FR2738914A1

FR2738914A1 - Procede et kit pour la mesure de la phototoxicite d'un produit in vitro

Info

Publication number: FR2738914A1
Application number: FR9511041A
Authority: FR
Inventors: Christophe Chesne
Original assignee: BIOPREDIC
Current assignee: BIOPREDIC
Priority date: 1995-09-20
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 1997-03-21

Abstract

Le procédé selon l'invention pour l'évaluation in-vitro du potentiel phototoxique d'un produit par mesure de la viabilité des cellules après leur mise en contact avec le produit à tester et l'irradiation du système cellule/produit à tester est caractérisée par le fait que le produit à tester est apporté par un matériau poreux. Ce procédé peut être réalisé à l'aide d'un kit renfermant les cellules et les réactifs nécessaires pour effectuer l'évaluation.

Description

PROCEDE ET KIT POUR LA MESURE DE LA
PHOTOTOXICITE D'UN PRODUIT IN VITRO
L'invention a pour objet un procédé et un kit pour évaluer le potentiel phototoxique d'un produit in vitro.

On sait que sous l'effet des rayons solaires de nombreux produits peuvent générer des métabolites phototoxiques.

I1 en est ainsi notamment des produits appliqués sur la peau.

Pour la protection du consommateur, il est donc important d'évaluer le comportement, vis-à-vis des rayons solaires, des produits utilisés, en particulier la capacité de ces produits à former des métabolites phototoxiques.

Pour évaluer ces effets, on a le plus souvent recours à des modèles animaux. Mais la validité de ces résultats et leur extrapolation à l'homme font l'objet de nombreuses contestations. S'il est possible de recourir à des volontaires humains, ce type d'expérimentation n'apparaît pas cependant souhaitable, aussi bien sur le plan éthique qu'économique, tout au moins pour le développement de formulations et le criblage de produits.

De nombreux modèles in vitro ont été proposés, qui permettent de modéliser la production de ces métabolites phototoxiques à partir des produits à 1 'essai.

Ces méthodes reposent sur des approches physiques, biochimiques ou cellulaires, ces dernières présentant l'avantage d'apporter des réponses globales à la question posée, sans rentrer dans des considérations mécanistiques.

D'une manière générale, les méthodes cellulaires comprennent la mise en contact du produit à tester et de cellules, l'irradiation du système produit à tester/cellule et la mesure de la viabilité cellulaire.

Cependant, les méthodes cellulaires proposées à ce jour ont été essentiellement mises au point pour des produits purs et ne sont applicables pour des produits lipophiles que dans la gamme de solubilité dans le milieu de culture de ces cellules. Cette concentration peut donc être très éloignée de celle qui sera utilisée dans la formulation commerciale. Par ailleurs, lorsque les essais sont réalisés sur des formulations, il est nécessaire de les diluer, d'où le risque d'une destructuration.

L'invention apporte une solution à ce problème en proposant un procédé et un kit permettant de tester le potentiel phototoxique de produits quelles que soient leurs caractéristiques physico-chimiques, notamment leur hydrophilie ou leur lipophilie et qu'il s'agisse des matières premières, pures ou en mélange, ou des produits finis.

Le procédé selon l'invention, pour tester le potentiel phototoxique d'un produit, est caractérisé par le fait que le produit à tester est apporté par un matériau poreux.

I1 s'agit d'un matériau poreux capable d'absorber, puis de relarguer le produit à tester et ses métabolites.

Des matériaux de ce type comprennent des produits mucilagineux et des compositions dont les solutions se prennent en gelée à la température ambiante, comme la gélose ou le collagène, ou des gels colloïdaux comme les alginates.

Ces différents matériaux poreux permettent d'apporter juste une pellicule de produits au contact des cellules, ce qui facilite l'étape ultérieure de rinçage.

Des biomatériaux et polymères plastiques inertes sont également utilisables, tels que ceux élaborés à partir de polyoléfines frittées, comme le polyéthylène haute densité, le PVC et le polypropylène.

On citera également les esters de cellulose ou des polyamides comme le nylon.

Ces différents matériaux poreux peuvent être mis en forme comme souhaité.

L'étape de mise en contact du produit à tester et des cellules est réalisée dans un récipient ou cuvette, tel qu'un puits de multipuits.

