FR2789088A1 - Moyens pour induire ou augmenter l'immunogenicite de cellules de leucemies aigues myeloides - Google Patents
Moyens pour induire ou augmenter l'immunogenicite de cellules de leucemies aigues myeloides Download PDFInfo
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Abstract
L'invention vise un procédé pour induire, ou augmenter, l'immunogénicité de cellules LAM, comprenant la mise en contact, notamment par incubation, des cellules LAM avec des composés capables de conférer aux cellules leucémiques des phénotypes et/ou des fonctions de cellules non tumorales, ces composés comprenant au moins un ligand de CD40, un facteur de croissance desdites cellules, tel que GM-CSF, et une cytokine telle que IL-4, dans des conditions permettant la culture des cellules. Application notamment à la fabrication de médicaments anti-LAM.
Description
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La présente invention est relative à des moyens permettant d'induire, ou d'augmenter, l'immunogénicité de cellules LAM (leucémies aiguës myéloïdes), tout en conservant les caractéristiques leucémiques de ces cellules, et notamment leurs caractéristiques antigéniques.
L'un des problèmes techniques posés par les cellules tumorales résulte du fait qu'elles peuvent présenter des antigènes tumoraux à leurs surfaces, mais qu'elles sont dépourvues de capacités co-stimulatrices. Elles ne sont donc pas capables de présenter ces antigènes de manière appropriée, et par là même, n'activent pas les lymphocytes T : lesystème immunitaire ne parvient pas alors à répondre efficacement à la prolifération tumorale.
Parmi les stratégies qui se sont développées pour répondre à cette situation, a notamment été envisagée l'identification de peptides antigéniques, et leur administration vaccinale sous forme soluble, ou sous forme associée (fusion, transfection) à des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles (CPA) telles que les cellules dendritiques (DC). Avec les moyens de l'art antérieur, cette stratégie restait toutefois techniquement insatisfaisante au moins à deux niveaux :
1) les cellules tumorales n'étant pas immunogènes, l'identification d'antigènes tumoraux restait problèmatique. Dans le cas des LAM en particulier, l'existence même de tels antigènes n'avait d'ailleurs pas encore été démontrée,
2) la solution préconisée d'administrer un ou plusieurs antigènes tumoraux identifiés pourrait permettre à l'organisme de fournir une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre ce (ou ces) antigène(s) particuliers), mais elle n'écarte pas complètement la possibilité que des cellules tumorales échappent par ailleurs à cette réponse par l'intermédiaire d'autres antigènes non précisément identifiés, ou non pris en compte spécifiquement.
1) les cellules tumorales n'étant pas immunogènes, l'identification d'antigènes tumoraux restait problèmatique. Dans le cas des LAM en particulier, l'existence même de tels antigènes n'avait d'ailleurs pas encore été démontrée,
2) la solution préconisée d'administrer un ou plusieurs antigènes tumoraux identifiés pourrait permettre à l'organisme de fournir une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre ce (ou ces) antigène(s) particuliers), mais elle n'écarte pas complètement la possibilité que des cellules tumorales échappent par ailleurs à cette réponse par l'intermédiaire d'autres antigènes non précisément identifiés, ou non pris en compte spécifiquement.
La stratégie proposée par les inventeurs consiste, au contraire, à transformer les cellules tumorales elles-mêmes, c'est-à-dire des cellules qui expriment l'ensemble des antigènes possibles, pour leur faire acquérir non
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seulement un phénotype, mais également l'ensemble des fonctions de CPA, et de DC notamment.
La présente invention fournit ainsi des moyens (procédés et kits) permettant d'induire une immunogénicité sur des cellules LAM (leucémies aiguës myéloïdes, de sous-type LAMO, LAM1, LAM2, LAM3, LAM4, LAM5, LAM6, LAM7 selon la classification FAB Française-Américaine-Britannique), et de cellules LAM2 (leucémie aiguë myéloblastique avec maturation), LAM3 (leucémie aiguë promyélocytaire), LAM4 (leucémie aiguë myélomonocytaire), LAM5 (leucémie aiguë monocytaire) en particulier, ou bien permettant d'augmenter l'immunogénicité de telles cellules LAM de manière efficace (c'est- à-dire de manière à ce que les cellules LAM traitées soient capables de provoquer une réaction immunitaire significative).
De manière remarquable, les moyens selon l'invention sont rapidement efficaces, et sont adaptés à l'homme.
Les moyens selon l'invention permettent ainsi notamment l'identification des antigènes LAM, la fabrication de médicaments anti-LAM adaptés à l'homme ainsi qu'une méthode permettant de prévoir et/ou ajuster l'efficacité de ces médicaments.
Un premier aspect de l'invention est donc relatif à un procédé pour induire ou augmenter l'immunogénicité de cellules LAM et aux cellules traitées ainsi obtenues ainsi qu'à leurs applications biologiques.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact, notamment par incubation, des cellules LAM avec des composés capables de conférer aux cellules leucémiques des phénotypes et/ou des fonctions de cellules non tumorales, ces composés comprenant au moins un ligand de CD40, un facteur de croissance desdites cellules, tel que GM-CSF, et une cytokine telle que IL-4, dans des conditions permettant la culture des cellules.
De manière avantageuse, l'étape de mise en contact est réalisée par incubation dans des conditions adaptées à la survie des cellules LAM. La nature et les intensités des paramètres de telles conditions de culture peuvent être
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choisies et ajustées par l'homme du métier à l'aide de ses connaissances dans le domaine des cultures cellulaires, et des cultures de cellules leucémiques en particulier, et en regard du cas particulier à traiter. Des exemples de telles conditions sont donnés dans la partie "exemples" qui suit. On peut notamment citer une température de 37 C environ, et/ou une atmosphère comprenant du C02, par exemple à 5% environ, et/ou un milieu de culture tel que le milieu RPMI 1640, le cas échéant enrichi en sérum, par exemple à 5% environ.
Une telle incubation peut optionnellement être accompagnée d'une élimination des cellules non adhérentes.
Le (ou les) ligand (s) CD40 mis en oeuvre peut (peuvent) être présent(s) sous forme soluble ou sous forme associée à une cellule. Un ligand de CD40 peut par exemple correspondre à CD40L (également appelé CD 154) disponible sous forme soluble chez Immunex, et sous forme membranaire (cellules L-CD40L) chez Schering-Plough.
Sous une forme libre, le (ou les) ligand (s) CD40 est (sont) avantageusement présent(s) à une concentration de 150 à 1150 ng/ml environ pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1 à 0,5x106 cellules/ml. Sous forme associée, le (ou les) ligand (s) CD40 est (sont) avantageusement présents) à une concentration de l'ordre de 0,05x106 cellules associées/ml pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1à 0,5x106 cellules/ml.
Le (ou les) facteur (s) croissance des cellules LAM, tel que GM-CSF, est (sont) avantageusement présent(s) à une concentration de l'ordre de 50 à 100 ng/ml environ pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1à 0,5x106 cellules/ml.
La (ou les) cytokine (s), que IL-4, est (sont) avantageusement présente(s) à une concentration de l'ordre de 10 ng/ml environ pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1à 0,5x106 cellules/ml.
Les cellules LAM mises en oeuvre dans l'étape d'incubation peuvent notamment être obtenues par prélèvement sur un patient LAM, et par
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prélèvement sanguin en particulier.
De manière remarquable, le procédé selon l'invention est efficace très rapidement : en effet, il ne nécessite pas une étape de pré-culture. La mise en contact peut ainsi être limitée à moins de 6 jours, préférablement à moins de 4 jours, par exemple à 3 jours.
Selon une disposition avantageuse de l'invention, l'étape de mise en contact se traduit par l'acquisition par lesdites cellules LAM d'un phénotype de type CPA, et de type DC en particulier. La nature des éléments correspondant à un tel phénotype font partie des connaissances générales de l'homme du métier, qui dispose également de moyens pour déterminer leur expression. Des exemples de tels éléments de phénotype et de moyens d'analyse sont par ailleurs donnés dans les exemples qui suivent.
Avantageusement, on observe l'acquisition par les cellules LAM d'un phénotype de type CPA mature, et de type DC mature en particulier. La population de cellules LAM traitées présente alors globalement un phénotype CD la' après traitement.
Au niveau de la population des cellules LAM, on peut également constater une régulation négative de la molécule CD 14. La population des cellules LAM présente alors globalement un phénotype CD 14- après traitement.
En outre, on peut observer également une régulation positive de la molécule CD83. La population des cellules LAM présente alors globalement un phénotype CD83+ après traitement.
Les cellules LAM peuvent également présenter à l'issue de l'étape de mise en contact, une régulation positive d'au moins une molécule d'adhérence, telle que CD54, CD58, et/ou d'au moins une molécule du CMH (Complexe Majeur d'histocompatibilité), telle qu'une molécule du CMH de classe I, une molécule du CMH de classe II, l'isoforme DQ, et/ou d'au moins une molécule de costimulation, telle que CD80, CD86.
De manière avantageuse, l'étape de mise en contact se traduit par une régulation positive de l'ensemble de ces molécules. La population de cellules
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LAM présente alors globalement un phénotype CD54+, CD58+, CMH classe I+, CMH classe Il+, DQ+, CDSO+, CD86+ après traitement.
Les différentes populations de cellules LAM évoquées ci-dessus, telles qu'obtenues par le procédé de l'invention, entrent également, en tant que produits nouveaux, dans le champ de l'invention. Il s'agit de cellules reprogrammées pour acquérir une nouvelle carte d'identité.
Selon une disposition remarquable de l'invention, les cellules LAM sont caractérisées en ce qu'elles possèdent des fonctions de CPA, et de DC en particulier. La nature de telles fonctions fait partie des connaissances générales de l'homme du métier, qui dispose également de moyens pour déterminer leur existence. Des exemples de telles fonctions et de moyens d'analyse sont par ailleurs donnés dans les exemples qui suivent.
Avantageusement, les cellules LAM sont capables de stimuler la prolifération de lymphocytes T CD4+. De nombreux moyens permettant de vérifier l'acquisition d'une telle capacité sont à la disposition de l'homme du métier, et des exemples en sont donnés dans la partie "exemples" qui suit.
Les cellules LAM traitées sont notamment capables d'induire la différenciation de lymphocytes T CD8+ en lymphocytes T cytotoxiques (CTL).
L'acquisition de cette capacité à induire la différenciation de CTL, représente l'efficacité maximale du procédé, elle peut être obtenue en combinant les trois composants "ligand de CD40, facteur de croissance cellulaire tel que GM-CSF, et cytokine telle que IL-4". De nombreux moyens permettant de vérifier l'acquisition d'une telle capacité sont à la disposition de l'homme du métier, et des exemples en sont donnés dans la partie "exemples" qui suit (lyse de cibles, lyse spécifique, production d'IFNy).
De manière particulièrement avantageuse, les CTL induits à l'aide des moyens selon l'invention sont capables de lyser spécifiquement des cellules correspondant aux cellules LAM avant traitement.
Pour une telle induction de CTL, un ratio (lymphocytes T CD8+ / cellules T AM) avantageux -et supérieur à 5/1
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Selon une disposition de l'invention, lesdites cellules LAM conservent des caractéristiques leucémiques, telles que d'éventuelles anomalies chromosomiques. De manière avantageuse, lesdites cellules LAM conservent leurs caractéristiques antigéniques (conservation des antigènes tumoraux et/ou de complexe d'histocompatibilité qu'elles exprimaient avant traitement).
