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FR2778665A1 - Polypeptide prax-1 - Google Patents

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FR2778665A1
FR2778665A1 FR9806190A FR9806190A FR2778665A1 FR 2778665 A1 FR2778665 A1 FR 2778665A1 FR 9806190 A FR9806190 A FR 9806190A FR 9806190 A FR9806190 A FR 9806190A FR 2778665 A1 FR2778665 A1 FR 2778665A1
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FR
France
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seq
glu
pro
leu
gly
Prior art date
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Granted
Application number
FR9806190A
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English (en)
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FR2778665B1 (fr
Inventor
Fur Gerard Le
Sylvaine Galiegue
Omar Jbilo
Pierre Casellas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi SA filed Critical Sanofi SA
Priority to FR9806190A priority Critical patent/FR2778665B1/fr
Priority to AU35285/99A priority patent/AU3528599A/en
Priority to PCT/FR1999/001070 priority patent/WO1999060117A2/fr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

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Abstract

Cette invention concerne un polypeptide purifié, comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmia) la séquence SEQ ID ndegre 2;b) une séquence biologiquement active dérivée de SEQ ID ndegre2; etc) un fragment de la séquence SEQ ID ndegre 2 ayant une activité biologique de même nature que celle du polypeptide de séquence SEQ ID ndegre 2 ou immunologiquement apparenté au polypeptide de séquence SEQ ID ndegre 2.

Description

L'invention concerne une nouvelle séquence d'acides nucléiques et
la séquence protéique correspondante.
L'invention concerne également les applications prophylactiques, thérapeutiques et diagnostiques de celles-ci. Les auteurs de la présente invention ont identifié le produit de transcription d'un nouveau gène ainsi que la protéine correspondante. Ce gène PRAX-1 a été isolé par la technique du double hybride comme codant pour une protéine interagissant spécifiquement avec le récepteur periphérique des
benzodiazépines (PBR).
La présente invention est donc relative à une protéine purifiée
PRAX-1, ou des fragments biologiquement actifs de celle-ci.
L'invention concerne également des séquences d'acides nucléiques isolées codant pour ladite protéine ou ses fragments biologiquement
actifs et des oligonucléotides spécifiques obtenues à partir de cette séquence.
Elle vise en outre les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant au moins l'une des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, et les cellules hôtes transfectées par ces vecteurs de clonage et/ou d'expression dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de l'une desdites
séquences nucléotidiques.
Les méthodes de production de protéines recombinantes PRAX-1 ou de ses fragments biologiquement actifs par les cellules hôtes transfectées
font également partie de l'invention.
L'invention comprend également des anticorps ou des dérivés
d'anticorps spécifiques des protéines définies ci-dessus.
L'invention concerne également tout inhibiteur ou activateur de l'activité spécifique du PRAX-1, mais aussi de toute interaction protéine-protéine
faisant intervenir le PRAX-1.
Elle concerne aussi des séquences oligonucléotidiques antisens, spécifiques des séquences d'acides nucléiques ci-dessus, pouvant moduler in
vivo l'expression du gène PRAX-1.
Elle concerne des séquences oligonucléotidiques définies a partir des séquences d'acides nucléiques ci-dessus, sonde ou amorce utilisable en
diagnostic de pathologies o le PRAX-1 est impliqué.
L'invention a enfin pur objet l'utilisation dans une méthode de thérapie génique d'une séquence nucléotidique selon l'invention, dans laquelle des vecteurs tels que par exemple des vecteurs viraux inactives capables de transférer des séquences codantes pour une protéine selon l'invention sont
injectés dans des cellules déficientes pour cette protéine.
La présente invention a pour objet un polypeptide purifié dont la séquence d'acides aminés est la séquence SEQ ID n 2 ou toute séquence
biologiquement active dérivée de SEQ ID n 2.
Dans la description de l'invention, on utilise les définitions
suivantes: - protéine PRAX-1: un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés choisie entre la séquence SEQ ID n 2 ou tout fragment ou
dérivé de celui-ci biologiquement actif.
- dérivé: tout polypeptide variant du polypeptide de séquence SEQ ID n 2 ou toute molécule résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID n 2 c'est-à-dire obtenue par mutation, délétion, addition, substitution et/ou modification chimique d'un seul ou d'un nombre limité d'acides aminés, ainsi que toute séquence isoforme, c'est-à-dire une séquence identique à la séquence SEQ ID n 2 à l'un de ses fragments ou séquences modifiées, contenant un ou plusieurs acides aminés sous la forme d'énantiomère D, lesdites séquences variantes, modifiées ou isoformes ayant conservé au moins l'une des propriétés les rendant biologiquement actives et/ou lesdites séquences étant immunologiquement apparentées à la séquence SEQ
ID n 2.
- biologiquement actif: capable d'interagir avec le récepteur
périphérique des benzodiazépines.
- immunologiquement apparenté: capable d'être reconnu par les anticorps spécifiques du polypeptide de séquence SEQ ID n 2 et/ou capable
d'induire des anticorps qui reconnaissent ce polypeptide.
La fabrication de dérivés peut avoir différents objectifs, dont en particulier celui d'améliorer ses taux de production, d'augmenter sa résistance à des protéases, de modifier ses activités biologiques ou de lui conférer de
nouvelles propriétés pharmaceutiques et/ou biologiques.
Avantageusement, I'invention vise un polypeptide comprenant le
domaine d'interaction avec PBR de l'un des polypeptides précédents.
Ce domaine correspond à la séquence comprise entre le résidu 1564 et le résidu 1857 de la séquence SEQ ID n 2. La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques codant pour une protéine PRAX-1 ou des fragments ou
dérivés de celle-ci biologiquement actifs.
Plus préférentiellement, I'invention a pour objet des séquences d'acides nucléiques isolées choisies parmi a) la séquence SEQ ID n 1, b) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID n 1, c) les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider spécifiquement à la séquence SEQ ID n 1 ou à leurs séquences complémentaires, ou de s'hybrider spécifiquement à leurs séquences proximales, d) les séquences dérivées des séquences a), b) et c), du fait de la
dégénérescence du code génétique.
