FR2793496A1 - Insect cells that can replicate at mammalian body temperature, useful for producing functional recombinant proteins encoded by baculovirus - Google Patents
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Abstract
Description
CULTURES DE CELLULES D'INSECTE SE MULTIPLIANT À 37 C, LEUR PROCÉDÉ D'OBTENTION, ET LEURS UTILISATIONS. La présente invention est relative à des cultures de cellules d'insecte capables de croître à 37 C, et permettant la multiplication de baculovirus, ainsi qu'à l'utilisation de ces lignées cellulaires pour l'expression de gènes d'intérêt clonés dans des baculovirus. INSECT CELL CULTURES MULTIPLYING AT 37 C, METHOD FOR OBTAINING SAME, AND USES THEREOF The present invention relates to insect cell cultures capable of growing at 37 C, and allowing the multiplication of baculoviruses, as well as to the use of these cell lines for the expression of genes of interest cloned into cells. baculovirus.
L'expression, dans des cultures de cellules d'insectes, de gènes d'intérêt clonés dans des vecteurs dérivés de baculovirus, est une des méthodes de production de protéines recombinantes les plus utilisées à l'heure actuelle. The expression in insect cell cultures of genes of interest cloned into baculovirus-derived vectors is one of the most widely used methods of producing recombinant proteins.
L'optimum de température pour les cellules d'insecte en culture est compris entre 26 et 28 C. A des températures supérieures à 30 C, leur croissance ralentit considérablement, et elles meurent rapidement si elles sont maintenues à des températures supérieures à 35 C. The temperature optimum for the insect cells in culture is between 26 and 28 C. At temperatures above 30 C, their growth slows considerably, and they die rapidly if they are maintained at temperatures above 35 C.
Dans le cas de cellules de Spodoptera frugiperda en culture, il a été constaté qu'un choc thermique de courte durée (30 min.) à 42 C ne diminuait pas leur viabilité [CLEM et MILLER, Mol. Cell. Biol., 14, 5212-5222 (1994)].. Cependant, lorsque ces cellules sont maintenues à des températures supra-optimales pendant une plus longue durée, leur croissance est affectée ; HARA et al. [Biosc. Biotech. Biochem., 57 (6), 996-997, (1993)] rapportent par exemple que l'on n'observe aucune croissance des cultures de cellules Sf21 à 37 C. Lorsque ces cellules sont infectées par un baculovirus recombinant exprimant le gène de la P-galactosidase sous contrôle du promoteur de la polyédrine, l'expression de ce gène est maximale pour des températures de l'ordre de 30 C, décroît considérablement à 33 C, et devient nulle à 35 C. In the case of Spodoptera frugiperda cells in culture, it was found that a short-term heat shock (30 min.) At 42 C did not decrease their viability [CLEM and MILLER, Mol. Cell. Biol., 14, 5212-5222 (1994)]. However, when these cells are maintained at supra-optimal temperatures for a longer period, their growth is affected; HARA et al. [Biosc. Biotech. Biochem., 57 (6), 996-997, (1993)] report, for example, that no growth of Sf21 cell cultures is observed at 37 C. When these cells are infected with a recombinant baculovirus expressing the β-galactosidase under the control of the polyhedrin promoter, the expression of this gene is maximal for temperatures of the order of 30 ° C., decreases considerably at 33 ° C., and becomes zero at 35 ° C.
La production de protéines recombinantes dans des systèmes baculovirus/cellules d'insectes est donc classiquement effectuée à des températures avoisinant les 27 C. Ceci peut présenter des inconvénients, particulièrement lorsque l'on souhaite exprimer certaines protéines qui sont naturellement synthétisées à une température plus élevée (par exemple des protéines d'animaux à sang chaud, et en particulier de mammifères) ; en effet, il est connu que la température peut avoir une influence directe sur le repliement des chaînes polypeptidiques, et que pour certaines protéines, une variation de quelques degrés C de la température à laquelle elles sont synthétisées peut modifier leur activité de manière notable. De plus, on sait que la composition lipidique des membranes est différente à 27 C et à 37 C, ce qui est important pour l'environnement de certaines protéines et en particulier des protéines membranaires. The production of recombinant proteins in baculovirus / insect cell systems is therefore conventionally carried out at temperatures approaching 27 C. This may present disadvantages, particularly when it is desired to express certain proteins which are naturally synthesized at a higher temperature. (for example, proteins of warm-blooded animals, and in particular mammals); indeed, it is known that temperature can have a direct influence on the folding of the polypeptide chains, and that for some proteins, a variation of a few degrees C of the temperature at which they are synthesized can modify their activity significantly. In addition, it is known that the lipid composition of the membranes is different at 27 ° C. and at 37 ° C., which is important for the environment of certain proteins and in particular membrane proteins.
C'est pourquoi il est souhaitable de pouvoir maintenir en culture et multiplier des cellules d'insectes permettant la multiplication de baculovirus et l'expression de gènes d'intérêt clonés dans ceux-ci, à une température la plus proche possible de la température corporelle des mammifères. That is why it is desirable to be able to maintain in culture and to multiply insect cells allowing the multiplication of baculoviruses and the expression of genes of interest cloned in them, at a temperature as close as possible to the body temperature. mammals.
