FR2794649A1

FR2794649A1 - Biomateriau a base d'un derive de dextrane insolubilise et d'un facteur de croissance, son procede de preparation et ses applications

Info

Publication number: FR2794649A1
Application number: FR9907401A
Authority: FR
Inventors: Cinderella Blanchat; Avramoglou Delphine Logeart; Herve Petite; Alain Meunier; Frederic Chaubet; Jacqueline Jozefonvicz; Marcel Jozefowicz; Laurent Sedel; Jose Correia
Original assignee: Solutions
Current assignee: Solutions
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2000-12-15
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: US6946443B2; FR2794649B1; WO2000076562A1; JP2003501217A; CA2376898A1; WO2000076562A9; US20020169120A1; EP1189644A1

Abstract

L'invention est relative à un biomatériau comprenant essentiellement au moins un dérivé de dextrane insolubilisé de formule générale DMCa Bb Suc Sd et au moins un facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéo-articulaires, dentaires et/ ou maxillo-faciaux, et à son procédé de préparation.L'invention est également relative aux utilisations dudit biomatériau pour la préparation d'un matériau de réparation ou de comblement, tel qu'un implant, pour applications ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciales et pour la préparation d'un revêtement de prothèse orthopédique, dentaire ou maxillo-faciale, ainsi qu'à la prothèse revêtue dudit biomatériau.

Description

BIOMATERIAU A BASE D'UN DERIVE DE DEXTRANE INSOLUBILISE ET D'UN FACTEUR DE CROISSANCE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES APPLICATIONS.

La présente invention est relative à un bio- matériau, à son procédé de préparation et à ses applica- tions, notamment comme matériau de réparation ou de comblement dans le domaine ostéo-articulaire, dentaire ou maxillo-facial.

Pour consolider des défauts osseux, des métho- des couramment employées sont l'autogreffe ou l'allogreffe. L'autogreffe cortico-spongieuse est la méthode la plus ancienne : elle permet d'obtenir une consolidation osseuse de bonne qualité, de parfaite tolé- @ rance immunitaire et sans risque de transmission d'agents pathogènes. Toutefois, le stock osseux est limité chez un individu surtout chez l'enfant, et le geste chirurgical supplémentaire qui en découle entraîne des risques de complications. Quant à l'allogreffe, prélevée sur des sujets en état de mort cérébrale, elle ne présente que des propriétés ostéoconductrices et non ostéoinductrices, puisque l'os prélevé est congelé de manière à détruire tous les éléments qui pourraient déclencher une réaction immunitaire de rejet de la greffe par l'organisme receveur ou être vecteur d'infections. Ce traitement diminue en outre les propriétés mécaniques de l'os.

De par les insuffisances des greffes osseuses, les matériaux substitutifs de l'os sont à l'heure actuelle la voie essentielle de recherche pour favoriser la conso- lidation osseuse.

Ces matériaux ont une importance considérable en santé publique. En effet, de nombreux matériaux synthé- tiques ou métalliques sont utilisés en tant que matériaux de remplacement de l'os dans des indications aussi diver- ses que la greffe osseuse ou la prothèse totale de hanche.

Ce sont actuellement 60 000 prothèses totales de hanche qui sont implantées chaque année en France. En 1988, une

étude épidémiologique a montré que la moitié des implants posés chez 16 millions de patients américains était des implants orthopédiques. Ces statistiques peuvent être extrapolées à la situation française.

La consolidation osseuse fait intervenir différents types de cellules issues soit de la lignée mésenchymateuse (préostéoblastes, ostéoblastes et ostéocytes), soit de la lignée hématopoïétique (ostéoclastes). Les ostéoblastes, localisés à la surface osseuse, interviennent dans la synthèse d'une nouvelle matrice osseuse. Les ostéocytes sont inclus dans la matrice osseuse ; reliés entre eux, ils forment un véritable réseau intercellulaire.Les ostéoclastes, qui permettent de résorber l'os, sont sous la dépendance de facteurs de croissance.

L'activité ostéoclastique est essentielle à la reconstruction, car elle est elle-même capable d'amplifier les activités de synthèse des ostéoblastes par l'intermédiaire, entre autres, de facteurs de croissance. Les plaquettes ont également un rôle important : elles libèrent de grandes quantités de facteurs de croissance, au stade initial de la réparation osseuse.

Les facteurs de croissance sont une catégorie de polypeptides ayant des propriétés régulatrices de nombreux paramètres de la vie cellulaire (tels que la prolifération, la différenciation, la survie). Ces facteurs sont sécrétés par de multiples types de cellules.

Les effets d'un même facteur sont déterminés par la nature de la cellule cible, la concentration du facteur, la présence simultanée éventuelle d'autres facteurs. Les cellules cibles possèdent des récepteurs membranaires à ces facteurs, le plus souvent des tyrosines kinases. Leur stimulation régule la synthèse ou l'activité de protéines régulatrices. La dénomination des facteurs de croissance est le plus souvent tirée du matériel où ils ont été mis en évidence pour la première fois et n'est pas toujours représentative de leur fonction.

Le tissu osseux contient une variété de facteurs de croissance et de différenciation qui contrôlent la formation et la résorption osseuse et qui jouent également un rôle important dans le développement, la croissance et la réparation du cartilage et de l'os. Ces principaux facteurs sont les EGFs ( Epidermic Growth Factor ) , les IGFs ( Insulin-like Growth Factor ) , les FGFs ( Fibroblast Growth Factor ), les TGF-P ( Transforming Growth Factor ), les PDGFs ( PlateletDerived Growth Factor ) et les BMPs ( Bone Morphogenetic Proteins ).

Les BMPs font partie de la superfamille des TGF-ss. Leur activité ostéoinductrice a été démontrée par M. R. Urist en 1965 (Science, 1965, 150, 893-899) : de l'os déminéralisé a été implanté en site ectopique, à savoir intramusculaire, chez le rat et a donné lieu à la formation de cartilage, puis d'os. Les protéines extraites de l'os déminéralisé et responsables de cette induction osseuse ont été purifiées et appelées les Bone Morphogenetic Proteins (BMP). Sept protéines (BMP-1 à 7) ont été initialement clonées grâce à des techniques de biologie moléculaire (Wozney, J. M. et al., Science, 1988,242, 1528-1534). Il a depuis été montré que la BMP-1 n'a pas de propriétés ostéoconductrices. A ce jour, de nombreuses autres BMPs ont été clonées.

L'utilisation de BMPs seules dans la réparation osseuse implique l'injection de grandes quantités, bien supérieures à celles efficaces dans les études in vitro ou détectées dans les tissus normaux.

Par ailleurs, l'effet systémique de ces produits présente des risques de diffusion de BMP dans la masse musculaire environnante et de calcification locale en site non-osseux. En outre, les BMP ont des durées de vie très courtes, de l'ordre de quelques minutes sous forme libre.

Il serait donc souhaitable de développer un vecteur des BMPs ainsi que des autres facteurs de croissance impliqués dans la réparation osseuse.

