 mM; CaCl2: 20 mM, NaTDC: 4 mM ; BSA100mg/ml; Trioléine : 300 M (radioactivité spécifique : 0.1-0.5mCi.mmol-1). La concentration finale en protéines dans l'essai est d'environ 50 g.ml-1. Des fractions aliquotes (60 l) ont été prélevées tout au long de la réaction et immédiatement mélangées à 107 l d'une solution 150 mM NaOH, 150 mM NaCl et 1 ml de solvant (méthanol/heptane/chloroforme; 1.41/1/1.25; v/v/v). Dans ces conditions, les triglycérides restent dans la phase organique tandis que 80% des acides gras sont dans la phase aqueuse (Belfrage et Vaughan, 1969). Après séparation des phases par centrifugation, des fractions aliquotes de la phase aqueuse sont transférées dans des fioles contenant 8 ml de mélange scintillant Hionic Fluor (Packard) et la radioactivité déterminée dans un compteur à scintillation Beckman LS1801. L'activité spécifique est exprimée en unités internationales (1 UI = 1 mole d'acides gras relâchée par minute).
La trioléine tritiée (22 Ci.mmor1, NEN) a été préalablement purifiée par chromatographie sur couche mince de silice et dispersée dans le tampon de réaction. Après l'addition de l'extrait protéique, les concentrations finales dans l'essai étaient : Tris HCl pH7.5 : 40 mM; CaCl2: 20 mM, NaTDC: 4 mM ; BSA100mg/ml; Trioléine : 300 M (radioactivité spécifique : 0.1-0.5mCi.mmol-1). La concentration finale en protéines dans l'essai est d'environ 50 g.ml-1. Des fractions aliquotes (60 l) ont été prélevées tout au long de la réaction et immédiatement mélangées à 107 l d'une solution 150 mM NaOH, 150 mM NaCl et 1 ml de solvant (méthanol/heptane/chloroforme; 1.41/1/1.25; v/v/v). Dans ces conditions, les triglycérides restent dans la phase organique tandis que 80% des acides gras sont dans la phase aqueuse (Belfrage et Vaughan, 1969). Après séparation des phases par centrifugation, des fractions aliquotes de la phase aqueuse sont transférées dans des fioles contenant 8 ml de mélange scintillant Hionic Fluor (Packard) et la radioactivité déterminée dans un compteur à scintillation Beckman LS1801. L'activité spécifique est exprimée en unités internationales (1 UI = 1 mole d'acides gras relâchée par minute).
Analyse des triglycérides
Les plantules sont broyées dans un mortier et les lipides extraits selon Folch et al.
Les plantules sont broyées dans un mortier et les lipides extraits selon Folch et al.
(1957). Du sulfate de magnésium a été utilisé pour éliminer l'eau des échantillons. Après évaporation de la phase organique, les lipides neutres sont dissous dans un mélange hexane/isopropanol (3/1, v/v). Les lipides neutres sont ensuite analysés par chromatographie sur couche mince, après dépôt automatique effectué à l'aide d'un linomat IV (CAMAG), dans un mélange contenant heptane/éther/acide acétique (55/45/1; v/v/v) jusqu'à ce que le front de migration atteigne la moitié de la plaque. Les lipides ont été révélés par carbonification et les bandes quantifiées à l'aide d'un scanner en utilisant des quantités connues de triglycérides de référence (Carrière et al., 2000).
Techniques immunologiques
Des anticorps polyclonaux ont été obtenus en utilisant la protéine recombinante produite dans E. coli. La protéine (100 g solubilisés dans 8 M urée) a été émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund et injecté à trois reprises à 3 semaines d'intervalle. Les lapins ont été saignés 10 jours après la dernière injection. Les IgGs ont été isolés par chromatographie sur une colonne de proteinA sepharose. La détection des protéines après immuno-empreinte (Western blotting) a été réalisée par chemiluminescence (ECL, Roche).
Des anticorps polyclonaux ont été obtenus en utilisant la protéine recombinante produite dans E. coli. La protéine (100 g solubilisés dans 8 M urée) a été émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund et injecté à trois reprises à 3 semaines d'intervalle. Les lapins ont été saignés 10 jours après la dernière injection. Les IgGs ont été isolés par chromatographie sur une colonne de proteinA sepharose. La détection des protéines après immuno-empreinte (Western blotting) a été réalisée par chemiluminescence (ECL, Roche).
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Les expériences d'immuno-soustraction ont été réalisées de la façon suivante : l'extrait protéique a été incubé une heure à température ambiante avec la quantité appropriée d'IgG.
La protéine A sépharose a été ajoutée, le mélange incubé une heure à 4 C puis centrifugé à 15 000 g pendant 10 minutes. L'activité lipase a alors été mesurée dans le surnageant comme décrit plus haut.
Les incubations ont été réalisées sous agitation continuelle et la quantité de protéine A sépharose a été ajustée de telle sorte que la capacité de fixation totale soit de trois fois la quantité totale d'IgG ajoutée à l'extrait protéique.