Le matériau poreux imprégné ou supportant le produit à tester présente une forme et une dimension permettant d'assurer son contact avec la surface des cellules contenues dans le récipient ou cuvette, notamment dans le puits des multipuits.

Ce matériau poreux se présente alors avantageusement sous forme bouchon.

On dispose ainsi de moyens permettant d'assurer à la fois la diffusion du produit à tester dans les cellules et de fermer les récipients ou cuvettes.

Ces bouchons peuvent être préparés en ajoutant le produit à tester au matériau poreux, en solution ou en suspension, puis en opérant une mise en forme par coulage dans un récipient ou cuvette identique à celui renfermant les cellules. En variante, le bouchon de matériau poreux est tout d'abord préparé selon la forme et dimension souhaitées, puis on fait pénétrer à l'intérieur le produit à tester, sous vide ou sous pression.

Les concentrations en produit à tester sont choisies dans la gamme de solubilité, ou de mise en suspension.

Après l'étape de mise en contact, le bouchon peut être facilement éliminé, ce qui présente l'avantage d'éviter la présence de produit au contact des cellules lors de l'irradiation.

Les cellules sont utilisées en monocouches, horizontales ou verticales, sur des supports tels que des billes, ou dans ces supports. Elles sont choisies comptetenu de leur stabilité et de leur facilité d'obtention.

A titre d'exemple, on citera les fibroblastes, les cellules SIRC, 3T3, ou encore les kératinocytes. Il peut s'agir aussi de cellules de levures, de bactéries ou de microalgues.

L'étape de mise en contact est réalisée en l'absence de tout milieu et à l'abri de l'air.

Il s'avère ainsi avantageux d'éliminer le milieu de transport, ou le milieu nutritif, par exemple par simple retournement du récipient, de préférence suivi d'un ou plusieurs rinçages à l'aide de tampons.

La formation de bulles d'air, qui perturberait la diffusion du produit à l'essai, du matériau poreux vers les cellules, doit être évitée. On procèdera donc avantageusement à l'évacuation de l'air qui pourrait se situer entre les cellules et le matériau poreux imprégné du produit à tester.

La mise en contact des produits à tester avec les cellules est effectuée à une température ambiante ou contrôlée. Le temps de contact varie selon les systèmes produits/cellules de 1 à plusieurs heures. Il s'agit de permettre aux produits à tester de diffuser dans les cellules et d'exercer leurs effets.

L'irradiation du système ainsi préparé est effectuée au niveau des cellules, à l'aide de rayonnements UVA et, en faible quantité, de manière à éviter une destruction des cellules, ou de rayonnements
WB et/ou visibles.

On remarquera donc que, conformément à l'invention, le contact produit à tester/cellule dans lesdits récipients ou cuvettes s'effectue par le dessus, alors que l'activation des produits chimiques par les W s'effectue par le dessous, c'est-à-dire au niveau des cellules.

Les conditions de l'étape d'irradiation sont choisies de manière à à obtenir une irradiation homogène et constante
Une énergie de l'ordre de 5 J/cm2 est appliquée pendant la durée de l'irradiation de 30 min avec des WA.

Cette étape est réalisée dans des conditions stériles ou propres et avec un milieu d'irradiation permettant de potentialiser la phototoxicité, ou au contraire assurant une protection vis-à-vis des agents générateurs de phototoxité.

Après l'étape d'irradiation, les cellules sont mises en contact avec un indicateur afin d'évaluer le pourcentage de cellules viables.

Cette révélation est effectuée avantageusement en ayant recours, de manière classique, à un agent colorant des cellules, les plus utilisé étant le rouge neutre. Ces protocoles classiques dits MTT ou FDA peuvent aussi être retenus.

De manière préférée, avant l'étape de révélation, les cellules sont soumises, à au moins une étape de rinçage, de manière à éliminer des cellules, les produits à tester et les métabolites et d'assurer que les mesures de viabilité ne correspondent qu'aux effets de la phase d'irradiation.

Les dégâts produits par l'irradiation n'étant pas toujours visibles immédiatement, il est en outre préférable de laisser les cellules incuber pendant un temps suffisant pour que les altérations subies produisent totalement leurs effets, avant d'effectuer des mesures.

Les dispositions qui précèdent permettent d'évaluer le potentiel phototoxique aussi bien de produits, qu'en mélange, tel qu'utilisés dans les formulations commerciales.