La demande japonaise au nom de NORINSUISANSHO KAJU SHIKEN publiée le 19/04/91 sous le numéro J03094074 mentionne l'obtention d'une lignée de cellules dérivées de larves d'Agrotis segetum, et capables de survivre à 37 C. Ces cellules sont obtenues en procédant à une mutagenèse aléatoire par rayons ultraviolets, puis à une sélection des mutants par acclimatation à une alternance de températures (30 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 4 à 7 jours, 33 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 5 à 7 jours, 35 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 5 à 7 jours, 37 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 4 à 7 jours). Les cellules obtenues ainsi permettent, lorsqu'elles sont cultivées à des températures de 33 à 37 C, la multiplication de baculovirus pathogènes pour des insectes du genre Agrotis. Toutefois, la demande J03094674 ne donne aucune indication sur la stabilité de ces lignées cellulaires, ni sur leur capacité à se multiplier indéfiniment à 37 C, ou sur la possibilité de les utiliser comme cellules-hôte pour l'expression de gènes recombinants clonés dans des baculovirus. The Japanese application in the name of NORINSUISANSHO KAJU SHIKEN published on 19/04/91 under the number J03094074 mentions the obtaining of a cell line derived from larvae of Agrotis segetum, and capable of surviving at 37 C. These cells are obtained by random mutagenesis by ultraviolet light, followed by selection of mutants by acclimation at alternating temperatures (30 C for 2-5 days, 25 C for 4-7 days, 33 C for 2-5 days, 25 C for 5 to 7 days, 35 C for 2 to 5 days, 25 C for 5 to 7 days, 37 C for 2 to 5 days, 25 C for 4 to 7 days). The cells obtained thus allow, when cultured at temperatures of 33 to 37 ° C., the multiplication of pathogenic baculoviruses for insects of the genus Agrotis. However, the application J03094674 gives no indication on the stability of these cell lines, or on their ability to multiply indefinitely at 37 C, or on the possibility of using them as host cells for the expression of recombinant genes cloned into cells. baculovirus.
Les Inventeurs ont maintenant constaté que de manière surprenante, des cellules des lignées Sf9 et Sf21 de Spodoptera frugiperda (qui sont classiquement utilisées pour la production de baculovirus recombinants), pouvaient lorsqu'elles étaient placées dans certaines conditions, donner naissance à des cultures capables de pousser et de se multiplier normalement et indéfiniment à 37 C et convenant parfaitement pour la multiplication de baculovirus et l'expression dans ceux-ci de protéines recombinantes actives. The inventors have now found that, surprisingly, cells of Sf9 and Sf21 lines of Spodoptera frugiperda (which are conventionally used for the production of recombinant baculoviruses) could, when they were placed under certain conditions, give rise to cultures capable of grow and multiply normally and indefinitely at 37 C and suitable for the multiplication of baculovirus and the expression in them of active recombinant proteins.
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de cultures de cellules d'insectes, et en particulier de lépidoptères, capables de se multiplier à 37 C ; ce procédé comprend les étapes suivantes a) la mise en culture desdites cellules d'insecte à une température d'environ 27 2 C ; b) l'augmentation de la température de culture jusqu'à environ 37 1 C, c) le maintien en culture desdites cellules à cette température pendant 4 à 6 jours environ ; d) la récupération des cellules issues de l'étape c) et leur remise en culture à une température d'environ 37 1 C. The present invention relates to a process for obtaining insect cell cultures, and in particular Lepidoptera, capable of multiplying at 37 C; this method comprises the following steps: a) culturing said insect cells at a temperature of approximately 27 2 C; b) increasing the culture temperature to about 37 1 C, c) maintaining in culture said cells at this temperature for about 4 to 6 days; d) the recovery of the cells resulting from stage c) and their re-culture at a temperature of approximately 37 l.
L'augmentation de température de l'étape b) peut être effectuée en une seule étape, en élevant la température de la culture directement de 28 C à 37 C. Elle peut également être effectuée en plusieurs étapes, par exemple une première élévation de température de 27 à 30 C environ, suivie du maintien à la température de 30 C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 30 C, de l'élévation de la température de cette culture de 30 à 33 C environ, suivie du maintien à la température de 33 C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 33 C, de l'élévation de la température de cette culture de 33 à 35 C environ, suivie du maintien à la température de 35 C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 35 C, et de l'élévation de la température de cette culture de 35 à 37 C environ. Chacune des étapes d'élévation de la température de la culture peut s'effectuer simplement par passage d'une étuve maintenue à la température la plus basse à une étuve maintenue à la température la plus élevée. The temperature increase of step b) can be carried out in a single step, raising the temperature of the culture directly from 28 ° C. to 37 ° C. It can also be carried out in several steps, for example a first temperature rise. from 27 to 30 ° C, followed by the maintenance at a temperature of 30 ° C. for 2 to 3 days, of the recovery of the cells, of their culture at 30 ° C., of the temperature rise of this culture of 30 ° C. 33 ° C, followed by the maintenance at a temperature of 33 ° C. for 2 to 3 days, of the recovery of the cells, of their culturing at 33 ° C., the rise of the temperature of this culture from 33 to 35 ° C. followed by the maintenance at a temperature of 35 ° C. for 2 to 3 days, of the recovery of the cells, their culturing at 35 ° C., and the raising of the temperature of this culture to about 35 ° C. to 37 ° C. Each of the steps of raising the temperature of the culture can be carried out simply by passing an oven maintained at the lowest temperature to an oven maintained at the highest temperature.