Isolement d'ARN et transfert
Les ARN totaux ont été isolés selon la méthode de Kay et al. (1987) pour les plantules en germination et celle de Chomczynski et Sacchi (1987) pour les autres tissus. Les ARN ont été séparés sur gel de formaldéhyde ( 0. 66 M ) contenant 1. 5% d'agarose et transférés sur membrane de nylon (Nytran SPC, Schleicher et Schuell). Les membranes ont été incubées après transfert pendant 30 min à 80 C. Les hybridations ont été réalisées selon le protocole de Singh et Jones (1984), en utilisant des sondes radioactives marquées par amorçage aléatoire selon Sambrook et Russell (2001).
Les ARN totaux ont été isolés selon la méthode de Kay et al. (1987) pour les plantules en germination et celle de Chomczynski et Sacchi (1987) pour les autres tissus. Les ARN ont été séparés sur gel de formaldéhyde ( 0. 66 M ) contenant 1. 5% d'agarose et transférés sur membrane de nylon (Nytran SPC, Schleicher et Schuell). Les membranes ont été incubées après transfert pendant 30 min à 80 C. Les hybridations ont été réalisées selon le protocole de Singh et Jones (1984), en utilisant des sondes radioactives marquées par amorçage aléatoire selon Sambrook et Russell (2001).
Les ARN messagers ont été sélectionnés en utilisant le kit Oligotex de Qiagen. Le premier brin d'ADN complémentaire a été synthétisé en utilisant la transcriptase inverse Expand (Roche) et l'oligonucléotide C253 (gactcgagtcgacatcgattttttttttttttttt) comme amorce.
Clonage de l'ADNc
L'ADNc Atlip25 a été amplifié par PCR (à partir du premier brin d'ADNc obtenu comme décrit ci dessus) en utilisant les oligonucléotides A61 (AGCGTAGCGATATCAAAATCCACGAGAAGACAAA) et A62 (AGCGTAGCGATATCTACAATCAGATGTGTACATA) qui contiennent un site de clonage EcoRV. Les conditions de PCR étaient : 3' à 95 C, 30 cycles de l' à 94 C, l' à 58 C, 2' à 72 C, et 7' à 72 C. Les oligonucléotides A64 (Agcgtagcgatatcatatgcatctcctccatggatct) et A65 (Agcgtagcgatatcggatccatttaccaactactagac) ont été utilisés pour amplifier la phase de lecture de l'ADNc Atlip25 en utilisant les mêmes conditions de PCR excepté pour la température d'hybridation qui était de 60 C et le nombre de cycles qui était de 25. La polymérase Pfu (Promega) a été utilisée dans toutes les expériences.
L'ADNc Atlip25 a été amplifié par PCR (à partir du premier brin d'ADNc obtenu comme décrit ci dessus) en utilisant les oligonucléotides A61 (AGCGTAGCGATATCAAAATCCACGAGAAGACAAA) et A62 (AGCGTAGCGATATCTACAATCAGATGTGTACATA) qui contiennent un site de clonage EcoRV. Les conditions de PCR étaient : 3' à 95 C, 30 cycles de l' à 94 C, l' à 58 C, 2' à 72 C, et 7' à 72 C. Les oligonucléotides A64 (Agcgtagcgatatcatatgcatctcctccatggatct) et A65 (Agcgtagcgatatcggatccatttaccaactactagac) ont été utilisés pour amplifier la phase de lecture de l'ADNc Atlip25 en utilisant les mêmes conditions de PCR excepté pour la température d'hybridation qui était de 60 C et le nombre de cycles qui était de 25. La polymérase Pfu (Promega) a été utilisée dans toutes les expériences.
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Séquence N-terminale
La séquence N-terminale de la protéine transférée sur membrane de nylon (PVDF, Sigma) a été réalisée à l'aide d'un séquençeur Applied Biosystein 473A.
La séquence N-terminale de la protéine transférée sur membrane de nylon (PVDF, Sigma) a été réalisée à l'aide d'un séquençeur Applied Biosystein 473A.
Résultats
Activité lipase pendant la germination d'Arabidopsis
L'activité lipase a été mesurée à partir de protéines solubles extraites de plantules d'Arabidopsis en utilisant de la trioléine tritiée (figure 1). L'activité n'est pas détectable pendant les 2 premiers jours après imbibition. Au 3ème jour, les cotylédons émergent de l'enveloppe de la graine et l'activité lipase peut être détectée. Cette activité augmente pour atteindre un maximum au 5ème jour. L'évolution de la quantité de triglycérides montre une corrélation inverse ; les niveaux de triglycérides détectés au cours des 2 premiers jours restent similaire à ceux mesurés dans la graine sèche. Ils décroissent entre les jours 3 et 5. Il est donc probable que la disparition des triglycérides est liée à l'activité lipolytique détectée.
Activité lipase pendant la germination d'Arabidopsis
L'activité lipase a été mesurée à partir de protéines solubles extraites de plantules d'Arabidopsis en utilisant de la trioléine tritiée (figure 1). L'activité n'est pas détectable pendant les 2 premiers jours après imbibition. Au 3ème jour, les cotylédons émergent de l'enveloppe de la graine et l'activité lipase peut être détectée. Cette activité augmente pour atteindre un maximum au 5ème jour. L'évolution de la quantité de triglycérides montre une corrélation inverse ; les niveaux de triglycérides détectés au cours des 2 premiers jours restent similaire à ceux mesurés dans la graine sèche. Ils décroissent entre les jours 3 et 5. Il est donc probable que la disparition des triglycérides est liée à l'activité lipolytique détectée.