Selon un mode de réalisation préféré, I'invention a pour objet la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 correspondant à l'ADNc de la protéine
humaine de séquence SEQ ID n 2.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n 1. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de
l'homme de l'art.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par
criblage de banques.
Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes nucléotidiques, capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une séquence d'acides nucléiques, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager, codant pour le polypeptide selon l'invention ou un fragment biologiquement actif de celui-ci. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques au niveau des séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus telles que la perte d'hétérozygotie ou le réarrangement génétique, résultant d'un
polymorphisme, de mutations ou d'un épissage différent.
A cet effet, une sonde nucléotidique selon l'invention est mise en contact avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et la séquence nculéotidique d'intérêt, éventuellement après une étape préalable d'amplification de ladite séquence nucléotidique; le complexe d'hybridation éventuellement formé est détecté et la séquence nucléotidique formant le complexe d'hybridation
avec la sonde de l'invention est éventuellement séquence.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également
être utilisées pour la fabrication d'un médicament utile en thérapie génique.
Les sondes de l'invention comportent au moins 10, de préférence au moins 16 nucléotides, et au maximum comportent la totalité de la séquence
du gène PRAX-1 ou de son ADNc contenu par exemple dans un cosmide.
Parmi les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à 20 nucléotides, les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions stringentes usuellement utilisées par l'homme de métier, notamment de forte stringence telles que définies par Sambrook et al. dans Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989. La température utilisée est de préférence comprise entre Tm -5 C à Tm -30 C, de préférence encore entre Tm -5 C et Tm -10 C, Tm étant la température de fusion, température à laquelle 50 % des brins d'ADN appariés se séparent. De manière avantageuse, les conditions d'hybridation utilisées sont les suivantes: - température: 65 C, - tampon d'hybridation: BSA 1%, SDS 7% NaH2PO4 0,5M, EDTA 1mM,
telles que décrites dans l'exemple VII.
Avantageusement, ces sondes sont représentées par les oligonucléotides suivants ainsi que les nucléotides de séquence complémentaire correspondants: SEQIDn 3: GCTCTG TTT GACTATGACCC SEQ ID n 4: AACTTG AAT CCAATGAGC AA SEQ ID n 5: TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC SEQ ID n 6: CCA TCA GGG GGC ACA GGC TC SEQ ID n 7: TGG GCC TTG TAC CCC CAG CT SEQ ID n 8: TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC SEQ ID n 9: CCC CTG CCC GGA AGG GCA GC SEQ ID n 10: TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC SEQ ID n 11: GGG CCT GCT GGC CCC TGT AA SEQ ID n 12: GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC SEQ ID n 13: CCT CTC CGG TCT CTG TTG CCC G SEQ ID n 14: AGG CCC AGG GGG CCT CCG AAG GC SEQ ID n 15: CGC TGC CCG CCT CCT GCT CAT CCT C SEQ ID n 16: TCC TCC AGG GCT GGA GAC TGC CT SEQ ID n 17: GGT TCC AGG ACT TGC TCC TTC CAG AAG SEQ ID n 18: CAG CTC CCT CAC TGG CCA AG SEQ ID n 19: TGG CTC CGG CCA GCC TGC C SEQ ID n 20: TCC GGG TCA CAG GCT ATG CCA T SEQ ID n 21: CC CAG TAC CTA CTG GGC CAC CT SEQ ID n 22: GCT TCC ATA TCT GTG TGA ATG GG SEQ ID n 23: GGT AAG GCA CGG CAG GAG GCT C SEQ ID n 24: GCT GGC TCC TTC TCA CAC TG SEQ ID n 25: GGA GAG CTC ATG GAT GGC CGA AG SEQ ID n 26: CCA GTG AGG TAG AGG AGC TGG SEQ ID n 27: TCC ATT CCC CAG CCT TGC CGG GG SEQ ID n 28: GCT CGA AGA ACA GTG CCG CAG CC SEQ ID n 29: TCG CAA GAG CCA GGG CCT GCA GA SEQ ID n 30: GCTGGAATCGGAGCTCAGCAAG SEQ ID n 31: CCC GTG ATT CTA GGG GAG CCA GAG SEQ ID n 32: GAGTGC AGG GAG CTG CAG GCCA SEQ ID n 33: GGCTGAAGC GGAAGAACG CCGAG SEQ ID n 34: CAA TCT GGA GCT GCT GAG GG SEQ ID n 35: TGAGGTCTGAGGAGAGTTCCAAG SEQ ID n 36: ATG GAG CCA TGG GCA CTG CCC Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier (marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent,
enzymatique, etc.).
Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre, sont incluses dans l'objet de la présente
invention.
Ces méthodes concemrnent par exemple la détection de synthèses anormales (ex. accumulation de produits de transcription) ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et le réarrangement génétique, et les mutations ponctuelles au niveau des séquences nucléotidiques d'acides nucléiques codant pour une protéine PRAX-1, selon la définition donnée précédemment. Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques pour des réactions de séquenç,age ou d'amplification spécifique selon la technique dite de
PCR ou toute variante de celle-ci (Ligase Chain Reaction (LCR),...).
Des paires d'amorces préférées sont constituées par des amorces avantageusement d'au moins 16 nucléotides, choisies sur la séquence
nucléotidique: SEQ ID n 1: séquence humaine de 7033 nucléotides.
Avantageusement, ces amorces sont représentées par les couples suivants: couple n : amorce sens: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n 3) amorce antisens: AAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n 4) - couple n 2: amorce sens: TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC (SEQ ID n 5) amorce antisens: TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n 8) - couple n 3: amorce sens: TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC (SEQ ID n 10) amorce antisens: AAC TTG AAT CCA ATG AGC MAA (SEQ ID n 4) - couple n 4: amorce sens: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n 3) amorce antisens: GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC (SEQ ID n 12) - couple n 5: amorce sens: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n 3) amorce antisens: TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n 8)
les amorces "sens" allant de 5' en 3' et les amorces "anti-sens" de 3' en 5'.