De manière également remarquable, ladite acquisition de phénotype CPA, et DC en particulier, et/ou ladite acquisition de fonctions de CPA, et de DC en particulier, et/ou ladite conservation de caractéristiques leucémiques et/ou antégéniques est réalisée (sont réalisées) pour une majorité de cellules LAM mises en contact, et pour un pourcentage moyen supérieur à 75% d'entre elles environ.
Les propriétés conférées aux cellules LAM traitées sont avantageusement mises à profit, selon l'invention, dans diverses applications biologiques.
Les moyens selon l'invention peuvent être ainsi pour la fabrication de médicaments anti-LAM adaptés à l'homme ou à l'animal. La présente invention vise donc également : - l'utilisation d'une composition capable de conférer aux cellules leucémiques des phénotypes et/ou des fonctions de cellules non tumorales, cette composition renfermant au moins un ligand de CD40, un facteur de croissance de cellules leucémiques, tel que GM-CSF, et une cytokine, telle que IL-4, pour la fabrication d'un médicament anti-LAM, et en particulier anti-LAM2 et/ou antiLAM3 et/ou anti-LAM4 et/ou anti-LAM5, administrable à l'homme ou l'animal, - l'utilisation de cellules LAM traitées telles que définies ci-dessus, notamment telles qu'obtenues avec le procédé selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament anti-LAM, et en particulier anti-LAM2 et/ou antiLAM3 et/ou anti-LAM4 et/ou anti-LAM5, administrable à l'homme ou l'animal, et - l'utilisation de lymphocytes cytotoxiques (CTL) tels que produits à l'aide de cellules LAM telles qu'obtenues avec le procédé selon l'invention pour la
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fabrication d'un médicament anti-LAM, et en particulier anti-LAM2 et/ou antiLAM3 et/ou anti-LAM4 et/ou anti-LAM5, administrable à l'homme ou l'animal.
La présente invention fournit également, selon un deuxième aspect, des moyens (procédé et kit) permettant d'identifier les antigènes de cellules LAM.
Elle fournit en particulier un procédé pour l'identification d'un antigène LAM, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en #uvre de cellules LAM traitées telles que définies ci-dessus, en particulier telles qu'obtenues avec le procédé selon l'invention, de manière à identifier au moins une molécule à la surface de ces cellules qui participe à une réaction immunitaire. L'antigène identifié peut être un antigène tumoral ou un antigène de complexe d'histocompatibilité.
Pour la mise en oeuvre de ce procédé, on utilise avantageusement des kits comprenant les réactifs et composés nécessaires pour l'identification des antigènes, avec une notice d'utilisation.
Un mode de mise en oeuvre du procédé d'identification selon l'invention peut en outre comprendre la constitution d'une banque ARN des cellules LAM traitées (constitution d'une banque d'expression par clonage des ARN des cellules LAM dans un vecteur eucaryote). La banque ARN LAM peut alors être mise en contact avec des lymphocytes, et des lymphocytes T CD8+ en particulier.
De tels lymphocytes T CD8+ proviennent avantageusement du même patient que les cellules LAM avant traitement. Un ARN de la banque est alors identifié comme correspondant à un antigène LAM lorsque le clone lui correspondant dans la banque est capable d'induire la différenciation des lymphocytes T CD8+ en CTL, et/ou d'induire la production par les lymphocytes T CD8+ d'interféron gamma et/ou de TNFa. A partir de l'identification d'un ARN correspondant à un antigène LAM, l'homme du métier peut, à l'aide de ses connaissances et des moyens de l'art, séquencer cet ARN, obtenir les séquence ADNc, ADN, protéique, (poly) peptidique correspondantes.
Un antigène tel qu'identifié à l'aide du procédé selon l'invention est, de manière particulièrement avantageuse, utilisé pour la fabrication d'un médicament anti-LAM, et anti-LAM2, et/ou anti-LAM3. et/ou anti-LAM4 et/ou
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anti-LAM5 en particulier. La présente demande vise en particulier une telle utilisation pour la fabrication d'un vaccin anti-LAM préventif ou thérapeutique.
La composition vaccinale entre également, en tant que telle, dans la portée de l'invention. Cette composition renferme le principe actif vaccinal avec les adjuvants habituels pharmaceutiquement acceptables.
Selon encore un autre aspect, la présente invention fournit également des moyens (méthode et kit) permettant la prévision et/ou l'ajustement de l'efficacité sur un patient donné d'un médicament tel que fabriqué à l'aide d'une utilisation quelconque selon l'invention. Une telle méthode de prévision et/ou d'ajustement comprend l'analyse de l'expression CD40 de la population cellulaire leucémique dudit patient. Cette méthode de prévision permet, outre une décision thérapeutique adaptée à chaque cas de leucémie considérée d'ajuster les doses réactives et/ou la posologie dudit médicament au patient auquel ce médicament est destiné. Les kits pour la mise en oeuvre de cette méthode font également partie de l'invention.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants dans lesquels, il est fait référence aux figures suivantes : - les figures lA, 1B, 1C, 1D représentent des clichés de microscopie (coloration May-Grünwald-Giemsa) de cellules leucémiques après différents traitements selon l'invention (GM-CSF + IL-4 ; GM-CSF+ IL-4 + CD40L) de trois jours, - les figures 2A, 2B représentent des graphes illustrant, en fonction du nombre de jours de traitement, la régulation négative de CD 14 (figure 2A) sur des cellules leucémiques traitées selon l'invention par GM-CSF et IL-4, et illustrant le phénotype globalement CD1a- des populations de cellules leucémiques traitées selon l'invention, - les figures 3A, 3B, 3C illustrent l'expression de CD83 (cytométrie en flux) sur les cellules leucémiques en fonction du traitement effectué selon l'invention,
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- les figures 4A, 4B, 4C, 4D illustrent l'expression de marqueurs de surface DC par les cellules leucémiques après différents traitements selon l'invention : CD86 (figure 4A), CMH Classe 1 (figure 4B), isoforme DQ (figure 4C), analyse de paramètres (CD86, CD83, CD54) en dispersion (figure 4D), - la figure 5 illustre la conservation des anomalies génétiques par les cellules leucémiques traitées selon l'invention (hybridation à l'aide de sondes à ADN), - les figures 6A et 6B illustrent la production d'IL-12 (figure 6A) et d'IL-8 (figure 6B) par différentes LAM5 traitées selon l'invention et par les témoins MoDC immatures et matures, - les figures 7A, 7B1, 7B2,7B3, 7C illustrent la stimulation de prolifération de lymphocytes T CD4+ obtenue à l'aide de cellules leucémiques ayant subi différents traitements (cpm en fonction du nombre de cellules stimulatrices) par comparaison aux témoins PBMC, monocytes activés, MoDC immatures et matures, - la figure 8 illustre la corrélation entre capacité à stimuler la prolifération CD4+ et acquisition du phénotype CD83+ par les cellules leucémiques traitées selon l'invention (incorporation de thymidine 3H en cpm en fonction du nombre de cellules stimulatrices utilisées), - les figures 9A, 9B, 9C illustrent la capacité des cellules leucémiques traitées selon l'invention à induire la différenciation de CTL : de lyse de P815 en fonction du ratio E/T (cellules effectrices / cellules stimulatrices) en figure 9A, % de lyse spécifique en fonction du ratio E/T en figure 9B, et production d'IFNy par les CTL induits en fonction du traitement subi par les cellules leucémiques inductrices (GM-CSF à gauche ; GM-CSF/IL-4/CD40L à droite) en figure 9C, et - les figures 10A et 10B illustrent la capacité de CTL induits d'un patient de détruire les propres cellules leucémiques de celui-ci.
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EXEMPLES
MATERIELS ET METHODES
Echantillons issus de patients, cellules mononuclées de sang périphérique et cellules de sang de cordon
Des échantillons de cellules leucémiques ont été obtenus, après consentement informé, de patients avant chimiothérapie. Les blastes LAM5 analysés dans cette étude (cf. Tableau 1 ci-dessous) proviennent de 10 patients traités à Marseille à l'Institut Paoli-Calmettes (9 adultes de 18 à 71 ans) ou à l'hôpital Timone (1 enfant) entre 1994 et 1997. Toutes les cellules monocytaires observées sur les frottis sanguins ont présenté au diagnostic un phénotype leucémique, et les cellules leucémiques représentaient 57 à 95% des cellules circulantes. Six des dix leucémies ont présenté des cellules sanguines avec des anomalies cytogéniques, dont 3 concernaient le chromosome 8. Les trois patients les plus âgés sont morts après la première induction avant qu'une évaluation précise de leur état soit possible. Cinq patients ont présenté une rémission complète après la première induction par chimiothérapie, et deux patients après la seconde induction par chimiothérapie. Pour cette étude, nous avons sélectionné celles des populations de blastes leucémiques qui présentaient plus de 50% de cellules vivantes après 5 jours de culture in vitro. La morphologie cellulaire a été analysée après trois jours de culture.
MATERIELS ET METHODES
Echantillons issus de patients, cellules mononuclées de sang périphérique et cellules de sang de cordon
Des échantillons de cellules leucémiques ont été obtenus, après consentement informé, de patients avant chimiothérapie. Les blastes LAM5 analysés dans cette étude (cf. Tableau 1 ci-dessous) proviennent de 10 patients traités à Marseille à l'Institut Paoli-Calmettes (9 adultes de 18 à 71 ans) ou à l'hôpital Timone (1 enfant) entre 1994 et 1997. Toutes les cellules monocytaires observées sur les frottis sanguins ont présenté au diagnostic un phénotype leucémique, et les cellules leucémiques représentaient 57 à 95% des cellules circulantes. Six des dix leucémies ont présenté des cellules sanguines avec des anomalies cytogéniques, dont 3 concernaient le chromosome 8. Les trois patients les plus âgés sont morts après la première induction avant qu'une évaluation précise de leur état soit possible. Cinq patients ont présenté une rémission complète après la première induction par chimiothérapie, et deux patients après la seconde induction par chimiothérapie. Pour cette étude, nous avons sélectionné celles des populations de blastes leucémiques qui présentaient plus de 50% de cellules vivantes après 5 jours de culture in vitro. La morphologie cellulaire a été analysée après trois jours de culture.
Des lymphocytes naïfs ont été obtenus à partir d'échantillons de sang de cordon. La fraction mononucléaire de tous ces échantillons a été isolée par centrifugation selon le gradient de densités Ficoll-Hypaque, et congelée sous forme de cellules vivantes dans l'azote liquide.