Clonage de l'ADNc
Plusieurs protéines ressemblant à des lipases ont été mises en évidence en analysant la séquence du génome d'Arabidopsis. Une de ces protéine présente une identité de séquence d'environ 30% avec la lipase gastrique de rat et a été appelée Atlip25. Des quantités égales d'ARN issus de sept lots de plantules collectés du premier au septième jour de germination ont été mélangées et leurs ARN messagers sélectionnés. Le premier brin d'ADNc a été synthétisé a partir de ces ARNm et l'ADNc correspondant à Atlip25 sélectivement amplifié par PCR. Le produit de PCR a été digéré par l'enzyme EcoRV et cloné dans le site EcoRV du plasmide pBluescript II KS+ (Stratagene) pour former le plasmide pL25. La séquence de l'insert a été déterminée sur les 2 brins et s'est avérée identique à la séquence prédite par l'analyse du génome d'Arabidopsis, à l'exception de la présence d'un intron supplémentaire.
Plusieurs protéines ressemblant à des lipases ont été mises en évidence en analysant la séquence du génome d'Arabidopsis. Une de ces protéine présente une identité de séquence d'environ 30% avec la lipase gastrique de rat et a été appelée Atlip25. Des quantités égales d'ARN issus de sept lots de plantules collectés du premier au septième jour de germination ont été mélangées et leurs ARN messagers sélectionnés. Le premier brin d'ADNc a été synthétisé a partir de ces ARNm et l'ADNc correspondant à Atlip25 sélectivement amplifié par PCR. Le produit de PCR a été digéré par l'enzyme EcoRV et cloné dans le site EcoRV du plasmide pBluescript II KS+ (Stratagene) pour former le plasmide pL25. La séquence de l'insert a été déterminée sur les 2 brins et s'est avérée identique à la séquence prédite par l'analyse du génome d'Arabidopsis, à l'exception de la présence d'un intron supplémentaire.
La séquence en acides aminés présente 27 % d'identité avec la lipase lysosomiale humaine et 28,7% d'identité avec celle de la lipase gastrique de chien (figure 2). Elle contient également un peptide signal putatif à l'extrémité N-terminale comme ces 2 enzymes.
Expression dans E. coli et production d'anticorps
La phase de lecture a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pL25 en utilisant un oligonucléotide choisi de telle sorte que l'ATG initiateur soit inclus dans un site Ndel au niveau du clivage du peptide signal putatif. Ce produit de PCR a été cloné dans un vecteur
La phase de lecture a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pL25 en utilisant un oligonucléotide choisi de telle sorte que l'ATG initiateur soit inclus dans un site Ndel au niveau du clivage du peptide signal putatif. Ce produit de PCR a été cloné dans un vecteur
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pET14b (Novagen) aux sites NdeI-BamHl. Le plasmide résultant a été introduit dans la souche BL21 (DE3) E. coli et la synthèse de la protéine recombinante induite par 1 mM IPTG pendant 2 heures, selon les protocoles standards (Sambrook and Russell, 2001). Les cellules ont été collectées par centrifugation et broyées par sonication. L'extrait brut de protéine ne présentait pas d'activité lipase et une analyse par gel de polyacrylamide a montré que la majeure partie de la protéine recombinante est dans des corps d'inclusion. Ceux-ci ont été collectés par centrifugation, lavés dans 4M Urée et solubilisés dans 8 M urée. La protéine recombinante a été purifiée à partir de la fraction soluble dans 8 M urée en utilisant une colonne de nickel. Cette protéine a été employée pour obtenir des anticorps après injection dans des lapins. Après dilution au millième, le sérum obtenu était capable de détecter 0.3 ng de protéine recombinante après révélation par la peroxydase.
Expression dans le système baculovirus/cellules d'insecte
Le fragment EcoRV du plasmide pL25 a été inséré dans le site Smal du plasmide pVL1393. Après vérification de l'orientation, le plasmide résultant a été utilisé pour produire un baculovirus recombinant après co-transfection avec le vecteur viral Baculogold (Pharmingen). Ce virus recombinant a été utilisé pour infecter des cellules High Five à une multiplicité d'infection de 3-5. Une activité lipase a été détectée, essentiellement (80 à 90%) dans le surnageant de culture avant la lyse de la cellule, ce qui veut dire que la protéine est sécrétée. La présence du produit du gène Atlip25 a été mise en évidence pendant l'infection par des mesures d'activité lipase ainsi que par immuno-empreinte ( figure 3). Une faible activité peut être détectée au jours 0 et 1 tandis que 20 10-3 UI peuvent être mesurées par ml de milieu de culture les jours 2,3 et 4. Les anticorps permettent de mettre en évidence le produit du gène At lip25 à partir du 2ème jour. Les niveaux les plus élevés sont détectés entre les 3ème et 5ème jours. Aucune activité lipase ne peut être détectée sur des cellules d'insecte infectées par le virus sauvage. Ces résultats montrent clairement que le gène Atlip25 code pour une enzyme ayant une activité triacylglycérol lipase. La quantité du produit Atlip25 a pu être estimée par immunoempreinte, en utilisant comme référence des quantités connues de protéine recombinante produite dans E. coli. Ainsi, au 3ème jour, le surnageant du milieu de culture contient environ 5 g.ml-1 du produit du gène atlip25. Une activité spécifique d'environ 4 UI.mg-1peut être estimée en utilisant la trioléine comme substrat.