Contrairement au procédé décrit dans la demande japonaise J03094674, le procédé conforme à l'invention ne nécessite aucune étape de mutagenèse. Unlike the process described in Japanese application J03094674, the process according to the invention does not require any mutagenesis step.
Des cellules d'insectes qui peuvent avantageusement être utilisées, conformément à l'invention, pour l'obtention de cultures de cellules capables de se multiplier à 37'C sont en particulier des cellules de Spodoptera frugiperda, par exemple celles de la lignée Sf21 ou de la lignée Sf9. Insect cells which can advantageously be used, in accordance with the invention, for obtaining cell cultures capable of multiplying at 37 ° C. are in particular Spodoptera frugiperda cells, for example those of the Sf21 line or of the Sf9 line.
Les milieux de culture classiquement utilisés pour la culture des cellules d'insecte conviennent pour la mise en ceuvre du procédé conforme à l'invention, et pour le maintien des cultures en résultant ; par exemple, dans le cas des lignées Sf9 ou Sf21, on peut utiliser l'un des milieux décrits par 0'REILLY et al. [Baculovirus Expression Vectors . A Laboratory Manual ; Freeman and Cie, New York, (1992)], tels que le milieu de GRACE, le milieu IPL-41, le milieu TC-100, etc... ou tout autre milieu. The culture media conventionally used for the culture of insect cells are suitable for the implementation of the process according to the invention, and for the maintenance of the resulting cultures; for example, in the case of Sf9 or Sf21 lines, one of the media described by O'RILLY et al. [Baculovirus Expression Vectors. A Laboratory Manual; Freeman and Co., New York, (1992)], such as the GRACE medium, the IPL-41 medium, the TC-100 medium, etc ... or any other medium.
La présente Invention a également pour objet les cultures de cellules d'insecte susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus, et les lignées issues de ces cultures. Ces lignées seront dénommées ci-après lignées HT , et désignées par la dénomination de la lignée d'origine, suivie des lettres HT . Par exemple, ou dénommera Sf9-HT et Sf21-HT les lignées respectivement issues, conformément à l'invention, des cellules Sf9 et Sf21. The subject of the present invention is also the insect cell cultures obtainable by a process according to the invention, as defined above, and the lines resulting from these cultures. These lines will be hereinafter referred to as HT lines, and designated by the denomination of the line of origin, followed by the letters HT. For example, or denominate Sf9-HT and Sf21-HT respectively derived lines, according to the invention, Sf9 and Sf21 cells.
Les lignées ainsi obtenues diffèrent des lignées-mères dont elles sont issues par leur nombre de chromosomes, qui est 2 fois plus élevé (endodiploïdie). Elles peuvent être maintenues en culture à 37 C, et se multiplier indéfiniment à cette température ; elles peuvent également être conservées sous forme congelée, et être remises en culture directement à 37 C. Elles conservent la possibilité de pousser et de se multiplier à 27 C (bien que plus lentement que les cellules dont elles sont issues), ainsi que la capacité de supporter la décongélation. The lines thus obtained differ from the parent lines from which they are derived by their number of chromosomes, which is twice as high (endodiploidy). They can be kept in culture at 37 C, and multiply indefinitely at this temperature; they can also be stored in frozen form, and be cultured directly at 37 C. They retain the ability to grow and multiply at 27 C (although more slowly than the cells from which they are derived), as well as the capacity to withstand thawing.
Les cellules conformes à l'invention sont permissives pour les mêmes baculovirus que les cellules mères dont elles sont issues. Dans des cultures de cellules conformes à l'invention, ces baculovirus se multiplient à 37 C et produisent des particules infectieuses. The cells according to the invention are permissive for the same baculoviruses as the parent cells from which they are derived. In cultures of cells according to the invention, these baculoviruses multiply at 37 C and produce infectious particles.
Les Inventeurs ont en outre constaté que des gènes d'intérêt insérés dans des baculovirus recombinants peuvent être exprimés à 37 C dans les cultures de cellules conformes à l'invention, et permettent d'obtenir des protéines fonctionnelles. Les cultures de cellules conformes à l'invention sont donc utilisables, de la même manière que des cultures des cellules dont elles sont issues, pour exprimer des gènes d'intérêt clonés dans des baculovirus. The inventors have furthermore found that genes of interest inserted into recombinant baculoviruses can be expressed at 37 ° C. in the cell cultures according to the invention, and make it possible to obtain functional proteins. The cell cultures in accordance with the invention can therefore be used, in the same way as cultures of the cells from which they originate, to express genes of interest cloned in baculoviruses.
La présente invention a pour objet un procédé d'expression d'au moins une protéine recombinante dans des cellules d'insecte, lequel procédé est caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est exprimée dans les cellules d'une culture conforme à l'invention. The present invention relates to a method for expressing at least one recombinant protein in insect cells, which method is characterized in that said recombinant protein is expressed in the cells of a culture according to the invention.
Selon un mode de mise en #uvre préféré du procédé conforme à l'invention, ladite protéine recombinante est exprimée à une température supérieure à 35 C, de préférence comprise entre 35 et 39 C. According to a preferred embodiment of the process according to the invention, said recombinant protein is expressed at a temperature above 35 C, preferably between 35 and 39 C.