Le procédé de l'invention est utilisable aussi bien avec des produits chimiques purs, que des produits dilués ou des produits formulés;
Ce procédé est ainsi particulièrement approprié pour des filtres solaires ou des principes actifs de médicaments, des produits dilués par exemple dans l'alcool, donc partiellement transformés comme certains filtres solaires ou des produits formulés comme les parfums, les extraits parfumés, les bases parfumantes, la cosmétique blanche (crème et lait), les agents moussants, les fards ou encore les déchets contenant des produits toxiques ou des extraits végétaux.

D'autes applications avantageuses du procédé de l'invention concernent les matières premières non hydrosolubles, comme les psoralènes, dont l'utilisation dans les proposés à ce jour, se heurte à de nombreuses difficultés, ou encore à des produits hydrophobes.

L'invention vise également un kit pour la mesure de la phototoxicité in vitro.

Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend
- les cellules en culture
- un ou plusieurs réactifs liquides nécessaires à la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.

Les plaques de culture multi-puits constituent à ce jour les supports les plus aisément disponibles et seront donc à ce titre avantageusement mises en oeuvre.

Les plaques de culture du kit renferment un tapis cellulaire adhérent au fond de chaque puits, ces puits étant transparents aux W. Les cultures sont avantageusement dans un milieu permettant de les placer dans un état métabolique approprié pour leur transport, qui est ensuite remplacé pour la réalisation du procédé.

Les plaques, ou autres supports, sont pourvus de moyens permettant d'assurer leur stérilité, leur étanchéité, et l'absence ou la quasi absence d'air pendant leur transport. Ces moyens de fermeture sont assurés par exemple par des bouchons fermant chaque puits et le recouvrement de l'ensemble par une feuille, notamment un film auto-collant, l'ensemble étant alors recouvert d'un couvercle rigide.

On utilise avantageusement le kit faisant l'objet du brevet FR 2 698 375.

Les réactifs liquides du kit comprennent au moins l'un des produits suivants : des milieux nutritifs, un ou plusieurs indicateurs de viabilité, un ou plusieurs tampons, un ou plusieurs réactifs de lyse, ainsi que des composés de référence.

Des indicateurs de viabilité préférés sont constitués par des colorants, l'un des plus utilisés dans les tests cellulaires de phototoxicité in-vitro étant le rouge neutre.

Ces kits peuvent être stockés à température contrôlée de 24 à 48 h environ avant utilisation. Une température de l'ordre de 8 à 20iC convient généralement.

Afin d'illustrer l'invention, on rapporte ciaprès des exemples de mise en oeuvre. Dans ces exemples, il sera fait référence aux figures 1 à 5, qui représentent, respectivement les pourcentages de viabilité des cellules en fonction de la concentration
- en produits chimiques purs de filtres solaires (figures lA à lC),
- en médicaments (figures 2A à 2C),
- en conservateur utilisé en cosmétique (figure 3),
- en produits finis du domaine de la cosmétique blanche (figure 4), et
- en parfums (figures 5A à C).

Dans ces différentes figures, les courbes en traits discontinus correspondent aux exppériences sans UVA et celles en traits continus avec WA.

1. Exemple de kit
Ce kit comprend les cellules en culture et des réactifs liquides permettant la mise en oeuvre du procédé de l'invention.

- les cellules en culture
On dispose d'une plaque de culture à 24 puits contenant des cellules SIRC confluentes. Ces cellules forment un tapis, appelé tapis cellulaire, adhérent au fond de chaque puits.

Ces cellules se trouvent dans un milieu approprié pour leur transport, qui sera remplacé pour la réalisation des expériences.

Chaque puits porte un bouchon en plastique qui permet de garantir la stérilité, l'étanchéité et l'absence ou la quasi-absence d'air pendant le transport.

La plaque et les bouchons sont recouverts d'un fil autocollant. L'ensemble est recouvert par un couvercle rigide.

- Les réactifs liquides
Les réactifs suivants sont fournis dans des flacons de différentes tailles.