Le fragment EcoRV du plasmide pL25 a été inséré dans le site Smal du plasmide pVL1393. Après vérification de l'orientation, le plasmide résultant a été utilisé pour produire un baculovirus recombinant après co-transfection avec le vecteur viral Baculogold (Pharmingen). Ce virus recombinant a été utilisé pour infecter des cellules High Five à une multiplicité d'infection de 3-5. Une activité lipase a été détectée, essentiellement (80 à 90%) dans le surnageant de culture avant la lyse de la cellule, ce qui veut dire que la protéine est sécrétée. La présence du produit du gène Atlip25 a été mise en évidence pendant l'infection par des mesures d'activité lipase ainsi que par immuno-empreinte ( figure 3). Une faible activité peut être détectée au jours 0 et 1 tandis que 20 10-3 UI peuvent être mesurées par ml de milieu de culture les jours 2,3 et 4. Les anticorps permettent de mettre en évidence le produit du gène At lip25 à partir du 2ème jour. Les niveaux les plus élevés sont détectés entre les 3ème et 5ème jours. Aucune activité lipase ne peut être détectée sur des cellules d'insecte infectées par le virus sauvage. Ces résultats montrent clairement que le gène Atlip25 code pour une enzyme ayant une activité triacylglycérol lipase. La quantité du produit Atlip25 a pu être estimée par immunoempreinte, en utilisant comme référence des quantités connues de protéine recombinante produite dans E. coli. Ainsi, au 3ème jour, le surnageant du milieu de culture contient environ 5 g.ml-1 du produit du gène atlip25. Une activité spécifique d'environ 4 UI.mg-1peut être estimée en utilisant la trioléine comme substrat.
Purification partielle de la protéine recombinante et séquence N-terminale
Un litre de milieu de culture prélevé au 4ème jour après infection a été tamponné à pH7.5 à l'aide de tampon HEPES ( 20 mM final) et chargé sur une colonne macroprep HiQ. La
Un litre de milieu de culture prélevé au 4ème jour après infection a été tamponné à pH7.5 à l'aide de tampon HEPES ( 20 mM final) et chargé sur une colonne macroprep HiQ. La
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colonne a été rincée avec 20 mM HEPES pH7. 5, 50 mM NaCl et les protéines éluées par un gradient de NaCl ( 0.05 - 1M). L'activité lipase était éluée à 300mM NaCl. Les fractions les plus actives ont été réunies et concentrées par filtration' sur membrane. Le facteur d'enrichissement était de 23. Les protéines ont été chargées sur gel de polyacrylamide et transférées sur membrane de nylon. Le produit du gène Atlip25 a été identifié, la bande correspondante excisée de la membrane et soumise au microséquençage. La séquence N- terminale s'est avérée être HLLHGSP, ce qui a confirmé l'existence d'un peptide signal clivé durant la sécrétion dans le milieu de culture.
Le produit du gène Atlip25 est présent pendant la germination
Une hybridation moléculaire réalisée sur des ARN extraits de plantules en germination montre que le gène Atlip25 est exprimé (figure 4). Un ARNm de taille voisine de 1. 6 kb est détecté à partir du 2ème jour. Le signal augmente jusqu'au 5ème jour et demeure constant par la suite jusqu'au 7ème jour.
Une hybridation moléculaire réalisée sur des ARN extraits de plantules en germination montre que le gène Atlip25 est exprimé (figure 4). Un ARNm de taille voisine de 1. 6 kb est détecté à partir du 2ème jour. Le signal augmente jusqu'au 5ème jour et demeure constant par la suite jusqu'au 7ème jour.
La lipase Atlip25 a été spécifiquement soustraite d'extraits protéiques réalisés à partir de plantules en germination en utilisant des anticorps spécifiques et l'activité lipase résiduelle a été déterminée. Lorsque l'on augmente la quantité d'anticorps utilisés, on observe une décroissance de l'activité lipase résiduelle ( figure 5). Lorsque l'on compare avec l'activité mesurée dans l'extrait initial traitée par des anticorps non-immun et en utilisant 300 g d'IgG et 10 g d'extrait protéique (about 0.2 mIU) provenant de germinations de 4 jours, 47. 6% +
6. 7 (n=7) de l'activité reste dans le surnageant. Les anticorps sont donc capables d'éliminer plus de 50% de l'activité lipase. La capacité des IgG de précipiter l'enzyme recombinante active produite dans le baculovirus a été testée dans des conditions similaires. Du surnageant de culture (Environ 0.2 UI d'activité lipase) a été incubé avec 300 g d'IgG. Dans ces conditions, la précipitation n'est pas complète et 30. 2% de l'activité reste dans le surnageant.
