FR2709965A1 - Compositions pharmaceutiques ayant une activité antithrombotique et procédé pour leur préparation. - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique ayant une action antithrombotique, comprenant, en tant que composant actif, au moins un extrait de thé vert et au moins un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. L'invention a également pour objet un procédé pour la préparation d'un extrait de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé soluble, ainsi que l'utilisation de cet extrait pour la fabrication d'une composition pharmaceutique ayant une activité anti-thrombotique.

Description

I Compositions pharmaceutiques ayant une activité antithrombotique et

procédé pour leur préparation La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique ayant une activité antithrombotique, inhibitrice de la thrombogénèse et inhibitrice

de la cause provoquant la thrombogénèse.

1 5 En particulier, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique ayant une action antithrombotique, inhibitrice de la thrombogénèse et inhibitrice de la cause provoquant la thrombogénèse, contenant, en tant que constituant actif, un extrait pharmacologiquement acceptable de feuilles de thé vert. Ledit extrait est nouveau, stable et inhibe de façon exceptionnelle la cause provoquant la thrombogénèse, et est préparé

selon un procédé perfectionné.

Les expressions "antithrombotique", "inhibiteur de la thrombogénèse" et "inhibiteur de la cause provoquant la thrombogénèse" seront désignés ciaprès

sous le terme "antithrombotique".

Le thé vert est utilisé en Extrême Orient, en commençant par la Chine et le

Japon, comme produit de luxe pour la table ayant des vertues médicinales.

Les feuilles de thé vert contiennent des tannins, de la caféine, de l'acide ascorbique, des tocophérols, des flavonols, des polysaccharides et du 3-carotène, etc., comme constituants chimiques. Parmi eux, la caféine, I'acide 3 0 ascorbique et les tannins du thé vert sont les constituants principaux. La caféine

et l'acide ascorbique sont contenus dans de nombreuses autres sortes de thé.

Toutefois, les tannins du thé vert représentés par les catéchines sont des constituants uniques ne se trouvant que dans le thé vert. Les quatre principales catéchines du thé vert sont l'épicatéchine, le gallate d'épicatéchine, I'épigallocatéchine et le gallate d'épigallocatéchine. D'autres substances inorganiques telles que le fluor, le zinc, le calcium et le magnésium sont

également contenus dans le thé vert.

On savait déjà que les catéchines du thé vert ont des effets variés, comprenant, comme effet principal, I'inhibition de I'hyperoxydation lipidique et de façon additionnelle, I'inhibition de la réaction de l'oxygène actif qui est 1 0 supposé provoquer de nombreuses maladies, l'inhibition de la réabsorption du cholestérol, une activité anticarcinogène, une activité antivirale-antibactérienne, une activité anticaries et une activité désodorante, etc. Au début des années 1990, on a découvert et décrit que le gallate d'épigallocatéchine, une des catéchines, inhibe la formation de composés carcinogènes et l'action de 1 5 promoteurs carcinogènes. En conséquence, vu les résultats encourageants, on s'attendait à voir développer, à partir des catéchines du thé vert, des

médicaments anticancéreux.

D'importantes recherches effectuées par les présents inventeurs concernant les effets pharmacologiques des composants du thé vert ont permis de constater de façon surprenante et inattendue que ces composants du thé vert

présentent une activité antithrombotique exceptionnelle.

La présente invention a donc pour objet une composition pharmaceutique ayant une activité antithrombotique, ladite composition comprenant au moins un extrait de thé vert en tant que composant actif et au moins un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. Parmi les adjuvants pharmaceutiquement acceptables, on peut notamment citer les véhicules, les diluants et les antioxydants. Les catéchines sont isolées à partir du thé vert, selon un procédé qui peut

être divisé en trois étapes: 1) extraction, 2) élimination et 3) purification.

3 0 L'extraction est réalisée de façon connue avec de l'eau chaude, de l'eau froide, du méthanol, de l'éthanol ou un de leurs mélanges en des proportions appropriées. Pour éliminer les composants autres que les composants actifs, on utilise des solvants fortement polaires tels que le chloroforme, l'acétate d'éthyle ou le diéthyléther, qui sont des solvants organiques ne se mélangeant pas avec l'eau,

afin d'optimaliser l'opération d'élimination.

Pour la purification finale, on utilise le procédé d'extraction-partage, dont

le mécanisme est basé sur la différence de polarité des solvants organiques.

Actuellement, les méthodes de chromatographie sur colonne et de chromatographie en phase liquide à grande vitesse sont utilisées pour la purification. Le procédé de purification par une méthode d'extractionpartage pose quelques problèmes tels que le retard à l'établissement de l'équilibre, le coût élevé de la maintenance et les risques accompagnant l'utilisation de solvants organiques tels que le chloroforme, la méthylisobutylcétone, etc. Pour la méthode par chromatographie, on utilise couramment du sephadex ou des polymères, mais cette méthode de purification demande encore à être perfectionnée dans la mesure o les conditions d'extraction sont complexes, durent longtemps et exigent beaucoup de main-d'oeuvre. D'autre part, bien que la purification par chromatographie liquide à grande vitesse permette de gagner du temps et soit plus efficace, elle est cependant peu satisfaisante dans la mesure o le système et les éluants sont coûteux, et o la colonne de séparation

peut se lézarder facilement.