Tous les vecteurs d'expression habituellement utilisables dans les lignées Sf21 et Sf9 peuvent également être utilisés pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cultures de cellules Sf21-HT et Sf9-HT conformes à l'invention. On peut notamment utiliser des vecteurs dans lesquels le gène d'intérêt à exprimer est placé sous contrôle d'un promoteur très précoce, comme le promoteur IE-I, d'un promoteur précoce, comme le promoteur<I>39K,</I> d'un promoteur tardif, comme le promoteur gp <I>67 ou</I> celui de la protéine de capside, ou d'un promoteur très tardif, comme celui de la polyédrine ou de la protéine P10. On peut également utiliser des promoteurs cellulaires capables de fonctionner à 37 C, tels que par exemple le promoteur Actine 3 de Bombyx mori (ver à soie) ou des promoteurs de cellules de mammifères. All the expression vectors that can usually be used in the Sf21 and Sf9 lines can also be used for the expression of genes of interest in cultures of Sf21-HT and Sf9-HT cells in accordance with the invention. It is especially possible to use vectors in which the gene of interest to be expressed is placed under the control of a very early promoter, such as the IE-I promoter, of an early promoter, such as the <I> 39K promoter, </ I > a late promoter, such as the gp <I> 67 promoter or that of the capsid protein, or a very late promoter, such as that of the polyhedrin or the P10 protein. It is also possible to use cell promoters capable of operating at 37 ° C., such as, for example, the Bombyx mori Actinol promoter (silkworm) or mammalian cell promoters.
On peut également utiliser des vecteurs du type multi-recombinant , dans lesquels 2 ou plusieurs gènes d'intérêt sont placés sous contrôle de 2 ou plusieurs promoteurs. Dans des cultures de cellules conformes à l'invention dérivées de la lignée monoclonale Sf9-HT, les promoteurs très précoces, précoces ou tardifs apparaissent comme plus actifs à 37 C que les promoteurs très tardifs (polyédrine ou P10) ; on pourra donc choisir le promoteur utilisé selon le niveau d'expression que l'on souhaite obtenir. It is also possible to use vectors of the multi-recombinant type, in which 2 or more genes of interest are placed under the control of 2 or more promoters. In cultures of cells according to the invention derived from the monoclonal line Sf9-HT, the very early, early or late promoters appear to be more active at 37 C than the very late promoters (polyhedrin or P10); we can choose the promoter used according to the desired level of expression.
Pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cultures de cellules conformes à l'invention, on peut également utiliser des vecteurs dérivés de baculovirus, tels que ceux décrits par exemple dans la Demande EP 0 638 647 aux noms de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE et du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE. For the expression of genes of interest in cell cultures in accordance with the invention, it is also possible to use vectors derived from baculoviruses, such as those described, for example, in application EP 0 638 647 in the name of the NATIONAL INSTITUTE AGRONOMIC RESEARCH and the NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de cultures de cellules conformes à l'invention, et d'utilisation de ces cultures pour l'expression de gènes clonés dans des baculovirus. EXEMPLE 1 : OBTENTION DE CULTURES DE CELLULES SE MULTIPLIANT <B>À</B> 37 C Les lignées cellulaires utilisées sont d'une part, les lignées Sf21(IPLB-SF-21) et Sf9(ATCC CRL 1711) issues du lépidoptère Spodoptera frugiperda, et d'autre part, à titre comparatif, la lignée S2 issue de la mouche Drosophila melanogaster, la lignée CB 1225 issue du moustique Aedes albopictus, et la lignée Mb, issue du lépidoptère Mamestra brassicae. The present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of obtaining cell cultures according to the invention, and of using these cultures for the expression of genes. cloned in baculoviruses. EXAMPLE 1: PRODUCTION OF CULTURES OF CELLS MULTIPLIANT <B> TO 37 C The cell lines used are, on the one hand, the Sf21 (IPLB-SF-21) and Sf9 (ATCC CRL 1711) lines derived from Lepidoptera Spodoptera frugiperda, and on the other hand, for comparison, the S2 line derived from the Drosophila melanogaster fly, the CB 1225 line from the Aedes albopictus mosquito, and the Mb line, from the Mamestra brassicae lepidopteran.
Les cellules des lignées de lépidoptères Sf21, Sf9, et Mb, et de la lignée S2 de Drosophile sont repiquées en milieu TC-100 (LIFE TECHNOLOGIES, INC.), supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal. The cells of lepidopteran lines Sf21, Sf9, and Mb, and of the S2 line of Drosophila are subcultured in TC-100 medium (LIFE TECHNOLOGIES, INC.), Supplemented with 5% fetal calf serum.
Les cellules de moustique CB 1225 sont entretenues dans le milieu de MITSUHASHI-MARAMOROSCH [Contrib. Boyce Thompson Inst., 22, 435-460 (1964)]. The mosquito cells CB 1225 are maintained in the middle of MITSUHASHI-MARAMOROSCH [Contrib. Boyce Thompson Inst., 22, 435-460 (1964)].