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Tableau I: Paramètres cliniques et paracliniques de 10 leucémies aiguës monoblastiques testées
<tb> Leucémie <SEP> Classification <SEP> caryotype <SEP> % <SEP> cellules <SEP> âge/sexe <SEP> rémission <SEP> allo/auto/greff <SEP> statut <SEP> survie
<tb> FAB <SEP> leucémiques <SEP> complète <SEP> après <SEP> e <SEP> actuel
<tb> périphériques <SEP> la <SEP> première
<tb> induction
<tb> LAMa <SEP> LAM5a <SEP> inv <SEP> 8 <SEP> 79 <SEP> 60/2 <SEP> oui <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMb <SEP> LAM5a <SEP> XX <SEP> 57 <SEP> 43/2 <SEP> oui <SEP> non <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> LAMc <SEP> LAM5b <SEP> inv <SEP> 16, <SEP> +22 <SEP> 97 <SEP> 41/2 <SEP> oui <SEP> autogreffe <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> LAMd <SEP> LAM5 <SEP> 8+ <SEP> 95 <SEP> 71/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMe <SEP> LAM5a <SEP> XY <SEP> 84 <SEP> 48/1 <SEP> oui <SEP> allogreffe <SEP> mort
<tb> et <SEP> cosinophylie
<tb> LAMf <SEP> LAM5a <SEP> 7-, <SEP> 8+ <SEP> 95 <SEP> 70/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMg <SEP> LAM5a <SEP> XX <SEP> 93 <SEP> 1/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> LAMh <SEP> LAM5b <SEP> t( <SEP> 1 <SEP> Op, <SEP> 11q, <SEP> 20q) <SEP> 62 <SEP> 74/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMi <SEP> LAM5a <SEP> XX <SEP> 79 <SEP> 18/2 <SEP> oui <SEP> autogreffe <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> et <SEP> cosinophylie
<tb>
<tb> LAMj <SEP> LAM5a <SEP> t <SEP> (9p, <SEP> llq, <SEP> 16q) <SEP> 91 <SEP> 36/1 <SEP> non <SEP> non <SEP> PR <SEP> vivant
<tb>
CR = rémission complète PR = rémission partielle
<tb> FAB <SEP> leucémiques <SEP> complète <SEP> après <SEP> e <SEP> actuel
<tb> périphériques <SEP> la <SEP> première
<tb> induction
<tb> LAMa <SEP> LAM5a <SEP> inv <SEP> 8 <SEP> 79 <SEP> 60/2 <SEP> oui <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMb <SEP> LAM5a <SEP> XX <SEP> 57 <SEP> 43/2 <SEP> oui <SEP> non <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> LAMc <SEP> LAM5b <SEP> inv <SEP> 16, <SEP> +22 <SEP> 97 <SEP> 41/2 <SEP> oui <SEP> autogreffe <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> LAMd <SEP> LAM5 <SEP> 8+ <SEP> 95 <SEP> 71/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMe <SEP> LAM5a <SEP> XY <SEP> 84 <SEP> 48/1 <SEP> oui <SEP> allogreffe <SEP> mort
<tb> et <SEP> cosinophylie
<tb> LAMf <SEP> LAM5a <SEP> 7-, <SEP> 8+ <SEP> 95 <SEP> 70/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMg <SEP> LAM5a <SEP> XX <SEP> 93 <SEP> 1/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> LAMh <SEP> LAM5b <SEP> t( <SEP> 1 <SEP> Op, <SEP> 11q, <SEP> 20q) <SEP> 62 <SEP> 74/2 <SEP> non <SEP> non <SEP> mort
<tb> LAMi <SEP> LAM5a <SEP> XX <SEP> 79 <SEP> 18/2 <SEP> oui <SEP> autogreffe <SEP> CR <SEP> vivant
<tb> et <SEP> cosinophylie
<tb>
<tb> LAMj <SEP> LAM5a <SEP> t <SEP> (9p, <SEP> llq, <SEP> 16q) <SEP> 91 <SEP> 36/1 <SEP> non <SEP> non <SEP> PR <SEP> vivant
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CR = rémission complète PR = rémission partielle
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Milieux et réactifs
Les cellules leucémiques et témoins ont été cultivées dans du RPMI 1640 (Biowhitaker) complémenté avec 10% de sérum de veau f#tal (SVF), à 37 C et sous 5% de C02. Pour les cultures de lymphocytes, le milieu a été additionné de 1 mmol/L de pyruvate de sodium (Life Sciences), 1,5 mmol/L de L-glutamine (Life Sciences), 5. 10-5 mmol/L de P-mercaptoéthanol, 50 mg/mL de streptomycine (Sigma), 50 U/mL de pénicilline (Sigma). Les cytokines humaines recombinantes suivantes ont été utilisées : GM-CSF (Novartis), IL-2 et y-IFN (yInterferon) (Roussel Uclaf), IL-4 (Schering Plough), TNFa (Roche). Un anticorps anti-CD3 tel que l'anticorps monoclonal 289 (Pierres A. et al. European Journal of Immunology, 1988, vol. 18,685-690).
Les cellules leucémiques et témoins ont été cultivées dans du RPMI 1640 (Biowhitaker) complémenté avec 10% de sérum de veau f#tal (SVF), à 37 C et sous 5% de C02. Pour les cultures de lymphocytes, le milieu a été additionné de 1 mmol/L de pyruvate de sodium (Life Sciences), 1,5 mmol/L de L-glutamine (Life Sciences), 5. 10-5 mmol/L de P-mercaptoéthanol, 50 mg/mL de streptomycine (Sigma), 50 U/mL de pénicilline (Sigma). Les cytokines humaines recombinantes suivantes ont été utilisées : GM-CSF (Novartis), IL-2 et y-IFN (yInterferon) (Roussel Uclaf), IL-4 (Schering Plough), TNFa (Roche). Un anticorps anti-CD3 tel que l'anticorps monoclonal 289 (Pierres A. et al. European Journal of Immunology, 1988, vol. 18,685-690).
Les anticorps suivants ont été utilisés pour les études de cytométrie en flux : CDla (BL6, IgGl), CD4 (13 B8.2, IgGl), CD8 (B9. 11, IgGl), CD14 (RM052, IgG2a), CD15 (80H5, IgM), CD33 (D3HL60, IgGl), CD34 (QBEndlO, IgGl), CD40 (5C3, IgGl), CD83 (HB15a, IgG2b) et HLA-DQ (SPVL3, IgG2A) provenant tous de Coulter-Immunotech (Marseille, France), CD80 (BB1/B7, IgGl, Becton Dickinson), CD86 (IT2. 2, IgG2b, Pharmingen).
Des anticorps de chèvre anti-souris (GAM) conjugués à FITC ou PE (CoulterImmunotech, Marseille, France) ont été utilisés en tant que deuxième anticorps pour marquer les anticorps monoclonaux non conjugués. CD1 le (BU 15) et CD23 (9P25) proviennent de Sem Sealand, Schering Plough, Lyon, CD58 de l'ATCC (Rockville, USA), CDla (lOH3.9.3), CD14 (IOG3.3), CD25 (33B3. 1), CD80 (2D10.4), CMH Class 1 (YJ4), CMH Class II (25. 1) ont été produits selon les techniques classiques.
Séparation cellulaire
Des cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains ont été isolées selon les gradients Ficoll-Hypaque. L'isolement des lymphocytes CD4 et CD8 a été réalisé par sélection négative, en utilisant des billes magnétiques couvertes d'anticorps monoclonaux anti-CD8 ou anti-CD4, CD 14,
Des cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains ont été isolées selon les gradients Ficoll-Hypaque. L'isolement des lymphocytes CD4 et CD8 a été réalisé par sélection négative, en utilisant des billes magnétiques couvertes d'anticorps monoclonaux anti-CD8 ou anti-CD4, CD 14,
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CD56, CD45RO et CD 19 (Immunotech, Marseille, France) Pour l'élimination des cellules mémoires CD4, des anticorps anti-CD45RO UCHL1 1 (Immunotech, Marseille, France). L'élimination des cellules L des cultures a été réalisée en utilisant du surnageant d'hybridome anti-H2Kk(81 020) (Naquet P., Centre d'Immunologie de Marseille Luminy). Pour le triage des cellules CD83+, les cellules leucémiques ont été cultivées 5 à 7 jours en présence de GM-CSF, d'IL-4 et cellules L-CD40L, lavées une fois dans un tampon PBS (phosphate buffer saline) EDTA 5 mM, et incubées pendant 0,5 heure dans du PBS comprenant du sérum humain à 30%, puis ont été marquées pendant 0,5 heure avec des anticorps monoclonaux anti-CD83 conjugués à FITC (100 l/106 cellules, 106cellules/ml). Les cellules ont alors été lavées deux fois dans du PBS EDTA 5 mM froid avant triage à l'aide du système de triage cellulaire FACS Ventage (Becton Dickinson). Après sélection des cellules leucémiques, les populations CD83+, CD83- et la population totale ont été triées en fonction de la fluorescence verte, par comparaison à une immunoglobuline témoin isotypique.
Lignées cellulaires
Des cellules L murines transfectées avec du CD40L humain (cellules LCD40L) ou avec du CD32 humain (cellules L-CD32) ont été utilisées après une irradiation à 75 Gy (Banchereau J. Dardilly). Dans les essais de cytotoxicité, les lignées cellulaires de mastocytome murin P815 et de leucémie K562 ont été utilisées.
Des cellules L murines transfectées avec du CD40L humain (cellules LCD40L) ou avec du CD32 humain (cellules L-CD32) ont été utilisées après une irradiation à 75 Gy (Banchereau J. Dardilly). Dans les essais de cytotoxicité, les lignées cellulaires de mastocytome murin P815 et de leucémie K562 ont été utilisées.
Cellules leucémiques et cellules dendritiques
Des cellules de leucémies monoblastiques aiguës (LAM de type 5, selon la classification FAB) ont été utilisées. Après décongélation, les cellules, dont les lymphocytes B et T ont été éliminées ou non, ont été cultivées à 0,5x106/ml pendant trois jours, ou pendant diverses périodes de temps, en l'absence ou en présence de cellules L-CD32 (0,05 106/ml) ou de cellules L-CD40L (0,05 106/ml), GM-CSF (100 ng/ml), TNFa (5 ng/ml), IL-4 (10 ng/ml).
Des cellules de leucémies monoblastiques aiguës (LAM de type 5, selon la classification FAB) ont été utilisées. Après décongélation, les cellules, dont les lymphocytes B et T ont été éliminées ou non, ont été cultivées à 0,5x106/ml pendant trois jours, ou pendant diverses périodes de temps, en l'absence ou en présence de cellules L-CD32 (0,05 106/ml) ou de cellules L-CD40L (0,05 106/ml), GM-CSF (100 ng/ml), TNFa (5 ng/ml), IL-4 (10 ng/ml).
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Le milieu de culture a été complémenté de cytokines tous les trois jours, et les cellules ont été fractionnées lorsque cela était nécessaire. Pour obtenir des cellules dendritiques témoins, des PBMC de donneurs sains ont été décongelés, et après 2 heures dans du RPMI à 5% de SVF à 37 C, les cellules non adhérentes ont été éliminées par doux rinçage au PBS. Ces cellules comprenaient environ 90% de monocytes, et ont été cultivées à une concentration allant de 0,1 à 0,5 106/ml pendant 7 jours, en présence de GM-CSF (100 ng/ml) et d'IL-4 (10 ng/ml). Au jour sept, 0,05. 106 ml cellules L-CD32 ou-CD40L ont été ajoutées pendant deux à trois jours. Pour obtenir des monocytes témoins, les cellules adhérentes obtenues à partir des PMBC ont été cultivées pendant 24 heures en l'absence ou en présence d'IFNy à 10 ng/ml.