T.R. Gerhart et al. (Clinical orthopaedics and related research, 1993, 293, 317-326 et 1995, 318, 222- 230) ont proposé de mélanger la BMP-2 recombinante humaine à de la matrice osseuse inactive (1,5mg de BMP pour 3 g de matrice osseuse) afin de réaliser des implants osseux. Ces implants permettent d'induire une réossification de défauts d'une longueur de 2,5 cm artificiellement créés au niveau des fémurs de moutons. Toutefois, la quantité de BMP apportée par l'implant (1,5 mg) est 25 000 fois supérieure à la quantité de BMP présente de façon endogène dans les tissus osseux natifs (- 0,06 ug).

D'autres types de supports ont également été proposés : collagène, hydroxyapatite, gélatine, phosphate de calcium tricalcique, sulfate de calcium, carbonate de calcium, corail, polymères d'acides polylactique et polyglycolique, etc.

Tous ces composés naturels ou synthétiques, organiques ou minéraux, ne sont pas réellement des vecteurs de la BMP. Ils présentent en effet une affinité plus ou moins bonne avec le facteur de croissance.

Parallèlement à ces travaux, il a été montré que, de façon similaire à l'héparine et aux héparanes sulfates, les dextranes (D) substitués par des groupes carboxyméthyles (CM), benzylamides (B) et sulfonates (S) (composés dénommés CMDBS) interagissent avec certains facteurs de croissance, les HBGFs (Heparin Binding Growth Factors) , en particulier avec les FGFs et les TGF-p. Ils potentialisent les effets biologiques de ces facteurs endogènes, libérés au niveau du site lésé, en les protégeant contre les dégradations d'origine thermique, acide ou protéolytique (F. Blanquaert et al., Bone, 1995, 17, 6,499-506 ; A. Meddahi et al., Journal of Biomédical Materials Research, 1996, 31, 293-297 ; J. Lafont et; al.,

Growth factors, 1998, 16, 23-38 ; F. Blanquaert et al., Journal of Biomédical Materials Research, 1999, 44, 63-72).

Dans le domaine de la réparation osseuse, des CMDBS particuliers, le RGTA9 et le RGTA11 (composés comprenant respectivement 83 % ou 110 % d'unités CM, 23 % ou 2,6 % d'unités B et 13 % ou 36,5 % d'unités S), immobilisés dans un support de collagène, ont permis d'induire une régénération osseuse (articles précités de F. Blanquaert et al., 1995 et J. Lafont et al., 1996). Il a ainsi été montré que le RGTA9 et le RGTA11 eux-mêmes, sans ajout de facteurs de croissance exogènes, permettent de stimuler la reconstruction osseuse. F. Blanquaert et al., 1995, expliquent cette propriété par le fait que le RGTA9, vectorisé dans le collagène et complexé aux facteurs de croissance présents de façon endogène, pourrait constituer un réservoir desdits facteurs de croissance en vue de leur libération ultérieure. J. Lafont et al. proposent d'utiliser le RGTAll en tant que tel, véhiculé dans un support de collagène, au lieu d'administrer des facteurs de croissance.

En résumé, F. Blanquaert et al. et J. Lafont et al. proposent donc de vectoriser le RGTA9 ou la RGTA11 dans un support de collagène, dont on sait qu'il induit une cinétique de libération rapide et non contrôlée.

D'autre part, l'article précité de F. Blanquaert et al. (1999) décrit la stimulation de l'expression du phénotype ostéoblastique par le RGTA9 et le RGTAll mis en présence, in vitro et sous forme soluble, de facteurs de croissance (BMP-2, TGF-1, FGF-2). Il est indiqué que cet effet provient d'une capacité des RGTA à interagir avec ces facteurs de croissance, permettant ainsi de favoriser le processus cicatriciel. Il est également indiqué que le RGTA9 est moins efficace que le RGTAll, les deux composés différant essentiellement au niveau de leurs degrés de substitution respectifs en

groupes sulfonates (S), à savoir 0,13 pour le RGTA9 et 0,365 pour le RGTA11. Il ressort de ces résultats qu'un pourcentage élevé en unités S joue un rôle important dans les propriétés du dérivé de dextrane sur la réparation osseuse.

Ainsi, les différents articles précités (F. Blanquaert et al., 1995 et 1999 ; Meddahi et al., 1996 ; J. Lafont et al., 1998) montrent que les CMDBS sont capables de pièger ces facteurs de croissance libérés de façon endogène ; ils jouent le rôle d'un réservoir temporaire pour les facteurs de croissance qui sont naturellement sécrétés au niveau du site lésé.

De telles combinaisons entre les CMDBS et les facteurs de croissance, qui se forment in vivo, ne constituent pas un vecteur efficace desdits facteurs de croissance dans une utilisation en chirurgie, notamment en chirurgie rachidienne, maxillo-faciale, dentaire ou toute chirurgie reconstructive. En effet, leur forme soluble ne permet pas de maîtriser la diffusion des facteurs de croissance au niveau d'un site précis. En outre, ces combinaisons ne permettent pas de restituer la géométrie de pièces osseuses détruites, notamment de grands défauts osseux, au niveau desquels les facteurs de croissance endogènes ne sont pas présents en quantité suffisante pour pouvoir initier une consolidation spontanée. Il est alors nécessaire d'ajouter des facteurs de croissance exogènes, qui doivent être utilisés in vivo en combinaison avec un système de libération adapté.

Les Inventeurs se sont donc donné pour but de pourvoir à un matériau support de facteurs de croissance, notamment de BMPs, répondant aux impératifs suivants : - il se présente sous forme solide, - il est adapté à la reconstruction de grandes pertes de substance ostéoarticulaire, notamment à la reconstruction de défauts osseux,

- il présente une réelle affinité pour le facteur de croissance, - il permet de contrôler la cinétique de libération du facteur de croissance, - il permet de contrôler la localisation de la libération du facteur de croissance, en évitant sa diffusion en site extra-osseux, - il permet de contrôler la concentration locale de facteur de croissance libéré, - il ne présente pas d'activité mutagène, il est biocompatible, non-immunogénique, non toxique, biodégradable, @ - il protège la molécule bioactive, sans la dénaturer, il permet en outre de diminuer la quantité de BMP utilisée.

La présente invention a pour objet un biomatériau, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : (1) au moins un dérivé de dextrane insolubilisé, de formule générale DMCaBbSucSd, dans laquelle :
D représente une chaîne polysaccharidique, de préférence constituée par des enchaînements d'unités glucosidiques,
MC représente des groupes méthylcarboxylates,
B représente des groupes carboxyméthyl-benzylamides,
Su représente des groupes sulfates (sulfatation des fonctions hydroxyles libres portées par les unités glucosidiques),
S représente des groupes sulfonates (sulfonatation des noyaux aromatiques des groupes B), a, b, c et d représentent le degré de substitution (ds), exprimé par rapport au nombre de fonctions hydroxyles libres dans une unité glucosidique du dextrane, respectivement en groupements MC, B, Su et S ;

a # à 0,3, b étant à 0,2, c étant égal à 0 ou # à 0,1et d étant égal à 0 ou # 0,15, lequel produit présente une homogénéité de la distribution des tailles de chaînes, illustrée par un profil d'élution de type gaussien symétrique en chromatographie d'exclusion stérique haute performance, et une homogénéité de la distribution des groupements chimiques chargés, illustrée par un profil d'élution à un seul pic symétrique en chromatographie d'échange d'ions basse pression, et (2) au moins un facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéoarticulaires, dentaires et/ou maxillo-faciaux.

