FR2798139A1 - Vecteurs synthetiques propres, plasmides, plantes et parties de plantes transgeniques les contenant, et leurs methodes d'obtention - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des vecteurs synthétiques propres, destinés a faciliter et à améliorer l'insertion de un ou plusieurs gènes d'intérêt dans une cellule eucaryote, et notamment dans une cellule végétale. L'invention concerne également un procédé pour l'obtention de ces vecteurs ainsi que des plantes transgéniques les contenant.
Description
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VECTEURS SYNTHÉTIQUES PROPRES, PLASMIDES, PLANTES ET PARTIES DE PLANTES TRANSGÉNIQUES LES CONTENANT, ET LEURS MÉTHODES D'OBTENTION.
[DESCRIPTION]
La présente invention concerne des vecteurs synthétiques propres, destinés notamment à une mise en #uvre pour la transformation génétique dans le domaine de la biotechnologie végétale.
La présente invention concerne des vecteurs synthétiques propres, destinés notamment à une mise en #uvre pour la transformation génétique dans le domaine de la biotechnologie végétale.
De manière générale, les vecteurs sont connus dans le domaine de la biotechnologie et de la manipulation génétique.
Les vecteurs qui sont actuellement utilisés le plus couramment pour la transformation génétique, et en particulier, dans le domaine de la biotechnologie végétale, posent toutefois plusieurs inconvénients dans leur utilisation. En effet, et notamment pour la transgénèse végétale, on a fréquemment eu recours à un vecteur appelé pBinl9 (Frisch et al., 1995). La séquence nucléotidique de ce plasmide binaire pBinl9 est entièrement connue. Cependant, le problème est que ce plasmide est de grande taille (11,8 kpb) et qu'il renferme des éléments inutiles (plus de la moitié de pBinl9) intolérables d'un point de vue réglementaire, voire même nuisibles à une bonne réplication. De plus, la cassette de sélection de ce plasmide est localisée près de la bordure droite de l'ADN-T. Ainsi, lors de la cassure de l'ADN-T après la cassette de sélection, aucune sélection ne pourra être opérée pour retenir uniquement les plantes possédant la cassette d'expression du gène d'intérêt.
Les expressions utilisées dans la description et les revendications ont la signification suivante : - "vecteur" signifie un système d'expression, par exemple des projectiles enrobés d'ADN, des véhicules de transit à base d'acides nucléiques, des molécules d'acide nucléique adaptées pour livrer de l'acide nucléique, et de l'ADN circulaire autoréplicant autonome, par exemple plasmides, cosmides, phagemides, etc. Si un micro-organisme ou une culture cellulaire recombinant est décrit comme hôte d'un "vecteur
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d'expression", ceci peut inclure également de l'ADN circulaire extrachromosomique (tel que par exemple de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique), de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte(s), le vecteur pouvant être soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure autonome, intégré au génome de l'hôte, soit maintenu dans le noyau ou le cytoplasme de l'hôte.
- le plus souvent, les vecteurs utilisés pour la transformation génétique existent sous forme de plasmides. Dans ce cas, le "plasmide" est une molécule d'ADN circulaire autonome capable de réplication dans une cellule. Si un micro-organisme ou culture cellulaire recombinante est décrit comme hôte d'un plasmide "d'expression", ceci comprend à la fois des molécules d'ADN circulaires extrachromosomiques et de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte (s). Si le plasmide est maintenu par une cellule hôte, le plasmide est soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure autonome, soit intégré au génome de l'hôte ; - "propre" signifie que le vecteur ne comprend que des séquences indispensables à sa fonctionnalité et porte une séquence d'acide nucléique ne comprenant que des éléments indispensables à l'expression de la cellule hôte; - "acide nucléique" signifie ADN ou ARN ; - "séquence d'acide nucléique" signifie un oligomère ou polymère, simple ou double brin, de bases nucléotidiques lues à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', et comprend des plasmides autoréplicants, des gènes, des polymères d'ADN, ou d'ARN, infectieux ou non, et de l'ADN, ou l'ARN, fonctionnel ou non-fonctionnel. Dans la notation nucléotidique utilisée dans la présente demande, sauf mention particulière, l'extrémité gauche d'une séquence nucléotidique simple brin est l'extrémité 5' ; - "séquence d'acide nucléique dérivée" signifie que la séquence dérive directement ou indirectement de la séquence à laquelle il est fait référence, par exemple par substitution, délétion, addition, mutation, fragmentation, et/ou synthèse d'un ou plusieurs nucléotides ; - "promoteur" signifie une région d'acide nucléique en
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amont du codon de démarrage de la traduction et qui est impliquée dans la reconnaissance et la liaison de l'ARN polymérase et d'autres protéines pour la transcription ; - "promoteur végétal" est un promoteur capable d'initier la transcription dans des cellules végétales ; - "promoteur constitutif" est un promoteur capable d'exprimer des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans tous ou pratiquement tous les tissus de l'organisme hôte pendant tout le développement dudit organisme ; - "promoteur tissulaire spécifique" est un promoteur capable d'exprimer de manière sélective, des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans certains tissus spécifiques de l'organisme hôte ; - "liées de manière opérationnelle" signifie la liaison d'un élément fonctionnel ou régulateur, par exemple un promoteur, à la séquence d'acide nucléique, ou gène, à exprimer qui code pour une protéine à produire, de telle sorte que cet élément influence la transcription de la séquence d'acide nucléique liée; - "cassette d'expression" signifie des séquences nucléotidiques capables de diriger l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou d'un gène, codant pour un polypeptide à produire dans un organisme hôte compatible avec de telles séquences. De telles cassettes incluent au moins un promoteur et un signal de terminaison de la transcription, et optionnellement d'autres facteurs nécessaires ou utiles à l'expression ; - "séquence hétérologue" ou "séquence d'acide nucléique hétérologue" signifie une séquence provenant d'une source, ou d'une espèce, étrangère à son environnement, ou si elle provient du même environnement, a été modifiée par rapport à sa forme originale. La modification de la séquence d'acide nucléique peut avoir lieu par exemple par traitement de l'acide nucléique avec une enzyme de restriction pour générer un fragment d'acide nucléique capable d'être lié de manière opérationnelle à un promoteur. La modification peut également avoir lieu par le biais de techniques comme la mutagenèse dirigée ;
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- "boîte" signifie une séquence d'acide nucléique à laquelle une fonction régulatrice est imputée ; - "like" signifie que la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique à laquelle ce terme est associé, comporte une certaine identité de séquence ou un consensus avec une boîte et/ou une séquence d'acide nucléique connue dite de référence, de préférence une identité de séquence d'au moins 50%, de manière plus préférée une identité de séquence d'au moins 75%, et plus particulièrement une identité de séquence d'au moins 90% avec la séquence de référence. Le pourcentage d'identité de séquence est calculée sur la base d'une fenêtre de comparaison d'au moins 6 bases nucléotidiques. La détermination d'une fenêtre de comparaison peut être effectuée en utilisant des algorithmes d'alignement de séquences pour déterminer une homologie avec une séquence de référence, par exemple l'algorithme d'homologie locale, l'algorithme d'alignement d'homologie, et l'algorithme de recherche de similitude, ces algorithmes existant également sous forme informatique, connus sous les noms GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA. Le pourcentage d'identité de séquence est obtenue en comparant la séquence de référence avec la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique ; - "située" signifie la position sur une séquence d'acide nucléique d'un élément identifié, tel qu'une "boîte", un site de restriction, ou un codon ayant une fonction particulière. La position qui est donnée par un chiffre se réfère à la position du début de l'élément dans la séquence d'acide nucléique, dans le sens de la lecture de cette dernière, c'est-à-dire dans le sens 5'->3' ; - "plante transgénique" signifie une plante ayant été obtenue par des techniques de manipulation génétique, et couvre les plantes entières obtenues, leur progéniture, ainsi que les organes végétaux, par exemple les racines, les tiges et les feuilles, obtenus par ces techniques. Les plantes transgéniques selon la présente invention peuvent avoir différents niveau de ploïdie, et peuvent notamment être polyploïdes, diploïdes, et haploïdes ; - "propagule" signifie un amas ou une association de
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cellules végétales, structuré(e) ou non, permettant la régénération d'une plante entière, par exemples des explants, des cals, des tiges, des feuilles, des racines, des boutures, et même des semences.
La demanderesse de la présente invention a réussi, et ce de manière surprenante, à produire des vecteurs synthétiques propres, en particulier des plasmides binaires, de séquence nucléotidique entièrement connue, de petite taille, permettant de pallier les inconvénients cités précédemment, et notamment présentant un fort taux de réplication par rapport aux vecteurs existants les plus couramment utilisés. Par ailleurs, la demanderesse a réussi en même temps à produire une gamme de vecteurs de manière à pouvoir choisir celui qu'il convient d'utiliser selon l'application envisagée et l'environnement de sa mise en #uvre, et ainsi de pouvoir mieux contrôler le taux d'expression d'un gène à exprimer codant pour un polypeptide à produire.
En outre, dans certains des vecteurs selon l'invention, chacun des éléments ou composants fonctionnels peut être isolé par simple digestion enzymatique.
Un objet de la présente invention est donc un vecteur synthétique propre ne renfermant que les éléments indispensables à sa fonctionnalité et à la transgénèse d'une cellule, et notamment d'une cellule végétale.
Selon un mode d'exécution préféré, le vecteur comprend, comme éléments indispensables à sa fonctionnalité et à la transgénèse d'une cellule, et liés de manière opérationnelle : - au moins une séquence d'acide nucléique codant pour au moins une première origine de réplication, de préférence un ori RK2, et plus préférentiellement au moins un ori V de pRK2 de Escherichia coli à large spectre d'hôtes ; - au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un agent de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, plus préférentiellement le gène npt III conférant la résistance à la kanamycine dans les bactéries ; - un locus trfA codant pour au moins une protéine permettant d'augmenter le taux de réplication du plasmide, de
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préférence issu de pRK2, et plus préférentiellement codant pour les protéines P285 et P382.
Selon un mode d'exécution plus préféré le vecteur comprend la séquence d'acide nucléique identifiée sous le numéro SEQ.ID01. Plus préférentiellement encore, le vecteur consiste en un plasmide simple pMRT1105 dont la séquence d'acide nucléique est identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
Selon un autre mode d'exécution préféré, le vecteur comporte au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une deuxième origine de réplication, de préférence un ori d'Escherichia coli, et plus préférentiellement un ori ColEI.
Plus préférentiellement, le vecteur comprend la séquence d'acide nucléique identifiée sous le numéro SEQ. ID02, et encore plus préférentiellement, le vecteur consiste en un plasmide simple pMRT1106 dont la séquence d'acide nucléique est identifiée sous le numéro SEQ.ID02.
De manière préférée, le vecteur synthétique selon l'invention comprend une région constituée par au moins une séquence d'acide nucléique contenant plusieurs sites de restriction enzymatique uniques appelés collectivement site de clonage multiple (MCS).
Selon un mode d'exécution préféré, le vecteur comporte en outre une séquence d'acide nucléique codant pour un ADN-T comportant une bordure droite RB et une bordure gauche LB, permettant au vecteur de fonctionner comme un plasmide binaire.
De préférence, le MCS se situe près de la bordure droite RB de l'ADN-T.
Selon un autre mode d'exécution préféré, le vecteur comprend en outre une séquence d'acide nucléique codant pour au moins un promoteur d'expression et au moins un terminateur de transcription situé entre la bordure gauche LB et la bordure droite RB de l'ADN-T. Plus préférentiellement, le promoteur d'expression est choisi dans le groupe consistant en les promoteurs constitutifs, les promoteurs inductibles, les promoteurs spécifiques, et de préférence choisi parmi les promoteurs d'expression végétale. De manière encore plus préférée, le promoteur d'expression est choisi dans le groupe
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consistant en le promoteur 35S du CaMV, l'ep35S du CaMV, le promoteur du gène de la plastocyanine du pois, ses zones "enhancers" et dérivés, le promoteur "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG) de blé, le promoteur CsVMV du "Cassava Vein Mosaic Virus", le promoteur CoYMV du "Commelina Yellow Mottle Virus", les promoteurs chimériques des promoteurs CsVMV et CoYMV, ainsi que leurs dérivés.
De préférence, le terminateur d'expression est choisi parmi les terminateurs fonctionnels dans une cellule végétale, et de préférence est un terminateur 35S ou nos.
Selon encore un autre mode d'exécution préféré, le vecteur comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un agent de sélection, fonctionnel dans une cellule végétale, de préférence au moins une séquence d'acide codant pour un gène de résistance aux antibiotiques, et/ou un gène de résistance aux herbicides.
De manière préférée, la séquence codant pour un agent de sélection est une séquence codant pour le gène de résistance bar ( bialaphos resistance ) ou pat ( phosphinothricine acétyltransferase ), ou encore une séquence codant pour le gène de résistance nptII, muté ou sauvage. Plus préférentiellement encore, la séquence d'acide nucléique codant pour l'agent de sélection se situe près de la bordure gauche de l'ADN-T.
Selon un autre mode d'exécution préféré de la présente invention, le vecteur comporte au moins une cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique promotrice d'expression liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptide à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription. De manière préférée, le polypeptide à produire est une enzyme ou protéine ou dérivé de ces dernières possédant une activité in vitro et/ou chez l'homme et/ou chez l'animal, ladite activité comprenant une activité digestive, pancréatique, biliaire, antivirale, anti-inflammatoire, pulmonaire, anti-microbienne, nutritive, cosmétique, structurelle, sanguine, cardio-vasculaire, ophtalmique, antigénique, immunostimulante, et cérébrale. Des
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exemples de telles protéines sont par exemple les insulines, les interférons, les lipases gastriques, pancréatiques, ou biliaires, les élastases, les antiprotéases telles que l'alpha-1 antitrypsine, les protéines structurantes comme le collagène, les transferrines comme la lactoferrine, les protéines dérivées du sang, comme l'hémoglobine, l'albumine humaine, et les cofacteurs sanguins, et les antioxydants comme la superoxyde dismutase,
Selon un mode d'exécution particulièrement préféré de l'invention, le vecteur se présente sous forme d'un plasmide binaire, linéaire ou circulaire, choisi dans le groupe consistant en les séquences d'acide nucléique identifiées sous les numéros SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ. ID12, SEQ. ID13, SEQ. ID14, SEQ. ID15, SEQ. ID16, SEQ. ID17, SEQ. ID18, SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ. ID21, et SEQ.ID22.