- un flacon de grande taille étiqueté "milieu nutritif (IXj", contenant 50 ml de milieu nutritif concentré une fois,
- un flacon de taille moyenne étiqueté "colorant vital", contenant 15 ml de colorant vital concentré deux fois,
- un flacon de taille moyenne étiqueté "milieu nutritif [2X]", contenant 15 ml de milieu nutritif (concentré 2 fois),
- un flacon de grande taille étiqueté "PBS", contenant 50 ml de PBS,
- un flacon de taille moyenne étiqueté "fixateur", contenant 25 ml de fixateur,
- un flacon de taille moyenne étiqueté "réactif de lyse", contenant 25 ml de réactif de lyse,
- un flacon de grande taille étiqueté "tampon", contenant 250 ml de tampon,
- un flacon de petite taille étiqueté "composé de référence n 1", contenant 4 ml du composé de référence n 1 comme le 8 méthoxy psoralène (référence positive) l'acide P-amino benzoïque (référence négative).

- un eppendorf étiqueté "composé de référence n 2", contenant 100 pl du composé de référence n0 2.

Une ou deux plaques de culture à 24 puits permettent de servir de moule pour l'élaboration de bouchons de matériau poreux.

2. Matériel utilisé pour la réalisation du procédé
- Une étuve réglée à 370C par exemple un incubateur pour la bactériologie, la plage de régulation acceptable étant de l-C autour de la température de consigne, ou un bain-marie à 37il, dont la température est contrôlée avec un thermomètre, la plage de régulation acceptable étant de lC autour de la température de consigne, les tolérances pouvant être plus larges avec certains appareils,
- un spectrophotomètre standard équipé de cuves appropriées et permettant une lecture à la longueur d'onde de 540 nm, ou un lecteur de plaques de type "immunologie" permettant la lecture des plaques 96 puits,
- une balance d'une portée d'au moins 5 grammes, permettant une mesure précise au centième de gramme,
- une table W délivrant une énergie d'irradiation en UVA de 3mW/cm2/seconde,
- un four à micro-ondes,
- une tige à soniquer.

Le petit matériel de laboratoire suivant sera réuni pour faciliter une réalisation rapide des essais
- des tubes à essai en verre ou en plastique d'un volume minimum de 30 ml, pour solubiliser ou mettre en suspension le matériau poreux utilisé,
- un emporte-pièce,
- des tubes à essai en verre ou en plastique d'un volume de 5 mi, pour réaliser les dilutions des produits à essai,
- des bouchons pour les tubes à essai,
- une spatule, pour prélever les produits à l'essai de consistance solide lors des dilutions,
- un "cutter" pour découper le film plastique,
- un récipient d'un volume minimum de 100 ml, par exemple un bécher, pour rejeter le milieu de transport de la plaque 24 puits,
- un chronomètre ou un minuteur,
- une pipette de 1 ml, en verre ou en plastique ou une pipette automatique de type Gilson par exemple, ou une pipette multicanaux (4 canaux) de type Finnpipette ou
Gilson, ce qui permet de traiter les puits 4 par 4,
- une pipette de 10 ml, en verre ou en plastique,
- des feuilles de papier absorbant.

On prévoit en outre
- un demi-litre d'eau distillée de qualité laboratoire,
- une quantité minimum de 1,5 g de chacun des produits à tester.

3. Evaluation de la phototoxicité d'un produit.

On effectue successivement les étapes suivantes:
- préparation des cellules.

Les cellules contenues dans les récipients ou cuvettes sont placées dans un milieu nutritif approprié,
- préparation des bouchons de matériau poreux.

On incorpore le produit à tester ou des produits de référence, à la concentration désirée, dans le matériau poreux auquel on donne ensuite la forme souhaitée en utilisant comme moule une plaque multipuits.

- On met en contact le matériau imprégné ainsi préparé avec les cellules pendant 1 h 30 mn.

- Le système est ensuite irradié durant 29 min et après rinçage du tapis cellulaire pendant 5 minutes, on soumet les cellules à une incubation avec un agent indicateur de viabilité cellulaire pendant 3 h et 15 minutes.

On laisse la lyse des cellules s'opérer, puis on procède aux mesures spectrophotométriques.

4. Exemple de réalisation d'un test de mesure de phototoxicité avec le kit selon 1 ci-dessus
stockage du kit après réception
Le kit réceptionné est stocké à plat, à température stable entre 8 et 20 C, pendant 24 à 48 heures, jusqu'à l'utilisation.

préparation des cellules
Il s'agit essentiellement de permettre aux cellules de retrouver leur métabolisme normal et de remplacer le milieu spécifique de transport par le milieu nutritif.