Ces résultats montrent bien que la majorité de l'activité lipase détectée au cours de la germination est due au produit du gène Atlip25.
6. 7 (n=7) de l'activité reste dans le surnageant. Les anticorps sont donc capables d'éliminer plus de 50% de l'activité lipase. La capacité des IgG de précipiter l'enzyme recombinante active produite dans le baculovirus a été testée dans des conditions similaires. Du surnageant de culture (Environ 0.2 UI d'activité lipase) a été incubé avec 300 g d'IgG. Dans ces conditions, la précipitation n'est pas complète et 30. 2% de l'activité reste dans le surnageant.
Ces résultats montrent bien que la majorité de l'activité lipase détectée au cours de la germination est due au produit du gène Atlip25.
Abréviations
NaTDC : Taurodésoxycholate de sodium
BSA : Sérum Albumine de boeuf
IgG : Immunoglobuline
PCR : polymerase chain reaction
IPTG : Isopropyl p-D-thiogalactopyranoside
NaTDC : Taurodésoxycholate de sodium
BSA : Sérum Albumine de boeuf
IgG : Immunoglobuline
PCR : polymerase chain reaction
IPTG : Isopropyl p-D-thiogalactopyranoside
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HEPES : (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonique acide]
Références
Sambrook J. et Russel D. W., 2001, Molecular Cloning : A laboratory manual, 3ème ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Bradford 1976 , A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 1976 May 7 ;72:248-54
Sambrook J., Fritsch E.F. et Maniatis T, 1989, Molecular Cloning : A laboratory manual, 2ème ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Belfrage et Vaughan J Lipid Res 1969 May;10(3):341-4 Simple liquid-liquid partition system for isolation of labeled oleic acid from mixtures with glycerides
Folch J., Lees M. et Stanley G. H. S., 1957, J. Biol. Chem., 226, 497.
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Chomczynski et Sacchi, 1987 Anal Biochem 1987 Apr;162(1):156-9. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.
Singh et Jones, 1984 Nucleic Acids Res 1984 Jul 25 ;12(14):5627-38The useof heparin as a simple cost-effective means of controlling background in nucleic acid hybridization procedures.
Carrière F., Renou C., Lopez V., De Caro J., Ferrato F., Lengsfeld H., De Caro A., Laugier R. & Verger R. (2000). The specific activities of human digestive lipases measured from the in-vivo and in-vitro lipolysis of test meals. Gastroenterology 119 : 949-960.
Kay R., Chan A., Daly M. and McPherson J. 1987, Duplication of CaMV 35S Promoter Séquences Creates a strong Enhancer for Plant Genes, Science, 236, 1299-1302.
Séquence des oligonucléotides :
A61 : AGCGTAGCGATATCAAAATCCACGAGAAGACAAA (SEQ ID NO : 5)
A62 : AGCGTAGCGATATCTACAATCAGATGTGTACATA (SEQ ID NO : 6)
A64 : AGCGTAGCGATATCATATGCATCTCCTCCATGGATCT (SEQ ID NO : 7)
A61 : AGCGTAGCGATATCAAAATCCACGAGAAGACAAA (SEQ ID NO : 5)
A62 : AGCGTAGCGATATCTACAATCAGATGTGTACATA (SEQ ID NO : 6)
A64 : AGCGTAGCGATATCATATGCATCTCCTCCATGGATCT (SEQ ID NO : 7)
<Desc/Clms Page number 16>
A65 : AGCGTAGCGATATCGGATCCATTTACCAACTACTAGAC (SEQ ID NO : 8)
Séquence nucléotidique de l'ADNc Atlip25 (SEQ ID NO: 1): gatatcaaaatccacgagaagacaaaaaagggtaatttgaaaattttcagatagaaacagtcccgtcaccggcgacgatgaaatggttg ctcgtcgccgtattgacctctcttacgatcttctccgccttaacacagtcccatctcctccatggatctccggtcaattctctctgcgctgatc tcattcatcccgctaattactcctgcactgaacacagtattcaaacaaaggatggttacatattagctcttcaacgtgtagcttctcttggtcc aagacttcaatctggtccacctgttttgcttcagcacggtctctttatggctggagatgtgtggttcttgaattcaccaaaagagtcactagg tttcattcttgctgatcatgggtttgatgtttgggttggaaatgttcgtggtacacgttacagttatggacatgtaactttgtctgacactgataa ggagttttgggactggagttggcaagatttggcaatgtatgacttggcagaaatgattcagtatctgtattcaatttcaaactccaaaattttc cttgttggacattctcaggggactatcatgtcttttgctgctcttactcagccgcatgttgcggaaatggttgaagcagctgcgttgctttgtc caatatcatatttggatcatgtcacagctcctcttgttgaaagaatggtttttatgcatctcgatcagatggtagttgctcttgggctgcatcaa ataaactttagaagtgatatgttagttaaacttgttgattcgttatgcgaagggcatatggattgcactgatttcctcacatccataacaggga cgaattgttgtttcaacgcctcgaagatagaatactatctagattacgagcctcacccatcatctgtcaagaatattcgacatcttttccaaat gattcggaagggaacctttgcacaatacgactacgggtatttcaaaaatctacggacttatgggctgtcgaaacctccagaattcatacta agccacatcccggcatcattaccaatgtggatggggtatggtggaactgatggtttagcagatgtgacagatgtggaacatactctcgc ggaactaccttccagtccagagttactatatcttgaggattatggtcacattgactttgtgcttggctcaagtgctaaagaagatgtctataa gcacatgattcaatttttcagagcaaaggttaagtctagtagttggtaaaatactaaatactctgttctgctttgcacatatttatcttccacaaa tatatgtacacatctgattgtagatatc