Des cultures de cellules Sf9 ou Sf21, ainsi que des cultures des cellules Mb, S2, et CB 1225 sont placées dans une étuve à 28 C ; la température est augmentée graduellement pendant quatre jours, jusqu'à 37 C. Les cellules sont maintenues à cette température et leur croissance est surveillée quotidiennement. Sf9 or Sf21 cell cultures, as well as cultures of Mb, S2, and CB1225 cells are placed in a 28 C oven; the temperature is gradually increased for four days, up to 37 C. The cells are maintained at this temperature and their growth is monitored daily.
Après une semaine à 37 C, seules les cellules issues des cultures Sf9 et Sf21 sont capables de survivre. Les cellules issues des lignées Mb, S2 et CB 1225 cessent toute croissance à partir d'une température de 30 C, et meurent à partir de 35 C. Des prélèvements des cultures issues des lignées Sf9 et Sf21 sont diluées dans du milieu frais à raison de 1/5e", et remis en culture à 37 C. Les lignées stables obtenues après plusieurs passages en culture dans ces conditions sont dénommées Sf9-HT et Sf21-HT. After one week at 37 C, only cells from cultures Sf9 and Sf21 are able to survive. The cells from Mb, S2 and CB 1225 lines cease all growth from a temperature of 30 C, and die from 35 C. Samples of cultures from Sf9 and Sf21 lines are diluted in fresh medium at a rate of The stable lines obtained after several passages in culture under these conditions are called Sf9-HT and Sf21-HT.
La croissance de la lignée Sf9-HT à 37 C et 28 C a été comparée à celle de la lignée mère Sf-9 à 28 C. Les courbes de croissance, qui sont représentées sur la figure 1, montrent qu'à 28 C, les cellules Sf9-HT <B>(O)</B> poussent moins vite (temps de doublement 33,6 heures) que les cellules Sf9 (0) (temps de doublement 26,4 heures). En revanche les cellules Sf9-HT à 37 C (A) poussent plus vite (temps de doublement 19,2 heures) que les cellules Sf9 à 28 C. The growth of the Sf9-HT line at 37 ° C. and 28 ° C. was compared with that of the Sf-9 mother line at 28 ° C. The growth curves, which are shown in FIG. 1, show that at 28 ° C. Sf9-HT <B> (O) </ B> cells grow less rapidly (doubling time 33.6 hours) than Sf9 (0) cells (doubling time 26.4 hours). On the other hand, Sf9-HT cells at 37 C (A) grow faster (doubling time 19.2 hours) than Sf9 cells at 28 C.
La phase stationnaire est atteinte plus rapidement (4 jours) et correspond à une densité cellulaire plus faible (1,2.106 cellules) dans le cas des cellules Sf9-HT que dans celui des cellules Sf9 (8 jours, et<B>2,7.106</B> cellules). The stationary phase is reached more rapidly (4 days) and corresponds to a lower cell density (1.2.106 cells) in the case of Sf9-HT cells than in that of Sf9 cells (8 days, and <B> 2.7.106 </ B> cells).
L'examen des cellules Sf9-HT au microscope montre qu'elles ont une morphologie normale ; cependant leur diamètre moyen est plus important que celui des cellules Sf9. L'analyse en@cytométrie de flux montre que le contenu en ADN des cellules Sf9-HT est 2 fois plus important que celui des cellules Sf9. Examination of Sf9-HT cells under the microscope shows that they have a normal morphology; however, their average diameter is larger than that of Sf9 cells. The flow cytometry analysis shows that the DNA content of the Sf9-HT cells is 2 times greater than that of the Sf9 cells.
L'analyse comparative des lipides membranaires des cellules Sf9 et Sf9-HT a été effectuée. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous.
Dans la lignée Sf9-HT, on observe une augmentation de la sphingomyéline et du phosphatidylinositol, et une diminution de la phosphatidylcholine et de la phosphatidyléthanolamine, ce qui entraîne une augmentation du rapport sphingomyéline/phosphatidylcholine. On observe également une augmentation globale du pourcentage d'acides gras saturés, principalement due à une augmentation de l'acide palmitique. In the Sf9-HT line, there is an increase in sphingomyelin and phosphatidylinositol, and a decrease in phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine, which leads to an increase in the sphingomyelin / phosphatidylcholine ratio. There is also an overall increase in the percentage of saturated fatty acids, mainly due to an increase in palmitic acid.
EXEMPLE <B>2</B> : MULTIPLICATION <B>DU</B> BACULOVIRUS ACMNPV, <B>ET</B> <B>EXPRESSION DES PROMOTEURS DANS DES CELLULES</B> SF9-HT <B>CULTIVÉES À 37 C</B> Des cultures de la lignée Sf9-HT ont été infectées par le baculovirus AcMNPV, à 28 C ou à 37 C, selon le protocole suivant Les cellules Sf9-HT sont reprises dans le milieu TC-100 utilisé à l'Exemple 1, sans sérum de veau foetal et réparties dans des boîtes neuves. Une heure après, lorsque les cellules adhérent au fond des boîtes de culture, le milieu de culture est éliminé et on ajoute l'inoculum viral, produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C, à raison de 10 unités virales infectieuses par cellule. Après une heure d'incubation à température ambiante, on ajoute du milieu complet, et l'on place les cultures à 28 C, ou à 37 C. Le cycle viral est observé en microscopie électronique. EXAMPLE <B> 2 </ B>: MULTIPLICATION <B> OF BACULOVIRUS ACMNPV, <B> AND </ b> <B> EXPRESSION OF PROMOTERS IN CELLS </ B> SF9-HT <B> CULTIVATED At 37 ° C., cultures of the Sf9-HT line were infected with baculovirus AcMNPV, at 28 ° C. or at 37 ° C., according to the following protocol. The Sf9-HT cells are taken up in the TC-100 medium used at Example 1, without fetal calf serum and distributed in new boxes. One hour later, when the cells adhere to the bottom of the culture dishes, the culture medium is removed and the viral inoculum, produced on Sf9 cells cultured at 28 ° C., is added at the rate of 10 infectious viral units per cell. After one hour of incubation at room temperature, complete medium is added, and the cultures are placed at 28 ° C. or at 37 ° C. The viral cycle is observed by electron microscopy.