Cytométrie en flux
Après élimination de la population murine fibroblastique co-cultivée à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-H2Kksur billes magnétiques, les cellules ont été marquées à 4 C en utilisant du PBS dépourvu de Ca2+/Mg2+ contenant 30% de SAB humain et 0,02% d'azide pendant 0,5 heures. Les cellules ont été ensuite incubées 0,5 heure avec les anticorps monoclonaux, puis incubées avec des fragments F (ab')2 Ig de chèvre anti-souris conjugués à FITC ou PE (Immunotech) lorsque des anticorps monoclonaux non-conjugués sont utilisés. Après lavages, les cellules marquées ont été fixées dans du PBS à 2% de formaldéhyde, avant analyse au cytomètre en flux FACScan (Becton Dickinson). Des fenêtres ont été mises en place. Lorsqu'on ne réalise pas de fixation, une fenêtre témoin a été réalisée par coloration à l'iodure de propidium.
Après élimination de la population murine fibroblastique co-cultivée à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-H2Kksur billes magnétiques, les cellules ont été marquées à 4 C en utilisant du PBS dépourvu de Ca2+/Mg2+ contenant 30% de SAB humain et 0,02% d'azide pendant 0,5 heures. Les cellules ont été ensuite incubées 0,5 heure avec les anticorps monoclonaux, puis incubées avec des fragments F (ab')2 Ig de chèvre anti-souris conjugués à FITC ou PE (Immunotech) lorsque des anticorps monoclonaux non-conjugués sont utilisés. Après lavages, les cellules marquées ont été fixées dans du PBS à 2% de formaldéhyde, avant analyse au cytomètre en flux FACScan (Becton Dickinson). Des fenêtres ont été mises en place. Lorsqu'on ne réalise pas de fixation, une fenêtre témoin a été réalisée par coloration à l'iodure de propidium.
Préparation des lymphocytes T
Les cellules mononuclées de sang périphérique ou de sang de cordon cryoconservées ont été décongelées le jour de la culture afin de préparer des cellules T CD4 ou CD8 allogéniques en utilisant l'immunosélection magnétique négative comme décrit ci-dessus. Brièvement, 200 l de billes magnétiques pour
Les cellules mononuclées de sang périphérique ou de sang de cordon cryoconservées ont été décongelées le jour de la culture afin de préparer des cellules T CD4 ou CD8 allogéniques en utilisant l'immunosélection magnétique négative comme décrit ci-dessus. Brièvement, 200 l de billes magnétiques pour
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10 millions de cellules ont été incubées pendant 15 minutes dans du PBS en présence de 5 g de chaque anticorps monoclonal purifié de souris anti-humain CD 14, CD56, CD 19, et CD8 ou CD4 respectivement. Pour obtenir des populations de cellules T naïves pures à partir de sang de cordon, l'anticorps monoclonal anti-CD45RO a été ajouté. Les cellules ont été préincubées dans du PBS comprenant du sérum humain à 30%, avant incubation en présence des billes marquées pendant 10 minutes. La fraction non adhérente a été sélectionnée après incubation avec un élément magnétique. La pureté obtenue est supérieure à 95% comme vérifiée par analyse FACS.
Tests de prolifération (MLR)
La prolifération des cellules T a été réalisée dans des plaques à fond plat à 96 puits dans un volume final de 200 l. Un nombre constant de 2,5 ou 5 105 cellules T purifiées a été cocultivé avec un nombre croissant de cellules leucémiques ou de cellules témoins irradiées (50 Gy), dans un volume final de 200 l en triplicata. La prolifération des cellules T a été suivie par mesure de l'incorporation de [méthyl-3H]TdR (Amersham, UK) pendant les 8 dernières heures d'une culture de 6 jours. Le prélèvement de thymidine a été compté sur un compteur ss à phase gazeuse (Matrix 9600, Packard) dont l'efficacité est d'environ 1/5 de celle d'un compteur à scintillation ss.
La prolifération des cellules T a été réalisée dans des plaques à fond plat à 96 puits dans un volume final de 200 l. Un nombre constant de 2,5 ou 5 105 cellules T purifiées a été cocultivé avec un nombre croissant de cellules leucémiques ou de cellules témoins irradiées (50 Gy), dans un volume final de 200 l en triplicata. La prolifération des cellules T a été suivie par mesure de l'incorporation de [méthyl-3H]TdR (Amersham, UK) pendant les 8 dernières heures d'une culture de 6 jours. Le prélèvement de thymidine a été compté sur un compteur ss à phase gazeuse (Matrix 9600, Packard) dont l'efficacité est d'environ 1/5 de celle d'un compteur à scintillation ss.
Tests de cytotoxicité
Après 7 jours de culture, les cellules leucémiques ont été irradiées (50Gy), puis cocultivées avec des cellules T allogéniques CD3 naïves dans des plaques à 24 puits à un taux (cellules effectrices/cellules stimulatrices) de 2 à 5 selon les expériences. Après 6 jours de cultures mixtes lymphocytaires et tumorales (NLTC), pendant lesquelles on a fait proliférer les lymphocytes nécessaires, les cellules ont été comptées de manière à tester leur activité cytolytique contre les cibles P815, K562, et contre différentes cellules LAM5. Pour les tests CTL (lymphocytes cytotoxiques), les cellules cibles ont été marquées avec 100 Ci de
Après 7 jours de culture, les cellules leucémiques ont été irradiées (50Gy), puis cocultivées avec des cellules T allogéniques CD3 naïves dans des plaques à 24 puits à un taux (cellules effectrices/cellules stimulatrices) de 2 à 5 selon les expériences. Après 6 jours de cultures mixtes lymphocytaires et tumorales (NLTC), pendant lesquelles on a fait proliférer les lymphocytes nécessaires, les cellules ont été comptées de manière à tester leur activité cytolytique contre les cibles P815, K562, et contre différentes cellules LAM5. Pour les tests CTL (lymphocytes cytotoxiques), les cellules cibles ont été marquées avec 100 Ci de
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51 Cr (NEN, USA), pendant 2 heures à 37 C. 103 cibles marquées et des dilutions en série en triplicata de cellules effectrices ont été incubées dans du RPMI à 10% de SVF dans des plaques à fond en V à 96 puits. Pour la lyse des cibles P815, l'incubation a été réalisée en l'absence ou en présence de surnageants d'hybridomes 289 anti-CD3. Les plaques ont été centrifugées à 500g pendant 3 minutes et incubées à 37 C pendant 4 heures. Ensuite, 50 l de surnageants ont été collectés pour mesurer la libération de radioactivité à l'aide d'un compteur y (Topcount Packard). La lyse spécifique a été déterminée pour chaque expérience en triplicata comme suit : lyse spécifique (% = [libération de 51Cr expérimentale libération de 51 Cr spontanée]/ [libération de 51Cr maximale - libération de 51Cr spontanée] x 100. La libération maximale a été déterminée par l'addition de détergents MP40 à 2% (Sigma, Saint-Louis, MO) aux cellules cibles.
Détermination des cytokines
Les surnageants de cultures leucémiques différenciées ont été collectés au jour 3, puis congelés. Après décongélation, la concentration en cytokines a été mesurée à l'aide de tests immuno-enzymatiques achetés auprès de CoulterImmunotech (Marseille, France) pour IL-12 et IL-8.
Les surnageants de cultures leucémiques différenciées ont été collectés au jour 3, puis congelés. Après décongélation, la concentration en cytokines a été mesurée à l'aide de tests immuno-enzymatiques achetés auprès de CoulterImmunotech (Marseille, France) pour IL-12 et IL-8.
FISH (hybridation in situ par fluorescence)
L'hybridation FISH a été réalisée selon les techniques classiques sur des préparations en cytospin à partir de cellules CD83+ et CD83- triées au FACS (FACS Ventage, Becton Dickinson) provenant de trois patients sélectionnés du fait d'une détection d'une anomalie cytogénétique par FISH interphasique. En effet, le patient LAMc présentait une trisomie 22 au diagnostic, alors que les patients LAMd et LAMf présentaient une trisomie 8. Ces anomalies ont été observées dans toutes les métaphases analysées au diagnostic (n >20). Pour la détection des trisomies 22 et 8, une sonde spécifique du gène BCR (Vysis) et une sonde spécifique du centromère du chromosome 8 (Onca), ont été
L'hybridation FISH a été réalisée selon les techniques classiques sur des préparations en cytospin à partir de cellules CD83+ et CD83- triées au FACS (FACS Ventage, Becton Dickinson) provenant de trois patients sélectionnés du fait d'une détection d'une anomalie cytogénétique par FISH interphasique. En effet, le patient LAMc présentait une trisomie 22 au diagnostic, alors que les patients LAMd et LAMf présentaient une trisomie 8. Ces anomalies ont été observées dans toutes les métaphases analysées au diagnostic (n >20). Pour la détection des trisomies 22 et 8, une sonde spécifique du gène BCR (Vysis) et une sonde spécifique du centromère du chromosome 8 (Onca), ont été
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respectivement utilisées. Au moins 200 noyaux ont été examinés au microscope à fluorescence par 2 observateurs indépendants.
RESULTATS
Conditions de culture pour la production de cellules dendritiques à partir de blastes leucémiques
Des échantillons de cellules leucémiques ont été cultivés dans du RPMI complémenté de SVF en présence de diverses combinaisons de GM-CSF, IL-4, TNFa et de cellules L-CD40L. La plupart des leucémies ont présenté des modications morphologiques dès le jour 3, principalement après addition de GMCSF en présence d'IL-4. Les cellules ont présenté d'importants changements morphologiques avec des phénomènes de membranes cellulaires irrégulières, d'avancées cytoplasmiques et d'augmentations en taille variables. Ces changements morphologiques sont illustrés par les figures 1A et 1B : les figures 1A et 1B présentent des clichés de microscopie (vues cytospin coloration May- Grünwald-Giemsa) qui illustrent la différenciation dendritique des cellules leucémiques (LAMe) après une culture de 3 jours sur GM-CSF et IL-4, avec de larges amas ou une adhérence au plastique (Figure lA, x 10), et avec des phénomènes d'avancées cytoplasmiques et de membranes cellulaires irrégulières (Figure 1B, x 40).
Conditions de culture pour la production de cellules dendritiques à partir de blastes leucémiques
Des échantillons de cellules leucémiques ont été cultivés dans du RPMI complémenté de SVF en présence de diverses combinaisons de GM-CSF, IL-4, TNFa et de cellules L-CD40L. La plupart des leucémies ont présenté des modications morphologiques dès le jour 3, principalement après addition de GMCSF en présence d'IL-4. Les cellules ont présenté d'importants changements morphologiques avec des phénomènes de membranes cellulaires irrégulières, d'avancées cytoplasmiques et d'augmentations en taille variables. Ces changements morphologiques sont illustrés par les figures 1A et 1B : les figures 1A et 1B présentent des clichés de microscopie (vues cytospin coloration May- Grünwald-Giemsa) qui illustrent la différenciation dendritique des cellules leucémiques (LAMe) après une culture de 3 jours sur GM-CSF et IL-4, avec de larges amas ou une adhérence au plastique (Figure lA, x 10), et avec des phénomènes d'avancées cytoplasmiques et de membranes cellulaires irrégulières (Figure 1B, x 40).