On entend par facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéoarticulaires, dentaires et/ou maxillo-faciaux un facteur de croissance intervenant dans les processus de cicatrisation et de reconstruction des os, mais aussi des tendons, des ligaments, etc.

Les dérivés de dextrane décrits ci-dessus sont considérés comme étant des copolymères constitués de sous-unités fictives R-OH et R-OX, X pouvant être un groupement méthylcarboxylate, benzylamide, sulfate ou sulfonate, la chaîne polysaccharidique du dextrane non substitué étant considérée comme étant constituée de 300 sous-unités fictives R-OH, au lieu de 100 unités glucosidiques, eu égard au fait qu'une unité glucosidique non substituée comporte trois groupes hydroxyles libres.

Ainsi, un dextrane méthylcarboxylate (DMC) avec un degré de substitution (ds) de 1,2 en groupements méthylcarboxylates contient 1,20 groupement substitué (R-C) et 1,80 groupement hydroxyle libre (R-OH) par unité glucosidique.

Les dérivés du dextrane décrits ci-dessus peuvent être préparés par un procédé qui comprend les étapes suivantes :

a) carboxyméthylation comprenant (i) l'activation d'un dextrane non substitué, par mise en contact dudit dextrane avec un milieu hydro-alcoolique liquide biphasique basique pendant au moins 1 h sous agitation, (ii) addition de l'acide monochloroacétique au produit activé obtenu, à une température comprise entre 40 et 90 C, de préférence à 60 C, le rapport RMC, égal au nombre de moles d'acide monochloracétique/nombre de moles d'OH étant compris entre 0,3 et 2, (iii) isolement et éventuellement purification du dextrane méthylcarboxylate (DMC) obtenu, b) couplage de la benzylamine sur les groupes méthylcarboxylates comprenant (i) la mise en contact, pendant au moins 2 h et en milieu aqueux acide, du DMC obtenu en a) avec de la benzylamine, en présence d'une carbodiimide hydrosoluble comme agent de couplage, à une température comprise entre 0 C et 30 C, le rapport molaire carbodiimide hydrosoluble/MC étant compris entre 0,25 et 2 et le rapport molaire benzylamine/MC étant compris entre 0,25 et 2, (ii) l'isolement du dextrane méthylcarboxyle benzylamide (DMCB) obtenu et éventuellement sa purification, c) éventuellement, sulfatation comprenant (i) la formation d'un sel de trialkylammonium du DMCB obtenu en b), (ii) la solubilisation du sel obtenu dans un solvant polaire anhydre, généralement une base de Lewis, telle que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou la diméthylformamide (DMF) et (iii) l'ajout audit sel en solution, d'un complexe à base de trioxyde de soufre tel que S03pyridine, S03-triéthylamine ou S03-DMF en solution dans le même solvant, à une température inférieure à 70 C, le rapport molaire complexe à base de trioxyde de soufre/OH libres étant compris entre 0,25 et 12, et éventuellement d) éventuellement, sulfonatation des groupes B par mélange sous agitation d'un dérivé DMCB obtenu en b) ou DMCBSu obtenu en c) en suspension dans un solvant

anhydre avec de l'acide chlorosulfonique en solution dans le même solvant, à une température comprise entre la température ambiante et la température d'ébullition du solvant utilisé.

A l'étape a), le rapport eau :alcool milieu hydro-alcoolique liquide biphasique est par exemple compris entre 10 :90 et 25:75 (v/v), et est de préférence de 15 :85 La carbodiimide hydrosoluble de l'étape b) est par exemple sélectionnée dans le groupe constitué par le 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide méta-p- toluène sulfonate (CMC) et le chlorhydrate de 1-éthyl-3- (3-diéthylamino-propyl)-carbodiimide (EDC).

De façon préférée, ledit dérivé de dextrane insolubilisé décrit ci-dessus est tel que d est égal à 0.

De façon particulièrement avantageuse, le biomatériau selon la présente invention, qui se présente sous forme solide, permet non seulement de servir de vecteur audit facteur de croissance, mais également de contrôler la localisation et la cinétique de sa libération ; il constitue ainsi un matériau support de facteurs de croissance à libération contrôlée.

De préférence, ledit facteur de croissance est sélectionné dans le groupe constitué par les EGF, les IGFs, les FGFs, les TGF-0, les PDGFs et les BMPs.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit facteur de croissance présente une activité ostéoinductrice. Il s'agit de préférence d'une BMP, cette dernière pouvant être une BMP recombinante ou être obtenue par un procédé d'extraction. Une BMP recombinante peut être produite, par exemple, par génie génétique en faisant appel à des techniques de biologie moléculaire connues en elles-mêmes, alors qu'une BMP extraite peut être issue de tissus humains ou animaux, auquel cas on obtient un mélange de protéines, qui

comprend notamment un mélange de protéines ostéoinductrices.

De manière inattendue, un tel biomatériau est un vecteur particulièrement efficace pour une libération contrôlée in situ dudit facteur de croissance.

En effet, le biomatériau selon l'invention est dégradé, in vivo, par les cellules de l'organisme, notamment les macrophages, ce qui permet la libération du facteur de croissance vectorisé par le dérivé de dextrane insolubilisé.

Le biomatériau selon l'invention protège et potentialise les effets du facteur de croissance qui lui est associé (facteur de croissance exogène) ; il agit comme un réservoir pour ledit facteur de croissance et il contribue à sa libération contrôlée, sous forme biodisponible, au niveau des sites lésés, stimulant ainsi la cicatrisation et la régénération tissulaire. Le biomatériau selon l'invention protège et potentialise également les facteurs de croissance endogènes, libérés naturellement au niveau du site lésé.

Dans le domaine orthopédique, où le comblement de défauts osseux d'origine traumatique ou tumorale et le descellement de prothèses implantées posent des problèmes difficiles de reconstruction, un tel biomatériau permet, de manière surprenante, de potentialiser la régénération osseuse de façon contrôlée. Un tel matériau est également particulièrement bien adapté à la chirurgie rachidienne (par exemple pour réaliser des arthrodèses du rachis, c'est-à-dire faire fusionner plusieurs vertèbres entre elles), à la chirurgie maxillo-faciale, à la chirurgie dentaire et à la chirurgie reconstructive.

De façon particulièrement avantageuse, le biomatériau selon l'invention, à base d'au moins un dérivé du dextrane, est biocompatible et n'entraîne pas de risque de contamination par des agents pathogènes d'origine animale.

Le biomatériau selon l'invention peut avantageusement être associé à plusieurs facteurs de croissance impliqués dans le processus de reconstruction osseuse. Il peut également avantageusement comprendre plusieurs dérivés de dextrane insolubilisés répondant à la formule générale DMCaBbSucSd telle que définie ci-dessus.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il est insolubilisé par réticulation à l'aide d'un agent réticulant.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent réticulant est sélectionné dans le groupe constitué par le trimétaphosphate de sodium, l'épichlorhydrine, la divinylsulfone, le glutaraldéhyde et les bisépoxyranes. A titre d'exemple de bisépoxyranes utilisables, on peut citer l'éther de 1,4butanediol-bis(époxypropyle) et l'éther de 1,4-butanedioldiglycidyle.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il se présente sous la forme d'un hydrogel, ou sous la forme d'une poudre lyophilisée, ladite poudre lyophilisée étant avantageusement obtenue à partir de l'hydrogel sus-mentionné.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il comprend en outre un matériau de comblement tissulaire.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il enrobe des particules d'un support insoluble minéral ou polymérique, lesdites particules ayant un diamètre supérieur à 100 m. Selon cet aspect de l'invention, le biomatériau est insolubilisé sur lesdites particules et se présente sous une forme particulaire.