Selon un mode d'exécution particulièrement préféré de l'invention, le vecteur se présente sous forme d'un plasmide binaire, linéaire ou circulaire, choisi dans le groupe consistant en les séquences d'acide nucléique identifiées sous les numéros SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ. ID12, SEQ. ID13, SEQ. ID14, SEQ. ID15, SEQ. ID16, SEQ. ID17, SEQ. ID18, SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ. ID21, et SEQ.ID22.
Selon un mode d'exécution particulièrement avantageux, chaque composant fonctionnel du vecteur peut être clivé indépendamment des autres composants. De préférence, chaque composant fonctionnel peut être clivé indépendamment des autre composants par digestion enzymatique au niveau d'un premier site de restriction unique et un deuxième site de restriction unique présents dans 1 vecteur.
Un autre objet de la présente invention est une séquence d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe consistant en les séquences d'acide nucléique identifiées sous les numéros SEQ.ID01, SEQ. ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ. ID12, SEQ. ID13, SEQ. ID14, SEQ. ID15, SEQ. ID16, SEQ. ID17, SEQ. ID18, SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ. ID21, et SEQ.ID22.
Encore un autre objet de la présente invention est une cellule contenant un vecteur ou une séquence d'acide nucléique tels que décrits précédemment. De préférence, la cellule est une cellule végétale.
Encore un autre objet de la présente invention est une plante transgénique ayant intégré de manière stable dans son
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génome un vecteur ou une séquence d'acide nucléique tels que décrits précédemment. De préférence, la plante est choisie parmi les espèces dicotylédones, telles que la pomme de terre, le tabac, le coton, la laitue, la tomate, le melon, le concombre, le pois, le colza, la betterave, ou le tournesol, ou les espèces monocotylédones, telles que le blé, l'orge, l'avoine, le riz, ou le maïs.
Encore un autre objet de la présente invention est une propagule d'une plante transgénique telle que décrite précédemment. De préférence, la propagule est une semence.
Encore un autre objet de la présente invention est une méthode d'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer la cellule avec un vecteur ou une séquence d'acide nucléique tels que décrits précédemment; - faire une culture de la cellule dans des conditions permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour le polypeptide à produire. De préférence, la cellule est une cellule procaryote ou eucaryote. De manière plus préférée, la cellule est une cellule choisie dans le groupe consistant en les cellules microbiennes, les cellules fongiques, les cellules d'insectes, les cellules animales, et les cellules végétales. Encore plus préférentiellement, la cellule est une cellule végétale.
Encore un autre objet selon la présente invention est une méthode d'obtention d'une plante transgénique ou d'une propagule telles que décrites précédemment, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant ou une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le vecteur ou la séquence d'acide nucléique ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.
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Ainsi, les nouveaux vecteurs synthétiques, et de préférence, plasmides binaires, selon l'invention ne possèdent que des régions indispensables à la fonctionnalité du vecteur et à la transgénèse. Le déposant a constaté qu'ils ont un fort taux de réplication. En outre, ils peuvent posséder une cassette de sélection près de la bordure gauche, ainsi que des sites de restrictions rares dans leurs polylinker (sites multiples de clonage).
DESCRIPTION DES FIGURES
L'invention sera mieux comprise par la description détaillée des différents modes de réalisation donnée ci-après à titre d'exemples non limitatifs, et en se référant au dessin en annexe, dans lequel : - la Figure 1 représente de manière schématique un vecteur minimal préféré selon la présente invention sous forme de plasmide identifié par la référence pMRT1105, et d'une longueur de 3508 paires de bases ; - la Figure 2 représente une carte schématique d'une variante du vecteur de la Figure I sous forme de plasmide identifié par la référence pMRT1106, et d'une longueur de 4098 paires de bases ; - la Figure 3 représente une carte schématique d'un vecteur préféré selon la présente invention, sous forme de plasmide binaire identifié par la référence pMRT1118, d'une longueur de
5971 paires de bases, et incluant un ADN-T comportant une cassette de sélection codant pour la résistance à un antibiotique, et un site de clonage multiple (MCS); - la Figure 4 représente un mode d'exécution préféré du vecteur selon la Figure 3, le site de clonage multiple (MCS) comportant encore d'autres sites uniques, le vecteur étant sous forme de plasmide binaire identifié par la référence pMRT1119, et d'une longueur de 6016 paires de bases ; - les Figures 5 à 22 représentent d'autres modes d'exécution préférés du vecteur selon l'invention, sous forme de plasmides binaires identifiés respectivement par les références pMRT1121 (6017 paires de bases), pMRT1122 (6016 paires de bases), pMRT1155 (6017 paires de bases), pMRT1175 (6767 paires de
L'invention sera mieux comprise par la description détaillée des différents modes de réalisation donnée ci-après à titre d'exemples non limitatifs, et en se référant au dessin en annexe, dans lequel : - la Figure 1 représente de manière schématique un vecteur minimal préféré selon la présente invention sous forme de plasmide identifié par la référence pMRT1105, et d'une longueur de 3508 paires de bases ; - la Figure 2 représente une carte schématique d'une variante du vecteur de la Figure I sous forme de plasmide identifié par la référence pMRT1106, et d'une longueur de 4098 paires de bases ; - la Figure 3 représente une carte schématique d'un vecteur préféré selon la présente invention, sous forme de plasmide binaire identifié par la référence pMRT1118, d'une longueur de
5971 paires de bases, et incluant un ADN-T comportant une cassette de sélection codant pour la résistance à un antibiotique, et un site de clonage multiple (MCS); - la Figure 4 représente un mode d'exécution préféré du vecteur selon la Figure 3, le site de clonage multiple (MCS) comportant encore d'autres sites uniques, le vecteur étant sous forme de plasmide binaire identifié par la référence pMRT1119, et d'une longueur de 6016 paires de bases ; - les Figures 5 à 22 représentent d'autres modes d'exécution préférés du vecteur selon l'invention, sous forme de plasmides binaires identifiés respectivement par les références pMRT1121 (6017 paires de bases), pMRT1122 (6016 paires de bases), pMRT1155 (6017 paires de bases), pMRT1175 (6767 paires de
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bases, pMRT1176 (6767 paires de bases), pMRT1191 (4805 paires de bases), pMRT1192 (8654 paires de bases), pMRT1193 (9143 paires de bases), pMRT1195 (6865 paires de bases), pMRT1196 (8654 paires de bases), pMRT1201 (7943 paires de bases), pMRT1202 (5614 paires de bases), pMRT1203 (7503 paires de bases), pMRT1204 (9390 paires de bases), pMRT1205 (7503 paires de bases), pMRT1206 (9390 paires de bases), pMRT1210 (10003 paires de bases), et pMRT1212 (8987 paires de bases).
Dans les figures, les abréviations ont les significations suivantes : - ori RK2 : ori V de pRK2 de Escherichia coli à large spectre d'hôtes, réplicon RK2 instable engendrant un faible nombre de copies ; - ori ColEI : l'origine de réplication ColEl d'Escherichia coli ; - gène npt III : codant pour la néomycine phosphotransférase conférant la résistance à la kanamycine - gène npt II : codant pour la néomycine phosphotransférase conférant la résistance à la kanamycine ; - trfA : locus trfA (1481 pb) issu de pRK2 permettant la production de 2 protéines, P285 et P382, qui augmentent la réplication du plasmide en se liant à l'origine de réplication ; - Tnos : terminateur nos (nopaline synthétase) ; - Pnos : promoteur nos (nopaline synthétase) ; - LB : bordure gauche d'un ADN-T ; - RB : bordure droite d'un ADN-T ; - MCS : site de clonages multiples, S :XXX le numéro de la base de départ, E :XXX le numéro de la base de fin du MCS, la liste commençant par le premier site de restriction en haut et se terminant par le dernier site de restriction en bas, dans le sens 5'>3' ; - polyA 35S : signal de terminaison (polyadénylation) de transcription ; - gène gus : gène codant pour la bêta-glucuronidase ; - IA : l'intron actine de riz ; - PA : promoteur actine de riz ;
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- Phmwg : promoteur high molecular weight glutenin (gluténine à haut poids moléculaire) du blé ; - gène bar ( bialaphos resistance ): gène codant pour l'enzyme phosphinothricine acétyltransférase conférant la résistance au glufosinate ; - ep35S : enhanced promoter (promoteur optimisé) du ribosome 35S.
EXEMPLES
Dans la description détaillée qui suit, toutes les digestions enzymatiques par enzymes de restriction ont été réalisées en suivant les recommandations du fournisseur New England Biolabs. Les purifications à l'aide des kits QIAquick Gel Extraction et QIAquick PCR Purification ont été effectuées en suivant les recommandations du fournisseur QIAGEN.
Dans la description détaillée qui suit, toutes les digestions enzymatiques par enzymes de restriction ont été réalisées en suivant les recommandations du fournisseur New England Biolabs. Les purifications à l'aide des kits QIAquick Gel Extraction et QIAquick PCR Purification ont été effectuées en suivant les recommandations du fournisseur QIAGEN.
Le kit Concert Rapid PCR Purification System a été utilisé selon les indications du fournisseur GIBCO BRL Life Technologies. Le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 utilisé est commercialisé par Perkin Elmer Applied Biosystems.
Exemple 1
1. Synthèse de pMRT1105
Un vecteur synthétique propre selon l'invention se présente de préférence sous forme d'un plasmide minimal pMRT1105 (3508 pb) et est constitué des éléments suivants : - ori RK2 : ori V de pRK2 de Escherichia coli à large spectre d'hôtes, réplicon RK2 instable engendrant un faible nombre de copies (643 pb).
1. Synthèse de pMRT1105
Un vecteur synthétique propre selon l'invention se présente de préférence sous forme d'un plasmide minimal pMRT1105 (3508 pb) et est constitué des éléments suivants : - ori RK2 : ori V de pRK2 de Escherichia coli à large spectre d'hôtes, réplicon RK2 instable engendrant un faible nombre de copies (643 pb).
- gène npt III : confère la résistance à la kanamycine (marqueur de sélection bactérien, 1337 bp).
- TrfA : locustrfA (1481 pb) issu de pRK2 permettant la production de 2 protéines, P285 et P382, qui augmentent la réplication du plasmide en se liant à l'origine de réplication.
Le plasmide pMRT1105 résulte de l'assemblage des fragments obtenus par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) pour ori RK2 et une partie de npt III , du fragment correspondant à une partie de trfA produit par amplification PCR ( polymerase chain reaction ) et de parties de trfA et de npt III isolées par digestion
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enzymatique.
1.1. Synthèse du fragment portant ori RK2 et partie de npt III
Le fragment AvrII-StuI (654 pb) portant ori RK2 (643 pb) a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pBinl9 à l'aide de 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC 3' (SEQ. ID23) contenant le site de restriction AvrII et 5' CGGATTAATGGTAGAAGGCCTTTCACGGGAGGGTTCGAGAAGG 3' (SEQ.ID24) possédant le site de restriction StuI, en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-SO4 pH 9,1,18 mM (NH4)2 SO;, 1,8 mM MgSO4 et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 55 C pendant 30 sec. et d'élongation à 68 C pendant 45 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Quarante l du milieu réactionnel PCR ont ensuite été soumis à l'action de 12,5 U du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 2 l de chacun des dNTP à 10 mM. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 10 min. Le produit PCR ainsi traité a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE (Tris-HCl 90 mM, Na2-EDTA 2 mM, acide borique 90 mM, pH 8,0) et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN a été repris dans 30 l de H2O.
Le fragment AvrII-StuI (654 pb) portant ori RK2 (643 pb) a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pBinl9 à l'aide de 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC 3' (SEQ. ID23) contenant le site de restriction AvrII et 5' CGGATTAATGGTAGAAGGCCTTTCACGGGAGGGTTCGAGAAGG 3' (SEQ.ID24) possédant le site de restriction StuI, en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-SO4 pH 9,1,18 mM (NH4)2 SO;, 1,8 mM MgSO4 et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 55 C pendant 30 sec. et d'élongation à 68 C pendant 45 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Quarante l du milieu réactionnel PCR ont ensuite été soumis à l'action de 12,5 U du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 2 l de chacun des dNTP à 10 mM. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 10 min. Le produit PCR ainsi traité a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE (Tris-HCl 90 mM, Na2-EDTA 2 mM, acide borique 90 mM, pH 8,0) et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN a été repris dans 30 l de H2O.
Le fragment StuI-BstXI (363 pb) portant partie de npt III (344 pb) a été amplifié et traité de la même manière que le fragment ori RK2 excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' TGAAAGGCCTTCTACCATTAATCCGCGATAAACCCAGCGAACC 3' (SEQ. ID25) contenant un site de restriction StuI et 5' ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3' (SEQ. ID26) possédant le site de restriction BstXI.
Les 2 fragments portant ori RK2 et partie de npt III ont ensuite été assemblés par extension par chevauchement
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( splicing overlap extension ) pour obtenir le fragment ori RK2 et partie de npt III . Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 7,5 l de chacun des produits PCR traités correspondant à ori RK2 et partie de npt III à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides 5' AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC 3' (SEQ. ID23) et 5' ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3' (SEQ. ID26) en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de
Tris-SO, pH9, 1, 18 mM (NH9 ) ~ Soi, 1, 8 mM MgSO. et 2 U d'enzyme ELONGASE dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 62 C pendant 30 sec. et d'élongation à 68 C pendant 45 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Quarante l du milieu réactionnel PCR ont ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% dans du tampon TBE et purifiés à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN, correspondant au fragment portant ori RK2 et partie de npt III , a été repris dans 30 l de H20. Ensuite, 27 l de cet ADN ont été hydrolysés par BstXI suivi de Avril, puis purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 30 l de H2O.
Tris-SO, pH9, 1, 18 mM (NH9 ) ~ Soi, 1, 8 mM MgSO. et 2 U d'enzyme ELONGASE dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 62 C pendant 30 sec. et d'élongation à 68 C pendant 45 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Quarante l du milieu réactionnel PCR ont ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% dans du tampon TBE et purifiés à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN, correspondant au fragment portant ori RK2 et partie de npt III , a été repris dans 30 l de H20. Ensuite, 27 l de cet ADN ont été hydrolysés par BstXI suivi de Avril, puis purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 30 l de H2O.