Séquence déduite de l'ADNc (SEQ ID NO : 2) mkwllvavltsltifsaltqshllhgspvnslcadlihpanysctehsiqtkdgyilalqrvaslgprlqsgppvllqhglfinagdvwf lnspkeslgfiladhgfdvwvgnvrgtrysyghvtlsdtdkefwdwswqdlamydlaemiqylysisnskiflvghsqgtimsfa
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Séquence protéique de la protéine L25 (SEQ ID NO : 4) hllhgspvnslcadlihpanysctehsiqtkdgyilalqrvaslgprlqsgppvllqhglfinagdvwflnspkeslgfiladhgfdv wvgnvrgtrysyghvtlsdtdkefwdwswqdlamydlaemiqylysisnskiflvghsqgtimsfaaltqphvaemveaaallc
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Séquence nucléotidique de l'ADNc Atlip25 (SEQ ID NO: 1): gatatcaaaatccacgagaagacaaaaaagggtaatttgaaaattttcagatagaaacagtcccgtcaccggcgacgatgaaatggttg ctcgtcgccgtattgacctctcttacgatcttctccgccttaacacagtcccatctcctccatggatctccggtcaattctctctgcgctgatc tcattcatcccgctaattactcctgcactgaacacagtattcaaacaaaggatggttacatattagctcttcaacgtgtagcttctcttggtcc aagacttcaatctggtccacctgttttgcttcagcacggtctctttatggctggagatgtgtggttcttgaattcaccaaaagagtcactagg tttcattcttgctgatcatgggtttgatgtttgggttggaaatgttcgtggtacacgttacagttatggacatgtaactttgtctgacactgataa ggagttttgggactggagttggcaagatttggcaatgtatgacttggcagaaatgattcagtatctgtattcaatttcaaactccaaaattttc cttgttggacattctcaggggactatcatgtcttttgctgctcttactcagccgcatgttgcggaaatggttgaagcagctgcgttgctttgtc caatatcatatttggatcatgtcacagctcctcttgttgaaagaatggtttttatgcatctcgatcagatggtagttgctcttgggctgcatcaa ataaactttagaagtgatatgttagttaaacttgttgattcgttatgcgaagggcatatggattgcactgatttcctcacatccataacaggga cgaattgttgtttcaacgcctcgaagatagaatactatctagattacgagcctcacccatcatctgtcaagaatattcgacatcttttccaaat gattcggaagggaacctttgcacaatacgactacgggtatttcaaaaatctacggacttatgggctgtcgaaacctccagaattcatacta agccacatcccggcatcattaccaatgtggatggggtatggtggaactgatggtttagcagatgtgacagatgtggaacatactctcgc ggaactaccttccagtccagagttactatatcttgaggattatggtcacattgactttgtgcttggctcaagtgctaaagaagatgtctataa gcacatgattcaatttttcagagcaaaggttaagtctagtagttggtaaaatactaaatactctgttctgctttgcacatatttatcttccacaaa tatatgtacacatctgattgtagatatc
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Séquence protéique de la protéine L25 (SEQ ID NO : 4) hllhgspvnslcadlihpanysctehsiqtkdgyilalqrvaslgprlqsgppvllqhglfinagdvwflnspkeslgfiladhgfdv wvgnvrgtrysyghvtlsdtdkefwdwswqdlamydlaemiqylysisnskiflvghsqgtimsfaaltqphvaemveaaallc
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<Desc/Clms Page number 17>
Séquence de la protéine exprimée dans E. coli qui a permis d'obtenir des anticorps ( SEO ID NO : 9) :
mgsshhhhhhssglvprgshshllhgspvnslcadlihpanysctehsiqtkdgyilal'qrvaslgprlqsgppvllqhglfmagd vwflnspkeslgfiladhgfdvwvgnvrgtrysyghvtlsdtdkefwdwswqdlamydlaemiqylysisnskiflvghsqgti msfaaltqphvaemveaaallcpisyldhvtaplvermvfmhldqmvvalglhqinfrsdmlvklvdslceghmdctdfltsitg tnccfnaskieyyldyephpssvknirhlfqmirkgtfaqydygyfknlrtyglskppefilshipaslpmwmgyggtdgladvtd vehtlaelpsspellyledyghidfvlgssakedvykhmiqffrakvksssw
Détail de la mesure de l'activité lipase :
L'activité lipase a été mesurée en utilisant un triacylglycérol (TAG) à longue chaîne et radioactif: la trioléine (9-10 3H) tritiée. Avant utilisation, le substrat radioactif est systématiquement repurifié par chromatographie sur couche mince. Lorsque l'activité est mesurée sur des plantules d'Arabidopsis en germination, celles ci sont cultivées en conditions stériles pour éviter toute contamination possible par des lipases de champignons. Lorsque l'activité est mesurée sur un milieu de culture de cellules d'insectes infectées par un virus recombinant, un témoin est réalisé en mesurant l'activité lipase à partir d'un milieu de culture de cellules d'insectes infectées par un virus non recombinant ; aucune activité n'a jamais été détectée sur ce témoin.