Pour éliminer les problèmes décrits ci-dessus, les présents inventeurs ont mené des recherches approfondies concernant diverses méthodes. Les présents inventeurs ont ainsi pu éliminer le résidu de l'extraction hydrothermale par centrifugation, et en utilisant une colonne de chromatographie Sephadex LH-20 et un solvant de séparation plus simple, ils ont réussi à éliminer les terpénoïdes et les composants colorants ainsi que la caféine hydrosoluble, les acides aminés libres et le saccharide par un rinçage avec une solution mixte eau-acétone ou dioxane à 15 %. En conséquence, I'étape supplémentaire d'élimination de la caféine, prévue dans le procédé connu, n'est 3 0 pas nécessaire dans le procédé selon la présente invention. De plus, on peut ainsi éviter de façon efficace l'apport de contaminants par les solvants organiques ou éliminer les contaminants se trouvant dans le produit final par suite de l'utilisation de chloroforme, méthylisobutylcétone, etc. Il en résulte que seule la partie jaune-rouge est placée dans la couche supérieure de la colonne de chromatographie et peut être observée facilement à l'oeil nu. D'autre part, le composant actif du reste de la partie jaune-rouge peut être obtenu avec un rendement maximal, par élution avec un solvant mixte eau-acétone ou dioxane à %, en une seule fois. Le procédé selon la présente invention est dépourvu des inconvénients des procédés connus. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait de thé vert comprenant les étapes consistant à soumettre à une extraction par voie hydrothermale des feuilles de thé vert séchées, du thé vert séché ou du thé soluble avec de l'eau ou avec une solution d'eau et d'un alcool de faible poids moléculaire afin d'éliminer les substances insolubles, concentrer l'extrait obtenu, redissoudre le concentré obtenu avec de l'eau, soumettre à une extration la solution obtenue avec un solvant organique pour éliminer les substances non polaires, concentrer la couche aqueuse obtenue, et reconcentrer le liquide séparé du concentré par une méthode de séparation sur

i 5 colonne.

Dans la première étape d'un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, on soumet du thé vert à une extraction avec de l'eau chaude. De préférence, on ajoute ensuite à l'extrait environ 1/4 de n-butanol, pour protéger de l'oxydation les composants actifs, puis on concentre, en maintenant la quantité de n-butanol pendant toute la durée de l'opération de façon à éviter l'oxydation des composés actifs par l'air à la surface. La concentration finale des composants actifs peut être réalisée par lyophilisation, éliminant ainsi complètement l'eau, tout en conservant un rapport final du

concentré aux composants actifs sensiblement constant.

La poudre sèche des composants actifs ainsi obtenue est jaune-marron, très soluble dans l'eau et stable pendant plus de 6 mois, n'étant pas hygroscopique. La poudre sèche peut donc être facilement transformée en

produit pharmaceutique.

On a en outre constaté, après des essais répétés du procédé mentionné 3 0 ci-dessus, que chaque lot contient les composants actifs dans un rapport de

composition constant.

La composition de la fraction active est la suivante: 30 % de polyphénols, 60 % d'un mélange de gallate d'épigallocatéchine et

d'épicatéchine, et seulement 6 % d'épigallocatéchine.

Un procédé particulier d'extraction des extraits de thé vert selon la présente invention sera décrit maintenant en détail. Extraction Dans la première étape, on soumet des feuilles séchées de thé vert ou de thé séché en tant que produit de départ d'une extraction, pendant 10 minutes avec de l'eau chaude à 70-90 C ou avec une solution hydroalcoolique. De préférence, on complète l'extraction par une agitation, sans laisser l'ébullition se produire. On traite les matières insolubles de l'extrait par une méthode connue telle que la filtration sous pression, la filtration sous vide ou la filtration par centrifugation. La quantité d'eau chaude utilisée pour l'extraction peut être de 5 à 1 5 100 fois le poids du thé vert, et de préférence, de 10 à 30 fois le poids de thé vert. La proportion de solvant d'extraction dans l'eau chaude est par exemple de -50 % de solvant alcoolique. Bien que le temps d'extraction dépende de la température, il est généralement de 30 secondes à une heure, et de préférence,

de 5 minutes à 20 minutes.

Concentration sous pression réduite Lorsqu'on utilise de l'eau chaude comme solvant d'extraction, on ajoute selon un mode de réalisation particulier, 10-50 % (v/v) de n-butanol, de préférence 20 %, dans l'extrait obtenu, et on maintient cette proportion jusqu'à la fin de l'étape de concentration sous pression réduite, afin d'éviter l'ébullition de l'extrait, et d'empêcher le contact direct des composants actifs contenus dans l'extrait avec l'air, par une couche de n-butanol recouvrant l'extrait, ce qui évite

une modification de la teneur en composants actifs de la composition.

La concentration est réalisée sous pression réduite, en chauffant sous 70 mm de Hg, par exemple, à une température d'environ 50 à 70 C, de

3 0 façon à produire un extrait épais (contenant environ 10 à 30 % (p/p) d'eau).

La durée de la concentration sous pression réduite dépend des conditions de pression réduite appliquées, mais est généralement de 30 minutes à 2 heures. Dans la méthode de concentration sous pression réduite, la température ne doit pas dépasser 90 C afin d'éviter une perte ou une destruction des composants actifs contenus dans l'extrait. Lyophilisation Le liquide purifié sur la colonne est concentré sous pression réduite à la

température ambiante sans chauffage, puis est rapidement congelé et stocké.

La lyophilisation peut éliminer complètement les sublimés et l'eau résiduelle, en maintenant le produit à une température extrêmement basse, par

utilisation d'un agent réfrigérant à -100 C sous vide.

La durée de l'opération de séchage dépend de la quantité de produit à traiter, de sa superficie, de la température de l'agent réfrigérant et de la capacité de la pompe à vide. La substance séchée est généralement obtenue en une

1 5 période de 12 à 24 heures.

La présente invention a également pour objet un extrait de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé soluble, pouvant être obtenu par le

procédé tel que défini précédemment.

La poudre sèche obtenue par le procédé décrit ci-dessus contient du gallate d'épigallocatéchine (EGCG), un des composants actifs des feuilles de thé vert, représenté par la formule suivante: >COH dans une proportion d'environ 50 % à 70 % en poids par rapport au poids de l'extrait. Etant donné que la poudre sèche obtenue par le procédé décrit précédemment n'est pas hygroscopique et présente un faible volume spécifique, il est possible de la transformer en une composition pharmaceutique, notamment sous forme de poudre, de granules, de granules fins ou de comprimés, par des

procédés usuels.