1. 2. Synthèse du fragment portant une partie de trfA
Le fragment NdeI-AvrII (295 pb) portant partie de trfA (295 pb) a été amplifié et traité de la même manière que le fragment ori RK2 excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' ATCGACGAGGAAATCGTCGTGCTGTTTGC 3' (SEQ. ID27) situé en amont du site Ndel et 5' AAACCTAGGAAATGCCAGTAAAGCGCTGGC 3' (SEQ. ID28) possédant le site de restriction Avril. Les fragments d'ADN correspondant à une partie de trfA issus de l'amplification PCR sont ensuite purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , repris dans 30pl de H20, hydrolysés par Avril et NdeI, repurifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 30 l de H2O.
Le fragment NdeI-AvrII (295 pb) portant partie de trfA (295 pb) a été amplifié et traité de la même manière que le fragment ori RK2 excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' ATCGACGAGGAAATCGTCGTGCTGTTTGC 3' (SEQ. ID27) situé en amont du site Ndel et 5' AAACCTAGGAAATGCCAGTAAAGCGCTGGC 3' (SEQ. ID28) possédant le site de restriction Avril. Les fragments d'ADN correspondant à une partie de trfA issus de l'amplification PCR sont ensuite purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , repris dans 30pl de H20, hydrolysés par Avril et NdeI, repurifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 30 l de H2O.
1. 3. Synthèse du fragment portant les parties de trfA
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et de npt III
Le fragment BstXI-NdeI (2196 pb) portant les parties de trfA et de npt III (2196 pb), a été isolé à partir de 9 pg d'ADN pBinl9 par digestion enzymatique par BstXI, purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , puis, hydrolysé par NdeI. Le fragment d'ADN a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,9% dans du tampon TBE, purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction et repris dans 30 l de H20.
Le fragment BstXI-NdeI (2196 pb) portant les parties de trfA et de npt III (2196 pb), a été isolé à partir de 9 pg d'ADN pBinl9 par digestion enzymatique par BstXI, purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , puis, hydrolysé par NdeI. Le fragment d'ADN a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,9% dans du tampon TBE, purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction et repris dans 30 l de H20.
1. 4. Obtention de pMRT1105
Les 3 fragments, ori RK2 et partie de npt III , parties de trfA et de npt III et partie de trfA , ont été ligaturés. Pour ce faire, le mélange réactionnel contenant 7,5 l des fragments digérés correspondant à ori RK2 et partie de npt III et parties de trfA et de npt III , et 11 l du fragment digéré correspondant à partie de trfA , a été concentré au SpeedVac AES1000 (SAVANT) pour atteindre un volume de 8 l. Puis, 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs) ont été ajoutés. La ligation a été effectuée par réaction PCR constituée de 200 cycles composés chacun de 2 étapes, l'une à 30 C pendant 30 sec. et l'autre à 10 C pendant 30 sec., dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu Luria-Bertani (LB, bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 10 g/1, Agar 15 g/1, pH 7,5) supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et vérifié par digestions enzymatiques et par séquençage. Le plasmide résultant retenu a été appelé pMRT1105 (3508 pb) et est représenté en figure 1. Sa séquence complète SEQ.ID01 est donnée dans le listage de séquences.
Les 3 fragments, ori RK2 et partie de npt III , parties de trfA et de npt III et partie de trfA , ont été ligaturés. Pour ce faire, le mélange réactionnel contenant 7,5 l des fragments digérés correspondant à ori RK2 et partie de npt III et parties de trfA et de npt III , et 11 l du fragment digéré correspondant à partie de trfA , a été concentré au SpeedVac AES1000 (SAVANT) pour atteindre un volume de 8 l. Puis, 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs) ont été ajoutés. La ligation a été effectuée par réaction PCR constituée de 200 cycles composés chacun de 2 étapes, l'une à 30 C pendant 30 sec. et l'autre à 10 C pendant 30 sec., dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu Luria-Bertani (LB, bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 10 g/1, Agar 15 g/1, pH 7,5) supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et vérifié par digestions enzymatiques et par séquençage. Le plasmide résultant retenu a été appelé pMRT1105 (3508 pb) et est représenté en figure 1. Sa séquence complète SEQ.ID01 est donnée dans le listage de séquences.
2 Synthèse de pMRT1106
Le plasmide pMRT1106 (4098 pb) diffère de pMRT1105 par l'addition de l'origine de réplication ColEl d'Escherichia coli ( ori ColEl ).
Le plasmide pMRT1106 (4098 pb) diffère de pMRT1105 par l'addition de l'origine de réplication ColEl d'Escherichia coli ( ori ColEl ).
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Le fragment, portant ori ColEl (590 pb), a été isolé à partir du plasmide pBR322 commercialisé par New England Biolabs. Le plasmide (5 pg) a été digéré par Ndel, purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 30 l de tampon TE (Tris-HCl 10 mM, Na~-EDTA 1 mM, pH 8,0). Le plasmide ainsi linéarisé a été soumis à l'action de 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 - MgCl 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant 30 min. Le plasmide linéarisé ainsi traité a été purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 30 l de H20. Puis, il a été digéré par AlwNI pour isoler le fragment portant ori ColEl , purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et soumis à l'action de 6 unités de T4 DNA polymérase (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel de 120 l en présence de 12 l de tampon T4 DNA polymérase x 10,4 l de dNTP 10 mM et 6 l de BSA 1 mg/ml. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 30 min. Le fragment d'ADN a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,2% dans du tampon TBE, purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction et repris dans 50 l de H2O. Puis, ce fragment d'ADN a été inséré dans le plasmide pMRT1105 (2 pg) digéré par StuI, purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, et purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification . La ligation par réaction PCR a été réalisée avec 10 ng de plasmide pMRT1105 digéré déphosphorylé et 100 ng de fragments d'ADN portant ori ColEl dans un milieu réactionnel de 10 l en présence de 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs). Elle est constituée de 180 cycles composés de 2 étapes, l'une de 10 C pendant 30 sec. et l'autre de 30 C pendant 30 sec. dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été
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transformées (Hanahan, 1983). La validité des clones obtenus a été vérifiée par test PCR sur colonies bactériennes en utilisant 10 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC 3' (SEQ. ID23) et 5' ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3' (SEQ. ID26), dans un milieu réactionnel de 24 l en présence de 22 l de SuperMix PCR (GIBCO BRL Life Technologies). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 30 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 60 C pendant 30 sec. et d'élongation à 72 C pendant 30 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 7 min. Le milieu réactionnel PCR a ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1% dans du tampon TBE. L'insertion de la séquence ori ColEl a été visualisée par la présence d'un fragment d'environ 1,6 kpb.
L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et vérifié par digestions enzymatiques et par séquençage. Le plasmide résultant retenu a été appelé pMRT1106 (4098 pb) et est représenté en figure 2. Sa séquence complète SEQ. ID02 est donnée dans le listage de séquences.
3. Synthèse de pMRT1118
Le plasmide pMRT1118 (5971 pb) diffère de pMRT1106 par l'introduction d'un ADN de transfert (ADN-T) propre dans pMRT1106. Cet ADN-T propre est constitué la cassette d'expression du gène nptII muté (Frisch et al., 1995) sous contrôle des promoteur et terminateur du gène nopaline synthase (nos, Depicker et al., 1982) d'Agrobacterium tumefaciens placée entre les bordures droite (RB) et gauche (LB) du plasmide pTiT37 d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline.
Le plasmide pMRT1118 (5971 pb) diffère de pMRT1106 par l'introduction d'un ADN de transfert (ADN-T) propre dans pMRT1106. Cet ADN-T propre est constitué la cassette d'expression du gène nptII muté (Frisch et al., 1995) sous contrôle des promoteur et terminateur du gène nopaline synthase (nos, Depicker et al., 1982) d'Agrobacterium tumefaciens placée entre les bordures droite (RB) et gauche (LB) du plasmide pTiT37 d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline.
3. 1 Synthèse du fragment portant fin nptII - Tnos LB
3. 1.1. Obtention du fragment portant LB
3. 1.1. Obtention du fragment portant LB
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Le fragment AvrII-SmaI (173 pb) portant LB (151 pb) a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pBinl9 à l'aide de 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3' (SEQ.ID29) contenant les sites de restriction Avril et AatII, et 5' CCTATGGATATCCCCCGGGGGATAGCCCCAGTACATTAAAAACGTCC 3' (SEQ.ID30) possédant le site de restriction SmaI, en présence de 200 pM de
chacun des dNTP, 60 mM de Tris-SO4 pH 9,1, 18 mM (NH) SO, l, 8 mM MgSO et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 55 C pendant 30 sec. et d'élongation à 68 C pendant 45 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Quarante l du milieu réactionnel PCR ont ensuite été soumis à l'action de 12,5 U du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 2 l de chacun des dNTP à 10 mM. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 10 min. Le produit PCR ainsi traité a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN a été repris dans 50 l de H20.
chacun des dNTP, 60 mM de Tris-SO4 pH 9,1, 18 mM (NH) SO, l, 8 mM MgSO et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 55 C pendant 30 sec. et d'élongation à 68 C pendant 45 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Quarante l du milieu réactionnel PCR ont ensuite été soumis à l'action de 12,5 U du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 2 l de chacun des dNTP à 10 mM. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 10 min. Le produit PCR ainsi traité a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN a été repris dans 50 l de H20.
3. 1.2. Obtention du fragment portant le terminateur nos (Tnos)
Le fragment SmaI-BspEI (288 pb) portant le terminateur nos (256 pb) a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5'CTATCCCCCGGGGGATATCCATAGGCCCGATCTAGTAACATAGATGAC 3' (SEQ.ID31) contenant un site de restriction SmaI et 5' GCGCACTTGGGCCCATAGCTCGACGAACGATCGTTCAAACATTTGGC 3' (SEQ.ID32) possédant le site de restriction Bsp120I.
Le fragment SmaI-BspEI (288 pb) portant le terminateur nos (256 pb) a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5'CTATCCCCCGGGGGATATCCATAGGCCCGATCTAGTAACATAGATGAC 3' (SEQ.ID31) contenant un site de restriction SmaI et 5' GCGCACTTGGGCCCATAGCTCGACGAACGATCGTTCAAACATTTGGC 3' (SEQ.ID32) possédant le site de restriction Bsp120I.
3. 1.3. Obtention du fragment portant fin du gène nptII ( fin nptII )
Le fragment (221 pb) portant fin nptII (221 pb) a été amplifié et traité de la même manière que le fragment
Le fragment (221 pb) portant fin nptII (221 pb) a été amplifié et traité de la même manière que le fragment
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portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' TTCGTCGAGCTATGGGCCCAAGTGCGCATCCCGTGGGCGAAGAACTC 3' (SEQ. ID33) contenant un site de restriction Bsp120I et 5' TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGG 3' (SEQ. ID34) en aval de BstBI.
3. 1.4. Obtention du fragment fin nptII - Tnos - LB
Les fragments, LB , Tnos et fin nptII , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) en 2 étapes : - assemblage des fragments LB et Tnos résultant en un fragment Tnos - LB , - assemblage du fragment Tnos - LB et du fragment fin nptII résultant en un fragment fin nptII - Tnos - LB .
Les fragments, LB , Tnos et fin nptII , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) en 2 étapes : - assemblage des fragments LB et Tnos résultant en un fragment Tnos - LB , - assemblage du fragment Tnos - LB et du fragment fin nptII résultant en un fragment fin nptII - Tnos - LB .
Pour ce faire, une première amplification PCR a été effectuée à partir de 10 l de chacun des produits PCR traités correspondant à LB et Tnos , à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides, 5' TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3' (SEQ.ID29) et 5' GCGCACTTGGGCCCATAGCTCGACGAACGATCGTTCAAACATTTGGC 3' (SEQ. ID32), en présence de 200 uM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-SO pH 9,1, 18 mM (NH4)2SO4, 1,8mM MgSO, et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 45 sec., d'hybridation à 62 C pendant 45 sec. et d'élongation à 68 C pendant 1 min. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Quarante l du milieu réactionnel PCR ont ensuite été soumis à l'action de 12,5 U du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 2 l de chacun des dNTP à 10 mM. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 10 min. Le produit PCR ainsi traité, correspondant au fragment Tnos - LB (477 pb), a ensuite été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN a été repris dans 30 l de H2O.
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Puis, une deuxième amplification PCR a été effectuée à partir de 7 l de chacun des produits PCR traités correspondant à fin nptII et Tnos - LB , à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides, 5' TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3' (SEQ.ID29) et 5' TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGG 3' (SEQ. ID34), en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-S04 pH 9,1,18 mM (NH4)2 S04, 1,8 mM MgS04 et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 45 sec., d'hybridation à 60 C pendant 45 sec. et d'élongation à 68 C pendant 1 min. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Cette réaction est répétée 3 fois pour les produits PCR traités, correspondant à fin nptII et Tnos - LB . Le milieu réactionnel PCR a ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . Le fragment d'ADN (672 pb) correspondant à fin nptII - Tnos - LB , a été repris dans 100 l de H20. Ensuite, 95 l de cet ADN ont été hydrolysés par Avril, purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , digérés par BstBI, purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 50 l de H2O. Le fragment AvrII-BstBI de 631 pb porte la séquence fin nptll - Tnos LB .
3. 2. Synthèse du fragment portant fin du promoteur nos (Pnos) et début du gène nptII ( fin Pnos - déb. nptII )
Le fragment (1023 pb) portant fin Pnos - déb. nptII a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3' (SEQ.ID39) et 5' ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3' (SEQ. ID40), et que l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 45 sec., d'hybridation à 55 C pendant 45 sec. et
Le fragment (1023 pb) portant fin Pnos - déb. nptII a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3' (SEQ.ID39) et 5' ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3' (SEQ. ID40), et que l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 45 sec., d'hybridation à 55 C pendant 45 sec. et
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d'élongation à 68 C pendant 1 min. L'amplification a été répétée pour 2 échantillons d'ADN pBinl9.
3. 3. Synthèse du fragment fin Pnos - nptII - Tnos LB
Les fragments, fin Pnos - déb. nptII et fin nptII - Tnos - LB , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) pour résulter en un fragment fin Pnos - nptII - Tnos - LB .
Les fragments, fin Pnos - déb. nptII et fin nptII - Tnos - LB , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) pour résulter en un fragment fin Pnos - nptII - Tnos - LB .
Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 5 l de chacun des produits PCR traités, correspondant à fin Pnos - déb. nptII et fin nptII - Tnos - LB , à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides, 5' TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3' (SEQ.ID29) et 5' ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3' (SEQ. ID40), en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-SO pH 9,1,18 mM (NH4)2 SO,, 1,8 mM MgS04 et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 45 sec., d'hybridation à 55 C pendant 45 sec. et d'élongation à 68 C pendant 1 min. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Cette réaction a été répétée 5 fois pour chacun des produits PCR traités, correspondant à fin Pnos - déb. nptII et fin nptII - Tnos - LB . Le milieu réactionnel PCR a ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . Le fragment d'ADN (1608 pb) correspondant à fin Pnos - nptII - Tnos - LB , a été repris dans 50 l de H20.
Ensuite, cet ADN a été soumis à l'action de 62,5 U du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 15 l de tampon du fragment Klenow x 10 (New England Biolabs) et de 10 l de chacun des dNTP à 10 mM. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 10 min. L'ADN ainsi traité, a ensuite été purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 50 l de H2O.
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3. 4. Synthèse du fragment portant RB - MCS - déb.
Pnos
3. 4.1. Obtention du fragment portant RB et site multiple de clonage (MCS) ( RB - MCS )
Le fragment (210 pb) portant RB - MCS a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' CGGTACCGAAGCTTTGAATTCACTCGAGCAGATTGTCGTTTCCCGCC 3' (SEQ. ID35) possédant les sites de restriction Kpnl, HindIII, EcoRI et XhoI, et 5' TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3' (SEQ.ID36) possédant les sites de restriction Avril et AgeI.
3. 4.1. Obtention du fragment portant RB et site multiple de clonage (MCS) ( RB - MCS )
Le fragment (210 pb) portant RB - MCS a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' CGGTACCGAAGCTTTGAATTCACTCGAGCAGATTGTCGTTTCCCGCC 3' (SEQ. ID35) possédant les sites de restriction Kpnl, HindIII, EcoRI et XhoI, et 5' TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3' (SEQ.ID36) possédant les sites de restriction Avril et AgeI.
3. 4.2. Obtention du fragment portant site multiple de clonage (MCS) et début du promoteur nos (Pnos) ( MCS - déb.
Pnos )
Le fragment (209 pb) portant MCS - déb. Pnos a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' (SEQ. ID37) et 5' GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3' (SEQ.ID38) possédant les sites de restriction XhoI, EcoRI, HindIII et Kpnl.
Le fragment (209 pb) portant MCS - déb. Pnos a été amplifié et traité de la même manière que le fragment portant LB excepté que les 2 oligodésoxynucléotides utilisés sont 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' (SEQ. ID37) et 5' GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3' (SEQ.ID38) possédant les sites de restriction XhoI, EcoRI, HindIII et Kpnl.
3. 4.3. Obtention du fragment portant RB - MCS - déb.
Pnos
Les fragments, RB - MCS et MCS - déb. Pnos , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) pour résulter en un fragment RB - MCS déb. Pnos .
Les fragments, RB - MCS et MCS - déb. Pnos , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) pour résulter en un fragment RB - MCS déb. Pnos .
Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 12 l de chacun des produits PCR traités, correspondant à RB - MCS et MCS - déb. Pnos , à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides, 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' (SEQ. ID37) et 5' TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3' (SEQ. ID36), en présence de 200 uM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-S04 pH9,l, 18 mM (NH4)2 S04, 1,8mM MgS04 et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une
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dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 60 C pendant 30 sec. et d'élongation à 68 C pendant 45 sec. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Cette réaction a été répétée pour les 3 x 12 l restants de chacun des produits PCR traités, correspondant à RB - MCS et MCS déb. Pnos . Le milieu réactionnel PCR a ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). Le fragment d'ADN (390 pb) correspondant à RB - MCS - déb.
Pnos , a été repris dans 100 l de H20. Ensuite, 95 l de cet ADN ont été hydrolysés par Avril, purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , digérés par Bsu36I, purifiés à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 50 l de H2O. Le fragment AvrII-Bsu36I de 295 pb porte la séquence RB - MCS - déb. Pnos .
3. 5 Synthèse de l'ADN-T
Les fragments, RB - MCS - déb. Pnos et fin Pnos nptII - Tnos - LB , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) pour résulter en un fragment RB - MCS - Pnos - nptII - Tnos - LB qui correspond à l'ADN-T (1883 pb).
Les fragments, RB - MCS - déb. Pnos et fin Pnos nptII - Tnos - LB , ont été assemblés par extension par chevauchement ( splicing overlap extension ) pour résulter en un fragment RB - MCS - Pnos - nptII - Tnos - LB qui correspond à l'ADN-T (1883 pb).
Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 4 l de du produit PCR traité correspondant à RB MCS - déb. Pnos et de 5 l de du produit PCR traité correspondant à fin Pnos - nptII - Tnos - LB , à l'aide de 20 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides, 5' TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3' (SEQ.ID29) et 5' TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3' (SEQ. ID36), en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-S04 pH 9,1,18 mM (NH4) 2 S04, 1,8 mM MgS04 et 2 U d'enzyme ELONGASE (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C
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pendant 45 sec., d'hybridation à 55 C pendant 45 sec. et d'élongation à 68 C pendant 1 min. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Cette réaction a été répétée 10 fois pour chacun des produits PCR traités, correspondant à RB - MCS - déb. Pnos et fin Pnos - nptII - Tnos - LB . Le milieu réactionnel PCR a ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . Le fragment d'ADN (1883 pb) correspondant à l'ADN-T, a été repris dans 100 l de H20. Ensuite, cet ADN-T a été hydrolysé par Avril (fragment de 1873 pb), purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 100 l de H2O.
3. 6. Obtention de pMRT1118
Le plasmide binaire pMRT1118 (5971 pb) résulte de l'introduction du fragment ADN-T digéré par Avril au site Avril du plasmide pMRT1106 déphosphorylé.
Le plasmide binaire pMRT1118 (5971 pb) résulte de l'introduction du fragment ADN-T digéré par Avril au site Avril du plasmide pMRT1106 déphosphorylé.
Pour ce faire, l'ADN plasmidique pMRT1106 (5 pg) a été digéré par Avril, purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , puis, déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6% dans du tampon TBE, purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction , déphosphorylé une deuxième fois par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau dans les conditions citées ci-dessus, et enfin, purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification et repris dans 50 l de H2O.
La ligation par réaction PCR a été réalisée avec 32,5 ng de plasmide pMRT1106 digéré déphosphorylé et 50 ng de fragments ADN-T digérés dans un milieu réactionnel de 10 l en présence de 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs). Elle est constituée de 180 cycles composés de 2 étapes, l'une de 10 C pendant 30 sec. et l'autre de 30 C pendant 30 sec. dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 .
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Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).
L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et vérifié par digestions enzymatiques et par séquençage. Le plasmide résultant retenu a été appelé pMRT1118 (Figure 3). Sa séquence complète SEQ. ID03 est donnée dans le listage de séquences.
4. Synthèse de pMRT1119
Le plasmide pMRT1119 (6016 pb) diffère de pMRT1118 par l'addition de sites de restriction uniques supplémentaires dans le site multiple de clonage MCS de pMRT1118.
Le plasmide pMRT1119 (6016 pb) diffère de pMRT1118 par l'addition de sites de restriction uniques supplémentaires dans le site multiple de clonage MCS de pMRT1118.
4. 1. Obtention des sites de restriction uniques supplémentaires
Les sites de restriction uniques supplémentaires (XbaI, SalI, PacI, BamHI, MluI, HpaI et FseI) ont été créés par hybridation entre les 2 oligodésoxynucléotides, 5'AGCTTGGCCGGCCGTTAACACGCGTGGATCCTTAATTAAGTCGACTCTAGAG 3' (SEQ. ID41) et 5' AATTCTCTAGAGTCGACTTAATTAAGGATCCACGCGTGTTAACGGCCGGCCA 3' (SEQ. ID42). Pour ce faire, 5 pg de chacun des 2 oligodésoxynucléotides ont été mélangés et placés à 85 C pendant 1 min. suivi d'une diminution progressive de la température jusqu'à 80 C pendant 5 min., puis d'une diminution lente de la température jusqu'à 60 C dans un bain-marie, et enfin, d'une diminution rapide de la température jusqu'à température ambiante hors du bain-marie.
Les sites de restriction uniques supplémentaires (XbaI, SalI, PacI, BamHI, MluI, HpaI et FseI) ont été créés par hybridation entre les 2 oligodésoxynucléotides, 5'AGCTTGGCCGGCCGTTAACACGCGTGGATCCTTAATTAAGTCGACTCTAGAG 3' (SEQ. ID41) et 5' AATTCTCTAGAGTCGACTTAATTAAGGATCCACGCGTGTTAACGGCCGGCCA 3' (SEQ. ID42). Pour ce faire, 5 pg de chacun des 2 oligodésoxynucléotides ont été mélangés et placés à 85 C pendant 1 min. suivi d'une diminution progressive de la température jusqu'à 80 C pendant 5 min., puis d'une diminution lente de la température jusqu'à 60 C dans un bain-marie, et enfin, d'une diminution rapide de la température jusqu'à température ambiante hors du bain-marie.
4. 2. Obtention de pMRT1119
Le plasmide binaire pMRT1119 (6016 pb) résulte de l'introduction de la séquence portant les sites de restriction uniques aux sites HindIII et EcoRI du plasmide pMRT1118.
Le plasmide binaire pMRT1119 (6016 pb) résulte de l'introduction de la séquence portant les sites de restriction uniques aux sites HindIII et EcoRI du plasmide pMRT1118.
Pour ce faire, l'ADN plasmidique pMRT1118 (5 ug) a été doublement digéré par HindIII et EcoRI, purifié à l'aide du kit QIAquick PCR Purification , et repris dans 50 l de H20.
La ligation par réaction PCR a été réalisée avec 75 ng de plasmide pMRT1118 digéré et 500 ng de fragments portant les
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sites de restriction uniques (décrits en 4. 1.) dans un milieu réactionnel de 10 ul en présence de 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs). Elle est constituée de 180 cycles composés de 2 étapes, l'une de 10 C pendant 30 sec. et l'autre de 30 C pendant 30 sec. dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 .
Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et vérifié par digestions enzymatiques et par séquençage. Le plasmide résultant retenu a été appelé pMRT1119 (Figure 4). Sa séquence complète SEQ. ID04 est donnée dans le listage de séquences.
5. Synthèse de pMRT1121
Le plasmide pMRT1121 (6017 pb) résulte de l'insertion dans pMRTlll9 d'un site de restriction unique, BspEI, entre le promoteur nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Pnos) et le gène nptII muté.
Le plasmide pMRT1121 (6017 pb) résulte de l'insertion dans pMRTlll9 d'un site de restriction unique, BspEI, entre le promoteur nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Pnos) et le gène nptII muté.
Le site BspEI a été inséré par l'assemblage par extension par chevauchement de deux fragments obtenus par amplification PCR.
5. 1. Synthèse du fragment portant "partie de nptII et site BspEI"
Le fragment de 892 pb portant "partie de nptII et site BspEI", a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pBinl9 à l'aide de 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3' (SEQ. ID39) et 5' TAATCTGCATCCGGATCTGGATCGTTTCGC 3' (SEQ.ID43) portant le site BspEI, en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-S04 pH 9,1,18 mM (NH4)2 S04, 1,8 mM MgS04 et 2 U d'enzyme eLONGase (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. Cette réaction a été répétée. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans un thermocycleur "GeneAmp PCR System 9700". Après dénaturation à
Le fragment de 892 pb portant "partie de nptII et site BspEI", a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pBinl9 à l'aide de 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3' (SEQ. ID39) et 5' TAATCTGCATCCGGATCTGGATCGTTTCGC 3' (SEQ.ID43) portant le site BspEI, en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-S04 pH 9,1,18 mM (NH4)2 S04, 1,8 mM MgS04 et 2 U d'enzyme eLONGase (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. Cette réaction a été répétée. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans un thermocycleur "GeneAmp PCR System 9700". Après dénaturation à
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94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 45 sec., d'hybridation à 55 C pendant 45 sec. et d'élongation à 68 C pendant 1 min. Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 3 min. Le produit PCR ainsi obtenu a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN a été repris dans 50 l de H2O.
5. 2. Synthèse du fragment portant "site BspEI - MCS"
Le fragment (250 pb) portant "site BspEI - MCS", a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRT1118 à l'aide de 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3' (SEQ.ID38) et 5' ACGATCCAGATCCGGATGCAGATTATTTGG 3' (SEQ.ID44) portant le site BspEI. Les conditions d'amplification PCR et du traitement du fragment PCR obtenu sont les mêmes que celles décrites en 5.1.
Le fragment (250 pb) portant "site BspEI - MCS", a été amplifié par PCR à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRT1118 à l'aide de 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3' (SEQ.ID38) et 5' ACGATCCAGATCCGGATGCAGATTATTTGG 3' (SEQ.ID44) portant le site BspEI. Les conditions d'amplification PCR et du traitement du fragment PCR obtenu sont les mêmes que celles décrites en 5.1.
5. 3. Synthèse du fragment portant "partie nptII - MCS"
Le fragment de 1117 pb portant "partie nptII - MCS", résulte de l'assemblage des 2 fragments PCR, "partie nptII site BspEI" et "site BspEI - MCS", par extension par chevauchement.
Le fragment de 1117 pb portant "partie nptII - MCS", résulte de l'assemblage des 2 fragments PCR, "partie nptII site BspEI" et "site BspEI - MCS", par extension par chevauchement.
Pour ce faire, une amplification PCR a été effectuée à partir de 7,5 l de chacun des produits PCR traités correspondant à "partie nptII - site BspEI" et "site BspEI MCS", à l'aide 20 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides, 5' GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3' (SEQ.ID39) et 5' GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3' (SEQ.ID38), en présence de 200 pM de chacun des dNTP, 60 mM de Tris-SO4 pH 9,1,18 mM (NH4)2 S04, 1,8mM MgSO4 et 2 U d'enzyme eLONGase (GIBCO BRL Life Technologies) dans un milieu réactionnel de 50 l final. Cette réaction a été répétée 4 fois. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans un thermocycleur "GeneAmp PCR System 9700". Après dénaturation à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 15 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 45 sec., d'hybridation à 62 C pendant 45 sec. et d'élongation à 68 C pendant 1 min.