72 heures après l'infection, on observe, dans les cellules Sf9-HT cultivées à 28 C, des particules virales présentes en grand nombre dans le noyau, ainsi que des polyèdres et des structures fibrillaires correspondant à la protéine P10. Dans les cellules à 37 C, en revanche, on ne distingue clairement que les particules virales intranucléaires. 72 hours after infection, in Sf9-HT cells cultured at 28 ° C., viral particles present in large numbers in the nucleus are observed, as well as polyhedra and fibrillar structures corresponding to the P10 protein. In cells at 37 C, on the other hand, only intranuclear viral particles are clearly distinguishable.
Dans les 2 cas, les cellules Sf9-HT sécrètent des particules virales infectieuses dans le milieu de culture ; dans le cas des cellules infectées cultivées à 37 C, le titre en particules virales infectieuses produites est 10 fois moindre qu'à 28 C. In both cases, Sf9-HT cells secrete infectious viral particles in the culture medium; in the case of infected cells cultured at 37 ° C., the titre in infectious viral particles produced is 10 times less than at 28 ° C.
Lorsque des particules virales sécrétées par les cellules Sf9-HT infectées cultivées à 37 C, sont utilisées comme inoculum pour un nouveau cycle d'infection virale dans des cellules Sf9-HT cultivées à 28 C, on observe dans ces dernières la formation de polyèdres et de structures fibrillaires ; en outre, le titre en particules virales infectieuses est identique à celui observé avec l'inoculum viral produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C. When viral particles secreted by infected Sf9-HT cells cultured at 37 ° C are used as an inoculum for a new cycle of viral infection in Sf9-HT cells cultured at 28 ° C., the polyhedra formation is observed in these cells. fibrillar structures; furthermore, the titre in infectious viral particles is identical to that observed with the viral inoculum produced on Sf9 cells cultured at 28 C.
La Figure 2 représente l'évolution du titre viral dans les cellules SF9-HT et Sf9 au cours des différents passages, à partir d'un même inoculum initial (10 unités virales infectieuses par cellule) obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C (#) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9 à 28 C, puis 4 passages successifs à 28 C avec l'inoculum du passage précédent obtenu à 28 C ; <B>(1)</B> inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9-HT à 37 C, puis 4 passages successifs à 37 C avec l'inoculum du passage précédent obtenu à 37 C ; (0) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9-HT cultivées à 28 C, puis 4 passages successifs à 28 C avec l'inoculum du passage précédent obtenu à 28 C ; (#) (témoin) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9 cultivées à 37 C puis 4 passages successifs à 37 C avec l'inoculum du passage précédent. Dans ce cas, on n'observe aucune réplication virale. FIG. 2 represents the evolution of the viral titer in the SF9-HT and Sf9 cells during the different passages, from the same initial inoculum (10 infectious viral units per cell) obtained on Sf9 cells cultured at 28 ° C. ( #) initial inoculum obtained on Sf9 cells cultured at 28 C; passage on Sf9 cells at 28 C, then 4 successive passages at 28 C with the inoculum of the previous passage obtained at 28 C; <B> (1) </ B> initial inoculum obtained on Sf9 cells cultured at 28 C; passage on Sf9-HT cells at 37 C, then 4 successive passages at 37 C with the inoculum of the previous passage obtained at 37 C; (0) initial inoculum obtained on Sf9 cells cultured at 28 C; passage on Sf9-HT cells cultured at 28 C, then 4 successive passages at 28 C with the inoculum of the previous passage obtained at 28 C; (#) (control) initial inoculum obtained on Sf9 cells cultured at 28 C; passage on Sf9 cells cultured at 37 C and 4 successive passages at 37 C with the inoculum of the previous passage. In this case, no viral replication is observed.
Lorsque des particules virales sécrétées par les cellules Sf9-HT infectées cultivées à 37 C, sont utilisées comme inoculum pour un nouveau cycle d'infection virale dans des cellules Sf9-HT ou Sf9 cultivées à 28 C, on observe dans ces dernières la formation de polyèdres et de structures fibrillaires ; en outre, le titre en particules virales infectieuses est identique à celui observé avec l'inoculum viral produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C. When virus particles secreted by infected Sf9-HT cells cultured at 37 ° C are used as inoculum for a new cycle of viral infection in Sf9-HT or Sf9 cells cultured at 28 ° C., the latter is observed in polyhedra and fibrillar structures; furthermore, the titre in infectious viral particles is identical to that observed with the viral inoculum produced on Sf9 cells cultured at 28 C.