La poudre sèche obtenue par le procédé décrit précédemment n'est pas

hygroscopique, présente un faible volume spécifique et une faible toxicité.

La présente invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique antithrombotique, contenant, en tant qu'ingrédient actif, au moins un extrait de thé vert pouvant être obtenu par le procédé décrit

précédemment et au moins un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladit composition

i 5 est destinée à être administrée par voie orale.

La composition selon l'invention peut également être administrée par injection. Parmi les adjuvants pharmaceutiquement acceptables, on peut notamment citer des véhicules tels que l'amidon, le lactose, le carbonate de calcium et le phosphate de calcium, des liants tels que l'amidon, la gomme arabique, la carboxyméthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose et la cellulose cristalline, des lubrifiants tels que le stéarate de magnésium et le talc, des agents séparateurs tels que la carboxyméthylcellulose calcique, le talc et le silicate d'aluminium de synthèse, et des diluants pharmaceutiquement acceptables tels

que l'eau et les huiles végétales.

La composition pharmaceutique telle que définie précédemment peut être

présentée sous différentes formes par des procédés usuelles.

Parmi celles-ci, on peut notamment citer des poudres, des granules, des microgranules, des comprimés, des capsules, des capsules molles et des

3 0 liquides.

Les exemples suivants ne sont pas destinés à limiter la présente

invention, mais à l'illustrer en détail.

On va maintenant donner, à titre d'illustration, des exemples de

préparation de l'extrait de thé vert et de compositions pharmaceutiques.

EXEMPLES DE PREPARATION D'EXTRAIT DE THE VERT

Exemple 1

Extraire 200 g de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé vert soluble à une température de 70 C à 90 C à l'aide de 4000 ml d'eau chaude, pendant 20 minutes. Filtrer l'extrait obtenu sur du papier filtre, afin de séparer les substances insolubles, puis centrifuger pendant 10 minutes à

2000 t/mn.

Recueillir le filtrat (environ 3500 ml) et concentrer sous pression réduite à

C dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir 400 ml d'extrait.

Dissoudre les 400 ml d'extrait dans 400 ml de chloroforme pour compléter

I'élimination des composés non-polaires. Répéter l'étape d'élimination-

extraction ci-dessus plus de trois fois. Extraire trois fois la phase aqueuse avec 400 ml d'acétate d'éthyle pour obtenir une phase organique d'environ 1200 ml et concentrer complètement la substance obtenue à 50 C sous vide, dans un évaporateur rotatif, jusqu'à 50 ml. Ajouter au concentré 200 ml d'acétone ou de dioxane et reconcentrer jusqu'à 20 ml. Injecter 20 ml du concentré au sommet de la colonne Sephadex LH-20 (diamètre intérieur 35 mm, longueur 550 mm,

poids net de Sephadex 200 g). D'abord, rincer avec 3000 ml de mélange eau-

acétone ou eau-dioxane (85: 15, v/v) jusqu'à élution complète de la phase colorée jaune-verte ou marron, et ensuite, commencer à éluer avec une solution eau-acétone ou eau-dioxane (40: 60, v/v). Lorsque la bande jaune-marron ou jaune, qui était absorbée au sommet de la colonne, commence à s'éluer, recueillir la fraction et la concentrer jusqu'à 50 ml à 70 C par évaporation sous vide. Conserver le concentré pendant une nuit à une température inférieure à -20 C puis la lyophiliser de façon à obtenir 8,6 g de poudre sèche (proportion

3 0 résiduelle d'EGCG: 70 %).

La proportion résiduelle d'EGCG dans la poudre sèche peut être calculée

par l'équation suivante.

Proportion d'EGCG (%) = superficie du pic comprenant de l'EGCG/ superficie totale des pics x 100 Dissoudre 5,0 mg de poudre sèche obtenue par le procédé ci-dessus dans 5,0 mg de méthanol, et injecter 5 J.I de la solution obtenue dans un appareil de chromatographie en phase liquide à grande vitesse pour déterminer

la teneur en EGCG.

Les conditions de la détermination par chromatographie en phase liquide à grande vitesse sont les suivantes:

Appareil: appareil de chromatographie en phase liquide à grande vitesse (P-

6330, Hitachi, Japon) Eluant: solvant mixte acétonitrile-acétate d'éthyle-acide phosphorique à 0,05% (12:2:86, v/v/v) Colonne: Cosmosil 5C18 (diamètre intérieur 4,6 mm, longueur 150 mm) (Nakalai Tesque Co., Japon) Température de la colonne: 40 C

Longueur d'onde: 280 nm.

Dans les conditions ci-dessus, le temps de séjour de l'EGCG est de

6,9 minutes.

Comme l'indiquent les résultats des mesures ci-dessus, la proportion

d'EGCG restante est de 70 %.

Les proportions d'EGCG dans la poudre sèche obtenue dans les

exemples 2-6 sont déterminées par la même méthode que ci-dessus.

Exemple 2

Extraire 1,5 kg de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé vert soluble avec 20 litres d'une solution eau-éthanol (90:10, v/v) à 70 C pendant 20 minutes. Filtrer l'extrait obtenu sur un papier filtre et séparer les substances insolubles. Recueillir le filtrat (environ 19, 0 litres) et concentrer sous pression réduite à 70 C dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir un extrait épais. Dissoudre l'extrait visqueux dans 2,0 litres d'eau chaude, le diviser en fractions aliquotes de 500 ml et extraire avec 500 ml de mélange chloroforme-n- hexane (80: 20, v/v) pour éliminer complètement les composés

non polaires. Répéter plus de trois fois l'étape d'élimination- extraction ci-dessus.