Ces amorces correspondent aux séquences respectivement comprises entre les: - nucléotide n 5091 et nucléotide n 5110 sur SEQ ID n 1 pour SEQ ID n 3
- nucléotide n 6700 et nucléotide n 6719 sur SEQ ID n 1 pour SEQ ID n 4.
- nucléotide n 5475 et nucléotide n 5494 sur SEQ ID n 1 pour SEQ ID n 5 - nucléotide n 5939 et nucléotide n 5958 sur SEQ ID n 1 pour SEQ ID n 8 nucléotide n 6226 et nucléotide n 6245 sur SEQ ID n 1 pour SEQ ID n 10 - nucléotide n 5188 et nucléotide n 5207 sur SEQ ID n 1 pour SEQ ID n 12 Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de protéines recombinantes PRAX-1, selon la
définition qui a été donnée à ce terme.
Ces protéines peuvent être produites à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence nucléotidique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant sa
transcription et son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'une protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale,
et d'une cellule hôte compatible.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes, de mammifères, notamment CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par la
bactérie E. colt, notamment la souche MC 1061 (Clontech).
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que les régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de
la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des
méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation.
Les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant au moins I'une des séquences nucléotidiques définies ci-dessus font également partie de
la présente invention.
Un vecteur de clonage et d'expression employé est le plasmide pZeoSV2(+) (Invitrogen, V850-01) qui comporte à la fois les éléments nécessaires pour son utilisation comme vecteur de clonage dans E.coli (origine de réplication dans E. coli et gène de résistance à la Zeocin), et comme vecteur d'expression dans les cellules animales (promoteur, signal de polyadenylation, origine de réplication du virus SV40), ainsi que les éléments permettant sa copie en simple brin dans un but de séquençage (origine de réplication du phage fl). L'intégration des ADNc provenant des séquences d'acides
nucléiques de l'invention est par ailleurs décrite dans les exemples ciaprès.
Selon un mode de réalisation préféré, les protéines de l'invention sont sous forme de protéines de fusion, notamment sous forme de protéine fusionnée avec la glutathione S-transférase (GST). Un vecteur d'expression désigné dans ce cas est représenté par le vecteur plasmidique pGEX-4T-2
(Pharmacia ref-27.4581-01).
L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées par ces vecteurs précédents. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant de séquence SEQ ID n 2 ou de tout fragment ou
dérivé biologiquement actif de celui-ci.
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante est elle-même comprise dans la présente invention, et se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transfectées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant de séquence SEQ ID n 2 ou de tout fragment ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et que l'on
récupère ledit polypeptide recombinant.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine "porteuse" (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le
partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Avantageusement, les polypeptides de l'invention sont fusionnés avec la glutathion S-transférase en position N-terminale (système "GST" Pharmacia). Le produit de fusion est dans ce cas détecté et quantifié grâce à l'activité enzymatique de la GST. Le réactif colorimétrique utilisé est un accepteur de glutathion, substrat de la GST. Le produit recombinant est purifié sur un support de chromatographie auquel ont été préalablement couplées des
molécules de glutathion.
Les anticorps mono ou polyclonaux spécifiquement dirigés contre une protéine PRAX-1 selon la définition donnée précédemment font également partie de l'invention. Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre la protéine, produite par exemple par recombinaison génétique suivant la méthode décrite ci-dessus, selon les modes
opératoires usuels.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein, Nature, 1975,
256, 495-497.
Des anticorps avantageux sont des anticorps dirigés contre des épitopes localisés dans la région comprise entre le résidu 1564 et le résidu 1857
pour la séquence SEQ ID n 2.
Les anticorps selon l'invention peuvent se présenter sous forme
d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués.
Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides recombinants, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces
polypeptides dans un échantillon biologique.
Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de la protéine PRAX-1 sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques. Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation o l'expression d'une protéine PRAX-1 doit être observée. L'invention concerne donc également un procédé de diagnostic in vitro d'états pathologiques corrélés à une expression ou une accumulation anormale de protéines PRAX-1, à partir d'un prélèvement biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact au moins un anticorps de l'invention avec ledit prélèvement biologique, dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre une protéine PRAX-1 et le ou lesdits anticorps et en ce que l'on détecte quantitativement les complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. L'invention concerne également un kit pour le diagnostic in vitro d'une expression ou une accumulation anormale de la protéine PRAX-1 dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression de celle-ci dans ledit prélèvement comprenant: - au moins un anticorps spécifique de la protéine PRAX-1, éventuellement fixé sur un support, - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la protéine PRAX-1 et ledit anticorps et/ou
des moyens de quantification de ces complexes.
L'invention vise également toute méthode de diagnostic par la mise en évidence dans le sérum d'un individu, d'auto-anticorps dirigés contre la
protéine PRAX-1.
Une telle méthode de diagnostic précoce est caractérisée en ce que l'on met en contact un échantillon de sérum prélevé chez un individu avec un polypeptide de l'invention, éventuellement fixé sur un support, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et les auto-anticorps éventuellement présents dans l'échantillon de sérum, et en ce que l'on détecte les complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. L'invention a également pour objet une méthode de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une insertion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique du gène PRAX-1, pouvant être impliquées dans des pathologies, caractérisée en ce qu'elle utilise au moins une séquence nucléotidique décrite ci-dessus. Parmi les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une insertion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique du gène PRAX-1, on préfère une méthode comprenant au moins une étape d'amplification par PCR de la séquence nucléique cible de PRAX-1 susceptible de présenter un polymorphisme, une mutation, une délétion ou une insertion à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques définies ci-dessus, une étape au cours de laquelle on procède au traitement des produits amplifiés à lI'aide d'enzymes de restriction appropriées et une étape au cours de laquelle on procède à la détection ou au dosage d'au moins l'un des produits de la réaction enzymatique. L'invention comprend également des compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif un polypeptide répondant aux définitions précédentes, préférentiellement sous forme soluble, associé à un
véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Ces compositions pharmaceutiques sont destinées à être administrées à des sujets ayant une expression déficiente en protéine PRAX-1, associée à des états pathologiques ou encore présentant un état pathologique
impliquant PRAX-1 ou son récepteur.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent également contenir un inhibiteur ou inactivateur de l'activité de PRAX-1 et de toute interaction protéine-protéine faisant intervenir PRAX-1, notamment un
polypeptide dérivé d'un polypeptide tel que défini précédemment.