Ces modifications ont été observées sur toute la population leucémique pour 2 leucémies (LAMf et LAMj), ou seulement sur une sous-population qui allait de 20 à 50% de la population totale pour 6 autres leucémies. Ces résultats sont illustrés par le Tableau 2 ci-dessous.
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Tableau II : analyse morphologique des cellules leucémiques testées
<tb> Identité <SEP> Viabilité <SEP> sans <SEP> Adhérence <SEP> au <SEP> Hétérogénéité <SEP> Amas <SEP> Augmentation <SEP> Apparition
<tb> Leucémie <SEP> GM-CSF <SEP> plastique <SEP> CD40L <SEP> * <SEP> de <SEP> la <SEP> taille <SEP> de <SEP> dendrites*
<tb> cellulaire <SEP> #
<tb> LAMa <SEP> oui <SEP> + <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++
<tb> LAMb <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +++
<tb> LAMc <SEP> oui <SEP> + <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> LAMd <SEP> oui- <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++
<tb> LAMe <SEP> oui- <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> LAMf <SEP> oui- <SEP> non <SEP> ++ <SEP> - <SEP> ++
<tb> LAMg <SEP> oui- <SEP> non <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> LAMh <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> oui <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++
<tb> LAMi <SEP> non- <SEP> non <SEP> ± <SEP> +
<tb> LAMj <SEP> oui <SEP> + <SEP> non <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +++
<tb>
* amas CD40L et apparition de fines dendrites observées en présence de CD40L, sur tout ou partie des cellules.
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* amas CD40L et apparition de fines dendrites observées en présence de CD40L, sur tout ou partie des cellules.
# augmentation de la taille cellulaire observée en présence de GM-CSF ou IL-4 Toutes les LAM5 ne sont pas identiques les unes aux autres, et les cellules leucémiques sont hétérogènes, mais toutes sont sensibles au CD40L.
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Les cellules qui ont présenté de telles modifications morphologiques appartenaient soit à la population cellulaire adhérente, soit à la population non adhérente selon la leucémie et les conditions de culture (voir Tableau 2 cidessus). Ainsi, deux leucémies ont présenté une forte adhérence au plastique (LAMb et LAMh) qui a diminué après addition d'IL-4. TNFa a rarement induit de tels changements, exception faite du cas de LAMe où des amas ont été observés. La co-incubation avec des cellules CD40L+ a stimulé la formation constante d'amas plus ou moins grands de cellules rondes autour des cellules LCD40L, qui étaient sensibles à l'addition d'EDTA. L'addition de CD40L a également été associée à l'acquisition de dendrites fines par les cellules leucémiques. La constante formation d'amas est illustrée par la figure 1C, et l'apparition de fines et longues dendrites par la figure 1D.
Les figures 1C et 1D représentent en effet des clichés de microscopie (vues cytospin coloration May-Grünwald-Giemsa) qui illustrent la différenciation dendritique de cellules leucémiques (LAMe) après 3 jours de culture sur GMCSF, IL-4 et CD40L, avec des amas entourant les cellules L transfectées par CD40L (Figure 1C, x10), et avec l'apparition de fines et longues dendrites (Figure 1D, x40).
Deux leucémies n'ont que très faiblement, voire pas du tout répondu à l'ensemble des différentes conditions de culture testées, et ont présenté des cellules rondes petites non adhérentes monomorphes (LAMg et LAMi), et n'adhérent que faiblement aux cellules L-CD40L.
Les changements observés ont été encore plus frappants après 10 jours de culture en présence de populations "de type cellules dendritiques dérivées de monocytes" pour toutes les LAM testées à l'exception de LAMg et LAMi.
Ainsi, les cellules issues de huit des dix LAM5 testées ont pu se différencier in vitro de manière à acquérir les caractéristiques morphologiques typiques de cellules dendritiques (DC, voir Tableau 2 ci-dessus).
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Différenciation phénotypique des cellules leucémiques en réponse aux signaux de différenciation de DC
La différenciation en cellules dendritiques est associée à des modifications moléculaires telles que la régulation négative de CD 14, et la régulation positive de molécules d'adhésion (CD54, CD58), de molécules co-stimulatrices (CD80, CD90), de molécules du CMH (Classe I, DR, DQ) et de molécules de différenciation telles que CD la ou CD83.
La différenciation en cellules dendritiques est associée à des modifications moléculaires telles que la régulation négative de CD 14, et la régulation positive de molécules d'adhésion (CD54, CD58), de molécules co-stimulatrices (CD80, CD90), de molécules du CMH (Classe I, DR, DQ) et de molécules de différenciation telles que CD la ou CD83.
La molécule monocytaire CD 14 a été observée exprimée au diagnostic sur huit leucémies parmi dix. Elle a été régulée négativement sur cinq d'entre-elles, après trois jours de culture en présence d'IL-4. Ces résultats sont illustrés par la figure 2A (pourcentage de cellules CD14+ en fonction du nombre de jours de culture sur GM-CSF/IL-4) qui représente la régulation négative de CD 14, telle que mesurée par cytométrie en flux sur les cellules leucémiques LAMb à LAMj cultivées pendant 10 jours en présence de GM-CSF et IL-4, et récoltées aux jours 3,7 et 10 (j3, j7, j10). Des cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDC) ont servi de témoins positifs (triangles noir). En figure 2A, la légende est la suivante :
L'expression de CD 14 a aussi été régulée de façon négative sur les monocytes témoins traités de la même façon.
L'expression de CD 14 a aussi été régulée de façon négative sur les monocytes témoins traités de la même façon.
Ceci n'a pas été associé, comme il aurait pu être pensé du modèle MoDC normal, avec une augmentation majeure conjointe dans l'expression de CD la, à l'exception d'une leucémie (LAMc). Ces résultats sont illustrés par la figure 2B (pourcentage de cellules CDla+ en fonction du nombre de jours de culture sur GM-CSF/IL-4) qui représente la régulation négative de CD 14, telle que mesurée par cytométrie en flux sur les cellules leucémiques LAMb à LAMj cultivées pendant 10 jours en présence de GM-CSF et IL-4, et récoltées aux jours 3,7 et 10 (j3, j7, j10). Des cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDC) ont servi de témoins positifs (triangles noir). La légende de la figure 2B correspond à celle de la figure 2A.
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Des cultures prolongées en présence de GM-CSF et d'IL-4 n'ont pas pu induire l'expression de CD la (LAMb, d, e, f, g, h, i), et le phénotype CD 14- /CDla' a persisté (cf. Figures 2A, 2B), ou n'a induit l'expression de CD la que sur une petite sous-population (LAMh et LAMj).
D'autres molécules de DC immatures, telles que le récepteur du mannose et la E-cadhérine, n'ont pas été régulées positivement dans la plupart des échantillons leucémiques traités selon les différentes conditions de cultures ici décrites. Ainsi, alors que CD 14 a été régulé négativement, les marqueurs de DC immatures n'ont été que rarement observés.
Il a ensuite été recherché l'expression de CD83, qui est normalement observée sur les cellules dendritiques périphériques matures. Ce phénomène est illustré par les figures 3A, 3B et 3C. Ces figures représentent en effet des mesures par cytométrie en flux de l'expression membranaire de CD83 (surfaces noires des graphes) sur des cellules leucémiques après une culture de trois jours en présence de différentes combinaisons de GM-CSF/IL-4/CD40L, ces combinaisons étant explicitées en-dessous des graphes. Pour chaque graphe des figures 3A, 3B et 3C, sont indiqués le pourcentage de cellules positives et l'intensité moyenne de fluorescence (%/MFI). Les témoins isotypiques sont représentés par des surfaces blanches. La figure 3A donne les résultats obtenus pour LAMi, qui est représentative de deux leucémies (LAMg et LAMi) qui n'expriment jamais CD83. La figure 3B donne les résultats obtenus pour LAMc qui est représentative de six leucémies pour lesquelles une forte expression de CD83 apparaît sur une fraction des cellules en présence de CD40L, cette expression étant plus avant stimulée par ajout d'IL-4. La figure 3C donne les résultats obtenus pour LAMf qui est représentative de deux leucémies (LAMf et LAMj) qui expriment CD83 sur presque toutes les cellules après culture sur GM- CSF/IL-4/CD40L.
Pour huit leucémies, une forte expression de CD83 a donc été obtenue après trois jours de culture en présence de CD40L, expression qui a encore augmenté lorsque CD40L a été combinée à IL-4. CD83 a été observée exprimée
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soit sur toute la population leucémique (LAMf et LAMj, cf. figure 3C), soit une sous-population leucémique (cf. figure 3B).
Deux leucémies (LAMg et LAMi, cf. figure 3A) n'ont jamais exprimé CD83, même après 15 jours de culture, et même lorsque des conditions typiques de culture MoDC ont été utilisées (10 jours de culture en présence de GM-CSF et IL-4, suivis par une stimulation par CD40L).
L'expression de molécules d'adhésion (CD54, CD58), de molécules du CMH (Classe I, Classe II et isoforme DQ) et de molécules co-stimulatrices (CD80 et CD86) a été analysée. Toutes ces molécules ont été régulées positivement (CD54, CD58, CMH Classe I, CMH Classe II, DQ, CD86) ou induites (CD80) sur 10 desdites leucémies testées, principalement après coincubation avec GM-CSF, IL-4 et CD40L. Ces résultats sont illustrés par les figures 4A, 4B et 4C.
Les figures 4A, 4B et 4C représentent en effet, pour dix LAM5 (LAMa à LAMj) cultivées pendant 3 jours en l'absence ou en présence des facteurs indiqués en abscisse, le facteur d'augmentation de l'expression de CD86 (Figure 4A), de molécules du CMH de classe I (Figure 4B) et de l'isoforme DQ du CMH de classe II (Figure 4C) .
Les cellules nouvellement CD83+ ont présenté une forte expression des molécules d'adhésion et de co-stimulation. Ces résultats sont illustrés par la figure 4D où est représentée l'analyse de LAMc après culture en présence de GM-CSF, IL-4 et CD40L, ladite LAMc apparaissant représentative de six leucémies hétérogènes. Les leucémies LAMg et LAMi ne répondent toujours pas à ces conditions de culture.
Prises ensemble, ces données démontrent que la plupart des blastes leucémiques LAM5 (huit parmi les dix testés), acquièrent in vitro des marqueurs de DC matures (y compris CD83) et la régulation positive de molécules du CMH de Classe I, du CMH de Classe II, et particulièrement de DQ, ainsi que de molécules co-stimulatrices telles que CD80 et CD86. Cependant, le stade
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immature de différenciation n'a pu être que très rarement détecté avec ces conditions de cultures.
Preuve complémentaire de l'origine leucémique des DC dérivant des leucémies générées in vitro
L'origine leucémique des cellules CD83+ obtenue à partir de populations de cellules leucémiques a été confirmée par : i. la forte expression de CD 15, une molécule caractéristique du stade immature de la lignée monocytaire exprimée sur les cellules leucémiques,et ii. la persistance des anomalies génétiques initiales comme cela est démontré par FISH pour 3 leucémies (LAMc, LAMd et LAMf).