Extraire trois fois la couche aqueuse avec 500 ml d'acétate d'éthyle pour obtenir une phase organique d'environ 1500 ml et évaporer à sec dans un évaporateur 1 0 rotatif sous vide. Ajouter à la substance sèche 500 ml d'acétone et concentrer jusqu'à 50 ml. Injecter 50 ml de concentré au sommet de la colonne Sephadex LH-20 (diamètre intérieur 70 mm, longueur 500 mm, poids net de Sephadex 400 g). Après élimination des substances solubles avec 4,0 litres d'eau, rincer avec 3,0 litres de solution eau/acétone (70: 30, v/v) jusqu'à 1 5 élution complète de la phase colorée en jaune-vert ou marron, et ensuite, commencer à éluer avec une solution eau-acétone (40: 60, v/v). Lorsque la bande jaune- marron ou jaune, qui était absorbée par la couche supérieure de la colonne, commence à s'éluer, recueillir la fraction et concentrer jusqu'à 100 ml à 70 C dans un évaporateur sous vide. Maintenir le concentré pendant une nuit à une température inférieure à -20 C et puis le sécher par lyophilisation pour

obtenir 43,8 g de poudre sèche (proportion résiduelle d'EGCG: 54 %).

Exemple 3

Extraire 200 g de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé vert soluble avec 4 litres d'eau chaude à une température de 70 C à 90 C pendant 20 minutes. Filtrer l'extrait obtenu sur un papier filtre et séparer les substances insolubles, puis centrifuger le filtrat à 2000 t/mn pendant minutes pour éliminer le résidu précipité. Recueillir le filtrat supérieur (environ 3500 ml) et concentrer sous pression réduite à 70 C dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir 400 ml d'extrait. Extraire la phase 3 0 aqueuse trois fois avec 400 ml d'acétate d'éthyle pour obtenir une phase organique d'environ 1200 ml et évaporer à sec la phase organique à 50 C jusqu'à 50 ml dans un évaporateur rotatif sous vide. Ajouter à la substance sèche 200 ml d'isopropanol et concentrer jusqu'à 20 mi. Injecter 20 ml de concentré au sommet de la colonne Sephadex LH-20 (diamètre intérieur mm, longueur 550 mm, poids net de Sephadex 200 g). Rincer avec 3,0 litres de solution eau/acétone (85: 15, v/v) jusqu'à élution complète de la phase colorée jaune-vert ou marron, et ensuite, commencer à éluer avec ,0 litres d'une solution eau-acétone (55: 45, v/v). Lorsque la bande jaune- marron ou jaune, qui était absorbée par la couche supérieure de la colonne, commence à s'éluer, recueillir la fraction et la concentrer jusqu'à 50 ml à 70 C dans un évaporateur sous vide. On peut réutiliser la colonne Sephadex LH-20 en éluant les substances non polaires résiduelles sur la colonne, avec 2,0 litres d'acétone. 1 0 Maintenir le concentré pendant une nuit à une température inférieure à -20 C et sécher par lyophilisation pour obtenir 14,7 g de poudre sèche

(proportion résiduelle d'EGCG: 62 %).

Exemple 4

Extraire 100 g de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé 1 5 vert soluble avec 1,0 litre d'eau chaude à une température de 70 C à 90 C pendant 10 minutes. Filtrer l'extrait obtenu sur un papier filtre et séparer les substances insolubles. Eliminer le précipité par centrifugation à 2000 t/mn pendant 10 minutes. Recueillir le filtrat supérieur (environ 800 ml) et concentrer sous pression réduite à 70 C dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir 100 ml d'extrait. Extraire la phase aqueuse trois fois avec 100 ml d'acétate d'éthyle pour obtenir une phase organique d'environ 280 ml et évaporer à sec à

C jusqu'à obtention d'un état visqueux dans un évaporateur rotatif sous vide.

Ajouter à la substance sèche 150 ml de méthanol et concentrer jusqu'à 15 ml.

Injecter 15 ml de concentré au sommet de la colonne Sephadex LH-20

(diamètre intérieur 35 mm, longueur 550 mm, poids net de Sephadex 200 g).

Rincer avec 4,0 litres de solution eau/acétone (85: 15, v/v) jusqu'à élution complète de la phase colorée jaune-vert ou marron, et ensuite, commencer à

éluer avec une solution eau-acétone (30: 70, v/v). Lorsque la bande jaune-

marron ou jaune, qui était absorbée par la couche supérieure de la colonne, 3 0 commence à s'éluer, recueillir la fraction et concentrer jusqu'à 30 ml à 70 C dans un évaporateur sous vide. Maintenir le concentré pendant une nuit à une température inférieure à -20 C puis le sécher par lyophilisation pour obtenir ,5 g de poudre sèche (proportion résiduelle d'EGCG: 58 %).

Exemple 5

Extraire 200 g de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé vert soluble avec 4,0 litres d'eau chaude à une température de 70 C à 90 C pendant 20 minutes. Filtrer l'extrait obtenu sur un papier filtre et séparer les substances insolubles. Eliminer le précipité par centrifugation à 2000 t/mn pendant 10 minutes. Recueillir le filtrat supérieur (environ 3500 ml) et concentrer sous pression réduite à 70 C dans un évaporateur rotatif sous vide pour obtenir 400 ml d'extrait. Extraire la phase aqueuse trois fois avec 400 ml d'acétate d'éthyle pour obtenir une phase organique d'environ 1200 ml et 1 0 évaporer à sec à 50 C jusqu'à obtention de 50 ml de concentré dans un évaporateur rotatif sous vide. Ajouter à la substance sèche 200 ml de méthanol et concentrer jusqu'à 20 ml. Injecter 20 ml de concentré au sommet de la colonne Sephadex LH-20 (diamètre intérieur 35 mm, longueur 550 mm, poids net de Sephadex 200 g). Rincer avec 2,5 litres de solution eau/isopropanol (90: 10, v/v) jusqu'à élution complète de la phase colorée en jaune-vert ou

marron, et ensuite, commencer à éluer avec 5 litres d'une solution eau-

isopropanol (50: 50, v/v). Lorsque la bande jaune-marron ou jaune, qui était absorbée par la couche supérieure de la colonne, commence à s'éluer, recueillir

la fraction et concentrer jusqu'à 40 ml à 70 C dans un évaporateur sous vide.