On utilise le matériel suivant
- plaque 24 puits contenant les cellules dans le milieu spécifique de transport,
- flacon étiqueté "milieu nutritif" LIX]",
- étuve ou bain-marie réglé à 37-C + 1-C,
- pipette ou pipette automatique ou pipette multicanaux de type Finnpipette,
- cutter.

On découpe le film autocollant autour des bouchons à l'aide d'un cutter, par colonne de 4 puits, puis on répète les manipulations suivantes colonne par colonne sur toute la plaque
- on retire les quatre bouchons d'une colonne en conservant la bande de film autocollant qui en est solidaire,
- on vide les quatre puits ouverts en retournant la plaque au-dessus d'un évier,
- on ajoute aussitôt un volume de 0,5 ml de milieu nutritif LIX] dans les quatre puits à sec à l'aide de la pipette ou de la pipette automatique ou de la pipette multicanaux, les cellules ne devant pas être laissées en l'absence de milieu plus de 15 secondes,
- on fait couler le liquide le long de la paroi du puits (en effet le liquide ne doit pas être versé sur les cellules),
- on remet les quatre bouchons avec la bande de film autocollant qui en est solidaire sur les quatre puits ouverts,
- on traite ainsi l'ensemble des puits de la plaque,
- on remet ensuite le couvercle d'origine sur la plaque, et on place la plaque dans une étuve réglée à 37iC ou à la surface d'un bain-marie à la même température, jusqu'à son utilisation.

Préparation de bouchons de gélose
On distribue les pièces métalliques de préhension dans les 2 plaques de culture à 24 puits.

On prépare une suspens ion de gélose 4 ou 6 % (p/v) dans le tampon Hanks, complété en CaCl2, 2H20 (1,2 mg/ml) et MgSO4 anhydre (0,1 mg/ml). On chauffe la suspension obtenue au micro-ondes jusqu'à ébullition et montée de la solution le long des parois du récipient, en évitant, par agitation, la sédimentation de la gélose.

Le temps de chauffage varie avec le pourcentage de gélose préparé.

Dès que la gélose est liquide, on bouche le flacon pour éviter l'évaporation du tampon et on le place dans le bain-marie à 60il. La température du bain-marie est contrôlée avec un thermomètre. On prélève la quantité de gélose nécessaire pour couler dans un nombre donné de puits.

On ajoute le produit à tester selon la concentration finale désirée.

Les composés à l'essai sont protégés de la lumière pendant toute la durée de la préparation protection des solutions diluées et des plaques de culture contenant les bouchons gélose/produits à l'essai" par du papier aluminium.

Lorsque le produit à tester est soluble dans le tampon, on prépare le produit à sa plus forte concentration, puis on le dilue 3 fois au 1/5ème (1 volume de produit + 4 volumes de tampon), on mélange 3 ml de produit à l'essai ainsi préparé à 6 % ml de gélose à 6 % liquide (préparé comme indiqué ci-dessus), puis on coule 2 ml du mélange obtenu/puits de la plaque de culture (4 bouchons par condition expérimentale).

Exemple : produit soluble à 3 mg/ml dans le tampon

<tb> Concentration <SEP> initiale <SEP> Concentration <SEP> finale <SEP> % <SEP> final <SEP> de <SEP> gélose
<tb> <SEP> préparée <SEP> (mg/ml) <SEP> testée <SEP> (llg/ml) <SEP>
<tb> <SEP> 100 <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> 4
<tb> <SEP> 20 <SEP> 200 <SEP> 4
<tb> <SEP> 4 <SEP> 40 <SEP> 4
<tb> <SEP> 0,8 <SEP> 8 <SEP> 4
<tb>
Lorsque le produit est soluble dans des solvants intermédiaires tels que ltéthanol, on prépare 9 ml de gélose liquide à 4 % par cultipuits. on ajoute 90 pl de produit à l'essai solubilisé à une concentration 100 fois supérieure à la concentration à tester aux 9 ml de gélose et on coule 2 ml de mélange obtenu/puits de la plaque de culture.