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Puis, lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 68 C pendant 7 min. Le produit PCR ainsi obtenu a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction". L'ADN a été repris dans 50 l de H20, digéré par Bsu36I et PstI, et, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 2 % dans du tampon TEB.
Le fragment d'ADN de 315 pb a été isolé et purifié à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction".
5. 4. Obtention de pMRT1121
Le fragment d'ADN Bsu36I - PstI de 315 pb, qui porte le site BspEI, a été ligaturé aux sites Bsu36I et PstI du plasmide binaire pMRT1119.
Le fragment d'ADN Bsu36I - PstI de 315 pb, qui porte le site BspEI, a été ligaturé aux sites Bsu36I et PstI du plasmide binaire pMRT1119.
Le plasmide pMRT1119 a été préalablement digéré par Bsu36I et PstI, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1% dans du tampon TEB et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . L'ADN a été repris dans 50 l de H2O, déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, et purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification".
La ligation par réaction PCR a été réalisée avec 100 ng de plasmide pMRT1119 digéré déphosphorylé et 30 ng de fragments d'ADN digérés (315 pb) dans un milieu réactionnel de 10 l en présence de 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et de 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs). Elle est constituée de 180 cycles composés de 2 étapes, l'une de 10 C pendant 30 sec. et l'autre de 30 C pendant 30 sec. dans un thermocycleur "GeneAmp PCR System 9700". Les bactéries, Escherichia coli DH5a ou SCS110 (déficiente en méthylases Dam et Dcm), rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1121 (Figure 5). Sa séquence complète SEQ. ID05 est donnée dans le listage de séquences.
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6. Synthèse de pMRT1122
Le plasmide pMRT1122 (6016 pb) résulte de l'introduction dans pMRT1119 d'une mutation ponctuelle dans le gène nptil muté pour restaurer le site de restriction BglII et conduire ainsi à l'obtention du gène nptII sauvage.
Le plasmide pMRT1122 (6016 pb) résulte de l'introduction dans pMRT1119 d'une mutation ponctuelle dans le gène nptil muté pour restaurer le site de restriction BglII et conduire ainsi à l'obtention du gène nptII sauvage.
Pour ce faire, le site de restriction BglII a été restauré dans le gène nptII muté de pMRT1119 par mutagenèse dirigée selon le procédé de Michael (1994).
L'oligodésoxynucléotide 5'ATGGGTCACGACGAGATCTTCGCCGTCGGG 3' (SEQ. ID45) a été préalablement phosphorylé en soumettant 600 pmoles de l'oligodésoxynucléotide à l'action de 90 unités de T4 kinase (Amersham) en présence de 30 l de tampon T4 kinase xlO (Amersham) et de 3 l d'ATP 100 mM dans un milieu réactionnel de 300 l final à 37 C pendant 30 min. L'oligodésoxynucléotide ainsi traité a été purifié à l'aide du kit Qiaquick Removal Nucleotide (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur.
Puis, la ligation par PCR a été réalisée à partir de 10 ng de matrice pBIN19 à l'aide de 200 pmoles de chacun des oligodésoxynucléotides, 5' GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3' (SEQ. ID39), 5' ATGGGTCACGACGAGATCTTCGCCGTCGGG 3' (SEQ. ID45) phosphorylé comportant le site de restriction BglII et 5' ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3' (SEQ. ID40), en présence de 400 pM de chacun des dNTP, 10 l de tampon Taq DNA ligase x 10 (New England BioLabs), 5 unités de Vent DNA Polymerase (New England BioLabs) et 40 unités de Taq DNA ligase (New England BioLabs) dans un milieu réactionnel de 100 l final. La réaction de ligation par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en réalisant les trois phases successives suivantes : la première phase a consisté en un cycle composé des étapes de dénaturation à 94 C pendant 5 min., d'hybridation à 50 C pendant 1 min. et d'élongation à 65 C pendant 4 min. ; seconde phase a été composée de 28 cycles comprenant chacun les étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à 50 C pendant 1 min. et d'élongation à 65 C pendant 4 min. ; enfin, la dernière phase a été constituée d'un cycle composé des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 sec., d'hybridation à
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50 C pendant 1 min. et d'élongation à 65 C pendant 15 min. Le milieu réactionnel PCR a ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 0.8 % dans du tampon TBE et purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction . Les fragments d'ADN (1023 pb) ainsi traités, ont été hydrolysés par NcoI et PstI et soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 2%. Les fragments d'ADN de 383 pb ont été isolés, purifiés à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction , repris dans 50 l de H20 et ligaturés aux sites Ncol et PstI du plasmide pMRT1119. Pour ce faire, l'ADN plasmidique pMRT1119 a été digéré par NcoI et PstI, purifié sur gel d'agarose à 0,8 %. Le fragment correspondant au plasmide a été isolé, purifié à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction , puis, déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, et enfin, repris dans 50 l de H2O.
La ligation par PCR a été réalisée avec 50 ng de plasmide pMRT1119 digéré déphosphorylé et la totalité des fragments d'ADN digérés et traités dans un milieu réactionnel de 10 l en présence de 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs). Elle est constituée de 180 cycles composés de 2 étapes, l'une de 10 C pendant 30 sec. et l'autre de 30 C pendant 30 sec. dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 .
Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).
L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et criblés par digestion par BglII. L'ADN plasmidique du clone retenu a été vérifié par digestions enzymatiques et par séquençage. Le plasmide résultant retenu a été appelé pMRT1122 (6016 pb) Il est représenté en figure 6 et sa séquence complète SEQ. ID06 est donnée dans le listage de séquences.
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7. Synthèse de pMRT1155
Le plasmide pMRT1155 (6017 pb) diffère de pMRT1122 par la présence du site BspEI.
Le plasmide pMRT1155 (6017 pb) diffère de pMRT1122 par la présence du site BspEI.
Pour ce faire, le fragment insert de 315 pb renfermant le site BspEI, a été obtenu par digestion de pMRT1121 par Bsu36I et PstI, électrophorèse sur gel d'agarose à 1,2 % dans du tampon TEB, purification à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction" et reprise dans 50 l de H20.
Le fragment vecteur pMRT1122 a été obtenu par digestion de pMRT1122 par Bsu36I et PstI, électrophorèse sur gel d'agarose à 1,2 % dans du tampon TEB, purification à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction" et reprise dans 50 l de H2O. Puis, pMRT1122 digéré a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, et purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification".
La ligation par réaction PCR a été réalisée avec 100 ng de plasmide pMRT1122 digéré déphosphorylé et 50 ng de fragments d'ADN digérés (315 pb) dans un milieu réactionnel de 10 l en présence de 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (New England Biolabs) et de 400 unités d'enzyme T4 DNA ligase (New England Biolabs). Elle est constituée de 180 cycles composés de 2 étapes, l'une de 10 C pendant 30 sec. et l'autre de 30 C pendant 30 sec. dans un thermocycleur "GeneAmp PCR System 9700". Les bactéries, Escherichia coli DH5a ou SCS110 (déficiente en méthylases Dam et Dcm), rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1155 (Figure 7). Sa séquence complète SEQ. ID07 est donnée dans le listage de séquences.
8. Obtention de plasmides binaires de base comprenant la séquence "eP35S - T35S"
8. 1. Obtention de pMRT1205
8. 1. Obtention de pMRT1205
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Le plasmide pMRT1205 (7503 pb) comporte la cassette d'expression du gène nptII muté et une séquence "promoteur double 35S - terminateur 35S" (eP35S - T35S) pour le clonage de gènes d'intérêt. Il résulte du clonage du promoteur eP35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) dans pMRT1175. Le promoteur eP35S du CaMV correspond à une duplication des séquences activant la transcription situées en amont de l'élément TATA du promoteur 35S (Kay et al., 1987). Le plasmide pMRT1175 (6767 pb), quant à lui, résulte du clonage de T35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1121. La séquence terminatrice de transcription, T35S du CaMV, correspond à la région en 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S (Franck et al., 1980).
8. 1.1. Obtention de pMRT1175
Le plasmide pMRT1175 résulte du clonage des fragments ADN insert EcoRI - XhoI correspondant au T35S aux sites EcoRI et XhoI du vecteur pMRT1121 produit à partir de la souche SCS110 d'Escherichia coli.
Le plasmide pMRT1175 résulte du clonage des fragments ADN insert EcoRI - XhoI correspondant au T35S aux sites EcoRI et XhoI du vecteur pMRT1121 produit à partir de la souche SCS110 d'Escherichia coli.
Le fragment vecteur pMRT1121 a été obtenu par digestion 7 pg de pMRT1121 par EcoRI et XhoI, purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et reprise dans 50 l de H20. Puis, pMRT1121 digéré a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, et purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et repris dans 50 l de H20.
Les fragments ADN insert EcoRI - Xhol (757 pb) correspondant au T35S (750 pb) ont été obtenus par digestion par EcoRI et XhoI du plasmide pJIT163, qui dérive du plasmide pJIT60 (Guerineau et Mullineaux, 1993). Puis, ils ont été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % dans du tampon TEB, purifiés à l'aide du kit QIAquick Gel Extraction et repris dans 30 l de H20.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 80 ng de plasmide pMRT1121
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digéré déphosphorylé et 80 ng de fragments ADN insert digérés.
Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1175 (6767 pb). Il est représenté en figure 8 et sa séquence complète SEQ. ID08 est donnée dans le listage de séquences.
8.1.2. Obtention de pMRT1205
Le plasmide pMRT1205 résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII correspondant à eP35S aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1175.
Le plasmide pMRT1205 résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII correspondant à eP35S aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1175.
Le fragment vecteur pMRT1175 a été obtenu par digestion 4,1 pg de pMRT1175 par KpnI et HindIII, purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System et reprise dans 100 l de HO. Puis, pMRT1175 digéré a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, purifié à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et repris dans 50 l de H2O.
Les fragments ADN insert KpnI - HindIII (743 pb) correspondant à eP35S (735 pb) ont été obtenus par digestion par KpnI et HindIII du plasmide pJIT163, qui dérive du plasmide pJIT60 (Guerineau et Mullineaux, 1993). Puis, ils ont été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % dans du tampon TEB, purifiés à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction" et repris dans 30 l de H2O.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 48 ng de plasmide pMRT1175 digéré déphosphorylé et 30 ng de fragments ADN insert digérés.
Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et
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vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1205 (7503 pb). Il est représenté en figure 19 et sa séquence complète SEQ. ID19 est donnée dans le listage de séquences.
8. 2. Obtention de pMRT1203
Le plasmide pMRT1203 (7503 pb) comporte la cassette d'expression du gène nptII sauvage et une séquence "promoteur double 35S - terminateur 35S" (eP35S - T35S) pour le clonage de gènes d'intérêt. Il résulte du clonage du promoteur eP35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1176. Le plasmide pMRT1176 (6767 pb), quant à lui, résulte du clonage de T35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1155. Le promoteur eP35S et le terminateur T35S sont décrits en 8.1.
Le plasmide pMRT1203 (7503 pb) comporte la cassette d'expression du gène nptII sauvage et une séquence "promoteur double 35S - terminateur 35S" (eP35S - T35S) pour le clonage de gènes d'intérêt. Il résulte du clonage du promoteur eP35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1176. Le plasmide pMRT1176 (6767 pb), quant à lui, résulte du clonage de T35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1155. Le promoteur eP35S et le terminateur T35S sont décrits en 8.1.
8. 2.1. Obtention de pMRT1176
Le plasmide pMRT1176 résulte du clonage des fragments ADN insert EcoRI - XhoI (757 pb) correspondant au T35S (750 pb) aux sites EcoRI et XhoI du vecteur pMRT1155 produit à partir de la souche SCS110 d'Escherichia coli.
Le plasmide pMRT1176 résulte du clonage des fragments ADN insert EcoRI - XhoI (757 pb) correspondant au T35S (750 pb) aux sites EcoRI et XhoI du vecteur pMRT1155 produit à partir de la souche SCS110 d'Escherichia coli.
Le plasmide pMRT1176 a été obtenu en suivant les méthodologies décrites en 8. 1.1., excepté que 6,3 pg du vecteur pMRT1155, qui constitue le vecteur de clonage, ont été digérés et traités. Le plasmide pMRT1176 (6767 pb) est représenté en figure 9. Sa séquence complète SEQ. ID09 est donnée dans le listage de séquences.
8. 2.2. Obtention de pMRT1203
Le plasmide pMRT1203 résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII (743 pb) correspondant à eP35S (735 pb) aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1176.
Le plasmide pMRT1203 résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII (743 pb) correspondant à eP35S (735 pb) aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1176.
Le plasmide pMRT1203 a été obtenu en suivant les méthodologies décrites en 8. 1.2., excepté que 3,9 ug du vecteur pMRT1176, qui constitue le vecteur de clonage, ont été digérés et traités. Le plasmide pMRT1203 (7503 pb) est représenté en figure 17. Sa séquence complète SEQ. ID17 est donnée dans le listage de séquences.
9. Obtention de plasmides binaires comprenant la séquence "eP35S - uidA - T35S"
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Ces vecteurs ont été exploités en transformation du tabac pour les évaluer et déterminer l'incidence de la mutation du gène nptII.
9. 1. Obtention de pMRT1206
Le plasmide pMRT1206 (9390 pb) comporte la cassette d'expression du gène nptII muté et la cassette d'expression du gène uidA (gus). Il résulte du clonage du promoteur eP35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1196. Le plasmide pMRT1196 (8654 pb), quant à lui, résulte du clonage du gène uidA (Jefferson RA et al., 1986) dans pMRT1175.
Le plasmide pMRT1206 (9390 pb) comporte la cassette d'expression du gène nptII muté et la cassette d'expression du gène uidA (gus). Il résulte du clonage du promoteur eP35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1196. Le plasmide pMRT1196 (8654 pb), quant à lui, résulte du clonage du gène uidA (Jefferson RA et al., 1986) dans pMRT1175.
9.1.1. Obtention de pMRT1196
Le plasmide pMRT1196 résulte du clonage des fragments d'ADN insert (SmaI - "SacI + T4 DNA polymérase") correspondant au gène uidA, au site "XbaI + Klenow" du vecteur pMRT1175.
Le plasmide pMRT1196 résulte du clonage des fragments d'ADN insert (SmaI - "SacI + T4 DNA polymérase") correspondant au gène uidA, au site "XbaI + Klenow" du vecteur pMRT1175.