Maintenir le concentré pendant une nuit à une température inférieure à 20 C puis le sécher par lyophilisation pour obtenir 10,2 g de poudre sèche

(proportion d'EGCG: 70 %).

Exemple 6

Extraire 200 g de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé vert soluble avec 4,0 litres d'eau-méthanol (50: 50, v/v) à une température de C à 65 C pendant 60 minutes. Filtrer l'extrait obtenu sur un papier filtre et séparer les substances insolubles. Eliminer le précipité par centrifugation à 2000 t/mn pendant 10 minutes. Recueillir le filtrat supérieur (environ 3000 ml) et concentrer sous pression réduite à 70 C dans un évaporateur rotatif sous vide 3 0 pour obtenir un extrait complètement sec. Dissoudre la substance sèche dans 500 ml d'eau-méthanol (80: 20, v/v), extraire trois fois avec 400 ml d'acétate d'éthyle pour obtenir une phase organique d'environ 1200 ml puis concentrer jusqu'à 50 ml à 50 C dans un évaporateur rotatif sous vide. Ajouter au concentré 200 ml de dioxane et concentrer de nouveau jusqu'à 20 mi. Injecter ml de concentré au sommet de la colonne Sephadex LH-20 (diamètre intérieur 35 mm, longueur 550 mm, poids net de Sephadex 200 g). Rincer avec 3,0 litres de solution eau/dioxane (85: 15, v/v) jusqu'à élution complète de la phase colorée jaune-vert ou marron, et ensuite, commencer à éluer avec une solution eau-dioxane (40: 60, v/v). Lorsque la bande jaune-marron ou jaune, qui était absorbée par la couche supérieure de la colonne, commence à s'éluer, recueillir la fraction puis la concentrer jusqu'à 50 ml à 70 C dans un évaporateur sous vide. Maintenir le concentré pendant une nuit à une température inférieure à -20 C puis le sécher par lyophilisation pour obtenir

7,8 g de poudre sèche (proportion résiduelle d'EGCG: 55 %).

On mesure l'activité anti-agglutination plaquettaire de la fraction obtenue ci-dessus. La coagulation sanguine est divisée grossièrement en une première hémostase par action des plaquettes (ou temps plaquettaire de l'hémostase), les i 5 plaquettes étant des composants actifs du sang, et en une seconde hémostase

(ou temps plasmatique), impliquant le plasma à l'exception des plaquettes.

Comme traitement de base, il est intéressant de développer l'agent inhibiteur de la première hémostase afin d'éviter la thrombogénèse et la coagulation sanguine. L'expression thé séché désigne, dans la présente invention, un produit semi-fini qui est obtenu avant la préparation du thé vert final par découpage fin

des feuilles de thé vert.

ETUDE PHARMACOLOGIQUE

Dans cette étude, on fait référence aux dessins annexés, dans lesquels: les figures 1 à 4 sont des représentations graphiques, comparant l'effet de l'agent antithrombotique selon la présente invention sur l'agglutination induite par différents promoteurs d'agglutination, à savoir respectivement par l'ADP, I'épinéphrine, le collagène et la ristocétine, la figure 5 est une représentation graphique de l'effet antithrombotique de 3 0 I'agent antithrombotique selon la présente invention sur l'agglutination, lorsqu'il est administré conjointement avec de l'épinéphrine et du collagène, la figure 6 est une représentation graphique du temps de saignement lorsqu'on administre l'agent antithrombotique selon la présente invention ou l'aspirine comme témoin, la figure 7 est une représentation graphique du temps de coagulation du sang total lorsqu'on administre l'agent antithrombotique selon la présente invention ou l'aspirine comme témoin, et la figure 8 est une représentation graphique du temps de coagulation plasmatique lorsqu'on administre l'agent antithrombotique selon la présente

invention ou l'aspirine comme témoin.

1 0 Effets dans le premier temps de l'hémostase 1. Essai d'inhibition del'agglutination plaquettaire L'action anti-agglutination plaquettaire est mesurée par la méthode turbidimétrique de Born, à l'aide d'un appareil Aggrecorder II PA-3220 (Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd.). Le principe de la méthode est que l'on prépare du 1 5 plasma riche en plaquettes (PRP) dans lequel la proportion de plaquettes est ajustée à 200 000-400 000/mm3, on y ajoute des agents favorisant l'agglutination ou promoteurs d'agglutination (ADP, épinéphrine, collagène, ristocétine) et on enregistre la variation de la densité optique due à l'agglutination. On prélève du sang d'une personne saine ayant des caractéristiques plaquettaires normales et on l'introduit dans un tube contenant

du citrate de sodium à 3,8 % comme anticoagulant, dans un rapport de 1: 9.

On effectue une centrifugation de 10 minutes à 160 g (1000 t/mn) et l'on

obtient du PRP dans lequel la proportion des plaquettes est de 200 000-

400 000/mm3. On répète la centrifugation pendant 10 minutes à 2000 g (3400 t/mn) et l'on obtient du plasma pauvre en plaquettes (PPP). On utilise un appareil Aggrecorder II PA-3220 pour effectuer les mesures (37 C, 1000 t/mn, correction avec du plasma pauvre en plaquettes). Après transfert dans l'appareil de mesure, on laisse le plasma riche en plaquettes et l'échantillon expérimental au repos pendant 3 à 5 minutes, puis on y ajoute des agents favorisant 3 l I'agglutination plaquettaire, et on évalue le processus d'agglutination pendant minutes. Comme agent favorisant l'agglutination (ou promoteur d'agglutination), on utilise de I'ADP, de l'épinéphrine, du collagène et de la ristocétine. Comme le montre l'essai ci-dessus, I'extrait de thé vert possède, à une concentration de 1 mg/ml, un puissant effet inhibiteur sur l'agglutination plaquettaire provoquée par les promoteurs d'agglutination. L'effet inhibiteur est plus particulièrement de 60 % lorsque le promoteur d'agglutination est l'ADP, de 96,5 % lorsque le promoteur d'agglutination est l'épinéphrine, de 35,5 % lorsque le promoteur d'agglutination est le collagène et de 36,5 % lorsque le promoteur d'agglutination est la ristocétine. Au contraire, I'aspirine (0,1 mM) 1 0 utilisé comme témoin présente une inhibition de 13,5 % pour l'ADP, de 79,5 %

pour l'épinéphrine, de 72,6 % pour le collagène et de zéro pour la ristocétine.