Selon une disposition avantageuse de ces modes de réalisation, ledit matériau de comblement tissulaire est sélectionné dans le groupe constitué par le collagène, la gélatine, la colle biologique, les polymères d'acides

polylactique ou polyglycolique et les copolymères de polyéthylène glycol et de polylactide-co-glycolide.

Selon une autre disposition avantageuse de ces modes de réalisation, ledit matériau de comblement tissulaire est un matériau ostéoconducteur sélectionné dans le groupe constitué par le corail, l'hydroxyapatite, un mélange de collagène et d'hydroxyapatite, le phosphate de calcium tricalcique, le sulfate de calcium et le carbonate de calcium.

On entend par ostéoconducteur un matériau servant de support tridimensionnel pour la repousse vasculaire et la croissance des cellules ostéoprogénitrices, ledit matériau permettant la repousse osseuse de proche en proche, sans être capable d'initier la fabrication d'os en site ectopique, contrairement à un matériau ostéoinducteur qui, lui, stimule une activité ostéogénique en induisant une prolifération et une différenciation des cellules du mésenchyme périvasculaire en cellules ostéoprogénitrices en site ectopique (M. R. Urist, Science, 1965, 150, 893-899).

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du biomatériau insolubilisé par réticulation tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd telle que décrite ci-dessus, - adsorption, dans le dérivé de dextrane insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini précédemment, - obtention d'un biomatériau selon l'invention sous la forme d'un hydrogel, - éventuellement, lyophilisation dudit hydrogel afin d'obtenir le biomatériau selon l'invention sous la forme d'une poudre.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, ladite réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd s'effectue à l'aide d'un agent réticulant tel que décrit précédemment .

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, ladite réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd s'effectue en présence d'un matériau de comblement ostéoconducteur tel que décrit précédemment.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du biomatériau sous forme partiçulaire tel que décrit précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en contact du dérivé de dextrane avec des particules d'un support ostéoconducteur insoluble minéral ou polymérique telles que décrites précédemment, de façon à obtenir un composite, - insolubilisation du composite obtenu cidessus, en présence d'un agent réticulant, - adsorption, dans le composite insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini précédemment.

Les agents réticulants utilisables dans ce procédé sont identiques à ceux décrits précédemment.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un biomatériau tel que défini précédemment pour la préparation d'un matériau de réparation ou de comblement pour applications ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciales, notamment pour la préparation d'implants ostéoarticulaires, dentaires ou maxillofaciaux.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un biomatériau tel que défini précédemment pour la préparation d'un revêtement de prothèse orthopédique, dentaire ou maxillo-faciale.

Une telle prothèse est par exemple, et de façon non limitative, constituée d'une céramique, d'un acier inoxydable, d'un alliage de titane ou encore d'un alliage chrome-cobalt.

La présente invention a, en outre, pour objet une prothèse fonctionnalisée, caractérisée en ce qu'une partie au moins de sa surface est revêtue d'un biomatériau selon l'invention.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de biomatériaux selon l'invention et à des exemples de leur utilisation, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquelles : - la figure 1 illustre schématiquement la structure d'un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSUcSd ; la figure 2a représente les résultats d'électrophorèses sur gel d'agarose à 0,8 % de différents polymères et du facteur de croissance TGF-pl ; - la figure 2b représente les résultats d'électrophorèses sur gel d'agarose à 0,8 % de différents polymères et de BMP extraite d'un tissu osseux bovin ; - les figures 3a et 3b représentent la quantité(en pg, valeurs cumulées) de TGF-ss1 libéré par les gels T500 (dextrane natif) et FC27 (dérivé de dextrane substitué) en fonction du temps (en heures), respectivement sans renouvellement du milieu (figure 3a) et avec renouvellement du milieu (figure 3b), selon le protocole décrit dans l'exemple 5 ; - la figure 4a représente une radiographie de la néoformation osseuse induite chez des rats par de la BMP extraite bovine, selon le protocole décrit dans l'exemple 9 ; - la figure 4b représente une vue au microscope optique d'un nodule osseux formé en site

intramusculaire chez un rat, selon le protocole décrit dans l'exemple 9 ; - la figure 4c représente une vue au microscope optique d'un implant à base de corail et de BMP extraite bovine en site intramusculaire, chez un rat, selon le protocole décrit dans l'exemple 9.

Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Mise en évidence de l'interaction de différents polymères, dont plusieurs dérivés de dextrane de formule DMCaBbSucSd, avec le facteur de croissance TGF-f.

Cet exemple a trait à des tests de criblage de polymères, en particulier de dérivés de dextrane fonctionnalisés comportant des unités CM, B, S et Su telles que définies précédemment, en vue de sélectionner des polymères ayant une bonne affinité pour le TGF-ss1. a) Polymères utilisés.

Les caractéristiques structurelles des différents polymères utilisés sont résumées dans le tableau I ciaprès, les degrés de substitution en groupes CM, B, Su et S étant indiqués pour chaque polymère. Le polymère T40 indique un dextrane natif (Pharmacia Fine Chemical, masse molaire moyenne en poids Mw : 37500 g/mol, Mw/Mn : 1,7, Mn représentant la masse molaire moyenne en nombre). Les autres polymères correspondent à des dérivés de dextrane fonctionnalisés.

Tableau <SEP> I
<tb> Polymères <SEP> CM <SEP> B <SEP> Su <SEP> S
<tb> CMD <SEP> 7 <SEP> 1. <SEP> 67 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> FC <SEP> 27 <SEP> 1. <SEP> 08 <SEP> 0.65 <SEP> 0.74 <SEP> 0. <SEP> 02
<tb> FC <SEP> 27 <SEP> EI-1 <SEP> 0.94 <SEP> 0.52 <SEP> 0.76 <SEP> 0
<tb> CMDBS <SEP> R2 <SEP> 0. <SEP> 77 <SEP> 0. <SEP> 42 <SEP> 0. <SEP> 12 <SEP> 0.01
<tb> CMDBSu <SEP> 1.07 <SEP> 0. <SEP> 42 <SEP> 1.41 <SEP> 0
<tb> CMDBS <SEP> 25 <SEP> 0. <SEP> 75 <SEP> 0.2 <SEP> 0.13 <SEP> 0. <SEP> 02
<tb> CMDB <SEP> 2 <SEP> 0.94 <SEP> 0.44 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> TD4 <SEP> 0. <SEP> 76 <SEP> 0. <SEP> 31 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> TD5 <SEP> 0. <SEP> 64 <SEP> 0. <SEP> 43 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> T40-B2 <SEP> 0. <SEP> 65 <SEP> 0. <SEP> 29 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> LS13 <SEP> 0. <SEP> 98 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> LS4 <SEP> 0. <SEP> 67 <SEP> 0. <SEP> 33 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> LS5 <SEP> 0. <SEP> 81 <SEP> 0. <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> LS8 <SEP> 0. <SEP> 59 <SEP> 0. <SEP> 39 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> R05 <SEP> 0. <SEP> 81 <SEP> 0. <SEP> 43 <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 0.01
<tb> Van <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 76 <SEP> 0. <SEP> 38 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Van <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 75 <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP> 0. <SEP> 64 <SEP> 0
<tb> Van <SEP> 3 <SEP> 0. <SEP> 74 <SEP> 0. <SEP> 37 <SEP> 1. <SEP> 08 <SEP> 0
<tb>
b) Matériels et méthode.