Préférentiellement, ces compositions peuvent être administrées par voie systémique, de préférence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire,
intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. L'invention est illustrée par les exemples suivants pour lesquels on se référera à la figure annexée qui est une représentation schématique avec une carte de restriction partielle du plasmide pZeoSV2(+ ) contenant le PRAX-1 (2H) humain.
EXEMPLE I
Isolement et identification de PRAX-1 1) Stratégie double hybride La technique du double hybride est une méthode de clonage par interaction in vivo chez la levure Saccharomyces cerevisiae. L'objet de cette technique est de détecter in vivo les interactions protéine-protéine et rechercher les partenaires protéiques d'une protéine donnée utilisée comme appât. L'appât utilisé est défini sur la séquence protéique de PBR. La définition de l'appât PBR doit se limiter aux régions hydrophiles de la protéine selon des contraintes de la technique du double hybride. Comme la protéine PBR est fortement hydrophobe, avec 5 régions transmembranaires, localisée sur la membrane mitochondriale externe, nous définissons l'appât PBR à partir du motif C-terminal de la protéine, région démontrée cytosolique et accessible à d'éventuels partenaires protéiques par l'existence d'un anticorps monoclonal anti-PBR dirigé contre cette région de la protéine. Un appât PBR construit sur la base de ce motif C-terminal, par juxtaposition trois fois des 14 acides aminés C-terminaux de PBR a été sélectionné. 2) Construction de l'appât PBR L'appât PBR est une construction synthétique qui juxtapose trois fois le motif C-terminal de PBR, domaine aa156 à 169, séparé par des linkers de glycine: séquence protéique appât:
RDNHGWHGGRRLPE-gly-gly-RDNHGWHGGRRLPE-gly-gly-
RDNHGWHGGRRLPE
soit 46 acides aminés.
La séquence nucléotidique codant pour l'appât PBR est clonée
dans le vecteur pGBT9 (Clontech) en sites EcoRI et Xhol.
3) Criblage des banques de fusion La lignée HF7c est d'abord transformée par le plasmide appât puis par la banque de fusion choisie (cerveau foetal, Matchmaker library, Clontech) selon la méthode définie par Schiestl et ai. Curr. Genet., 1989, 16, 339-346. Le criblage double hybride est réalisée sur 2.106 cellules. Les clones HIS+ et LacZ+ sont repérés et testés pour leur spécificité en remplaçant l'appât PBR par
d'autres constructions non relevantes.
Les tests de sélection et de spécificité, réalisés dans les conditions définies dans Matchmaker Library User Manuel (Clontech), permettent d'isoler 4
clones positifs.
4) Identification de PRAX<-1 L'insert contenu dans chacun des clones est séquence avec le kit de séquençage ABI PRISMTM Dye Terminator cycle sequencing Ready reaction Kit, selon les instructions définies dans le protocole d'utilisation, sur séquenceur Applied Biosystems model 373A. Les 4 clones contiennent une séquence identique de 2152pb contenant une queue polyA, un codon STOP, inconnue dans les banques de données. Cette séquence a été baptisée PRAX-1 pour Peripheral benzodiazepine Receptor Associated Protein 1. La séquence isolée par double hybride code pour un polypeptide de 294 acides aminés et est
incomplète: il manque le codon ATG codant pour la méthionine initiale en 5'.
L'obtention de la séquence complète de PRAX-1 est décrite dans l'exemple Il.
EXEMPLE II
Obtention de la séquence entière et clonage de l'ADNc de la protéinehumaine PRAX-1 1) Criblage de la banque a) La banque La banque sélectionnée est une banque lamda Zap cDNA cortex
frontal (Stratagène).
b) Préparation des membranes Les clones de la banque sont étalés sur du milieu LB gélosé, maltose 0,2%, MgSO4 lOmM (boîtes de petri diamètre 150) revêtu de membranes Hybond (Amersham). Après une nuit à 37 C, les clones sont transférés par contact sur de nouvelles membranes. Ces dernières sont traitées en les déposant sur du papier Whatman 3 mm imbibé des solutions suivantes NaOH 0.5 N, NaCI 1.5 M pendant 2 minutes puis Tris HCI 0.5 M pH 8, NaCI 1.5 M pendant 5 minutes, enfin 30 sec sur Tris HCI 0,2M pH 7,5, SSC 2X. Les membranes sont séchées puis incubées au four sous vide à 80 C pendant 2 heures. c) Préparation des sondes PRAX-1 Différentes sondes PRAX-1 sont successivement employées définies sur la séquence nucléotidique SEQ ID n 1. Les sondes sont marquées au oE 32p en utilisant le kit RTS Rad Prime DNA labeling system (Gibco BRL). Les sondes sont préparées avec une activité spécifique de 5 108 dpm/pg en moyenne. d) Préhybridation et hybridation Les membranes préparées en b) sont préhybridées 30 minutes à 42 C dans 6 x SSC, 5 x Denhart's, 0,1 % SDS puis hybridées pendant la nuit dans le même tampon additionné de la sonde préparée en c) à raison de
106 dpm/ml.
e) Lavage et exposition des membranes Les membranes sont lavées deux fois à température ambiante dans
le tampon 2 x SSC/SDS 0.1 % puis une heure à 56 C en 6 x SSC/SDS 0.1 %.