La figure 1 est une représentation graphique de l'effet antiagglutination d'un agent antithrombotique selon l'invention lorsqu'on injecte de l'ADP comme

agent favorisant l'agglutination.

i 5 La figure 2 est une représentation graphique de l'effet antiagglutination d'un agent antithrombotique selon l'invention lorsqu'on injecte de l'épinéphrine

comme agent favorisant l'agglutination.

La figure 3 est une représentation graphique de l'effet antiagglutination d'un agent antithrombotique selon l'invention lorsqu'on injecte du collagène

comme agent favorisant l'agglutination.

La figure 4 est une représentation graphique de l'effet antiagglutination d'un agent antithrombotique selon l'invention lorsqu'on injecte de la ristocétine

comme agent favorisant l'agglutination.

Les résultats de l'essai indiquent que l'agent antithrombotique selon

I'invention présente une puissante action anti-agglutination plaquettaire.

2. Détermination de l'activité antithrombotique L'induction d'un thrombus expérimental est réalisée selon la méthode de Dimino et al. Pour l'expérimentation, on utilise des rats mâles ICR, ayant un poids corporel de 20-30 g. Le thrombus est induit par injection d'un promoteur 3 0 d'agglutination plaquettaire (épinéphrine, collagène) dans la veine caudale du rat, provoquant rapidement la formation d'un thrombus dans un vaisseau capillaire. La substance accélérant l'agglutination est préparée dans cet essai en mélangeant 15 Rl de collagène, 400 mM d'épinéphrine et 1001 il de solution saline physiologique. Ladite substance est injectée dans la veine caudale des rats à raison de 100 Rl par 20 g de poids corporel. Deux heures avant le début du test, on injecte aux rats des fractions de 100 mg et de 10 mg d'extrait de thé vert par kg de poids corporel pour étudier l'action antithrombotique des extraits de thé vert. Le volume total injecté ne doit pas dépasser 0,4 ml. L'effet antithrombotique des extraits de thé vert est calculé en pourcentage de rats survivants, ayant échappé à la mort ou à la paralysie de la patte arrière qui peut se produire lors de l'injection d'un promoteur d'agglutination plaquettaire. La paralysie est définie ici par la perte de la capacité d'utiliser la patte arrière pendant 15 minutes ou par un tremblement continu. Dans l'essai réalisé pour déterminer le volume réel de l'induction thrombotique par l'épinéphrine et le collagène, le mélange de 15 111 de collagène, de 400 mM d'épinéphrine et de 100 Il de solution saline physiologique est capable d'induire un thrombus de 95 %. La production de thrombus ou son absence est déterminée par la mort ou la paralysie de la patte arrière pendant 15 minutes après injection du promoteur de l'agglutination plaquettaire. La paralysie de la patte arrière est mesurée par les deux symptômes consistant à ramper et à trembler. Lorsqu'on injecte 100 mg/kg d'extrait de thé vert dans la cavité abdominale, on observe un effet préventif de 66 %, et pour 10 mg/kg, un effet préventif de 44 %. Par ailleurs, l'aspirine

(100 mg/kg) utilisé comme témoin présente un effet préventif de 45 %.

La figure 5 est une représentation graphique de l'effet antithrombotique lorsqu'on administre de l'épinéphrine et du collagène comme agents favorisant

l'agglutination, puis un agent antithrombotique selon l'invention.

Conformément à cet essai, I'agent antithrombotique selon la présente 3 0 invention présente un puissant effet antithrombotique qui est identique à celui de l'aspirine, mais avec une quantité qui n'est qu'un dixième de la quantité d'aspirine. 3. Essai de coagulation sanguine (1) Détermination du temps de saignement A des rats Sprague-Dawley ayant un poids corporel de 180-200 g, on administre une substance expérimentale une fois par jour pendant 10 jours. On anesthésie les rats par injection intrapéritonéale d'une solution de pentobarbital de sodium (400 mg/kg). On coupe la queue du rat anesthésié à une longueur de 5 mm à partir de l'extrémité et on immerge la queue coupée dans 5 cm3 de solution saline à 37,5 C. On mesure le temps qui s'écoule entre l'excision de la

queue et l'hémostase.

1 0 Les résultats de l'essai montrent que le temps de saignement augmente en fonction du volume administré: 113,2+19,6 sec pour 10 mg/kg, 250,7+17,3 sec pour 100 mg/kg, 509,8 +1,6 sec pour 300 mg/kg dans le

groupe expérimental, contre 65,0 12,9 sec dans le groupe témoin.

Dans le cas de l'administration d'aspirine (100 mg/kg), ce temps est 1 5 supérieur à celui du groupe témoin et est de 165,1 +34,3 sec. Les résultats sont représentés à la figure 6. Celle-ci est une représentation graphique du temps de saignement lors de l'administration de l'agent antithrombotique selon la

présente invention et de l'aspirine en tant que témoin.

(2) Détermination du temps de coagulation de sang total Le jour suivant la détermination du temps de saignement, on anesthésie les rats avec de l'éther et on prélève 4,5 ml de sang cardiaque à l'aide d'une seringue en plastique contenant 0,5 ml d'une solution de citrate de sodium à 3,13 %. On mélange le sang prélevé avec précaution dans la seringue, on dépose 1 ml de sang dans un tube à essai en verre et on y ajoute 200 Il de CaCI2-2H20 à 1,7 % puis on mesure, sous agitation, le temps nécessaire pour

la formation d'une coagglutination à la température ambiante.