15 ng (0,5 fil) de TGF-ss1 (fourni par R&D System), seul (contrôle) ou en présence de 100 g de polymère, sont dissous dans 10 l de tampon d'échantillon, à savoir de l'acétate de sodium 125 mM, du tampon Tris pH 7,00, 50 mM et 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA).

Les échantillons sont incubés pendant 1 à 2 h à 4 C.

On prépare 45 ml d'un gel d'agarose à 0,8 %.

Les échantillons sont chargés sur le gel d'agarose, sur lequel 2 Fil de glycérol à 75 % et du Bleu de Bromophénol ont été préalablement déposés. L'électrophorèse est réalisée pendant 4 h sous un courant de 200 mA, à la température de 4 C. Le tampon de migration est un tampon comportant de l'acétate de sodium 125 mM et du tampon Tris-HCl pH 7,00,50 mM.

En fin de migration, le gel est incubé, pendant 15 à 20 minutes, dans un tampon de transfert

comprenant du tampon Tris-HCl pH 9,00,25 mM, de la glycine 192 mM, du méthanol à 20 % et du SDS (sodium lauryl sulfate). Le gel est ensuite transféré par capillarité sur une membrane PVDF (fluorure de polyvinylidène) préalablement trempée dans du méthanol puis dans de l'eau ultrapure (3 minutes) et enfin dans le tampon de transfert, le transfert s'effectuant par capillarité pendant une nuit.

La membrane de PVDF est ensuite trempée 20 minutes dans un mélange tampon TBS (Tris-HCl 20 mM et NaCl 150 mM), Tween 0,05 % et BSA 1 %, puis 20 minutes dans un mélange tampon TBS, Tween 0,05 % et gélatine 1 %.

@ Suivent deux étapes d'incubation de la membrane : - de 1 h 30 à 2 h, à température ambiante, avec une solution diluée au 1/1000 d'anticorps primaire anti-TGF-P de lapin, fourni par Promega (soit 10 fil d'anticorps dans 10 ml de TBS/Tween 0,05 %/BSA 1 %).

L'incubation est suivie d'un lavage de la membrane 4 x 10 minutes avec une solution TBS/Tween 0,05 % ; - de 1 h à 1 h 30, à température ambiante, avec une solution diluée au 1/2500 d'anticorps secondaire anti-lapin couplé à de la peroxydase (Boehringer Mannheim), soit 10 l d'anticorps dans 25 ml de TBS/Tween 0,05 %/BSA 1 %. L'incubation est suivie d'un lavage de la membrane 3 x 10 minutes avec une solution TBS/Tween 0,05 %, puis d'un dernier lavage avec le tampon TBS.

On effectue ensuite une révélation colorimétrique. Dans ce but, on prépare une solution d'orthodianisidine à 0,5 % dans le méthanol (50 mg dans 10 ml) et une solution de peroxyde d'hydrogène 0,01 %/tampon Tris pH 7,4,10 mM. La révélation colorimétrique s'effectue en ajoutant à la membrane 50 ml du tampon Tris et 125 l de la solution d'ortho-dianisidine (soit 0,00125 %). Une coloration brune apparaît en quelques minutes. La

révélation colorimétrique est alors arrêtée par addition d'eau.

Le facteur de croissance seul (contrôle) doit peu migrer, son point isoélectrique (pI) étant proche du pH du tampon de migration ; en revanche, s'il se complexe avec un polymère qui est fortement anionique, l'ensemble va migrer vers l'anode (+). c) Résultats.

La figure 2a représente les résultats des électrophorèses décrites ci-dessus.

Il ressort de cette figure que le TGF-ss1 n'interagit ni avec le dextrane natif T40, ni avec le CMD7,dérivé du dextrane uniquement carboxyméthylé. En revanche, le TGF-pl interagit de façon variable avec les dérivés du dextrane comprenant au moins des unités benzylamides, excluant les interactions purement ioniques.

Deux produits sortent du lot : le CMDB2 et le FC27, pour lesquels le front de migration est fortement déplacé vers l'anode. Leur point commun est un fort taux de substitution en groupements benzylamides.

EXEMPLE 2 : Mise en évidence de l'interaction de différents polymères, dont plusieurs dérivés de dextrane de formule DMCaBbSucSd, avec de la BMP extraite bovine (bBMP) .

Comme dans l'exemple précédent, cet exemple a trait à des tests de criblage de polymères, en particulier de dérivés de dextrane fonctionnalisés, en vue de sélectionner des polymères ayant une bonne affinité pour la bBMP (BMP bovine). a) Polymères utilisés.

Cf. exemple précédent (tableau I). b) Matériels et méthode.

Le protocole suivi est similaire à l'exemple précédent, aux différences près suivantes : - on utilise 250 ng de bBMP fournie par exemple par Sulzer Orthopedics Biologics Inc. (Wheat

Ridge, Colorado), marquée par de la biotine selon le kit de Boehringer, - l'électrophorèse est réalisée pendant 2 h sur le gel d'agarose à 0,8 %, - il n'y a pas d'étape d'incubation de la membrane PVDF avec des anticorps, mais une étape d'incubation, pendant 2 h et à température ambiante, avec une solution au 1/2000 de streptavidine couplée à de la peroxydase (soit 5 l de streptavidine dans 10 ml de TBS/Tween 0,05 %/BSA 1 %). L'incubation est suivie d'un lavage de la membrane 4 x 10 minutes avec une solution TBS/Tween 0,05 %. c) Résultats.

La figure 2b représente les résultats des électrophorèses décrites ci-dessus. Il ressort de cette figure que, de façon similaire au TGF-pl (voir l'exemple précédent), la bBMP n'interagit ni avec le dextrane natif, ni avec un dérivé de dextrane uniquement carboxyméthylé.

En revanche, la bBMP interagit avec tous les dérivés du dextrane comprenant au moins des unités benzylamides.

EXEMPLE 3 : Préparation d'un biomatériau selon l'invention. a) Préparation d'un dérivé de dextrane insolubilisé par le trimétaphosphate de sodium (TMP)
Le TMP permet la réticulation du dérivé de dextrane. Cette réaction fait intervenir une phosphorylation du polysaccharide par le biais de liaisons covalentes phosphate-diester, en milieu alcalin. Les liaisons diesters se créent sur les groupements hydroxyles du dextrane. Les dérivés de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd selon l'invention ayant, du fait de leur substitution, peu de groupements hydroxyles libres, leur réticulation sera réalisée en présence de dextrane natif (non substitué).