Les clones hybrides sont révélés par autoradiographie et sélectionnés après
multiple screening.
2) Séquençage des clones obtenus PRAX-1 Le criblage séquentiel de la banque lambda Zap a permis d'isoler des clones contenant l'ADNc codant pour la protéine entière PRAX-1. La séquence est obtenue à l'aide du kit ABI PRISMTM Dye Terminator cycle sequencing Ready reaction Kit, selon les instructions définies dans le protocole
d'utilisation, sur séquenceur Applied Biosystems model 373A.
La séquence nucléotidique complète codante pour PRAX-1 est de
7033pb, présentée en annexe.
Elle code pour un polypeptide de 1857 acides aminés, de poids
moléculaire 200 kDa. La portion isolée par double hybride est l'extrémité C-
terminale, de 294 acides aminés C-terminaux, correspondant sur la séquence codante SEQ ID n 1 à la région 4887 à 7033. La portion de PRAX- 1 isolée dans le screening double hybride est référencée PRAX-1 (2H) et correspond au
domaine s'étendant des acides aminés 1564 à 1857 sur SEQ ID n 2.
EXEMPLE III
1) Production de protéine recombinante PRAX-1 dans E. Co/i a) Construction du plasmide d'expression Elle consiste à insérer la séquence codante pour la portion 2H de PRAX-1 (294 acides aminés C- terminaux de PRAX-1) en phase avec la glutathione S-transférase (GST) dans le vecteur pGEX 4T2 (Pharmacia). Pour cela l'insert correspondant (pb 4887 à 7033) est cloné en site Smal dans le vecteur pGEX 4T2. L'insert et le plasmide sont digérés puis purifiés après migration sur gel d'agarose 1% à l'aide du kit Geneclean (Bio1 01). Après ligation avec 100ng d'insert et 10ng de vecteur déphosphorylé et transformation par choc thermique, les clones E. coli recombinants sont vérifiés par séquenç,age à
l'aide du kit Applied Biosystem (Perkin Elmer).
b) Expression et purification de la protéine de fusion GST-PRAX-
1(2H)
Cette étape a été réalisée en utilisant le kit " Bulk GST purification
module " (Pharmacia).
Un clone recombinant a été mis en culture à 37 C dans un litre de milieu de culture LB (bactotryptone 10g/l, extrait de levure 5g/l, NaCI 10g/l) + ampicilline 100pg/ml. A DO6onm 0,8, I'expression est induite avec 0,5mM d'IPTG pendant 2h à 37 C. Après centrifugation, le culot cellulaire est repris dans du PBS froid puis soniqué par ultrasons. Après centrifugation à 12000g, pendant 10 min à 4 C, on récupère le surnageant. La purification est ensuite réalisée sur une colonne de chromatographie d'affinité glutathion sepharose 4B. La fixation et le lavage sont réalisés en tampon PBS et l'élution est réalisée par compétition
avec du glutathion réduit. La concentration finale en protéine de fusion GST-
PRAX-1 (2H) est variable entre 0,5 et 1 mg/ml selon les préparations.
2) Production de protéine recombinante PRAX-1 dans les cellules Jurkat a) Construction du plasmide d'expression L'insert codant pour l'extrémité C-terminale de PRAX-1 est sorti du
plasmide de la banque cerveau foetal pActll-PRAX-1(2H) par digestion par Bglll.
Cette digestion permet de laisser en 5' de l'insert codant pour PRAX1(2H), la séquence codante pour l'épitope HA (hémagglutinine). L'insert ainsi digéré est clone dans pZeo SV2+ en site BamHl. Le vecteur de clonage linéarisé et l'insert sont ligués. Des bactéries "choc thermique" compétentes sont transfectées par cette construction. La construction est vérifiée par séquenç,age (Cf figure en annexe). b) Cellules Jurkat Les cellules Jurkat (leucémie humaine T) sont cultivées dans le milieu RPMI 1640 (Gibco) supplémente avec 50mg/ml de gentamycine et de
% de sérum de veau foetal (Gibco).
c) Transformation des cellules Jurkat Les cellules Jurkat sont transfectées par électroporation à l'aide de l'appareil Biorad Gene Pulser (Biorad), 320V, 250pFr, 5ms. La sélection des clones transfectés est réalisée par Zéocin 500pg/ml en milieu RPMI 1640, 20% SVF. d) Les cellules transfectées sont mises en culture en milieu RPMI1640, 20% SVF, Zéocin 500pg/ml. La production de protéine recombinante HA-PRAX-1 (2H) est vérifiée en utilisant l'anticorps anti-HA (Boerhinger
Mannheim) ou anti-PRAX-1.
3C
EXEMPLE IV
Préparation d'anticorps spécifiques polyclonaux Des peptides immunogènes de 20 acides aminés sont sélectionnés sur la séquence protéique PRAX-1 SEQ ID n 2, dans les portions hydrophiles de la protéine. 5mg de chaque peptide couplé KLH sont utilisés pour immuniser 2 lapins (mâle de 1,5 à 2kg environ, New Zealand). Quatre immunisations ont été effectuées à 15 jours d'intervalle selon le protocole décrit par Vaitukaitis, Methods in enzymology, 1981, 73, 46. Les serums sont recueillis un mois après la première immunisation puis 2 fois successivement à 1 mois et 15 jours d'intervalle. Chaque sérum recueilli est testé en western immunoblotting pour la reconnaissance de la protéine PRAX-1. Les sérums immuns sont purifiés sur colonne d'affinité Affigel (Biorad). La spécificité de reconnaissance de PRAX-1 par les anticorps a été vérifiée par déplacement du marquage obtenu, en présence du peptide immunogène correspondant. Un anticorps polyclonal a ainsi
été obtenu. Sa cible est le peptide AA1772-1792 sur la séquence SEQ ID n 2.