Les résultats de l'essai montrent que le temps de coagulation de sang total augmente en fonction du volume administré: 130,1 +20,5 sec pour mg/kg, 140,9 +14,2 sec pour 100 mg/kg, 150,6 +17,6 sec pour 300 mg/kg 3 0 dans le groupe expérimental, contre 109,4 +14,0 sec dans le groupe témoin. De plus, I'administation d'aspirine (100 mg/kg) en tant que témoin conduit à un temps de 137,2_19,4 sec. Les résultats sont représentés à la figure 7, qui est une représentation graphique du temps de coagulation de sang total lors de

l'administration d'un agent selon l'invention et d'aspirine.

(3) Détermination du temps de coagulation plasmatique Le plasma est obtenu à partir du sang recueilli dans l'essai ci-dessus par centrifugation à 25 000 t/mn. On mélange un échantillon de 100 Il de plasma avec 50 RI de CaCI2 50 mM dans un tube à essai et on agite à 37 C. On détermine la période s'écoulant entre l'addition de CaCI2 et l'apparition du caillot. 1 0 Les résultats de l'essai montrent que le temps de coagulation plasmatique augmente en fonction du volume administré: 177,5 37,6 sec pour 10 mg/kg, 219,8 +57,9 sec pour 100 mg/kg, 233,1 +83,2 sec pour 300 mg/kg dans le groupe expérimental, contre 146, 2 +26,5 sec dans le groupe témoin. De plus, l'administration d'aspirine (100 mg/kg) en tant que témoin conduit à un temps 1 5 de 222,5 +40,2 sec. Les résultats sont représentés à la figure 8. Celle-ci est une représentation graphique du temps de coagulation plasmatique lors de

l'administration d'un agent selon l'invention et d'aspirine.

4. Inhibition de l'hyperoxydation lipidique et de l'activité enzymatique dans le plasma a) Détermination de l'effet inhibiteur par la production de dialdéhyde malonique (MDA) On introduit 1 ml d'une suspension de plaquettes dans une solution isotonique d'extrait de thé vert (concentration finale 1 mg/ml) et on y ajoute du Ca++ et du collagène. Ensuite, on ajoute au mélange obtenu 2 ml de TBA puis on chauffe pendant 20 minutes à 90 C, on refroidit à la température ambiante et on effectue une centrifugation pendant 10 minutes à 3000 t/mn. On mesure la densité optique à 535 nm de la solution rouge qui est dans la partie supérieure des plaquettes précipitées, et on calcule la quantité de MDA produite en se basant sur l'indice d'absorption molaire du conjugué MDA-TBA de 1,56 x 105,

3 0 indiquant que l'extrait de thé vert inhibe l'hyperoxydation lipidique.

La quantité de MDA produite par la réaction du produit secondaire de l'hyperoxydation lipidique peut être utilisée comme critère pour la détermination de l'hyperoxydation lipidique totale. Le thé vert présente des résultats du même ordre que ceux obtenus avec l'aspirine, qui inhibe l'action d'inhibiteurs de la phospholipase A2 tels que la primaquine, la quinacrine et l'oxygénase. d) Détermination de l'activité de libération de l'acide arachidonique On introduit de l'extrait de thé vert (densité finale 1 mg/ml), du Ca++ et du collagène dans 1 ml d'une suspension plaquettaire et on incube à 37 C. Après 30 minutes, on élimine rapidement les plaquettes par filtration à travers une membrane filtrante et on acidifie le filtrat à un pH inférieur à 3. On extrait la solution obtenue deux fois avec 2 ml de solvant d'extraction (chloroforme: alcool méthylique = 1:1, v/v). On transfère la couche inférieure chloroformique obtenue par centrifugation dans l'autre tube à essai et 1 5 I'on sèche par de l'azote gazeux. On dissout la substance sèche dans 50 li de diméthylformamide (DMF), et on ajoute à la solution obtenue, 50 jIl de solution de DMF contenant 12 mM de monodansylcadavérine et 2 Nul de diéthylphosphorocyanidate et on laisse le mélange obtenu à la température ambiante pendant 15 minutes, de sorte que l'acide arachidonique est marqué

par fluorescence.

On élue l'acide arachidonique marqué par fluorescence avec un gradient linéaire de méthanol: acétonitrile à 50 % sur la colonne à image inversée, et on effectue la détection à une longueur d'onde de 340 nm et à une longueur

d'onde de fluorescence de 520 nm.

Comme l'indique le déplacement quantitatif de l'acide arachidonique, la modification de l'acide arachidonique provoquée par l'extrait de thé vert est inférieure à celles provoquées par la primaquine et la quinocrine. En conséquence, on suppose que l'extrait de thé vert évite l'hyperoxydation lipidique et l'agglutination plaquettaire par inhibition de la cyclooxygénase ou de 3 0 la lipoxygénase plutôt que de la phospholipase comme partie active des plaquettes. 6. Effet thérapeutique sur I'hyperlipidémie - Action d'antiperoxydation (in vitro) On ajoute de l'extrait de thé vert à une fraction de microsome hépatique (1,5 mg de protéine/ml) de rat, et on y ajoute de la cystéine (concentration finale: 500 gM) et du sulfate ferreux (concentration finale: 5 gM) et on incube le mélange obtenu pendant 30 minutes à 37 C. On y ajoute 3 ml d'acide

trichloracétique à 10 %, et on recueille 2 ml de surnageant après centrifugation.

On y ajoute une solution de TBA à 0,67 %, et on active la solution obtenue dans de l'eau bouillante pendant 15 minutes, et après refroidissement, on mesure la

1 0 densité optique.