Exemple

<tb> final <SEP> de <SEP> quantité <SEP> de <SEP> quantité <SEP> de <SEP> % <SEP> initial <SEP> de <SEP> gélose <SEP> % <SEP> final <SEP> de <SEP> gelose
<tb> <SEP> crème <SEP> crème <SEP> à <SEP> peser <SEP> gélose
<tb> <SEP> en <SEP> g <SEP> en <SEP> ml <SEP>
<tb> <SEP> 40 <SEP> 3.6 <SEP> 5,4 <SEP> <SEP> 6,7 <SEP> 4
<tb> <SEP> 10 <SEP> 0,9 <SEP> 8,1 <SEP> 4,4 <SEP> 4
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 0,225 <SEP> 8.775 <SEP> <SEP> au <SEP> 4 <SEP>
<tb> <SEP> 0,6 <SEP> 0,054 <SEP> 9 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb>
Dans le cas où le produit n'est pas soluble dans le tampon ni dans un solvant intermédiaire, on met le produit à l'essai directement en suspension dans la gélose à 4 % liquide, on vérifie l'homogénéité de la suspension obtenue, et on coule 2 ml de mélange obtenu/puits de la plaque de culture (4 bouchons par condition expérimentale)
Lorsque le produit est une crème, le produit à l'essai est préparé comme suit

<tb> Concentration <SEP> initiale <SEP> Concentration <SEP> finale <SEP> % <SEP> final <SEP> de <SEP> gélose
<tb> <SEP> préparée <SEP> ( > glml) <SEP> testee <SEP> (pg/ml) <SEP>
<tb> <SEP> 3000 <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> <SEP> 4
<tb> <SEP> 600 <SEP> 200 <SEP> 4
<tb> <SEP> 120 <SEP> 40 <SEP> 4
<tb> <SEP> 24 <SEP> 8 <SEP> 4
<tb>
Lorsque le produit est un parfum, le parfum est testé à 0,03 - 0,1 - 0,3 et 1 % (%, v/v) final dans la gélose à 4 % liquide, et on coule 2 ml du mélange obtenu/puits de la plaque de culture (4 bouchons par condition expérimentale.)
Dans tous les cas ci-dessus, les bouchons de gélose contenant les produits à l'essai sont démoulés juste avant leur utilisation, 20 à 30 minutes à température ambiante après leur préparation, grâce à la pièce métallique de préhension que contient chaque puits.

Pour valider l'essai, on utilise des composés de référence préparés comme suit
La référence n 1 est constituée par PABA (acide p-aminobenzoïque)
- on prépare 6 ml de gélose à 6 %,
- on ajoute 3 ml du composé de référence n 1 présent dans le flacon étiqueté "composé de référence n0 1",
- on soumet le mélange à l'action d'un Vortex, puis on distribue 2 ml du mélange par puits de la plaque de culture (4 bouchons).

La référence n 2 est constituée par le 8-MOP (8 méthoxy psoralène)
- on prépare 9 ml de gélose à 4 %
- on ajoute 90 ul de composé référence n0 2 présent dans le flacon étiqueté "composé de référence n0 2
- on soumet le mélange 15 secondes à un traitement de sonication à l'aide de la tige à soniquer puissance 10, puis à celle d'un Vortex, et
- on distribue 2 ml du mélange/puits de plaque de culture (4 bouchons).

Les bouchons obtenus, contenant les références n0 1 et 2, sont démoulés, dans les mêmes conditions que ci-dessus pour les produits à tester.

Mise en contact des cellules avec des produits à l'essai inclus dans la gélose.

On élimine le milieu de culture des cellules
SIRC, par retournement de la plaque au dessus d'un évier, puis on ajoute 500 ul par puits de tampon contenu dans le flacon étiqueté "tampon".

On élimine le tampon par retournement de la plaque au dessus d'un évier, et on répète le rinçage une fois.

On ajoute ensuite 250 ul de tampon par puits, et on évide le bord des bouchons de gélose par poinçonnage avec un emporte-pièce, de manière à faciliter l'évacuation de l'air qui pourrait se situer entre le tapis cellulaire et la gélose, la formation de bulles d'air devant être évitée, puis on place les bouchons sur les cellules.

Le système cellule/produit à tester est mis à incuber à 370C dans un incubateur sans CO2 pendant une heure.

. Irradiation
A température ambiante, on irradie la plaque aux UVA pendant 29 minutes avec une énergie de 5 J/cm2, une plaque témoin étant protégée des irradiations.