Le profil d'expression des gènes des baculovirus infectant ces cultures de cellules est différent à 28 C et à 37 C, comme le montrent les Figures 3a à 3f, qui illustrent la comparaison des cinétiques d'expression dans les cellules Sf9 à 28 C () , et à 37 C (-) ou dans les cellules Sf9-HT à 28 C (M) , et à 37 C des ARN messagers correspondant à des protéines très précoces (IE1), précoces (39K), tardives (gp67 et vp39) ou très tardives (polyédrine et P10). The gene expression profile of baculoviruses infecting these cell cultures is different at 28 C and 37 C, as shown in Figures 3a to 3f, which illustrate the comparison of expression kinetics in Sf9 cells at 28 C ( ), and at 37 C (-) or in the Sf9-HT cells at 28 C (M), and at 37 C of the messenger RNA corresponding to very early (IE1), early (39K), late (gp67 and vp39) proteins. ) or very late (polyhedrin and P10).
En abscisse, le temps de culture après infection (heures) ; en ordonnée, la quantité d'ARNm (exprimée en cpm) pour les gènes des protéines IE1 (3a), 39K (3b), gp67 (3c), vp39 (3d), P10 (3e), et polyédrine (ph) (3f), à 28 C et 37 C. Ces ARNm sont extraits et dosés en utilisant des sondes spécifiques d'ARNc marquées au 32P sur les résidus C, obtenues à l'aide du KIT RIBOPROBE PROMEGA. On the abscissa, the culture time after infection (hours); on the ordinate, the amount of mRNA (expressed in cpm) for the genes of proteins IE1 (3a), 39K (3b), gp67 (3c), vp39 (3d), P10 (3e), and polyhedrin (ph) (3f) ), at 28 ° C and 37 ° C. These mRNAs are extracted and assayed using 32 P-labeled cDNA specific probes on the C residues, obtained using the KIT RIBOPROBE PROMEGA.
Dans le cas des cellules Sf9 : à 28 C, 24 heures après l'infection, les ARN messagers principalement présents sont ceux des gènes gp <I>67,</I> ie1, vp39 et<I>39k ;</I> à partir de 48 heures après l'infection, les ARN messagers les plus exprimés sont ceux des gènes très tardifs (polyédrine et<I>P10) ;</I> à 37 C on n'observe aucune expression des ARNm, à l'exception d'une faible expression de l'ARNm <I>39k.</I> In the case of Sf9 cells: at 28 C, 24 hours after infection, the messenger RNAs mainly present are those of the gp <I> 67, </ I> ie1, vp39 and <I> 39k; </ I> genes. from 48 hours after infection, the most expressed messenger RNAs are those of the very late genes (polyhedrin and <I> P10); </ I> at 37 ° C., no expression of the mRNAs is observed at except for a low expression of mRNA <39k. </ i>
Dans le cas des cellules Sf9-HT infectées à 37 C, l'expression des gènes ie1, <I>39K,</I> gp67 et Vp39 est diminuée, avec seulement 6, 20, 20 et 30% d'expression à 24 h post-infection, par rapport à ce que l'on observe à 28 C avec les cellules Sf9. Quant à l'expression des gènes très tardifs polyédrine et<I>P10,</I> elle est seulement de 15 à 20% (à 24 heures). In the case of Sf9-HT cells infected at 37 C, the expression of the genes ie1, <I> 39K, </ I> gp67 and Vp39 is decreased, with only 6, 20, 20 and 30% expression at 24 h post-infection, compared to that observed at 28 C with Sf9 cells. As for the expression of the very late genes polyhedrin and <I> P10, </ I> it is only 15 to 20% (at 24 hours).
Bien que les productions des ARNm des gènes polyédrine et<I>P10</I> apparaissent faibles en valeurs relatives (surtout à 48 h), elles sont cependant du même ordre de grandeur que ce que l'on observe pour les gènes iel et<I>39K.</I> Although the mRNA productions of the polyhedrin and <I> P10 </ I> genes appear low in relative values (especially at 48 h), they are nevertheless of the same order of magnitude as that observed for the iel genes and <I> 39K. </ I>
En effet, les sondes utilisées pour mesurer la synthèse des ARN exprimés sous le contrôle des promoteurs <I>P10</I> et iel sont de taille comparable (ie1 278bp/P10 233bp). Cependant, leur contenu en résidus C est cependant plus faible pour<I>P10</I> (70 pour iel et 44 pour P10). De même, les sondes polyédrine et<I>39K</I> sont de taille comparable (513bp pour la sonde<I>39K</I> et 460 pour la sonde polyédrine), mais le contenu en résidus C est respectivement de 104 pour la sonde<I>39K</I> et de 125 pour la sonde polyédrine). Ainsi, à 24 heures post-infection, les gènes !e1, <I>P10</I> et polyédrine sont transcrits avec la même efficacité ; et le gène<I>39K</I> est le mieux exprimé dans ces conditions. Indeed, the probes used to measure RNA synthesis expressed under the control of the <I> P10 </ I> and iel promoters are of comparable size (ie1 278bp / P10 233bp). However, their residue content C is however lower for <I> P10 </ I> (70 for iel and 44 for P10). Similarly, the polyhedrin and <I> 39K probes are of comparable size (513bp for the <I> 39K </ I> probe and 460 for the polyhedrin probe), but the C residues content is 104 respectively. for the <I> 39K </ I> probe and 125 for the polyhedrin probe). Thus, at 24 hours post-infection, the genes! E1, <I> P10 </ I> and polyhedrin are transcribed with the same efficiency; and the <I> 39K </ I> gene is best expressed under these conditions.