Le fragment vecteur pMRT1175 a été obtenu par digestion 10 pg de pMRT1175 par XbaI, purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", repris dans 50 l de H20 et soumis à l'action de 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 MgCl2 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant 30 min. Puis, il a été purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et repris dans 50 l de H2O. Le plasmide pMRT1175 ainsi digéré et traité a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, et purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et repris dans 50 l de H2O.
Les fragments ADN insert (2 pg) correspondant au gène uidA (1,8 kpb), ont été obtenus par digestion de pBI221 (commercialisé par Clontech) par SacI, purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et reprise dans 50 l de H20.
Puis, pBI221 digéré a été soumis à l'action de 6 unités de T4 DNA polymérase (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel de 120 l en présence de 12 l de tampon T4 DNA polymérase x 10, 4 l de dNTP 10 mM et 6 l de BSA 1 mg/ml. La réaction a été
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effectuée à 37 C pendant 30 min. Le plasmide pBI221 ainsi traité a été purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et repris dans 50 l de H20. Enfin, pBI221 ainsi traité, a été digéré par SmaI. Le fragment [SacI + T4 DNA polymérase] SmaI (1882 pb) a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %, purifié à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction" et reprise dans 50 l de H2O.
La ligation par réaction PCR a été réalisée en suivant les méthodologies décrites en 7, avec 15 ng de plasmide pMRT1175 digéré déphosphorylé et 100 ng de fragments ADN insert digérés.
Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1196 (8654 pb). Il est représenté en figure 14 et sa séquence complète SEQ. ID14 est donnée dans le listage de séquences.
9. 1.2. Obtention de pMRT1206
Le plasmide pMRT1206 (9390 pb) résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII (743 pb) correspondant à eP35S (735 pb) aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1196.
Le plasmide pMRT1206 (9390 pb) résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII (743 pb) correspondant à eP35S (735 pb) aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1196.
Le plasmide pMRT1206 a été obtenu en suivant les méthodologies décrites en 8. 1.2., excepté que 2 pg du vecteur pMRT1196, qui constitue le vecteur de clonage, ont été digérés et traités. Il est représenté en figure 24 et sa séquence complète SEQ. ID24 est donnée dans le listage de séquences.
Le plasmide pMRT1206 a été introduit dans Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404 par transformation directe selon le procédé de Holsters et al. (1978).
9. 2. Obtention de pMRT1204
Le plasmide pMRT1204 (9390 pb) comporte la cassette d'expression du gène nptII sauvage et la cassette d'expression du gène uidA. Il résulte du clonage du promoteur eP35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1192. Le plasmide pMRT1192 (8654 pb), quant à lui, résulte du clonage du gène uidA dans pMRTl176.
Le plasmide pMRT1204 (9390 pb) comporte la cassette d'expression du gène nptII sauvage et la cassette d'expression du gène uidA. Il résulte du clonage du promoteur eP35S du virus de la mosaïque du chou-fleur dans pMRT1192. Le plasmide pMRT1192 (8654 pb), quant à lui, résulte du clonage du gène uidA dans pMRTl176.
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9. 2.1. Obtention de pMRT1192
Le plasmide pMRT1192 résulte du clonage des fragments d'ADN insert (SmaI - "SacI + T4 DNA polymérase") correspondant au gène uidA, au site "XbaI + Klenow" du vecteur pMRT1176.
Le plasmide pMRT1192 résulte du clonage des fragments d'ADN insert (SmaI - "SacI + T4 DNA polymérase") correspondant au gène uidA, au site "XbaI + Klenow" du vecteur pMRT1176.
Le plasmide pMRT1192 (8654 pb) a été obtenu en suivant les méthodologies décrites en 9. 1.2., excepté que le vecteur de clonage est pMRT1176. Il est représenté en figure 11 et sa séquence SEQ.IDll est donnée dans le listage de séquences.
9. 2.2. Obtention de pMRT1204
Le plasmide pMRT1204 (9390 pb) résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII (743 pb) correspondant à eP35S (735 pb) aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1192.
Le plasmide pMRT1204 (9390 pb) résulte du clonage des fragments ADN insert KpnI - HindIII (743 pb) correspondant à eP35S (735 pb) aux sites KpnI et HindIII du vecteur pMRT1192.
Le plasmide pMRT1204 a été obtenu en suivant les méthodologies décrites en 8. 1.2., excepté que 2 ug du vecteur pMRT1192, qui constitue le vecteur de clonage, ont été digérés et traités. Il est représenté en figure 18 et sa séquence complète SEQ. ID18 est donnée dans le listage de séquences.
Le plasmide pMRT1204 a été introduit dans Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404 par transformation directe selon le procédé de Holsters et al. (1978).
10. Obtention de plasmides binaires renfermant le gène bar
Les plasmides finaux ont été exploités en transformation du maïs et/ ou du tabac pour les évaluer.
Les plasmides finaux ont été exploités en transformation du maïs et/ ou du tabac pour les évaluer.
10. 1. Création de pMRT1210
Le plasmide pMRT1210 (10003 pb) comporte la cassette d'expression du gène bar et la cassette d'expression du gène uidA. Il résulte du clonage de la cassette d'expression du gène uidA dans pMRT1195. Le plasmide pMRT1195 (6865 pb), quant à lui, résulte du clonage de la séquence "promoteur suivi de l'intron 1 du gène actine de riz" (McElroy D et al., 1991), dans pMRT1191.
Le plasmide pMRT1210 (10003 pb) comporte la cassette d'expression du gène bar et la cassette d'expression du gène uidA. Il résulte du clonage de la cassette d'expression du gène uidA dans pMRT1195. Le plasmide pMRT1195 (6865 pb), quant à lui, résulte du clonage de la séquence "promoteur suivi de l'intron 1 du gène actine de riz" (McElroy D et al., 1991), dans pMRT1191.
Le plasmide pMRT1191(4805 pb) dérive de pMRT1119.
10. 1.1. Obtention de pMRT1191
Le plasmide pMRT1191 (4805 pb) diffère de pMRT1119 par la délétion des séquences : promoteur nos et gène nptII muté.
Le plasmide pMRT1191 (4805 pb) diffère de pMRT1119 par la délétion des séquences : promoteur nos et gène nptII muté.
Il a été obtenu par digestion par Bsp120I de 10 ug de
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pMRT1119, suivie d'une purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et d'une reprise dans 50 l de H20. Puis, pMRT1119 digéré et a été hydrolysé par KpnI, purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", repris dans 50 l de H20, soumis à l'action de 6 unités de T4 DNA polymérase (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel de 120 l en présence de 12 l de tampon T4 DNA polymérase x 10,4 l de dNTP 10 mM et 6 l de BSA à 1 mg/ml. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 30 min. Puis, le fragment vecteur a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %, purifié à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction" et repris dans 50 l de H2O.
Trente nanogrammes du plasmide ainsi traité ont été religaturés par ligation par réaction PCR (procédé décrit en 7).
Le plasmide résultant a été appelé pMRT1191. Il est représenté en figure 10 et sa séquence complète SEQ.ID10 est donnée dans le listage de séquences.
10. 1.2. Obtention de pMRT1201
Le plasmide pMRT1201 (7943 pb) diffère de pMRT1191 par l'insertion de la cassette d'expression du gène uidA isolée à partir du plasmide pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos qui comprend la cassette d'expression de uidA insérée aux sites EcoRI et HindIII de pUC19 (commercialisé par New England Biolabs). Ce plasmide résulte de clonages successifs. Le fragment correspondant à la séquence gène uidA - terminateur nos a été isolé par digestions successives par EcoRI suivi de l'action du fragment Klenow et Smal à partir de pBI221 A SacI (= pBI221 (Clontech) dont le site ScaI a été éliminé par digestion SacI suivie de l'action de la T4 DNA polymérase, puis ligation). Le fragment isolé et purifié a été inséré aux sites SmaI - [SphI + T4 DNA polymérase] de pUC19 (Clontech) pour obtenir le plasmide résultant pUC19-uidA-Tnos. Puis, le site EcoRI recréé du côté 3' de Tnos a été éliminé par remplacement du fragment BstBI-HindIII de pUC19-uida-Tnos par le fragment BstBI-HindIII obtenu par digestion du fragment amplifié par PCR (1054 pb) à partir de la matrice pUC19-uidA-Tnos à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides 5' AGGCATTGGTTTCGAAGCG 3' (SEQ. ID46) contenant le site BstBI et 5' TACGCCAAGCTTGGCAATTCC 3'(SEQ.ID47). Le plasmide résultant a été
Le plasmide pMRT1201 (7943 pb) diffère de pMRT1191 par l'insertion de la cassette d'expression du gène uidA isolée à partir du plasmide pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos qui comprend la cassette d'expression de uidA insérée aux sites EcoRI et HindIII de pUC19 (commercialisé par New England Biolabs). Ce plasmide résulte de clonages successifs. Le fragment correspondant à la séquence gène uidA - terminateur nos a été isolé par digestions successives par EcoRI suivi de l'action du fragment Klenow et Smal à partir de pBI221 A SacI (= pBI221 (Clontech) dont le site ScaI a été éliminé par digestion SacI suivie de l'action de la T4 DNA polymérase, puis ligation). Le fragment isolé et purifié a été inséré aux sites SmaI - [SphI + T4 DNA polymérase] de pUC19 (Clontech) pour obtenir le plasmide résultant pUC19-uidA-Tnos. Puis, le site EcoRI recréé du côté 3' de Tnos a été éliminé par remplacement du fragment BstBI-HindIII de pUC19-uida-Tnos par le fragment BstBI-HindIII obtenu par digestion du fragment amplifié par PCR (1054 pb) à partir de la matrice pUC19-uidA-Tnos à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides 5' AGGCATTGGTTTCGAAGCG 3' (SEQ. ID46) contenant le site BstBI et 5' TACGCCAAGCTTGGCAATTCC 3'(SEQ.ID47). Le plasmide résultant a été
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appelé pUC19-uidA-Tnos A EcoRI. Puis, pour introduire un site Ncol au niveau du codon initiateur du gène uidA, un fragment de 440 pb a été amplifié par PCR à partir de la matrice pUC19-uidA-TnosAEcoRI à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides 5' AATACCCGGGACCATGGTCCGTCCTGTAG 3' (SEQ. ID48) contenant les sites NcoI et SmaI et 5' ATAGTCTGCCAGTTCAGTTCGTTG 3' (SEQ.ID49) situé en aval de SnaBI. Le fragment PCR digéré par SmaI et SnaBI a ensuite été inséré dans pUC19-uidA-Tnos A EcoRI pour remplacer le fragment SmaI-SnaBI existant. Le plasmide résultant a été appelé pUC19-NcoI-uidA-Tnos. Puis, le promoteur Phmwg [High Molecular Weight Glutenin, Anderson et al. (1989)], porté par le fragment EcoRI - SmaI, a été introduit aux sites EcoRI et SmaI de pUC19-NcoI-uidA-Tnos pour résulter en plasmide pUC19-Phmwg-uidA-Tnos. Enfin, l'intron 1 du gène actine de riz (IA, fragment EcoRV - SmaI) provient du plasmide pActl-F6 (McElroy D et al., 1991) qui est modifié lui-même par l'apport de sites de restriction notamment de part et d'autre du fragment EcoRV-SmaI contenant IA. Le fragment SmaI-NcoI portant IA a été isolé à partir de pACtl-F6 modifié et inséré aux sites SmaI et Ncol de pUC19-Phmwg-uidA-Tnos pour résulter en plasmide pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos. Les techniques utilisées sont celles déjà décrites dans ce brevet.
Le fragment vecteur pMRT1191 a été obtenu par digestion de 2 pg de pMRT1191 par EcoRI, purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , suivi de l'action de 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 - MgCl; 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP à 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant 30 min., purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et reprise dans 50 l de H20. Puis, pMRT1191 digéré et traité a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, purifié à laide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et
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repris dans 50 l de H2O.
Les fragments ADN insert (2 pg) correspondant à la cassette d'expression du gène uidA (3 kpb), à savoir le gène uidA placé sous contrôle du promoteur "high molecular weight glutenin" de blé suivi de l'intron 1 du gène actine de riz et du terminateur nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens, ont été obtenus par digestion de pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos par ScaI (site présent dans pUC19), purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de H2O, digestion par HindIII, purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de HO, traitement par 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 MgCl; 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant 30 min., purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de H2O, digestion par EcoRI. Puis, les fragments d'ADN insert ont été isolés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %, purifiés à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction", soumis à l'action du fragment Klenow comme décrit ci-dessus, et repris dans 50 l de H2O.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 10 ng de plasmide pMRT1191 digéré déphosphorylé et 100 ng de fragments ADN insert digérés et traités. Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1201 (7943 pb). Il est représenté en figure 15 et sa séquence complète SEQ. ID15 est donnée dans le listage de séquences.
10. 1.3. Obtention de pMRTl210
Le plasmide pMRT1210 (10003 pb) diffère de pMRT1201 par l'insertion de la séquence "promoteur suivi de l'intron 1 du gène actine de riz - gène bar" (Pact-IA-bar) isolé à partir de
Le plasmide pMRT1210 (10003 pb) diffère de pMRT1201 par l'insertion de la séquence "promoteur suivi de l'intron 1 du gène actine de riz - gène bar" (Pact-IA-bar) isolé à partir de
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pSB12-Pact-IA-bar-Tnos qui dérive de pSB12 décrit par Komari et al. (1996). Le plasmide pSB12-Pact-IA-bar-Tnos résulte du clonage de la cassette d'expression Pact-IA-bar-Tnos (fragment BspDI - XhoI + Klenow ) isolé à partir de pDM302 aux sites SmaI et BspDI de pSB12 dont le site XhoI du côté LB a été délété. Le plasmide pDM302, construit au laboratoire de Wu R., comprend la cassette d'expression Pact-IA-bar-Tnos dans le plasmide pSP72 commercialisé par Promega.
Le fragment vecteur pMRT1201 a été obtenu par digestion de 2 pg de pMRT1201 par HpaI, purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et reprise dans 98 l de H20. Puis, pMRT1201 digéré a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, purifié à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et repris dans 50 l de H20.