70 (il d'une solution de dextrane natif de masse molaire élevée (supérieure ou égale à

500,000 g/mol), par exemple le dextrane T500 fourni par Pharmacia Fine Chemical (masse molaire moyenne en poids (Mw) de 464,000 g/mol, Mw/Mn = 2, 9, Mn représentant la masse molaire moyenne en nombre) sont mélangés à 20 l d'une solution de CMDB2 tel que défini dans l'exemple 1 (voir le tableau I) , à savoir un DMCaBbSucSd dans lequel a = 0,94, b = 0,44 et c = d = 0, lesdites solutions étant réalisées dans NaOH 0,5 M à des concentrations de 300 mg/ml. 10 (il d'une solution de TMP (c'est-à-dire (NaP03) 3) dans NaOH 0,5M à la concentration de 300 mg/ml sont ajoutés à ce mélange. On obtient ainsi 100 \il d'une solution très visqueuse, l'augmentation de viscosité traduisant la réticulation du CMDB2 et du dextrane.

La solution très visqueuse obtenue ci-dessus est aliquotée par volumes de 1 l sur une plaque de téflon et l'ensemble est placé à l'étuve à 40 C pendant 2 h. Les gels secs ainsi obtenus sont mis en suspension deux fois pendant 24 h dans un grand excès (2 ml) d'eau ultrapure, ceci afin d'éliminer les traces de soude dans le gel, puis lyophilisés et ensuite stérilisés par rayonnement ionisant (25 kGray). b) Association d'un facteur de croissance (bBMP) au dérivé de dextrane insolubilisé
Chaque gel est réhydraté en conditions stériles avec 2 l d'un tampon phosphate PBS (formulation Dubelcco) contenant 250 ng/ml (0,5 ng/gel) de bBMP (BMP extraite bovine, fournie par exemple par Sulzer Orthopedics Biologics Inc, Wheat Ridge, Colorado). On obtient alors un biomatériau selon l'invention sous la forme d'un hydrogel.

Cet hydrogel peut être lyophilisé afin de conserver le biomatériau selon l'invention sous la forme d'une poudre (obtention de 100 lyophilisats prêts à l'emploi à partir de 100 Fil de solution de départ).

Au moment de l'utilisation pour la préparation d'un implant, le lyophilisat peut être utilisé tel quel ou

réhydraté avec 10 l d'eau ppi (prêt pour injection) par mg de lyophilisât.

Le même protocole de préparation d'un biomatériau tel que décrit ci-avant pourrait être réalisé à l'aide d'un composé de formule générale DMCaBbSucSd dans lequel a = 0,90, b = 0, 53, c - 0, 19 et d = 0, 05 (composé dénommé FC 06) .

EXEMPLE 4 : Autre protocole de préparation d'un biomatériau selon l'invention. a) Préparation d'un dérivé de dextrane insolubilisé par l'éther de 1,4-butanediol-diglycidyle
700 l d'une solution de dextrane T500 (identique au dextrane utilisé dans l'exemple précédent) sont 'mélangés à 200 l d'une solution de CMDBSu (cf. tableau I), lesdites solutions étant réalisées dans de l'eau bidistillée, à raison de 300 mg/ml. La solution résultante est congelée et lyophilisée.

Le lyophilisat est immergé dans une solution d'éther de 1,4-butanediol-diglycidyle dans de l'éther éthylique (0,5 % en volume) pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'éther éthylique est évaporé à 40 C sous vide. Le gel réticulé sec est suspendu successivement dans 2 ml de NaOH 0,1 M, 2 ml d'eau bidistillée, 2 ml de NaCl 2 M et enfin 3 x 2 ml d'eau bidistillée. Le gel est lyophilisé, puis réhydraté avec 1 ml d'eau bidistillée.

Le gel mou obtenu est alors placé dans un récipient constitué d'une plaque de verre de 3 cm x 3 cm comportant un rebord de 1 mm de hauteur. Un couvercle en verre est placé sur ce récipient et l'ensemble est congelé à -80 C. La galette de glace obtenue (3 x 3 x 0,1 cm3) est lyophilisée dans le récipient débarrassé de son couvercle, puis découpée avec une lame de rasoirs en gels secs de 5 mm de côté (soit des volumes de 25 fil) . Les gels secs sont sont mis en suspension deux fois pendant 24 h dans un

grand excès d'eau ultrapure (20 ml), puis lyophilisés et stérilisés par rayonnement ionisant (25 kGray). b) Association d'un facteur de croissance (bBMP) au dérivé de dextrane insolubilisé
Chaque gel est réhydraté en conditions stériles avec 50 l d'un tampon phosphate PBS (formulation Dubelcco) contenant 250 ng/ml (12,5 ng/gel) de bBMP, puis lyophilisé. On obtient ainsi une trentaine de lyophilisats prêts à l'emploi à partir de 1 ml de solution de départ.

Au moment de l'utilisation pour la préparation d'un implant, le lyophilisat peut être utilisé tel quel ou réhydraté avec 50 Fil d'eau ppi (prêt pour injection) par mg de.lyophilisât.

EXEMPLE 5 : Adsorption et libération du facteur de croissance TGF-pl par un dérivé de dextrane insolubilisé de formule générale DMCaBbSucSd. a) Adsorption du facteur de croissance.

# Protocole d'adsorption du TGF-pl et de mesure de la quantité de TGF-pl adsorbé.

On utilise le dérivé de dextrane dénommé FC27 dans le tableau I, c'est-à-dire un dextrane dont les degrés de substitution respectifs en unités CM, B et Su sont de 1,08,0,65 et 0,76, ledit dextrane étant insolubilisé conformément au protocole décrit dans l'exemple 3. Le témoin est un dextrane natif T500, lui aussi insolubilisé comme décrit dans l'exemple 3.

Dans un tube de verre siliconé, on place : - 0,24 g de FC27 insolubilisé, - 200 l de tampon phosphate PBS comprenant 0,02 % d'azidure de sodium (agent bactéricide) et 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA), ce composé permettant d'éviter l'adsorption du facteur de croissance sur les parois du tube de verre, et - 100 ng de TGF-pl.

Le témoin est préparé de façon similaire, mais à partir de 0,30 g de dextrane natif et de 400 l de tam-

pon phosphate (en effet, le gel de dextrane T500 a un taux de gonflement plus important que le FC27, cette différence pouvant s'expliquer par une différence dans les taux de réticulation).

Le tout est laissé 48 h à température ambiante sous agitation douce, puis chaque gel est lavé par du tampon phosphate afin d'éliminer le facteur de croissance non absorbé. Le facteur de croissance restant dans le tube et dans le tampon de lavage est ensuite dosé par la méthode ELISA.

# Résultats
Le tableau II résume les quantités de TGF-1 adsorbées dans le gel de dérivé de dextrane fonctionnalisé (FC27) et dans le gel de dextrane natif T500 (contrôle).

Tableau <SEP> II <SEP> . <SEP> quantité <SEP> de <SEP> TGF-ss1 <SEP> adsorbé <SEP> (ng)
<tb> Gel <SEP> tube <SEP> vide <SEP> tampon <SEP> de <SEP> lavage <SEP> adsorbé <SEP> dans <SEP> le <SEP> gel
<tb> T500 <SEP> 9,9 <SEP> 5,0 <SEP> 85,1
<tb> FC27 <SEP> 13,7 <SEP> 9,4 <SEP> 76,9
<tb>

Il ressort du tableau II qu'il reste une concentration résiduelle en TGF-ss1 de 14,9 % à la quantité initialement ajoutée pour le T500 et de 23,1 % pour le FC27. Ainsi, le T500 et le FC27 ont respectivement adsorbé 85,1 % et 76,9 % du TGF-pl initialement ajouté : les deux gels adsorbent le TGF-pl de manière significative. b) Libération du facteur de croissance dans un milieu tampon phosphate.