EXEMPLE 3 : MULTIPLICATION DU BACULOVIRUS ACMNPV DANS DES CELLULES SF21-HT CULTIVÉES À 37 C Une culture de cellules Sf21-HT capables de se multiplier à 37 C, a été infectée par le baculovirus AcMNPV selon le protocole indiqué à l'Exemple 2 ci- dessus. Le cycle viral a été observé en microscopie électronique dans les cellules cultivées à 27 C, et celles cultivées à 37 C. EXAMPLE 3: Multiplication of ACMNPV Baculovirus in Cultured SF21-HT Cells at 37 ° C. A culture of Sf21-HT cells capable of multiplication at 37 ° C. was infected with AcMNPV baculovirus according to the protocol indicated in Example 2 above. above. The viral cycle was observed by electron microscopy in the cells cultured at 27 C, and those cultured at 37 C.
72 heures après l'infection, l'aspect des cellules Sf21-HT infectées cultivées à 27 C est identique à celui des cellules Sf9-HT cultivées dans les mêmes conditions, décrit à l'exemple 2. La majeure partie des cellules Sf21-HT infectées cultivées à 37 C a également le même aspect que celui des cellules Sf9-HT cultivées dans les mêmes conditions. Cependant, on observe en outre la présence de polyèdres dans 1 à 2% environ des cellules Sf21-HT. 72 hours after infection, the appearance of infected Sf21-HT cells cultured at 27 C is identical to that of Sf9-HT cells cultured under the same conditions, described in Example 2. The majority of Sf21-HT cells Infected cultures cultured at 37 C also has the same appearance as that of Sf9-HT cells grown under the same conditions. However, the presence of polyhedra in about 1 to 2% of Sf21-HT cells is also observed.
EXEMPLE 4 : EXPRESSION DANS DES CELLULES SF9-HT CULTIVÉES À 37 C D'UN GÈNE HÉTÉROLOGUE CLONÉ DANS UN BACULOVIRUS. EXAMPLE 4 EXPRESSION IN SF9-HT CELLS CULTIVATED AT 37 C OF A HETEROLOGOUS GENE CLONED IN A BACULOVIRUS
Le gène lacZ codant pour la (3-galactosidase a été placé sous contrôle du promoteur du gène de la protéine P10, ou bien sous contrôle du promoteur du gène de la polyédrine, dans des baculovirus recombinants issus du virus AcMNPV. The lacZ gene encoding β-galactosidase was placed under the control of the P10 protein gene promoter, or under the control of the polyhedrin gene promoter, in recombinant baculoviruses derived from the AcMNPV virus.
Des cultures de cellules Sf9-HT capables de se multiplier à 37 C, ont été infectées par l'un ou l'autre de ces baculovirus recombinants, selon le même protocole que celui indiqué ci-dessus pour le baculovirus AcMNPV. Sf9-HT cell cultures capable of multiplying at 37 ° C. were infected with one or other of these recombinant baculoviruses, according to the same protocol as that indicated above for the AcMNPV baculovirus.
Après 3 jours de culture à 37 C, l'activité (3- galactosidase est révélée dans les cellules, en utilisant comme substrat chromogène, le X-Gal (5-bromo-4-chloro-3- indoyl-(3-D-galactopyranoside) et les cultures sont observées au microscope. After 3 days of culture at 37 [deg.] C., the β-galactosidase activity is revealed in the cells, using X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl) (3-D-) as the chromogenic substrate. galactopyranoside) and the cultures are observed under a microscope.
Dans le cas du promoteur du gène de la protéine P10, une proportion importante des cellules (environ 95%) présente une coloration bleue, indiquant l'expression de (3-galactosidase active. In the case of the P10 protein gene promoter, a significant proportion of the cells (approximately 95%) show a blue color, indicating the expression of active β-galactosidase.
Dans le cas du promoteur du gène de la polyédrine environ 5% des cellules présentent une coloration bleue. In the case of the promoter of the polyhedrin gene, about 5% of the cells are blue in color.
- Immunoglobulines Un baculovirus recombinant exprimant les chaînes lourdes et légères d'une immunoglobuline humaine [POUL et al., Eur. J. Immunol., 25, 2005-2009, (1995)] a été utilisée pour infecter une culture de cellules conformes à l'invention. Au bout de 4 jours de culture à 37 C, on récupère dans le surnageant des cultures jusqu'à 2mg/1 d'anticorps fonctionnels (soit environ 2mg d'anticorps pour 5.10$ cellules).Immunoglobulins A recombinant baculovirus expressing the heavy and light chains of a human immunoglobulin [POUL et al., Eur. J. Immunol., 25, 2005-2009, (1995)] was used to infect a cell culture according to the invention. After 4 days of culture at 37 [deg.] C., cultures of up to 2 mg / l of functional antibodies (ie approximately 2 mg of antibody per 5 × 10 6 cells) are recovered in the supernatant.
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Patent Citations (1)
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