Les fragments ADN insert (2 pg) correspondant à "Pact-IA-bar" (2,1 kpb) ont été obtenus par digestion par XbaI de pBIOS273, purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de H2O, traitement par 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 - MgCl: 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant 30 min. Puis, les fragments ADN insert ainsi traités ont été isolés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 %, et purifiés à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et reprise dans 50 l de H2O.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 60 ng de plasmide pMRT1201 digéré déphosphorylé et 100 ng de fragments ADN insert digérés et traités. Les bactéries, Escherichia coli DH5[alpha] rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé
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pMRT1210. Il est représenté en figure 21 et sa séquence complète SEQ.ID21 est donnée dans le listage de séquences.
Ce plasmide pMRT1210 a ensuite été introduit dans Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404 (pSBl) [Komari T et al., 1996] et souche LBA4404 par transformation directe selon le procédé de Holsters et al. (1978).
10. 1.4. Obtention de pMRT1193
Le plasmide binaire pMRT1193 a été obtenu par clonage aux sites EcoRI et [XhoI + action fragment klenow] de pMRT1119, du fragment EcoRI - [HindIII + action fragment Klenow] portant la séquence Phmwg-IA-uidA-Tnos isolé à partir de pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos décrit en 10.1.2.
Le plasmide binaire pMRT1193 a été obtenu par clonage aux sites EcoRI et [XhoI + action fragment klenow] de pMRT1119, du fragment EcoRI - [HindIII + action fragment Klenow] portant la séquence Phmwg-IA-uidA-Tnos isolé à partir de pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos décrit en 10.1.2.
Pour ce faire, le fragment vecteur pMRT1119 a été obtenu par digestion de 10 pg de pMRT1119 par XhoI, purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de H20, traitement par 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 - MgCl 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant 30 min.
Puis, purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et digestion par EcoRI. Le fragment vecteur traité a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 %, purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et repris dans 50 l de H2O.
Puis, pMRT1119 digéré a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, purifié à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification" et repris dans 50 l de H2O.
Les fragments ADN insert (2 pg) correspondant à la cassette d'expression du gène uidA (3 kpb), à savoir le gène uidA placé sous contrôle du promoteur "high molecular weight glutenin" de blé suivi de l'intron 1 du gène actine de riz et du terminateur nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens, ont été obtenus par digestion de pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos par ScaI (site présent dans pUC19), purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de H2O, digestion
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par HindIII, purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de HO, traitement par 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 MgCl2 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant 30 min., purification à l'aide du kit "QIAquick PCR Purification", reprise dans 50 l de H2O, digestion par EcoRI. Puis, les fragments d'ADN insert ont été isolés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %, purifiés à l'aide du kit "QIAquick Gel Extraction" et repris dans 50 l de H20.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 20 ng de plasmide pMRT1119 digéré déphosphorylé et 100 ng de fragments ADN insert digérés et traités. Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1193 (9143 pb). Il est représenté en figure 12 et sa séquence complète SEQ. ID12 est donnée dans le listage de séquences.
10. 2. Obtention de pMRT1195
Le plasmide pMRT1195 (6857 pb) diffère de pMRT1191 par l'insertion de la séquence "promoteur suivi de l'intron 1 du gène actine de riz - gène bar" (Pact-IA-bar). Le vecteur pMRT1191 a été digéré par Bsp120I et KpnI suivi de l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase et déphosphorylé mais non religaturé a été obtenu comme décrit en 10.1.1.
Le plasmide pMRT1195 (6857 pb) diffère de pMRT1191 par l'insertion de la séquence "promoteur suivi de l'intron 1 du gène actine de riz - gène bar" (Pact-IA-bar). Le vecteur pMRT1191 a été digéré par Bsp120I et KpnI suivi de l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase et déphosphorylé mais non religaturé a été obtenu comme décrit en 10.1.1.
Les fragments ADN insert correspondant à "Pact-IA-bar" (2,1 kpb), ont été obtenus comme décrit en 10.1.3.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 20 ng de plasmide pMRT1191 digéré déphosphorylé et 100 ng de fragments ADN insert digérés et traités. Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN
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plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1195. Il est représenté en figure 13 et sa séquence complète SEQ. ID13 est donnée dans le listage de séquences.
10. 3. Obtention de pMRT1202
Le plasmide pMRT1202 (5614 pb) diffère de pMRT1195 par le remplacement de la séquence "Pact-IA" par le promoteur nopaline synthase (Pnos) d'Agrobacterium tumefaciens isolé à partir de pMRT1121 produit dans la souche SCS110 d'Escherichia coli.
Le plasmide pMRT1202 (5614 pb) diffère de pMRT1195 par le remplacement de la séquence "Pact-IA" par le promoteur nopaline synthase (Pnos) d'Agrobacterium tumefaciens isolé à partir de pMRT1121 produit dans la souche SCS110 d'Escherichia coli.
Le fragment vecteur pMRT1195 (2 pg) a été digéré par PstI, purifié à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , repris dans 98 l de H2O, traité par l'action de 6 unités de T4 DNA polymérase (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel de 120 l en présence de 12 l de tampon T4 DNA polymérase x 10,4 l de dNTP 10 mM et 6 l de BSA à 1 mg/ml. La réaction a été effectuée à 37 C pendant 30 min. Puis, le fragment vecteur a été purifié à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , repris dans 50 l de H2O, digéré par HindIII, isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %, purifié à laide du kit Concert Rapid PCR Purification System , repris dans 98 l de H2O. Puis, pMRT1195 digéré et traité a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, purifié à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et repris dans 50 l de H2O.
Les fragments ADN insert correspondant à "Pnos", ont été obtenus par digestion par BspEI de pMRT1121, purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , reprise dans 98 l de H2O, traitement par 20 unités du fragment Klenow (New England Biolabs) en présence de 12 l de Tris-HCl 500 mM pH 7,5 - MgCl2 500 mM, 6 l de dithiothréitol 1M, 6 l de chacun des dNTP 10 mM dans un volume réactionnel de 120 l à 37 C pendant
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30 min., purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , reprise dans 50 l de H2O, digestion par HindIII. Puis, les fragments d'ADN insert (219 pb) portant Pnos (209 pb), ont été isolés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %, purifiés à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et repris dans 50 l de H2O.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 48 ng de plasmide pMRT1195 digéré déphosphorylé et 56 ng de fragments ADN insert digérés et traités. Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1202. Il est représenté en figure 16 et sa séquence complète SEQ.ID16 est donnée dans le listage de séquences.
10. 4. Obtention de pMRT1212
Le plasmide pMRT1212 (8987 pb) diffère de pMRT1206 par le remplacement du gène nptII par le gène bar.
Le plasmide pMRT1212 (8987 pb) diffère de pMRT1206 par le remplacement du gène nptII par le gène bar.
Pour ce faire, le fragment vecteur pMRT1206 a été obtenu par digestion par Bsu36I de 2 ug de pMRT1206, purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , reprise dans 50 l de H2O et digestion par AatII. La digestion par Bsu36I et AatII a permis de déléter le vecteur du fragment correspondant à partie Pnos nptII Tnos LB . Le fragment vecteur digéré a ensuite été soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose à 1%, purifié à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et repris dans 98 l de H2O. Puis, ce fragment vecteur digéré et traité a été déphosphorylé par 50 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) dans un milieu réactionnel final de 120 l en présence de 12 l de tampon 3 x 10 (New England Biolabs) à 37 C pendant 1 heure, purifié à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System , et repris dans 50 l de HO.
Les fragments ADN insert correspondant à partie Pnos bar Tnos LB (1,2 kpb), ont été obtenus par digestion par Bsu36I
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de 2 pg de pMRT1202, purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System, reprise dans 40 l de H2O, digestion par AatII, isolement par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %, purification à l'aide du kit Concert Rapid PCR Purification System, et reprise dans 50 l de H2O.
La ligation par réaction PCR a été réalisée comme décrite précédemment en 7, avec 100 ng de plasmide pMRT1206 digéré déphosphorylé et 50 ng de fragments ADN insert digérés.
Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en kanamycine (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques et séquençage. Le plasmide résultant a été appelé pMRT1212. Il est représenté en figure 22 et sa séquence complète SEQ. ID22 est donnée dans le listage de séquences.
11. Evaluation des vecteurs synthétiques produits dans les bactéries
Le rendement en quantité de plasmides obtenus à partir des bactéries Escherichia coli souche DH5a a été déterminé.
Le rendement en quantité de plasmides obtenus à partir des bactéries Escherichia coli souche DH5a a été déterminé.
I Plasmides synthétiques non binaires
Des précultures des bactéries recombinantes possédant les plasmides pMRT1105, pMRT1106 ou pMRT1105-ori ColEl ont été réalisées à partir de 500 ml de chacun des "glycérol-stock" respectifs dans 10 ml de milieu LB supplémenté en kanamycine à 50 mg/1, à 37 C pendant 16 heures. Puis, 500 ml de chacune des précultures ont été ensemencés dans 100 ml de LB supplémenté en kanamycine à 50 mg/1 à 37 C pendant 23 heures. Pour pMRT1106, deux cultures ont été effectuées, l'une sans ajout de chloramphénicol et l'autre avec ajout de chloramphénicol 40 mg/1 après 7 heures de culture. Les cultures ont ensuite été centrifugées à 5000 g pendant 10 min. Les ADN plasmidiques ont été extraits à l'aide de "QIAFilter Plasmid Midi kit" (QIAGEN) selon les recommandations du fabricant et dosés au spectrophotomètre. Les quantités de plasmides obtenus sont
Des précultures des bactéries recombinantes possédant les plasmides pMRT1105, pMRT1106 ou pMRT1105-ori ColEl ont été réalisées à partir de 500 ml de chacun des "glycérol-stock" respectifs dans 10 ml de milieu LB supplémenté en kanamycine à 50 mg/1, à 37 C pendant 16 heures. Puis, 500 ml de chacune des précultures ont été ensemencés dans 100 ml de LB supplémenté en kanamycine à 50 mg/1 à 37 C pendant 23 heures. Pour pMRT1106, deux cultures ont été effectuées, l'une sans ajout de chloramphénicol et l'autre avec ajout de chloramphénicol 40 mg/1 après 7 heures de culture. Les cultures ont ensuite été centrifugées à 5000 g pendant 10 min. Les ADN plasmidiques ont été extraits à l'aide de "QIAFilter Plasmid Midi kit" (QIAGEN) selon les recommandations du fabricant et dosés au spectrophotomètre. Les quantités de plasmides obtenus sont
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dosées à 10 mg, 50,6 mg, 86,2 mg et 9,8 mg respectivement pour pMRT1105, pMRT1106, pMRT1106 traité au chloramphénicol et pMRT1105 ori ColEl (plasmide pMRT1105 dans lequel ori ColEl a été insérée en orientation inverse de celle de pMRT1106). Ces résultats montrent que les plasmides synthétiques se répliquent dans Escherichia coli., la présence de l'origine de réplication "ori ColEl" dans la bonne orientation (site NdeI de "ori ColEl" proche de "ori RK2") permet d'augmenter le rendement d'un facteur 5 tandis qu'aucun effet n'est mis en évidence pour l'orientation inverse de "ori ColEl", le traitement au chloramphénicol apporte un facteur 1,6 supplémentaire.
11.2. Plasmides binaires synthétiques.
Les plasmides binaires synthétiques pMRT1118 et pMRT1119 sont évalués par rapport aux témoins pBinl9 et pBIOC4. Le plasmide pBIOC4 diffère de pGA492 (An,1986) par la délétion de la quasi-totalité de la séquence codante du gène cat de pGA492 et par la conversion du site HindIII en site EcoRI. Il a été obtenu par double digestion par SacI et ScaI suivi de l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase (New England Biolabs) et ligation du plasmide modifié (20 ng) dans un milieu réactionnel de 10 ul en présence de 1 l de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), 2,5 unités de T4 DNA ligase (Amersham) à 14 C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli souche DH5[alpha], rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus sélectionnés sur tétracycline à 12 mg/1, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestions enzymatiques.
Puis, le site HindIII de l'ADN plasmidique du clone retenu a été modifié en un site EcoRI à l'aide d'un adaptateur HindIII-EcoRI phosphorylé (Stratagene). Pour ce faire, 500 ng d'ADN plasmidique du clone retenu ont été digérés par HindIII, déphosphorylés par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant et coprécipités en présence de 1500 ng d'ADN adaptateur HindIII-EcoRI, 0,1 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à - 80 C pendant 30 min.
Après centrifugation à 12000 g pendant 30 min., l'ADN précipité
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a été lavé à l'éthanol 70 %, séché, repris dans 8 l de H2O, porté à 65 C pendant 10 min., puis ligaturé comme décrit précédemment. Après inactivation de la T4 DNA ligase à 65 C pendant 10 min., le mélange réactionnel de ligation a été digéré par EcoRI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %, électroélué, précipité à l'éthanol absolu, centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70 %, séché, puis, ligaturé et introduit dans Escherichia coli souche DH5a, et traité comme décrit précédemment.
Des précultures des bactéries recombinantes possédant les plasmides cités ci-dessus, ont été réalisées à partir de 500 ml de chacun des "glycérol-stock" respectifs dans 10 ml de milieu LB supplémenté en kanamycine à 50 mg/1 excepté pour pBIOC4 sélectionné sur tétracycline à 12 mg/1, à 37 C pendant 16 heures. Puis, 250 ml de chacune des précultures ont été ensemencés dans 100 ml de LB supplémenté en l'antibiotique adéquat à 37 C pendant 23 heures. Les cultures ont ensuite été centrifugées à 5000 g pendant 10 min. Les ADN plasmidiques ont été extraits à l'aide de "QIAFilter Plasmid Midi kit" (QIAGEN) selon les recommandations du fabricant et dosés au spectrophotomètre. Les quantités de plasmides obtenus sont dosés à 94,2 mg, 113 mg, 37,2 mg et 45,6 mg respectivement pour pMRT1118, pMRT1119, pBinl9 et pBIOC4.
Ces résultats montrent que les plasmides binaires synthétiques se répliquent dans Escherichia coli., et que le rendement de pMRT1119 est augmenté des facteurs 3 et 2,5 respectivement par rapport aux témoins pBinl9 et pBIOC4.
Par ailleurs, ces plasmides synthétiques se répliquent dans Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404.
12. Evaluation des plasmides synthétiques par transgénèse
12. 1. Transformation du tabac
12. 1.1. Transformation stable du tabac
La transformation du tabac (Nicotiana tabacum L. var.