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Détail de la mesure de l'activité lipase :
L'activité lipase a été mesurée en utilisant un triacylglycérol (TAG) à longue chaîne et radioactif: la trioléine (9-10 3H) tritiée. Avant utilisation, le substrat radioactif est systématiquement repurifié par chromatographie sur couche mince. Lorsque l'activité est mesurée sur des plantules d'Arabidopsis en germination, celles ci sont cultivées en conditions stériles pour éviter toute contamination possible par des lipases de champignons. Lorsque l'activité est mesurée sur un milieu de culture de cellules d'insectes infectées par un virus recombinant, un témoin est réalisé en mesurant l'activité lipase à partir d'un milieu de culture de cellules d'insectes infectées par un virus non recombinant ; aucune activité n'a jamais été détectée sur ce témoin.
Le substrat radioactif est dispersé dans le milieu d'incubation qui contient 40 mM Tris-HCl pH7. 5, CaCl2 20mM, taurodéoxycholate de sodium 4mM, sérum albumine bovine 100 microgrammes par ml, trioleine, 300 micromolaires-radioactivité spécifique 0. 1 à 0.5 mCi/mmol-. La concentration finale de protéines (extrait à tester) dans le test est d'environ 50 microgrammes par ml. Le mélange est incubé à température ambiante et des aliquots sont prélevés à différents moments. Un aliquot de 60 microlitre est mélangé avec 107 microlitres d'une solution de 150mM NaOH et 150mM NaCl et avec 1 ml de solvant (méthanol/heptane/chloroforme, 1.41/1/1.25). Dans ces conditions, les inventeurs ont vérifié que la totalité des TAG reste dans la phase organique tandis que 80% des acides gras sont dans la phase aqueuse. On prélève alors des aliquots de la phase aqueuse qui sont transférés dans des fioles à scintillation. La radioactivité est mesurée dans un compteur à scintillation et la quantité d'acides gras libérée calculée à partir de cette mesure. Les cinétiques sont linéaires dans le cas des mesures faites à partir d'extraits d'arabidopsis pendant au moins trente minutes et pendant au moins 5 minutes en ce qui concerne les surnageants de cultures de cellules d'insecte. Les activités sont toujours calculées à partir des vitesses initiales.
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Légende de la figure 1 : des TAG et de l'activité lipase au cours de la germination d'arabidopsis
Les triacylglycérols (carrés pleins) ont été extraits à ' partir de 5000 plantules en germination et quantifiés par chromatographie sur couche mince. L'activité lipase (ronds creux) a été mesurée sur une émulsion de trioléine tritiée, les acides gras étant sélectivement extraits et séparés des TAG par une extraction avec un mélange approprié de solvants, à pH basique.
Les triacylglycérols (carrés pleins) ont été extraits à ' partir de 5000 plantules en germination et quantifiés par chromatographie sur couche mince. L'activité lipase (ronds creux) a été mesurée sur une émulsion de trioléine tritiée, les acides gras étant sélectivement extraits et séparés des TAG par une extraction avec un mélange approprié de solvants, à pH basique.
Claims (31)
1. Triacylglycérol (TAG) lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana représentée par la séquence SEQ ID NO : 2 comprenant un peptide signal de 21 acides aminés situés aux positions 1 à 21 de SEQ ID NO : 2, et caractérisée en ce que sa forme mature est représentée par la séquence peptidique SEQ ID NO : 4, ou fragment de cette lipase, ou un variant de cette lipase ou dudit fragment par substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ledit variant ayant un pourcentage d'identité d'au moins environ 60 %, et de préférence d'au moins environ 70 %, ou un pourcentage de similarité d'au moins environ 80 %, avec ladite TAG lipase ou ledit fragment de cette dernière, ledit fragment ou variant ayant une activité enzymatique de TAG lipase telle que représentée par SEQ ID NO : 2, à savoir une activité d'hydrolyse des huiles tels que les triacylglycérols à longues chaînes, notamment la trioléine.
2. TAG lipase, ou fragment ou variant de cette dernière selon la revendication 1, tels qu'obtenus par transformation de cellules d'insectes à l'aide de vecteurs contenant une séquence d'ADN codant pour ladite TAG lipase, telle que la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, ou codant pour un fragment ou un variant selon la revendication 1, et récupération, le cas échéant après purification, de la TAG lipase ou fragment ou variant selon la revendication 1 produits par lesdites cellules ainsi transformées.
3. TAG lipase, ou fragment ou variant de cette dernière selon la revendication 1 ou 2, tels qu'obtenus à partir de cellules de la lignée Sf9 de Sporoptera frugiperda infectées par un baculovirus lui-même transformé à l'aide d'un plasmide contenant la séquence d'ADN codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant selon la revendication 1.