L'origine leucémique des cellules CD83+ obtenue à partir de populations de cellules leucémiques a été confirmée par : i. la forte expression de CD 15, une molécule caractéristique du stade immature de la lignée monocytaire exprimée sur les cellules leucémiques,et ii. la persistance des anomalies génétiques initiales comme cela est démontré par FISH pour 3 leucémies (LAMc, LAMd et LAMf).
Les résultats de la LAMc sont présentés à la figure 5. La figure 5 représente en effet les résultats d'hybridation obtenus avec une sonde ADN spécifique du chromosome 22 marquée au FITC (analyse au microscope à fluorescence) pour des cellules CD83+ qui sont issues par triage de la LAMc, après 5 jours de culture en présence GM-CSF, IL-4 et CD40L, et qui ont subi une analyse FISH sur les cellules à l'interphase. Cette expérience est représentative de trois expériences (3 LAM) réalisée avec les sondes appropriées à chacune d'entreelles.
La cytokine de DC mature IL-12 est produite par les cellules leucémiques lorsqu'elles sont cultivées en présence de CD40L, et cette production est encore augmentée par ajout d'IL-4.
IL-12 est produite par les DC matures après liaison croisée avec CD40 ou les molécules de Classe II, ce qui revient à mimer l'interaction entre le TcR CD4 ou CD40L. 11-12 stimule les cellules NK, mais participe aux développements des cellules C et stimule la différenciation de CTL (lymphocytes cytotoxiques). Les cellules leucémiques ont été incubées comme décrit ci-dessus, et l'hétérodimère IL-12 p70 a été mesuré par la technique ELISA dans les surnageants. Ces résultats d'ELISA sont illustrés par la figure 6A : x 106/ml cellules leucémiques (LAMa à LAMj) ont été incubées pendant 3 jours en présence de
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GM-CSF (barres gris clair), GM-CSF et IL-4 (barres gris foncé), GM-CSF, IL-4 et CD40L (barres noires) ; à titre de témoins positifs, les moyennes obtenues pour 4 MoDC non leucémiques immatures et matures sont indiquées. Comme témoins ont été utilisées des MoDC immatures. Comme attendu, contrairement aux MoDC immatures, les MoDC matures produisent une très forte quantité d'IL- 12. Pour sept leucémies (LAMa, c, d, e, h, i, j), une caractéristique similaire a été observée avec des quantités d'IL-12 produite significatives, telles que mesurées en la seule présence de CD40L à des concentrations allant de 150 à 1150 ng/ml avec, dans la plupart des cas, un effet synergique exercé par IL-4. La production d'IL-12 a atteint un pic au jour 3, puis n'a été que faiblement détectable après 6 jours. Les quantités d'IL-12 produites sont similaires à celles produites par les MoDC matures. De manière remarquable, IL-12 est produite indépendamment de la stimulation de CD40L pour deux des leucémies testées (LAMb et LAMf). Une des leucémies n'a pas été capable de produire des quantités significatives d'IL-12 (LAMg), bien qu'elle ait produit, comme les autres LAM testés, de l'IL-8 dans les mêmes conditions de culture, ce qui confirme que la production d'IL-12 a été dans la plupart des cas restreint aux leucémies qui se sont différenciées en DC.
Les résultats de production d'IL-8, qui ont été obtenus de la manière comparable à ceux obtenus pour la prodution d'IL-12 en figure 6A, sont illustrés en figure 6B.
Ainsi, les cellules leucémiques différenciées acquièrent, en tant que DC matures, la capacité de produire de fortes quantités d'IL-12.
Les cellules T naïves CD4+ prolifèrent en présence de cellules leucémiques cultivées en présence de CD40L. La capacité à stimuler une réponse primaire des cellules T est une des caractéristiques clés des fonctions de DC. La capacité des cellules leucémiques différenciées obtenues à stimuler la prolifération de lymphocytes CD4+ de sang de cordon a donc été vérifié. Les résultats obtenus sont illustrés par les figures 7A, 7B1, 7B2,7B3 et 7C.
En figure 7A (cpm en fonction du nombre de cellules stimulatrices), la LAMa, qui appartient au groupe des leucémies qui effectuent une différenciation en DC sur une sous-population cellulaire, a été cultivée pendant 3 jours en
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présence ou en l'absence de GM-CSF, TFNa, IL-4 et CD40L. Les cellules T CD4+ de sang de cordon allogéniques ont été isolées, et 105 cellules T ont été stimulées pendant 6 jours en présence d'un nombre variable de cellules leucémiques irradiées (50 Gy). La prolifération a été mesurée par incorporation de thymidine 3H pendant les 8 dernières heures. Des cellules mononuclées de sang périphérique ont servi de témoins. Cette expérience est représentative de trois expériences réalisées avec les cinq autres leucémies différenciées hétérogènes. Les témoins de stimulation utilisés ont été : monocytes activés par IFNy, MoDC matures d9 stimulés par CD40L et immatures d7, et les témoins représentés sont représentatifs de deux donneurs. Les résultats correspondent à une moyenne de mesures faites en triplicata, et sont représentatifs de quatre expériences.
En figures 7B 1, 7B2,7B3 (cpm en fonction du nombre de cellules stimulatrices), les LAM ont été précultivés pendant 3 jours en présence de GMCSF, ou GM-CSF et TNFa, ou GM-CSF, IL-4 et CD40L. On a appliqué le même protocole qu'en figure 7A (mêmes choix de témoins, mesures faites en triplicata), avec un nombre constant de 0,5 x 105 lymphocytes par puits. LAMe (figure 7B 1), LAMh (figure 7B2) et LAMi (figure 7B3) sont représentatives respectivement des trois groupes de leucémies qui ont été observés. Chaque graphe est représentatif d'un groupe de deux à cinq expériences. Des PBMC ont été utilisées comme témoins.
En figure 7C (cpm en fonction du nombre de cellules stimulatrices), LAMe, qui appartient au groupe des leucémies qui se différencient en DC sur une sous-population, a été cultivée pendant 7 jours en présence de GM-CSF, IL-4 et CD40L, et irradiée. Les lymphocytes CD4+ CD45RO- naïfs ont été isolés à partir de sang de cordon sur des billes magnétiques, puis le même protocole qu'en figure 7A a été utilisé (même choix de témoins qu'en figure 7A, résultats représentatifs de quatre expériences et correspondant aux moyennes de mesures faites en triplicata), avec un nombre constant de 0,5 x 105 lymphocytes CD4+ par puits.
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Pour l'ensemble des figures 7, la légende des graphes est la suivante : conditions de culture des leucémies : trait simple gras, milieu seul triangles noir, pointes en bas +GM-CSF triangles noir, pointes en haut +GM-CSF/TNF cercles noir + GM-CSF/IL-4 carrés blanc + GM-CSF/CD40L ronds blanc + GM-CSF/IL-4/CD40L conditions de culture témoins : trait simple PBMC losanges blanc monocytes activés triangles blanc, trait pointillé MoDC immatures triangles blanc, trait continu MoDC matures
Comme donc l'illustre la figure 7A pour LAMa qui appartient au groupe des leucémies qui présentent une différenciation en DC sur une sous-population leucémique, une forte prolifération a été observée en présence de leucémies prétraitées au GM-CSF et au CD40L. L'addition d'IL-4 à CD40L n'a pas amélioré de manière significative la prolifération (cf. Figure 7A). Une culture de 7 jours des cellules leucémiques a néanmoins encore amélioré la prolifération de cellules T observée.
Comme donc l'illustre la figure 7A pour LAMa qui appartient au groupe des leucémies qui présentent une différenciation en DC sur une sous-population leucémique, une forte prolifération a été observée en présence de leucémies prétraitées au GM-CSF et au CD40L. L'addition d'IL-4 à CD40L n'a pas amélioré de manière significative la prolifération (cf. Figure 7A). Une culture de 7 jours des cellules leucémiques a néanmoins encore amélioré la prolifération de cellules T observée.
Parmi les 10 leucémies étudiées, trois groupes ont pu être déterminés en fonction de leur capacité à induire la prolifération de cellules T naïves après culture in vitro en présence de GM-CSF, avec ou sans addition de CD40L. En figures 7B1, 7B2,7B3, est présenté une leucémie représentative de ces trois groupes.
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Six leucémies ont présenté exactement le même type d'induction de prolifération de cellules T CD4+ naïves (cf. Figure 7B 1), c'est-à-dire qu'une prolifération a été observée lorsqu'elles ont été précultivées en l'absence de CD40L à la plus forte concentration de cellules stimulatrices. Par contre, une forte prolifération a été observée lorsqu'elles ont été précultivées en présence de CD40L, même en présence de faibles quantités de cellules stimulatrices leucémiques (cf. Figure 7B 1).
Les deux leucémies LAMd et LAMh ont présenté des cellules à stimulation très forte après culture sur GM-CSF in vitro, et cette stimulation n'a pas pu être plus avant augmentée par ajout de TNFa ou d'IL-4 et de CD40L (cf. Figure 7B2).
Les deux leucémies LAMg et LAMi ont présentés des cellules à stimulation assez faibles sauf lorsqu'il y a eu addition de CD40L ce qui a alors permis une prolifération faible mais significative de cellules TCD4+ naïves au plus fort de cellules leucémiques (cf. Figure 7B3).
Afin de mieux souligner les propriétés de stimulation de type DC des leucémies précultivées pendant 7 jours, nous avons sélectionné des cellules T de sang de cordon CD4+ naïves CD45RO- en éliminant la petite fraction de cellules CD40RO+ (5 à 10% correspondant vraisemblablement à des PBMC contaminantes d'origine maternelle au moment de la collecte), et les avons utilisées comme cellules réponses. De plus, ont été testés, comme stimulateurs, des monocytes normaux activés à l'Interféron y et des MoDC immatures et matures. Pour la leucémie LAMe, dans une expérience représentative des résultats obtenus, une préculture de 7 jours des cellules leucémiques en présence de GM-CSF, d'IL-4 et de CD40L induit la prolifération de cellules T CD4+ naïves à des niveaux presque similaires à ceux observés en présence de MoDC témoins matures (cf. Figure 7C).
Par contraste, les DC immatures ou les monocytes activés induisent une très faible prolifération, et seulement aux plus fortes des concentrations de cellules stimulatrices.
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Ainsi, la différenciation des cellules leucémiques vers des DC est associée avec l'acquisition d'une capacité à stimuler la prolifération de cellules T naïves.
L'expression de molécules de DC CD83+ matures sur des blastes leucémiques différenciés et corrélées avec la capacité à faire proliférer des cellules T naïves
Il a ensuite été recherché si la forte capacité à stimuler des cellules T naïves observée pour les leucémies précultivées sur des CD40L est associée à l'acquisition du marqueur de différenciation CD83+. Deux populations leucémiques, dont seule une sous-population a acquis le marqueur de différenciation CD83 (LAMc, LAMe), ont été cultivées pendant 5 à 7 jours en présence de GM-CSF, d'IL-4 et de cellules L-CD40L (cf. Figure 7C). Les fractions cellulaires CD83+ et CD83- ont ensuite été isolées par triage cellulaire, et leur capacité à stimuler la prolifération de CD4+ naïfs a été testée. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 8 : cellules LAMe ont été cultivées pendant 7 jours en présence de GM-CSF, IL-4 et CD40L, puis les souspopulations CD83+ et CD83- ont été isolées par triages cellulaires ; les lymphocytes CD4+ CD45RO' naïfs ont été isolés de sang de cordon sur des billes magnétiques, et 0,5 x 105 lymphocytes par puits ont été cultivés pendant 6 jours en présence de différentes concentrations de cellules leucémiques irradiées CD83- (triangles), CD83+ (carrés) ou non triées (cercles). La prolifération a été mesurée par incorporation de thymidine 3H pendant les 8 dernières heures.