# Protocole.

La cinétique de libération du TGF-pl est réalisée dans des plaques 6 puits siliconées. Les gels de FC27 et de T500 dans lesquels est adsorbé le TGF-pl sont incubés dans les puits en présence de tampon phosphate PBS (soit 5 ml, soit 10 ml, comme décrit ci-après), de 0, 02 % d'azidure de sodium et de 0,5 % de BSA, à température ambiante.

Le dosage du TGF-ss1 libéré dans le milieu se fait par une méthode ELISA classique, mettant en #uvre des plaques de microtitration à 96 puits revêtues par une solution d'anticorps monoclonal anti-TGF-p (2 g/ml) dans un tampon carbonate, pH 9,6. La plaque est scellée, incubée une nuit à 4 C sans agitation, puis lavée 5 fois avec 300 (il de tampon PBS pH 7,4 comprenant 0,05 % de Tween 20. Le blocage des sites non spécifiques s'effectue alors avec une solution de BSA à 0,5 % (ajout de 300 l de la solution par puits, suivi d'lh d'incubation à température ambiante sans agitation). Après un lavage convenable des puits avec la solution de lavage décrite ci-dessus, on prépare les échantillons standards (gamme de TGF-pl de 31,25 à 2000 pg/ml) et les échantillons à tester. Chaque puits contient 100 (il de chaque échantillon et est incubé sous agitation pendant 1 h 30 à température ambiante. Après un lavage convenable de la plaque avec la solution de lavage décrite ci-dessus, les puits sont incubés avec une solution d'anticorps primaire anti-TGF humain biotinylé à 100 ng/ml (100 1/puits) dans un tampon PBS/Tween 20 à 0,05 %/BSA 0,5 %. Après un lavage convenable de la plaque avec la solution de lavage décrite ci-dessus, les puits sont incubés avec une solution diluée au 1/10000 (100 l/puits) de streptavidine couplée à la peroxydase. Un dernier lavage de la plaque est alors effectué, puis la plaque est révélée à l'ODP (1 pastille dans 25 ml de tampon citrate pH 5,0,05 M, auquel on ajoute 33,3 (il de peroxyde d'hydrogène à 9 %) en ajoutant 200 l de réactif par puits. La réaction se développe pendant 3-4 minutes puis est arrêtée en ajoutant 50 l d'acide sulfurique 3M.

Pour mesurer la cinétique de libération du TGF-pl, deux protocoles ont été employés : - soit sans renouvellement du milieu, auquel cas 4 prélèvements successifs (à 15 min., 45 min., 1 h 30

et 8 h après immersion) de 400 (il ont été réalisés à partir d'un volume de tampon initial de 10 ml ; - soit avec renouvellement du milieu, auquel cas les 5 ml initiaux de tampon sont prélevés (à 30 min. , 1, 2,5, 24 heures, 2,3, 4,5, 9 et 15 jours) et remplacés par 5 ml de tampon frais.

# Résultats.

Les figure 3a et 3b représentent la quantité (en pg, valeurs cumulées) de TGF-ss1 libéré par les gels T500 et FC27 en fonction du temps (en heures), respectivement sans renouvellement du milieu (figure 5a) et avec renouvellement du milieu (figure 5b).

Ces figures montrent une libération rapide du TGF-pl dans le tampon phosphate pour le T500, alors que cette libération ne se produit pas avec le FC27. Il ressort ainsi que le FC27 forme, avec le TGF-pl, un complexe qui n'est pas dissocié dans le tampon phosphate : le TGF-pl est adsorbé dans le gel mais n'en est pas libéré. Il convient toutefois de préciser que dans des conditions in vivo, le gel de dextrane fonctionnalisé serait exposé à différentes enzymes ainsi qu'à des conditions de pH qui favoriseraient la dégradation lente du gel et la libération progressive du TGF-pl.

EXEMPLE 6 : Préparation d'un implant osseux à l'aide d'un biomatériau selon l'invention sous la forme d'un hydrogel.

Pour une cavité osseuse d'environ 50 mm3, on utilise 15 mg du biomatériau selon l'invention sous forme d'une poudre lyophilisée, telle qu'obtenue dans l'exemple 3, qui sont concassés et réhydratés avec 100 (il d'eau ultrapure (obtention d'un hydrogel de 100 l).

EXEMPLE 7 : Préparation d'un implant osseux solide comprenant un biomatériau selon l'invention associé à un matériau de comblement sous forme particulaire, le phosphate de calcium tricalcique.

70 l d'une solution de dextrane natif de masse molaire élevée (supérieure ou égale à

500,000 g/mol), tel que le dextrane utilisé dans l'exemple 3, sont mélangés à 20 [il d'une solution de CMDB2 (même dérivé de dextrane que dans l'exemple 3), lesdites solutions étant réalisées dans NaOH 0,5 M à des concentrations de 300 mg/ml. 80 mg de granules (0,5 mm de diamètre) de phosphate de calcium tricalcique sont mélangés à la solution précédente et 10 l d'une solution de TMP dans NaOH 0,5 M à la concentration de 300 mg/ml y sont ajoutés.

Le mélange obtenu est moulé sous forme d'un spécimen cubique de 5 mm3 et mis à l'étuve à 40 C pendant 2 h.

Le spécimen obtenu est mis en suspension deux fois pendant 24 h dans de l'eau ultrapure (100 fois le volume du cube) sous agitation douce, séché à l'étuve sous vide à 40 C pendant 1 nuit, puis stérilisé comme décrit dans l'exemple 3.

Le spécimen est alors réhydraté en conditions stériles avec 50 (il du tampon phosphate PBS utilisé dans l'exemple 3, contenant 1 ng/1 (50 ng par spécimen) de bBMP. Le cube est ensuite séché sous vide à 40 C pendant 3 h. Il peut être utilisé tel quel en tant qu'implant.

EXEMPLE 8 : Préparation d'un revêtement d'une prothèse orthopédique à l'aide d'un biomatériau selon l'invention.

210 ml d'une solution de dextrane natif de masse molaire élevée (supérieure ou égale à 500,000 g/mol), par exemple le dextrane T500 décrit dans l'exemple 3, sont mélangés à 60 ml d'une solution de CMDB2 tel que décrit dans l'exemple 3, lesdites solutions étant réalisées dans NaOH 0,5 M à des concentrations de 300 mg/ml. 30 ml d'une solution de TMP dans NaOH 0,5 M à la concentration de 300 mg/ml sont ajoutés à ce mélange.

La solution très visqueuse obtenue (300 ml) est homogénéisée rapidement et placée à 37 C dans un récipient adapté.

La queue d'une prothèse fémorale en TiAl6V4 (alliage de titane comprenant 6 % d'aluminium et 4 % de vanadium) est immédiatement plongée dans ce mélange. Elle

en est retirée après 10 minutes et placée dans une étuve maintenue à 40 C pendant 2 h. La queue fémorale est immergée dans 1 1 d'eau ultrapure deux fois pendant 24 h, séchée à l'étuve sous vide à 40 C pendant 1 nuit et stérilisée comme décrit dans l'exemple 3.