4. Séquence nucléotidique codant pour la TAG lipase ou fragment ou variant tels que définis dans la revendication 1.
5. Séquence nucléotidique selon la revendication 4, correspondant : - à la séquence représentée par SEQ ID NO : 1, codant pour la TAG lipase recombinante d'Arabidopsis thaliana sous forme mature représentée par la séquence peptidique SEQ ID NO : 2,
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@ - ou à la séquence représentée par SEQ ID NO : 3, codant pour la TAG lipase susmentionnée précédée d'un peptide signal représentée par SEQ ID NO : 4, ou toute séquence dérivée de SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3, par dégénérescence du code génétique, et codant pour SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 4 respectivement.
6. Séquence nucléotidique recombinante comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 4 ou 5, en association avec les éléments essentiels à la transcription de cette dernière, notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
7. Vecteurs, tels que plasmides ou baculovirus, contenant une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 6.
8. Cellules hôtes transformées à l'aide d'un vecteur selon la revendication 7.
9. Cellules hôtes selon la revendication 8, choisies parmi les cellules d'insectes, telles que la lignée Sf9 de Sporoptera frugiperda, transformées par un baculovirus en tant que vecteur.
10. Procédé de préparation d'une TAG lipase recombinante, ou fragment ou variant de cette dernière tels que définis dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules hôtes transformées selon la revendication 8 ou 9, et la récupération, le cas échéant après purification, de la TAG lipase ou fragment ou variant susmentionnés produits dans lesdites cellules.
11. Séquence nucléotidiques antisens complémentaires des séquences nucléotidiques définies dans les revendications 4 et 5.
12. ADN ou ARN antisens selon la revendication 11, capables de s'hybrider in vitro et in planta respectivement avec l'ADN ou l'ARN codant pour la TAG lipase représentée par SEQ ID NO : 2 ou 4.
13. ADN ou ARN antisens selon la revendication 12, caractérisés en ce que leur taille est comprise entre environ 200 et environ 1500 nucléotides, et en ce qu'ils s'hybrident avec la région de la séquence SEQ ID NO : 1 ou 3 constituée des nucléotides complémentaires de ces derniers.
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14. Vecteurs, tels que plasmides ou Agrobacterium tumefaciens, contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 11à 13.
15. Cellules transgéniques de plantes, ou fragments de plantes, telles que racines, tiges, feuilles, notamment de plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, transformées avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 à 6 ou 11 à 13, le cas échéant à l'aide d'un vecteur selon la revendication 14.
16. Plantes transgéniques transformées avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 à 6 ou 11 à 13, notamment plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, telles qu'obtenues à partir de cellules ou fragments de plantes selon la revendication 15.
17. Semences transgéniques transformées avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 à 6 ou 11 à 13, notamment semences de plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, telles qu'obtenues à partir du croisement de plantes selon la revendication 16.
18. Plantes transgéniques transformées avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 à 6 ou 11 à 13, notamment plantes oléagineuses telles que Arabidopsis thaliana, ou colza, telles qu'obtenues à partir de semences selon la revendication 17.
19. Utilisation de séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 4 à 6 ou 11à 13, pour la mise en #uvre de procédés d'obtention de plantes transgéniques au sein desquelles l'activité TAG lipase est modulée, et la quantité et/ou la qualité des huiles biosynthétisées au sein desdites plantes transgéniques sont modifiées par rapport à la quantité et/ou la qualité de ces mêmes huiles chez les plantes sauvages.
20. Procédé d'obtention de plantes transgéniques au sein desquelles l'activité TAG lipase est modulée, et la quantité et/ou la qualité des huiles biosynthétisées au sein desdites plantes transgéniques sont modifiées par rapport à la quantité et/ou la qualité de ces mêmes huiles chez les plantes sauvages, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes selon la revendication 15 jusqu'à l'obtention de plantes transformées entières selon la revendication 16.
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21. Procédé d'obtention de plantes transgéniques telles que définies dans la revendication 19, au sein desquelles l'activité TAG lipase est augmentée, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes selon la revendication 15 transformées avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 à 6.
22. Procédé d'obtention de plantes transgéniques telles que définies dans la revendication 19, au sein desquelles l'activité TAG lipase est diminuée, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes selon la revendication 15 transformées avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 11 à 13.
23. Procédé d'obtention de plantes transgéniques telles que définies dans la revendication 19, au sein desquelles l'activité TAG lipase est diminuée selon un mécanisme de co-suppression, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules ou fragments de plantes selon la revendication 15 transformées avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 à 6.
24. Utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un adjuvant de nutrition, ou d'un médicament, pour l'alimentation ou le traitement des sujets atteints de déficiences en lipases digestives, notamment en lipases gastriques.
25. Adjuvant de nutrition, caractérisé en ce qu'il comprend une TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 3.
26. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 3, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
27. Utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 3, dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de bioconversions enzymatiques d'huiles telles que l'huile de colza.
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28. Utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 3, dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de résolution de composés racémiques.
29. Utilisation de la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 3, dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de fabrication de lessives.
30. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la TAG lipase, ou fragment, ou variant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 3.
31. Utilisation d'anticorps définis dans la revendication 30 dans le cadre de la mise en #uvre de procédés de détection et d'identification de lipases végétales.
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