Il a ensuite été recherché si la forte capacité à stimuler des cellules T naïves observée pour les leucémies précultivées sur des CD40L est associée à l'acquisition du marqueur de différenciation CD83+. Deux populations leucémiques, dont seule une sous-population a acquis le marqueur de différenciation CD83 (LAMc, LAMe), ont été cultivées pendant 5 à 7 jours en présence de GM-CSF, d'IL-4 et de cellules L-CD40L (cf. Figure 7C). Les fractions cellulaires CD83+ et CD83- ont ensuite été isolées par triage cellulaire, et leur capacité à stimuler la prolifération de CD4+ naïfs a été testée. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 8 : cellules LAMe ont été cultivées pendant 7 jours en présence de GM-CSF, IL-4 et CD40L, puis les souspopulations CD83+ et CD83- ont été isolées par triages cellulaires ; les lymphocytes CD4+ CD45RO' naïfs ont été isolés de sang de cordon sur des billes magnétiques, et 0,5 x 105 lymphocytes par puits ont été cultivés pendant 6 jours en présence de différentes concentrations de cellules leucémiques irradiées CD83- (triangles), CD83+ (carrés) ou non triées (cercles). La prolifération a été mesurée par incorporation de thymidine 3H pendant les 8 dernières heures.
Comme le montre la figure 8, pour LAMe, une forte prolifération est observée seulement en présence de cellules leucémiques CD83+. Des résultats similaires ont été obtenus pour l'autre leucémie LAMc.
Ces expériences démontrent que les capacités allo-stimulatrices sont principalement restreintes aux cellules leucémiques CD83+ puisque la souspopulation CD83- n'est que très faiblement efficace. Ceci met également en évidence l'hétérogénéité des populations cellulaires tumorales.
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Les leucémies différenciées peuvent générer des lymphocytes T cytotoxiques (CTD naïfs.
La capacité de leucémies pré-cultivées à générer des CTL à partir de lymphocytes T CD45RO- de sang de cordon a été testée. Trois leucémies ont été cultivées pendant 7 jours en présence de GM-CSF ou GM-CSF, IL-4 et cellules L-CD40L, puis ont été utilisées comme stimulatrices de lymphocytes T allogéniques naïfs. La différenciation en CTL des cellules réponses a été analysée de deux manières : en évaluant la différenciation globale en CTL par lyse redirigée à l'aide P815 et d'anticorps monoclonaux anti-CD3, et en évaluant leur capacité à tuer les blastes leucémiques. Ces résultats sont illustrés par les figures 9A, 9B et 9C où sont représentés les résultats obtenus pour LAMe, qui est représentative des deux autres leucémies testées: LAMe a été cultivée pendant 7 jours en présence de GM-CSF, ou en présence de GM-CSF, IL-4 et CD40L, et sa capacité à générer des CTL a été testée.
En figure 9A sont reportés les résultats de différenciation en CTL, tels qu'analysés à l'aide de tests standards de libération de 5'Cr sur des cellules cibles P815 en présence d'anticorps monoclonaux anti-CD3. Les cellules effectrices sont des lymphocytes CD3+ CD45RO- naïfs qui ont été isolés de sang de cordon sur des billes magnétiques, et qui ont été cultivés sur des plaques à 24 puits pendant 6 jours en présence de cellules leucémiques irradiées à un taux (cellules effectrices / cellules stimulatrices) de 2 (cellules leucémiques pré-cultivées en présence de GM-CSF : cerclesnoir ; cellules leucémiques pré-cultivées en présence de GM-CSF, IL-4 et CD40L : noir).
On a également testé la capacité de lymphocytes naïfs stimulés par les mêmes cellules leucémiques à lyser les leucémies stimulatrices correspondantes.
Ces résultats sont illustrés par les figures 9B et 9C, qui représentent les résultats obtenus pour LAMe, qui sont représentatifs des deux autres leucémies testées, des lymphocytes CD3+ CD45RO- naïfs ont été cultivés en présence de cellules leucémiques irradiées à un ratio (cellules effectrices / cellules stimulatrices) de 5.
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En figure 9B, sont reportés les résultats de lyse de cellules leucémiques différenciées après 7 jours sur GM-CSF/IL-4/CD40L (triangles noir) ou sur GMCSF seul (cercles noir), tels qu'analysés à l'aide de tests standards de libération de 51Cr, après six jours de culture en présence de cellules leucémiques stimulantes.
A titre de témoins, on a testé la lyse de MoDC matures exercée par des CTL différenciés en présence de MoDC matures (triangles blanc). Les résultats de test de libération de 51Cr sont représentatifs de trois leucémies, et de deux expériences par leucémie.
En figure 9C, sont reportés les résultats de production d'IFNy mesurés par ELISA sur les surnageants de cultures de trois leucémies (culture sur GM-CSF, ou sur GM-CSF/IL-4/CD40L).
Comme le montre la figure 9A, le traitement par IL-4 et CD40L permet la différenciation de CTL naïfs. Les témoins DC (DC matures normales) se sont montrés très efficaces dans les conditions expérimentales testées pour l'induction de CTL.
Comme le montrent les figures 9B et 9C, pour LAMe la différenciation en CTL, telle que déterminée par la lyse des cellules cibles et la production d'IFNy, requièrent la co-incubation de cellules leucémiques avec IL-4 et CD40L de manière à obtenir une élimination spécifique. GM-CSF seul ne suffit pas à induire la différenciation de CTL. Des résultats similaires ont été obtenus avec les deux autres leucémies testées. De manière remarquable, des cellules cibles témoins, telles que d'autres LAM5 et la cible K562 sensible aux NK, ne sont pas éliminées par les trois CTL testés.
Sur les figures 10A et 10B, on rapporte le % de libération de Cr51 en fonction du ratio E/T. Les symboles utilisés correspondent aux cibles suivantes : -#-: LAMb, -A- LAMc, -1- LAMe et + LAMj.
Ces résultats mettent en évidence la capacité des cellules autologues (CTL du patient) à tuer ses propres cellules leucémiques.
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DISCUSSION
Les expériences réalisées démontrent qu'il est possible d'induire la différenciation de leucémies aiguës humaines en quelques jours en présence d'IL- 4 et CD40, pour les transformer en cellules de type cellules dendritiques matures qui expriment CD83, des molécules du CMH et costimulatrices, et qui produisent de l'IL-12 tout en conservant leur statut leucémique.
Les expériences réalisées démontrent qu'il est possible d'induire la différenciation de leucémies aiguës humaines en quelques jours en présence d'IL- 4 et CD40, pour les transformer en cellules de type cellules dendritiques matures qui expriment CD83, des molécules du CMH et costimulatrices, et qui produisent de l'IL-12 tout en conservant leur statut leucémique.
De plus, ces cellules peuvent conduire à la prolifération et, respectivement, à la différenciation des cellules effectrices (cellules T CD4+ et CTL).
Les CTL sont un composant essentiel de la réponse immunitaire contre les tumeurs. Les CTL peuvent en effet, par reconnaissance de peptides associés à des molécule du CMH de classe I, soigner les tumeurs dans les modèles animaux, et lyser les cellules cancéreuses humaines in vitro. Les peptides obtenus à partir de différents antigènes tumoraux sont des protéines mutantes, des protéines de fusion ou des protéines normales exprimées par des tumeurs ou des antigènes de différenciation. L'induction de CTL nécessite l'identification de cibles telles que les antigènes de tumeurs, et leur stimulation à l'aide de CPA (cellules présentatrices d'antigènes) professionnelles. L'identification d'antigènes de tumeurs, en particulier de mélanomes, a permis de proposer différentes stratégies de thérapie cellulaire par immunisation anti-tumorale, ainsi que par stimulation et expansion de clones CTL anti-tumoraux. De manière à utiliser le système immunitaire comme thérapie adjuvante, il est nécessaire d'identifier de bonnes cibles antigéniques, et de produire des cellules effectrices lymphocytaires spécifiques. Diverses procédures expérimentales sont utilisées pour identifier les antigènes tumoraux à l'aide de stratégies génétiques, biochimiques ou sérologiques. Un autre objectif est l'activation de cellules T effectrices après administration des antigènes tumoraux. Diverses stratégies sont testées qui correspondent à des peptides, des protéines, des protéines de choc thermique isolées de cellules tumorales, des vaccins à ADN. La présentation d'antigènes
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tumoraux peut être in vivo essentiellement réalisée par liaison indirecte, par l'intermédiaire de DC qui capturent et présentent les peptides antigéniques tumoraux associés aux molécules du CMH de classe I aux CTL. Un grand nombre de molécules de costimulation, adhésion et du CMH efficaces qui sont présentes sur la membrane de DC matures permet le recrutement et l'activation des extrêmement rares CTL anti-tumoraux spécifiques qui sont supposés, s'ils existent, appartenir à l'ensemble des lymphocytes naïfs. En fait, de nombreuses expériences sur l'animal ont confirmé et illustré cette capacité dendritique, en mettant en évidence la capacité de DC stimulées par des peptides à inhiber un nouveau développement tumoral, et même à induire l'élimination de tumeurs établies. De manière à surmonter l'absence d'antigènes tumoraux identifiés, puisque la plupart d'entre-eux sont restreints aux mélanomes chez l'homme, les cellules tumorales peuvent être utilisées en tant qu'immunogènes. De plus, l'utilisation de tumeurs comme immunogènes permet d'induire une immunisation polyvalente contre de multiples peptides, ce qui évite qu'ils échappent à des CTL qui ne seraient spécifiques que d'un peptide. Finalement, la présente approche surmonte un obstacle possible, à savoir que les antigènes tumoraux pourraient ne pas avoir accès aux DC in vivo.
Puisque les cellules tumorales sont naturellement dépourvues de capacité CPA, diverses stratégies, utilisant la transfection de molécules d'adhésion et de costimulation, sont utilisées pour augmenter leur reconnaissance par le système immunitaire. Certaines stratégies ont utilisé la transfection de GM-CSF, une cytokine connue pour activer, recruter et affecter la différenciation de monocytes, mais aussi la transfection d'IL-12, une des cytokines produites par les DC matures qui sont impliquées dans la différenciation de Thl et l'activation de CTL et NK. Finalement, d'autres ont également pu fusionner des cellules B de type CPA, ou des DC à des cellules tumorales.La présente invention fournit, quant à elle, des moyens particulièrement efficaces, et adaptés à l'homme, qui permettent de différencier des cellules tumorales en cellules dendritiques tumorales : les
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cellules obtenues possèdent la capacité à présenter l'antigène des CPA, et la capacité à exprimer les antigènes tumoraux.