Rinçage
On enlève les bouchons de gélose des puits, on élimine le tampon restant dans les puits et on effectue des rinçages des cellules au tampon Hanks complet (500 ul de tampon par puits).

Amplification
On ajoute 500 ul de milieu par puits et on laisse les altérations et réactions provoquées par l'irradiation se produire durant environ 14 h à 370C dans l'incubateur sans CO2.

évaluation de la toxicité
Après avoir éliminé le milieu, on ajoute 500 pl par puits de la solution de rouge inerte 2X mélangée volume à volume avec le milieu nutritif 2X. On laisse incuber trois heures à 37-C, puis on lave les cellules avec 200 p1 par puits de PBS.

Le milieu est ensuite éliminé par retournement des plaques sur papier absorbant et on ajoute 200 p1 par puits de solution formol-calcium pendant une minute. On lave les cellules avec 200 pl par puits de PBS, puis on ajoute 500 pl par puits de solution acide acétiqueéthanol. Après cinq minutes, jusqu'à homogénéisation, on transfère 100 pl du contenu de chaque dans une plaque 96 puits, puis on effectue les lectures au spectrophotomètre à 540 nm ou 550 nm.

Résultats
On rapporte sur les figures 1 à , les pourcentages de viabilité des cellules, par rapport à un témoin en fonction de la concentration (%, v/v) en produit testé, obtenus avec, respectivement,
- des filtres solaires correspondant à des produits chimiques purs (fig. 1A à 1C)
- des médicaments, la prométhazine (fig. 2A) connu pour sa phototoxicité in vivo le 8-MOP (fig 2B) et la doxycycline (fig. 2C),
- un conservateur utilisé en cosmétique, réputé peu phototoxique in vivo, le PABA (fig. 3),
- des produits finis appartenant au domaine de la cosmétique blanche crème ou lait (fig. 4), et
- des parfums (figures 5A, B et C).

Le pourcentage de viabilité des cellules est déterminé de la manière suivante
pour chaque condition expérimentale (avec ou sans UV), chaque produit et chaque concentration, on considère que le % de viabilité est égal à la moyenne des
DO/moyenne DO témoin x 100
Pour qu'une conclusion soit possible, il est nécessaire d'être dans la gamme de toxicité du produit.

Il est préférable, pour faciliter les comparaisons de produits, d'être aussi dans la gamme de cytotoxicité non soumis aux W.

Les courbes effet-dose permettent d'observer un décalage ou une superposition de la toxicité des produits avec ou sans irradiation.

L'invention fournit ainsi des moyens simples et reproductibles pour la mesure de la phototoxicité de produits, utilisables aussi bien avec des matières premières que des produits finis.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour évaluer le potentiel phototoxique d'un produit in vitro par mesure de la viabilité de cellules après leur mise en contact avec le produit à tester et l'irradiation du système cellule/produit à tester, caractérisé par le fait que le produit à tester est apporté par un matériau poreux.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériau poreux est choisi parmi des produits mucilagineux ou des compositions dont les solutions sont gélifiables à température ambiante, ou des gels colloïdaux;

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le matériau poreux est choisi parmi la gélose, le collagène, ou un alginate, ou encore des biomatériaux et polymères plastique.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de mise en contact est réalisée dans des récipients ou cuvettes renfermant les cellules, notamment dans des puits de plaques multipuits, les cellules étant au contact dudit matériau poreux imprégné du produit à tester, ou le supportant, qui constitue un bouchon.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit bouchon est préparé en ajoutant le produit à tester au matériau poreux, en solution ou en suspens ion, puis en opérant une mise en forme par coulage dans un récipient ou cuvette tel que celui renfermant les cellules.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'irradiation est réalisée au niveau des cellules.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on applique pour l'irradiation une énergie de 5 J/cm2 pendant environ 30 min avec des CUVA.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les cellules sont soumises à au moins une étape de rinçage avant de mesurer leur taux de viabilité.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on laisse incuber les cellules après l'étape d'irradiation, avant de procéder à la mesure du taux de viabilité des cellules.

10. Kit utilisable pour la mesure in vitro du potentiel phototoxique de produits, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules en culture et un ou plusieurs réactifs liquides nécessaires à la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 9.