EXEMPLE V
Détection de la protéine PRAX-1 par western immunoblotting (immunoempreinte) 1) Matériels utilisés pour l'immunoempreinte a) Lignées cellulaires utilisées pour l'immunoempreinte Les lignées cellulaires ont été cultivées, comme décrit dans le 3 < " Catalogue of cell lines and hybridomas, 7th edition, 1992 " de I'ATCC (American Type Culture Collection). Lignées humaines: U373 (lignée
astrocytaire), SHSY5Y (neuroblastome), NHA (astrocytes normaux), Jurkat, Molt-
4 (leucémie T), Daudi, U937 (lymphome B), SW480 (adénocarcinome de colon), DU145 (carcinome prostatique), Hacat, SVK14, WS1, NCTC2544, A431, VA ES BJ (kératinocytes). Lignée murine: J744-A1 (monocytes-macrophage). Lignée
de rat: C62b (Gliome).
b) E. caoli exprimant GST-PRAX-1(2H) ou protéine PRAX-1(2H) traduite in vitro La protéine de fusion GST-PRAX-1(2H) est préparée comme indiquée dans l'exemple III. PRAX-1(2H) est préparée en lysat de réticulocytes avec le kit TNT T7/T3 Coupled reticulocyte Lysate system (Promega réf. L5010) selon le protocole d'utilisation défini dans le kit. Le plasmide employé dans ce système est un plasmide pBluescript-PRAX-1(2H) construit par insertion de la séquence codante pour PRAX-1(2H) (nucléotides 4887 à 7033 sur SEQ ID n 1)
dans le vecteur pBluescript (Stratagène) en site BamHl.
2) Préparation des échantillons protéiques à partir des cultures cellulaire Après culture, les cellules sont lavées avec du PBS puis lysées dans le tampon de lyse (6M urée, 50mM Tris HCI pH 6,8, 2% SDS, 10% glycérol, mM DTT, 0,1% bleu de bromophénol). Les lysats sont soniqués par ultrasons
à 4 C pendant 2min, chauffés 10min à 100 C et conservés à -20 C.
3) Western Blot Les échantillons calibrés pour leur contenu protéique sont déposés sur gel SDS-PAGE 4-12% ou 4-20% puis electrotransférés sur une membrane
de nitrocellulose.
4) Révélation par l'anticorps anti-PRAX-1 La membrane est incubée pendant 1 h minimum dans le tampon de blocage TBST (Tris HCI 10mM pH 8, NaCI 150mM, 0,1% Tween 20) additioné de % de lait à température ambiante. La membrane est successivement mise en presence de l'anticorps anti- PRAX-1 dans le même tampon, pendant 3 h à température ambiante, lavée 3 fois pendant 10 min avec du TBST, puis incubée pendant 45 min avec un second anticorps anti-immunoglobuline de lapin couplé à la peroxidase (SIGMA) dans du tampon TBST lait 5%. Après 3 lavages en TBST de 15min, la révélation est réalisée en utilisant le kit ECL (Amersham) par chimioluminescence. ) Résultats Figure en annexe: Les immunoempreintes obtenues avec l'anticorps anti PRAX-1 montrent que celui-ci reconnaît spécifiquement les protéines recombinantes et endogènes. L'analyse des lignées cellulaires humaines montre une expression de la protéine PRAX-1 détectée dans toutes
les lignées testées.
Exemple VI
Localisation chromosomique La localisation chromosomique du gène PRAX-1 a été réalisée par hybridation in situ selon la procédure décrite par Heng et a/. Proc. Natl Acad. Sci. USA (1992), 89, 9509-9513 et Chromosoma (1993), 102, 325-332. La sonde cDNA employée est une sonde de 3,5Kb définie sur la séquence SEQ ID n 1, comprenant l'extrémité 3' du cDNA isolé par double hybride. 100 mitoses ont été analysées, 73 images mitotiques montrent des doubles spots localisés sur une paire de chromosome. Les résultats permettent de localiser le gène PRAX-1
dans la région q22-q23 sur le chromosome 17.
EXEMPLE VII
Expression de l'ARNm PRAX-1 humain L'analyse de l'expression de I'ARNm PRAX-1 a été réalisée sur membrane Multiple Tissue Northern Blot et RNA Master Blot (Clontech) portant des ARN poly A+ de tissus humains séparés par électrophorèse ou déposés en
dot.
Les membranes sont préhybridées 1h à 65 C en tampon Church (BSA 1%, SDS 7%, NaH2PO4 0,5M, EDTA l1mM), hybridées dans le même tampon contenant la sonde cDNA PRAX-1, à 65 C pendant la nuit. Les membranes sont lavées pendant 5 min en tampon SDS 5%, BSA 0,5%, NaH2PO4 mM, EDTA lmM. Les marquages sont révélés par autoradiographie après 24h d'exposition. Une sonde PRAX-1 de 837pb est préparée par PCR en utilisant les amorces SEQ ID n 3 et SEQ ID n 8. La sonde purifiée sur gel par geneClean (Bio101) est radiomarquée au a 32p avec le kit Radprime labeling kit (Gibco)
dans les conditions définies par le protocole de marquage du kit.
Les résultats montrent une expression majoritaire du transcrit PRAX-1 dans le cerveau humain. Le transcrit majoritaire visible est de 7,5Kb en
accord avec la taille du cDNA déterminée après criblage des banques cDNA.