7. Etude de l'action sur les fonctions physiologiques et de l'action antihypertensive (in vitro) Inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) L'ACE est une enzyme agissant sur les systèmes rénine-angiotensine qui 1 5 joue un rôle décisif in vivo dans la régulation de la pression sanguine, des liquides corporels et de leur composition électrolytique. Cette enzyme convertit l'angiotensine I (ANG I) en angiotensine Il (ANG II) active, par libération du dipeptide (hisleu) à l'extrémité C-terminale de ANG I produite à partir de la rénine. L'enzyme joue également un rôle important dans la régulation du système circulatoire des organismes vivants, car elle active ANG II dans le

système hypertenseur, et inactive la bradykinine dans le système hypotenseur.

En conséquence, il est possible de prouver l'activité de l'extrait de thé vert

comme agent dépresseur de la pression sanguine.

L'aspirine est un puissant agent anticoagulant, toutefois, son ingestion

prolongée est impossible en raison des douleurs d'estomac qu'elle provoque.

Au contraire, I'agent antithrombotique selon l'invention se révèle dépourvu d'effets secondaires tels que des embarras gastriques et produit la même activité

que l'aspirine, et même d'avantage.

Les résultats expérimentaux prouvent que l'extrait de thé vert selon

3 0 l'invention présente une action antithrombotique remarquable.

En conséquence, I'extrait de thé vert selon l'invention peut être utilisé comme agent antithrombotique, agent inhibiteur de la thrombogénèse ou agent

inhibiteur de la cause provoquant la thrombogénèse.

Test de toxicité aiguë On administre une solution physiologique contenant de l'extrait de thé vert à des rats ICR par voie orale et intraveineuse. On calcule la DL5o par la mortalité après 72 heures. On applique le mode de calcul "up and down" (montant et

descendant). Les résultats sont les suivants.

Substance Mode Nombre DL50 administrée d'administration d'animaux mg/kg Extrait de thé vert intraveineuse 10 10 N orale 10 1000 Comme l'indiquent les résultats ci-dessus, I'agent antithrombotique selon

i 5 la présente invention présente une faible toxicité aig e.

L'extrait de thé vert selon la présente invention peut être administré à raison de 1,00-2 000,00 mg/kg en une à plusieurs prises par jour, en fonction de l'âge, du sexe et de l'état du patient, ou en fonction des précautions à observer. L'extrait de thé vert selon la présente invention peut être transformé en compositions pharmaceutiques par addition d'adjuvants usuels tels que des véhicules, des liants, des lubrifiants, des agents séparateurs, des diluants, etc.

EXEMPLES DE COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES

Les exemples suivants sont des exemples de composition

pharmaceutique selon la présente invention.

Exemple 1: comprimés extrait de thé vert 10 mg lactose 20 mg amidon 20 mg stéarate de magnésium quantité appropriée Les composants ci- dessus sont transformés en comprimés contenant

mg par comprimé, par une méthode classique de préparation.

Exemple 2: gélules (capsules) extrait de thé vert 100 mg lactose 20 mg amidon 19 mg talc 1 mg stéarate de magnésium quantité appropriée Les composants ci-dessus sont répartis dans des gélules de 50 mg, par

une méthode connue de préparation.

Exemple 3: composition liquide extrait de thé vert 100 mg saccharide isomérisé 10 mg miel 500 mg amide de l'acide nicotinique (pharmacopée) 20 mg anhydride de caféine (pharmacopée) 30 mg benzoate de sodium 70 mg Les composants ci-dessus sont mélangés pour donner un médicament sous forme liquide, qui est conditionné dans des flacons en verre fumé de

ml que l'on ferme hermétiquement, puis que l'on pasteurise.

Exemple 4: solution injectable extrait de thé vert 5 mg eau stérilisée quantité appropriée Les composants ci-dessus sont transformés en solution injectable selon un mode de préparation connu. Puis la solution est conditionnée dans des

ampoules de 2 ml qui sont ensuite scellées et stérilisées.

Exemple 5: gélules molles 1) composants introduits dans la gélule extrait de thé vert 10 mg polyéthylèneglycol 230 mg glycérine 20 mg 2) composants de l'enveloppe sèche (% en poids) gélatine 52 % glycérine 32 % Anidrisorb 35/70 12 % eau 5 % Les composants ci-dessus sont transformés en gélules molles par une

méthode classique de préparation.

Exemple 6: granules extrait de thé vert 10 mg lactose 25 mg Les composants ci-dessus sont transformés en granules au moyen d'un

granulateur par extrusion.

D'autre part, I'extrait de thé vert selon la présente invention peut être utilisé sous la forme de compositions dans lesquelles l'extrait de thé vert se trouve mélangé à d'autres produits pharmaceutiques connus ayant une action différente. Les compositions de ce type sont comprises dans le domaine de l'invention.

Claims (5)

Revendications

1. Procédé de préparation d'un extrait de thé vert comprenant les étapes consistant à: soumettre à une extraction par voie hydrothermale des feuilles de thé vert séchées, du thé vert séché ou du thé soluble avec de l'eau ou avec une solution d'eau et d'un alcool de faible poids moléculaire afin d'éliminer les substances insolubles, concentrer l'extrait obtenu, redissoudre le concentré obtenu avec de l'eau, soumettre à une extration la solution obtenue avec un solvant organique pour éliminer les substances non polaires, concentrer la couche aqueuse obtenue, et reconcentrer le liquide séparé du concentré par une méthode de

séparation sur colonne.

2. Extrait de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé soluble, pouvant être obtenu par le procédé tel que défini selon la

revendication 1.

1 5

3. Composition pharmaceutique ayant une action antithrombotique, comprenant, en tant que composant actif, au moins un extrait de thé vert pouvant être obtenu par le procédé tel que défini dans la revendication 1, et au moins un

adjuvant pharmaceutiquement acceptable.

4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée par le fait que ladite composition se présente sous la forme d'une poudre, d'un comprimé, d'une gélule, d'un liquide, d'une gélule molle, d'un

granule ou d'une solution injectable.

5. Utilisation d'un extrait de feuilles de thé vert séchées, de thé vert séché ou de thé soluble pour la fabrication d'une composition pharmaceutique

ayant une activité anti-thrombotique.