3 ml d'une solution du tampon PBS utilisé dans l'exemple 3, contenant 300 g de bBMP, sont dispersés à la surface traitée de la prothèse sous forme de spray, en conditions stériles. La prothèse est ensuite séchée sous vide à 40 C pendant 3 h. La prothèse peut être utilisée telle quelle au moment de l'implantation.

Le même protocole peut être utilisé pour enrober une prothèse de genou ou un cotyle de prothèse de hanche.

EXEMPLE 9 : Etudes in vivo de biomatériaux selon l'invention.

# Protocole.

On utilise 0,5 cm3 d'un gel de CMDB2 (dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd, dans laquelle a = 0,94, b = 0,44 et c = d = 0) réticulé de la façon décrite dans l'exemple 3 et chargé avec 100 ng de BMP extraite bovine.

Le contrôle est un cube de corail de 0,5 cm3 (Porites fournies par Biocoral Inc. ) chargé avec 100 ng de BMP extraite bovine.

Les animaux, au nombre de 10, sont des rats Sprague-Dawley âgés de 3 semaines, pesant environ 70 g.

Ils sont anesthésiés par une solution de Ketalar et de Xylaxine. Une particule de gel (environ 1 % du volume initial du gel) est prélevée avec une pince et mise en place en intramusculaire, dans les muscles paravertébraux.

La peau des animaux est refermée avec un fil de suture non résorbable. L'implantation est maintenue pendant 1 mois, puis les animaux sont sacrifiés en vue d'une étude histologique des implants dans la masse musculaire.

# Résultats.

La figure 4a représente une radiographie de la néoformation osseuse.

La figure 4b représente une vue (grossisse- ment : x 100) d'un nodule osseux néoformé en site intramusculaire. On remarque la structure corticale mature du nodule.

La figure 4c (grossissement : x 100) représente le contrôle de l'étude (corail chargé en BMP). Les porosités du matériau sont peu cellularisées, le matériau est intact (aucune résorption) et aucune néoformation osseuse n'est observée.

Il ressort de cette étude qu'une dose faible de BMP (100 ng), vectorisée par un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd' dans laquelle a = 0, 94, b = 0,44 et c = d = 0, permet d'obtenir un biomatériau capable d'induire une néoformation osseuse en site ectopique.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1. Biomatériau, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : (1) au moins un dérivé de dextrane insolubilisé, de formule générale DMCaBbSucSd, dans laquelle :

D représente une chaîne polysaccharidique, de préférence constituée par des enchaînements d'unités glucosidiques,

MC représente des groupes méthylcarboxylates,

B représente des groupes carboxyméthyl-benzylamides,

Su représente des groupes sulfates (sulfatation des fonctions hydroxyles libres portées par les unités glucosidiques),

S représente des groupes sulfonates (sulfonatation des noyaux aromatiques des groupes B), a, b, c et d représentent le degré de substitution (ds), exprimé par rapport au nombre de fonctions hydroxyles libres dans une unité glucosidique du dextrane, respectivement en groupements MC, B, Su et S ; a étant à 0,3, b étant à 0,2, c étant égal à 0 ou à 0,1 et d étant égal à 0 ou :9 0,15, lequel produit présente une homogénéité de la distribution des tailles de chaînes, illustrée par un profil d'élution de type gaussien symétrique en chromatographie d'exclusion stérique haute performance, et une homogénéité de la distribution des groupements chimiques chargés, illustrée par un profil d'élution à un seul pic symétrique en chromatographie d'échange d'ions basse pression, et (2) au moins un facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéo-articulaires, dentaires et/ou maxillo-faciaux.

2. Biomatériau selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit dérivé de dextrane insolubilisé est tel que d est égal à 0.

3. Biomatériau selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit facteur de croissance est sélectionné dans le groupe constitué par les EGF, les IGFs, les FGFs, les TGF-, les PDGFs et les BMPs.

4. Biomatériau l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit facteur de croissance présente une activité ostéoinductrice et est une BMP.

5. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs dérivés de dextrane insolubilisés et/ou plusieurs facteurs de croissance impliqués dans le processus de reconstruction osseuse.

6. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est insolubilisé par réticulation à l'aide d'un agent réticulant.

7. Biomatériau selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit agent réticulant est sélectionné dans le groupe constitué par le trimétaphosphate de sodium, l'épichlorhydrine, la divinylsulfone, le glutaraldéhyde et les bisépoxyranes.

8. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un hydrogel.

9. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une poudre lyophilisée.

10. Biomatériau selon la revendication 9, caractérisé en ce ladite poudre lyophilisée est obtenue à partir de l'hydrogel défini dans la revendication 8.

11. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un matériau de comblement tissulaire.

12. Biomatériau selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il enrobe des particules d'un support insoluble minéral ou polymérique, lesdites particules ayant un diamètre supérieur à 100 m.

13. Biomatériau selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce que ledit matériau de comblement tissulaire est sélectionné dans le groupe constitué par le collagène, la gélatine, la colle biologique, les polymères d'acides polylactique ou polyglycolique et les copolymères de polyéthylène glycol et de polylactide-co-glycolide.

14. Biomatériau selon la revendication Il ou la revendication 12, caractérisé en ce que ledit matériau de comblement tissulaire est un matériau ostéoconducteur sélectionné dans le groupe constitué par le corail, l'hydroxyapatite, un mélange de collagène et d'hydroxyapatite, le phosphate de calcium tricalcique, le sulfate de calcium et le carbonate de calcium.

15. Procédé de préparation du biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd telle que défini dans la revendication 1 ou la revendication 2, - adsorption, dans le dérivé de dextrane insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, - obtention d'un biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, sous la forme d'un hydrogel,

- éventuellement, lyophilisation dudit hydro- gel afin d'obtenir ledit biomatériau sous la forme d'une poudre.

16. Procédé selon la revendication 15, carac- térisé en ce que ladite réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSuSd s'effectue à l'aide d'un agent réticulant tel que défini dans la revendication 6 ou la revendication 7.

17. Procédé selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que la réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd s'effectue en présence d'un matériau de comblement tissulaire.

18. Procédé selon la revendication 17, carac- térisé en ce que ledit matériau de comblement tissulaire est tel que défini dans la revendication 13 ou la revendication 14.

19. Procédé de préparation du biomatériau selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en contact du dérivé de dextrane avec des particules d'un support insoluble minéral ou polymérique telles que définies dans la revendication 12, de façon à obtenir un composite, - insolubilisation du composite obtenu ci-dessus, en présence d'un agent réticulant, - adsorption, dans le composite insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini dans les revendications 1 à 4.

20. Utilisation du biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un matériau de réparation ou de comblement pour applica- tions ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciales.

21. Utilisation selon la revendication 20 pour la préparation d'implants ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciaux.

22. Utilisation d'un biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un revêtement de prothèse orthopédique, dentaire ou maxillo-faciale.

23. Prothèse fonctionnalisée, caractérisée en ce qu'une partie au moins de sa surface est revêtue d'un biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.