Le transcrit PRAX-1 présente donc une forte expression dans le système nerveux central, avec une expression variable selon les régions du cerveau. En périphérie le thymus, I'hypophyse se distinguent des autres tissus o l'expression est plus faible. Parmi les tissus foetaux, le cerveau foetal donne
un signal fort, suivi par le coeur, le rein, le thymus et le poumon.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT: (A) NOM: Sanofi (B) RUE: 32-34 rue Marbeuf
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75008
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Polypeptide PRAX-1 (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 7033 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 198..5768
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GGCTCCAGCT CCAGCAGCCA TGGCGCCTTG TGCAGCCTCC TTTGTGGGTG GAGAAGAGCT 60
CAGCCAACCT TGGATGGAGC GTCGGTGAAG CAAGAGCTCA GAGGGGAGAG GGGCTGGCCT 120
GGCATGACCG TCGCCAGTCC CCCCACCTGG CTGGGTGATG TCCCCCGGCC CGGGTTCTGG 180
GGCCCCTTGG CAGTACC ATG GAG CAA CTG ACA ACC CTC CCA CGG CCT GGG 230
Met Glu Gln Leu Thr Thr Leu Pro Arg Pro Gly
1 5 10
GAC CTT GGA GCC ATG GAG CCA TGG GCA CTG CCC ACC TGG CAT AGC TGG 278
Asp Leu Gly Ala Met Glu Pro Trp Ala Leu Pro Thr Trp His Ser Trp
20 25
ACT CCA GGT CGA GGG GGT GAA CCT AGC AGT GCA GCC CCA AGC ATC GCT 326
Thr Pro Gly Arg Gly Gly Glu Pro Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ile Ala
35 40
GAT ACT CCT CCG GCA GCT CTG CAG CTT CAA GAA CTG AGG TCT GAG GAG 374
Asp Thr Pro Pro Ala Ala Leu Gln Leu Gln Glu Leu Arg Ser Glu Glu
50 55
AGT TCC AAG CCC AAA GGA CAC GGG AGC TCC AGG CCC GTG GGG GGA ACT 422
Ser Ser Lys Pro Lys Gly His Gly Ser Ser Arg Pro Val Gly Gly Thr
65 70 75
GAC CCT GAA GGA GCA CAG GCT TGT CTG CCC AGC CTG GGC CAG CAA GCA 470
Asp Pro Glu Gly Ala Gln Ala Cys Leu Pro Ser Leu Gly Gln Gln Ala
85 90
TCC AGC TCT GGA CCC GCC TGC CAG AGG CCA GAG GAT GAG GAA GTG GAG 518
Ser Ser Ser Gly Pro Ala Cys Gln Arg Pro Glu Asp Glu Glu Val Glu
100 105
GCT TTC CTG AAG GCC AAG CTG AAT ATG AGC TTT GGG GAC AGG CCC AAT 566
Ala Phe Leu Lys Ala Lys Leu Asn Met Ser Phe Gly Asp Arg Pro Asn
115 120
CTG GAG CTG CTG AGG GCC CTG GGG GAG CTG CGG CAG CGC TGT GCC ATC 614
* Leu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Gly Glu Leu Arg Gln Arg Cys Ala Ile
130 135
CTT AAG GAG GAA AAC CAG ATG CTG AGG AAG AGC AGC TTC CCT GAG ACA 662
Leu Lys Glu Glu Asn Gln Met Leu Arg Lys Ser Ser Phe Pro Glu Thr
145 150 155
GAA GAG AAG GTG CGG AGG CTG AAG CGG AAG AAC GCC GAG CTG GCG GTC 710
Glu Glu Lys Val Arg Arg Leu Lys Arg Lys Asn Ala Glu Leu Ala Val
165 170
ATT GCC AAG CGC CTG GAG GAG AGG GCC CGA AAG CTG CAG GAA ACG AAC 758
Ile Ala Lys Arg Leu Glu Glu Arg Ala Arg Lys Leu Gln Glu Thr Asn
180 185
CTG AGG GTG GTG AGT GCC CCC TTG CCC CGG CCG GGG ACC AGC TTG GAG 806
Leu Arg Val Val Ser Ala Pro Leu Pro Arg Pro Gly Thr Ser Leu Glu
195 200
TTG TGT CGG AAG GCC CTA GCC CGC CAG CGA GCC CGG GAC CTC AGT GAG 854
Leu Cys Arg Lys Ala Leu Ala Arg Gln Arg Ala Arg Asp Leu Ser Glu
205 210 215
ACA GCC AGT GCA CTG CTG GCC AAG GAC AAG CAG ATT GCT GCC TTG CAG 902
Thr Ala Ser Ala Leu Leu Ala Lys Asp Lys Gin Ile Ala Ala Leu Gln
220 225 230 235
CGG GAG TGC AGG GAG CTG CAG GCC AGG CTC ACT CTG GTG GGC AAG GAG 950
Arg Glu Cys Arg Glu Leu Gln Ala Arg Leu Thr Leu Val Gly Lys Glu
240 245 250
GGT CCC CAG TGG CTC CAC GTG CGG GAC TTC GAT CGG CTG CTG CGC GAG 998
Gly Pro Gln Trp Leu His Val Arg Asp Phe Asp Arg Leu Leu Arg Glu
255 260 265
TCC CAG CGG GAG GTG CTG CGG CTG CAG AGG CAG ATC GCG CTG CGC AAC 1046
Ser Gln Arg Glu Val Leu Arg Leu Gln Arg Gln Ile Ala Leu Arg Asn
270 275 280
CAG CGG GAG ACG CTC CCG CTC CCG CCG TCC TGG CCC CCG GGC CCT GCT 1094
Gln Arg Glu Thr Leu Pro Leu Pro Pro Ser Trp Pro Pro Gly Pro Ala
285 290 295
CTC CAG GCC AGA GCA GGG GCG CCT GCT CCC GGG GCC CCG GGA GAG GCC 1142
Leu Gin Ala Arg Ala Gly Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro Gly Glu Ala