Les tumeurs hématopoïétiques sont les principales candidates pour la différenciation en DC (qui sont des leucocytes), et différentes études ont réussi leur différenciation in vitro en DC CDla+ (immatures). Ces leucémies très immatures expriment une translocation constante (9; 22) à partir de laquelle des peptides de jonction dérivés sont de bons candidats pour être des antigènes tumoraux. Ces DC leucémiques ont élicité in vitro des réponses cytotoxiques spécifiques anti-LMC (leucémies myéloïdes chroniques).
La présente invention s'est, quant à elle, intéressée aux cas particulier des LAM (leucémies myéloïdes/aiguës). Les travaux des inventeurs démontrent que les résultats, ici présentés pour LAM5, peuvent être étendus à d'autres leucémies appartenant à la lignée myéloïde aiguë. Comme aucun antigène tumoral n'a encore pu être mis en évidence pour les LAM, qu'elles soient associées ou non à différentes anomalies chromosomiques, les moyens selon l'invention fournissent des CTL qui peuvent reconnaître ces cellules tumorales, et ainsi identifier les peptides tumoraux. Le protocole in vitro, ci-dessus décrit, permet d'induire ou d'augmenter l'immunogénicité de la grande majeurité des leucémies myéloïdes.
Par conséquent, ce type de protocole peut être utilisé pour identifier des antigènes sur ces leucémies (LAM), qu'ils correspondent à des antigènes d'histocompatibilité mineurs ou à des antigènes tumoraux.
Un paramètre critique consiste à conserver les antigènes LAM pendant la différenciation in vitro en DC, de manière à conserver tout ou partie des peptides tumoraux et à ainsi permettre la lyse des cellules LAM par les cellules T. Comme les cellules leucémiques traitées selon l'invention conservent leurs anomalies chromosomiques et/ou les marqueurs associés à une transformation leucémique, la présente stratégie permet de conserver la plupart, sinon tous les peptides trouvés dans les cellules tumorales non différenciées. De plus, dans la plupart des expériences qui utilisent des tumeurs transplantées après modification par
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transfert de molécules co-stimulatrices ou de cytokines, les CTL générés in vivo conservent la capacité à reconnaître et à éliminer les tumeurs non modifiées.
Les inventeurs démontrent ici par leurs travaux qu'il est possible pour les LAM, qui sont des cellules leucémiques rattachées à la lignée monocytaire, de les différencier in vitro en les meilleures CPA possibles : les cellules obtenues présentent les propriétés de DC matures. La population blastique est principalement constituée de cellules monoblastiques (LAM5a) et/ou monocytaires (LAM5b), ce qui correspond à un état intermédiaire entre des cellules hématopoïétiques CD34 immatures et des monocytes complètement différenciés. Quelques observations de LAM5 exprimant naturellement un phénotype dendritique, bien que rares, ont d'ailleurs pu être faites. Afin de mettre au point un protocole qui puisse être utilisé lors d'essais cliniques, les inventeurs ont étudié des protocoles susceptibles d'être adaptés aux conditions de cellules vivantes, voire de conditions in vivo, mais qui soient efficaces dans les 3 jours de manière à garder vivantes un maximum de cellules leucémiques. Le protocole le plus efficace pour obtenir en 3 jours le phénotype et les fonctions de DC matures tout en conservant les caractéristiques leucémiques correspond à des combinaisons de GM-CSF et de ligands de CD40, IL-4 étant très avantageusement dans le cas où l'on vise à produire des CTL. Les autres protocoles testés ont été, dans la plupart des cas, moins efficaces, et en particulier la combinaison de GM-CSF et TFNa.
Cependant, 2 des 10 leucémies testées ne sont pas parvenues à se différencier in vitro. Puisque les leucémies peuvent présenter une hétérogénéité des stades de maturation, ou peuvent exprimer en même temps des cellules de lignées différentes, des temps plus longs d'incubation in vitro (jusqu'à 15 jours) ont été testés mais n'ont pas permis d'induire la différenciation recherchée. Il peut être noté que TGFss et FLT3L ont de même échoué. Toutefois, ces cellules leucémiques ne sont pas complètement insensibles aux cytokines, puisque comme le montre la Figure 7C, après stimulation elles acquièrent jusqu'à un certain niveau la capacité à stimuler la prolifération de cellules naïves allogéniques. Soit
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ces cellules leucémiques ne correspondent pas au sous-type LAM5a ou LAM5b et définissent un nouveau sous-type, soit elles présentent des anomalies au niveau de leur réactivé à IL-4 ou CD40L, ce qui implique qu'elles sont à un stade de leur différenciation où elles sont insensibles, ou qu'elles présentent des mutations au niveau de leur voie IL-4 et/ou CD40L. Par exemple, dans la plupart des cas, l'expression de CD40 sur les cellules leucémiques cultivées sans cytokine ajoutée était modale, ce qui indique que l'absence de réponse n'est pas liée à l'expression de CD40. En effet, un faible pourcentage de cellules CD83+ s'est montré suffisant pour produire la réponse proliférative naïve recherchée, caractéristique de DC matures, et ce comportement de DC mature a été confirmé par une production d'IL-12 même si l'identité des cellules leucémiques produisant cette IL-12 n'est pas précisée.
La préculture sur CD40L apparaît être l'un des paramètres essentiels pour obtenir une bonne prolifération de lymphocytes CD4+ naïfs, bien qu'il apparaisse avantageux d'associer CD40L à GM-CSF (et IL-4) pour obtenir une expression maximale des molécules costimulatrices, de CD83 et d'IL-12. Le rôle essentiel de l'interaction CD40/CD40L est donc ici démontré dans le cadre de la participation lymphocytaire CD4+ à la génération de CTL, avec une réponse adéquate de DC envers CD40L en surexprimant les molécules de costimulation et de présentation, en augmentant l'aide à la cytotoxicité et/ou à la cytostaticité, et en permettant une production de CTL. Ainsi, l'expression de CD40 sur des leucémiques myéloïdes aiguës, associée à la capacité à se différencier vers la lignée DC mature, est une observation d'un intérêt tout particulier, notamment pour la mise en place de thérapies vaccinales, qui peuvent être adjuvantes.
Claims (18)
- REVENDICATIONS 1. Procédé pour induire, ou augmenter, l'immunogénicité de cellules LAM, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact, notamment par incubation des cellules LAM avec des composés capables de conférer aux cellules leucémiques des phénotypes et/ou des fonctions de cellules non tumorales, ces composés comprenant au moins un ligand de CD40, un facteur de croissance desdites cellules, tel que GM-CSF, et une cytokine telle que IL-4, dans des conditions permettant la culture des cellules.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le (ou les) ligand(s) de CD40 est (sont) présent(s) sous forme soluble ou sous forme associée à une cellule.
- 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le (ou les) ligand(s) sous forme libre est (sont) présent(s) à une concentration de 150 à 1150 ng/ml environ pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1 à 0,5 x 106 cellules/ml.
- 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le (ou les) ligand (s) CD40 sous forme associée est (sont) présent(s) à une concentration de l'ordre de 0,05 x 106 cellules associées/ml pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1 à 0,5 x 106 cellules/ml.
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le (ou les) facteur (s) croissance desdites cellules, tel que GM-CSF, est (sont) présent(s) à une concentration de l'ordre de 50 à 100 ng/ml environ pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1 à 0,5 x 106 cellules/ml.<Desc/Clms Page number 37>
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la (ou les) cytokine (s), que IL-4, est (sont) présente (s) une concentration de l'ordre de 10 ng/ml environ pour une concentration initiale en cellules LAM de l'ordre de 0,1à 0,5 x 106 cellules/ml.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite mise en contact se traduit par l'acquisition par lesdites cellules LAM d'un phénotype de type CPA, notamment d'un phénotype de type CPA mature et/ou de fonction (s) deCPA, en particulier par l'acquisition d'un phénotype de type DC, notamment d'un phénotype de type DC mature.
- 8. Cellules LAM caractérisées par une régulation négative de la molécule CD 14, et/ou une régulation positive de la molécule CD83, et/ou une régulation positive d'au moins une molécule d'adhérence, telle que CD54, CD58, et/ou d'au moins une molécule du CMH (Complexe Majeur d'histocompatibilité), telle que une molécule du CMH de classe I, une molécule du CMH de classe II, l'isoforme DQ, et/ou d'au moins une molécule de co-stimulation, telle que CD80, CD86.
- 9. Cellules LAM selon la revendication 8, caractérisées par leur capacité à stimuler la prolifération de lymphocytes T CD4+ et/ou à induire la différenciation de lymphocytes T CD8+ en lymphocytes T cytotoxiques (CTL), ces dernières étant avantageusement capables de lyser spécifiquement des cellules correspondant aux cellules LAM avant traitement.
- 10. Cellules LAM selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisées en ce qu'elles conservent des caractéristiques leucémiques, telles que d'éventuelles anomalies chromosomiques et/ou leurs caractéristiques antigéniques.<Desc/Clms Page number 38>
- 11. Utilisation d'une composition capable de conférer aux cellules leucémiques des phénotypes et/ou des fonctions de cellules non tumorales, cette composition renfermant au moins un ligand de CD40, un facteur de croissance de cellules leucémiques, tel que GM-CSF, et une cytokine, telle que IL-4, pour la fabrication d'un médicament anti-LAM, et en particulier anti-LAM2 et/ou anti-LAM3 et/ou anti-LAM4 et/ou anti-LAM5, administrable à l'homme ou l'animal.
- 12. Utilisation de cellules LAM selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la fabrication d'un médicament anti-LAM, et en particulier anti-LAM2 et/ou anti-LAM3 et/ou anti-LAM4 et/ou anti-LAM5, administrable à l'homme ou l'animal.
- 13. Utilisation de lymphocytes cytotoxiques (CTL) tels que produits à l'aide de cellules LAM selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la fabrication d'un médicament anti-LAM, et en particulier anti-LAM2 et/ou antiLAM3 et/ou anti-LAM4 et/ou anti-LAM5, administrable à l'homme ou l'animal.
- 14. Utilisation des cellules LAM selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 pour identifier au moins une molécule à la surface de ces cellules qui participe à une réaction immunitaire, en particulier un antigène tumoral ou un antigène de complexe d'histocompatibilité.
- 15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la constitution d'une banque d'ARN desdites cellules LAM traitées.
- 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite banque d'ARN LAM est mise en contact avec des lymphocytes, et des lymphocytes T CD8+ en particulier, l'ARN de la banque étant identifié comme correspondant à un antigène LAM lorsque le clone lui correspondant dans la banque est capable d'induire la différenciation desdits lymphocytes T CD8+ en CTL, et/ou d'induire<Desc/Clms Page number 39>la production par les lymphocytes T CD8+ d'interféron gamma et/ou de TNFa.
- 17. Utilisation d'un antigène tel qu'identifié conformément à l'une quelconque des revendications 14 à 16 pour la fabrication d'un médicament et notamment d'un vaccin anti-LAM, et anti-LAM2, et/ou anti-LAM3, et/ou anti-LAM4 et/ou anti-LAM5 en particulier.
- 18. Méthode de suivi thérapeutique pour la prévision et/ou l'ajustement de l'efficacité sur un patient donné d'un médicament tel que fabriqué à l'aide d'une utilisation selon l'une quelconque des revendications 11, 12,13, ou 17 caractérisée en ce qu'elle comprend l'analyse de l'expression CD40 de la population cellulaire leucémique dudit patient.
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