12. 1. Transformation du tabac
12. 1.1. Transformation stable du tabac
La transformation du tabac (Nicotiana tabacum L. var.
PBD6) a été réalisée en infectant des disques foliaires isolés à partir de plantules de tabac in vitro âgées de 6 semaines par des agrobactéries recombinantes selon la méthode décrite par
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Horsch et al. (1985).
Toutes les cultures in vitro sont réalisées dans une enceinte climatisée dont l'intensité lumineuse est de 200 uE.m-2.s-l, la photopériode de 16 heures lumière/ 8 heures obscurité et, la température de 25 C.
Hormis pour l'étape initiale de coculture, les étapes de régénération, de développement et d'enracinement ont été réalisées sur divers milieux sélectifs supplémentés en bactériostatique, à savoir l'augmentin à 400 mg/1 et en agent sélectif, à savoir la kanamycine à 200 ou 100 mg/1.
Les différentes étapes et les milieux utilisés sont les suivants :
Après une préculture des agrobactéries dans 5 ml de milieu 2YT (bacto-tryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 5 g/1, pH 7,2) supplémenté en CaCl2 6 mM final et en antibiotiques adéquats à 28 C pendant 48 heures, une culture dans 10 ml de milieu 2YT supplémenté en CaCl2 et antibiotiques est réalisée à 28 C pendant une nuit. La culture est ensuite centrifugée à 3000 g pendant 10 min. et les bactéries sont resuspendues dans 10 ml de MS30 liquide (M0404 à 4,4 g/1 commercialisé par SIGMA supplémenté en saccharose 30 g/1, pH 5,7).
Après une préculture des agrobactéries dans 5 ml de milieu 2YT (bacto-tryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 5 g/1, pH 7,2) supplémenté en CaCl2 6 mM final et en antibiotiques adéquats à 28 C pendant 48 heures, une culture dans 10 ml de milieu 2YT supplémenté en CaCl2 et antibiotiques est réalisée à 28 C pendant une nuit. La culture est ensuite centrifugée à 3000 g pendant 10 min. et les bactéries sont resuspendues dans 10 ml de MS30 liquide (M0404 à 4,4 g/1 commercialisé par SIGMA supplémenté en saccharose 30 g/1, pH 5,7).
La coculture est réalisée en plaçant les explants foliaires découpés à partir des feuilles des plantules in vitro d'environ 1 cm2 au contact de la suspension d'agrobactéries diluée au 1/10 dans MS30 liquide pendant 20 min. Puis, les explants ainsi traités sont séchés rapidement sur papier filtre et placés sur un milieu de coculture (MC) solide (MS30, Benzyl Amino Purine (BAP) à 1 mg/1, Acide Indole-3 Acétique (ANA) à 0,1 mg/1, agar-agar à 8 g/1) pendant 48 heures dans l'enceinte climatisée.
Les explants traités sont ensuite placés sur un milieu de régénération solide (MC solide, augmentin à 400 mg/1, kanamycine à 200 mg/1). Un repiquage des explants sur le même milieu est effectué après 2 semaines.
Après 2 semaines, les bourgeons sont repiqués sur un milieu de développement solide (M0404 à 4,4 g/1 commercialisé
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par sigma supplémenté en saccharose 20 g/1, pH 5,7 (MS20 liquide), augmentin à 400 mg/1, kanamycine à 100 mg/1, agar-agar à 8 g/1).
Après 2 semaines, les plantules transformées sont repiquées sur milieu d'enracinement solide identique au milieu de développement. L'enracinement dure 2 à 3 semaines, au terme duquel les plantules sont sorties au phytotron en pots Giffy pendant 10 jours (photopériode 16 heures lumière/ 8 heures obscurité, 23 C et 70% d'hygrométrie), puis, passées en serre.
12. 1.2. Evaluation des plasmides synthétiques utilisés en transformation du tabac
Les agrobactéries recombinantes (Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404) renfermant le plasmide binaire synthétique pMRT1118 ou le plasmide binaire témoin pBinl9, ont été utilisées pour transformer le tabac Nicotiana tabacum L. var. PBD6.
Les agrobactéries recombinantes (Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404) renfermant le plasmide binaire synthétique pMRT1118 ou le plasmide binaire témoin pBinl9, ont été utilisées pour transformer le tabac Nicotiana tabacum L. var. PBD6.
Les résultats ont montré que le nombre et la croissance des plantules, qui se développent en présence de l'agent sélectif (kanamycine), sont similaires pour les deux plasmides binaires testés. Ces observations indiquent que le plasmide binaire synthétique est parfaitement fonctionnel en transgénèse du tabac.
12. 2. Transformation du maïs
12. 2.1. Transformation génétique de cals de maïs
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation, Agrobacterium, microfibres, canon à particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs.
12. 2.1. Transformation génétique de cals de maïs
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation, Agrobacterium, microfibres, canon à particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs.
Ces cals ont été obtenus à partir d'embryons immatures de génotype HI, II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (Maize handbook, 1994, Freeling M and Walbot V (eds), pp 665-671). Les cals ainsi obtenus ont été multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les 15 jours sur le milieu d'initiation.
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Des plantules ont été régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes ont ensuite été acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
12. 2.2. Transformation génétique du maïs par le canon à particules
L'obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation sont décrites en 12.2.1.
L'obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation sont décrites en 12.2.1.
* Le procédé, qui met en jeu le canon à particules pour la transformation génétique, est décrit par Finer et al. (1992).
Les cellules cibles sont des fragments de cals d'une surface de 10 à 20 mm2. Ces fragments ont été déposés sur milieu d'initiation supplémenté en mannitol 0,2 M et sorbitol 0,2 M pendant 4 heures avant bombardement.
Les particules de tungstène (M10) et les plasmides de transformation ont été co-précipités en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées ont été projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon à particule selon le protocole de Finer et al. (1992).
Les cals bombardés ont été placés à l'obscurité à 27 C.
Après 24 heures, le premier repiquage a lieu suivi de repiquages tous les 15 jours pendant 3 mois sur milieu d'initiation additionné de l'agent sélectif adéquat pour ne retenir que les cals transformés. Puis, ces cals ont été cultivés en présence de l'agent sélectif pour régénérer des plantules transformées comme décrit en 12. 2.1. Les plantules obtenues ont été acclimatées et transférées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
12. 2.3. Transformation génétique du maïs par Agrobacterium tumefaciens
La technique utilisée est décrite par Ishida et al.
La technique utilisée est décrite par Ishida et al.
(1996). Des embryons immatures de 1,0 à 1,2 mm de long (9 à 14 jours après pollinisation) ont été lavés dans le milieu LS-inf, puis immergés dans la suspension d'agrobactéries, préparée comme décrit par Ishida et al. (1996), soumis au vortex pendant 30 sec., et incubés à température ambiante pendant 5 min. Les
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embryons immatures ainsi traités ont été cultivés sur milieu LS-AS à l'obscurité à 25 C pendant 3 jours, puis transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 2 semaines et enfin, placés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 3 semaines. Les cals de type I ainsi générés ont été isolés , fragmentés et transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 3 semaines. Puis, les cals de type I, qui ont proliféré, ont été isolés et placés sur milieu LSZ supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, sous photopériode 16 heures lumière/ 8 heures obscurité à 25 C pendant 2 à 3 semaines. Les plantules régénérées ont ensuite été transférées sur milieu LSF sous photopériode 16 heures lumière/ 8 heures obscurité à 25 C pendant 1 à 2 semaines, puis, en phytotron et en serre.
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Claims (34)
1) Vecteur synthétique propre ne renfermant que les éléments indispensables à sa fonctionnalité et à la transgénèse d'une cellule, et notamment d'une cellule végétale, comprenant, comme éléments indispensables à sa fonctionnalité et à la transgénèse d'une cellule, et liés de manière opérationnelle : - au moins une séquence d'acide nucléique codant pour au moins une première origine de réplication, de préférence un ori RK2, et plus préférentiellement au moins un ori V de pRK2 de Escherichia coli à large spectre d'hôtes ; - au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un agent de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, plus préférentiellement le gène npt III conférant la résistance à la kanamycine dans les bactéries ; - un locus trfA codant pour au moins une protéine permettant d'augmenter le taux de réplication du plasmide, de préférence issu de pRK2, et plus préférentiellement codant pour les protéines P285 et P382.
2) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acide nucléique identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
3) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en qu'il consiste en un plasmide simple pMRT1105 dont la séquence d'acide nucléique est identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
4) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 précédentes caractérisé en ce qu'il comporte au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une deuxième origine de réplication, de préférence un ori d'Escherichia coli, et plus préférentiellement un ori ColEI.
5) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 précédentes caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acide nucléique identifiée sous le numéro SEQ. ID02.
6) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des
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revendications précédentes caractérisé en qu'il consiste en un plasmide simple pMRT1106 dont la séquence d'acide nucléique est identifiée sous le numéro SEQ.ID02.
7) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend une région constituée par au moins une séquence d'acide nucléique contenant plusieurs sites de restriction enzymatique uniques appelés collectivement site de clonage multiple (MCS).
8) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte en outre une séquence d'acide nucléique codant pour un ADN-T comportant une bordure droite RB et une bordure gauche LB, permettant au vecteur de fonctionner comme un plasmide binaire.
9) Vecteur synthétique propre selon la revendication 7 ou la revendication 8 caractérisé en ce que le MCS se situe près de la bordure droite RB de l'ADN-T.
10) Vecteur synthétique propre selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence d'acide nucléique codant pour au moins un promoteur d'expression et au moins un terminateur de transcription situé entre la bordure gauche LB et la bordure droite RB de l'ADN-T.
11) Vecteur synthétique propre selon la revendication 10, caractérisé en ce que le promoteur d'expression est choisi dans le groupe consistant en les promoteurs constitutifs, les promoteurs inductibles, les promoteurs spécifiques, et de préférence choisi parmi les promoteurs d'expression végétale.
12) Vecteur synthétique propre selon la revendication 11, caractérisé en ce que le promoteur d'expression est choisi dans le groupe consistant en le promoteur 35S du CaMV, l'ep35S du CaMV, le promoteur du gène de la plastocyanine du pois, ses zones "enhancers" et dérivés, le promoteur "gluténine à haut poids moléculaire" (HMWG) de blé, le promoteur CsVMV du "virus de la mosaïque de Cassava", le promoteur CoYMV du "virus de la mosaïque jaune de Commelina", les promoteurs chimériques des promoteurs CsVMV et CoYMV, ainsi que leurs dérivés.
13) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que le terminateur
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d'expression est choisi parmi les terminateurs fonctionnels dans une cellule végétale, et de préférence est un terminateur 35S ou nos.
14) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications 8 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un agent de sélection, fonctionnel dans une cellule végétale, de préférence au moins une séquence d'acide codant pour un gène de résistance aux antibiotiques, et/ou un gène de résistance aux herbicides.
15) Vecteur synthétique propre selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour le gène de résistance bar ( bialaphos résistance ) ou pat ( phosphinothricine acétyltransferase ).
16) Vecteur synthétique propre selon la revendication 14 caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour l'agent de sélection fonctionnel dans une cellule végétale est une séquence codant pour le gène de résistance nptII, muté ou sauvage.
17) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendication 14,15 ou 16, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour l'agent de sélection se situe près de la bordure gauche de l'ADN-T.
18) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique promotrice d'expression liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptide à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription.
19) Vecteur synthétique propre selon la revendication 18, caractérisé en ce que le polypeptide à produire est une enzyme ou protéine ou dérivé de ces dernières possédant une activité in vitro et/ou chez l'homme et/ou chez l'animal, ladite activité comprenant une activité digestive, pancréatique, biliaire, antivirale, anti-inflammatoire, pulmonaire, anti-microbienne, nutritive, cosmétique, structurelle, sanguine, cardio-vasculaire, ophtalmique, antigénique, irnmunostimulante,
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et cérébrale.
20) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 19 précédentes caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'un plasmide binaire, linéaire ou circulaire, choisi dans le groupe consistant en les séquences d'acide nucléique identifiées sous les numéros SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ. ID13, SEQ. ID14, SEQ. ID15, SEQ. ID16, SEQ.ID17, SEQ. ID18, SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ.ID21, et SEQ.ID22.
21) Vecteur synthétique propre selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que chaque composant fonctionnel peut être clivé indépendamment des autres composants.
22) Vecteur synthétique propre selon la revendication 21 caractérisé en ce que chaque composant fonctionnel peut être clivé indépendamment des autre composants par digestion enzymatique au niveau d'un premier site de restriction unique et un deuxième site de restriction unique présents dans 1 vecteur.
23) Séquence d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe consistant en les séquences d'acide nucléique identifiées sous les numéros SEQ.ID01, SEQ.ID02, SEQ. ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ. ID12, SEQ. ID13, SEQ. ID14, SEQ. ID15, SEQ. ID16, SEQ. ID17, SEQ. ID18, SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ.ID21, et SEQ. ID22.
24) Plante transgénique ayant intégré de manière stable dans son génome un vecteur ou une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes.
25) Plante transgénique selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les espèces dicotylédones, telles que la pomme de terre, le tabac, le coton, la laitue, la tomate, le melon, le concombre, le pois, le colza, la betterave, ou le tournesol, ou les espèces monocotylédones, telles que le blé, l'orge, l'avoine, le riz, ou le maïs.
26) Propagule d'une plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 24 ou 25.
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27) Propagule d'une plante transgénique selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle est une semence.
28) Cellule contenant un vecteur ou une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 23.
29) Cellule selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle est une cellule végétale.
30) Méthode d'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer la cellule avec un vecteur ou une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 ; - faire une culture de la cellule dans des conditions permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour le polypeptide à produire.
31) Méthode selon la revendication 30, caractérisée en ce que la cellule est une cellule procaryote ou eucaryote.
32) Méthode selon l'une quelconque des revendications 30 ou 31, caractérisée en ce que la cellule est une cellule choisie dans le groupe consistant en les cellules microbiennes, les cellules fongiques, les cellules d'insectes, les cellules animales, et les cellules végétales.
33) Méthode selon l'une quelconque des revendications 30 à 32, caractérisée en ce que la cellule est une cellule végétale.
34) Méthode d'obtention d'une plante transgénique selon l'une quelconque des revendications 24 ou 25, ou d'une propagule selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant ou une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le vecteur ou la séquence d'acide nucléique ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes
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entières chimériques ou transgéniques.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20090529 |