300 305 310 315
ACG CCC CAG GAG GAT GCG GAC AAC CTA CCC GTG ATT CTA GGG GAG CCA 1190
Thr Pro Gln Glu Asp Ala Asp Asn Leu Pro Val Ile Leu Gly Glu Pro
320 325 330
GAG AAA GAG CAG AGG GTG CAG CAG CTG GAA TCG GAG CTC AGC AAG AAG 1238
Glu Lys Glu Gln Arg Val Gln Gln Leu Glu Ser Glu Leu Ser Lys Lys
335 340 345
CGG AAG AAA TGC GAG AGC CTG GAG CAG GAA GCC CGG AAA AAG CAG AGG 1286
Arg Lys Lys Cys Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Arg Lys Lys Gln Arg
350 355 360
CAA TGT GAG GAG CTG GAA CTG CAG CTG AGA CAA GCG CAG AAT GAG AAT 1334
Gln Cys Glu Glu Leu Glu Leu Gln Leu Arg Gln Ala Gln Asn Glu Asn
365 370 375
GCC CGC CTG GTG GAG GAG AAC TCC CGG CTC AGT GGG AGA GCC ACA GAG 1382
Ala Arg Leu Val Glu Glu Asn Ser Arg Leu Ser Gly Arg Ala Thr Glu
380 385 390 395
AAG GAG CAG GTG GAG TGG GAG AAT GCG GAG CTG AGG GGC CAG CTC CTG 1430
Lys Glu Gln Val Glu Trp Glu Asn Ala Glu Leu Arg Gly Gln Leu Leu
400 405 410
GGG GTG ACA CAG GAG AGG GAC TCA GCC CTT CGC AAG AGC CAG GGC CTG 1478
Gly Val Thr Gln Glu Arg Asp Ser Ala Leu Arg Lys Ser Gln Gly Leu
415 420 425
CAG AGC AAG CTG GAG AGC CTG GAG CAA GTG CTG AAG CAC ATG CGG GAG 1526
Gln Ser Lys Leu Glu Ser Leu Glu Gln Val Leu Lys His Met Arg Glu
430 435 440
GTG GCC CAG CGG CGG CAG CAG CTG GAG GTG GAG CAT GAA CAG GCT CGG 1574
Val Ala Gin Arg Arg Gln Gin Leu Glu Val Glu His Glu Gin Ala Arg
445 450 455
CTC AGC CTA CGG GAG AAG CAG GAG GAG GTC CGG AGA CTG CAG CAG GCC 1622
Leu Ser Leu Arg Glu Lys Gin Glu Glu Val Arg Arg Leu Gln Gln Ala
460 465 470 475
CAG GCT GAA GCC CAG AGG GAA CAT GAA GGA GCC GTG CAG CTG CTG GAG 1670
Gln Ala Glu Ala Gin Arg Glu His Glu Gly Ala Val Gin Leu Leu Glu
480 485 490
TCT ACC TTG GAT TCC ATG CAG GCC CGG GTT CGA GAG CTC GAA GAA CAG 1718
Ser Thr Leu Asp Ser Met Gin Ala Arg Val Arg Glu Leu Glu Glu Gln
495 500 505
TGC CGC AGC CAA ACC GAG CAG TTC AGC CTC CTG GCA CAA GAA CTC CAG 1766
Cys Arg Ser Gln Thr Glu Gln Phe Ser Leu Leu Ala Gln Glu Leu Gln
510 515 520
GCT TTC CGC CTG CAC CCG GGC CCC TTG GAT CTG CTC ACA TCT GCC CTG 1814
Ala Phe Arg Leu His Pro Gly Pro Leu Asp Leu Leu Thr Ser Ala Leu
525 530 535
GAC TGT GGG AGC CTT GGA GAC TGC CCA CCA CCC CCC TGC TGC TGC TCC 1862
Asp Cys Gly Ser Leu Gly Asp Cys Pro Pro Pro Pro Cys Cys Cys Ser
540 545 550 555
ATT CCC CAG CCT TGC CGG GGG TCT GGC CCC AAA GAC CTT GAC CTC CCG 1910
Ile Pro Gln Pro Cys Arg Gly Ser Gly Pro Lys Asp Leu Asp Leu Pro
560 565 570
CCG GGC TCC CCT GGG CGC TGC ACC CCA AAG TCT TCC GAG CCT GCC CCT 1958
Pro Gly Ser Pro Gly Arg Cys Thr Pro Lys Ser Ser Glu Pro Ala Pro
575 580 585
GCC ACT CTC ACT GGG GTC CCT CGA AGG ACA GCC AAG AAG GCA GAG TCT 2006
Ala Thr Leu Thr Gly Val Pro Arg Arg Thr Ala Lys Lys Ala Glu Ser
590 595 600
CTC TCC AAC TCC TCC CAC TCC GAG TCC ATC CAC AAC AGC CCC AAG TCA 2054
Leu Ser Asn Ser Ser His Ser Glu Ser Ile His Asn Ser Pro Lys Ser
605 610 615
TGC CCT ACA CCT GAG GTG GAC ACA GCC AGT GAG GTA GAG GAG CTG GAG 2102
Cys Pro Thr Pro Glu Val Asp Thr Ala Ser Glu Val Glu Glu Leu Glu
620 625 630 635
GCA GAC AGT GTC TCC CTG CTC CCA GCT GCG CCA GAG GGC AGC CGG GGA 2150
Ala Asp Ser Val Ser Leu Leu Pro Ala Ala Pro Glu Gly Ser Arg Gly
640 645 650
GGA GCC AGG ATC CAG GTC TTC CTA GCA CGT TAT AGC TAC AAC CCC TTT 2198
Gly Ala Arg Ile Gln Val Phe Leu Ala Arg Tyr Ser Tyr Asn Pro Phe
655 660 665
GAG GGT CCC AAT GAG AAT CCA GAA GCA GAG CTT CCG CTG ACA GCT GGC 2246
Glu Gly Pro Asn Glu Asn Pro Glu Ala Glu Leu Pro Leu Thr Ala Gly
670 675 680
GAG TAC ATC TAC ATC TAT GGC AAC ATG GAT GAG GAT GGC TTT TTT GAA 2294
Glu Tyr Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Met Asp Glu Asp Gly Phe Phe Glu
685 690 695
GGA GAG CTC ATG GAT GGC CGA AGG GGC CTG GTC CCT TCC AAT TTT GTA 2342
Gly Glu Leu Met Asp Gly Arg Arg Gly Leu Val Pro Ser Asn Phe Val
700 705 710 715
GAG CGT GTG TCG GAT GAT GAC CTC CTG ACC TCC CTC CCT CCA GAG CTG 2390
Glu Arg Val Ser Asp Asp Asp Leu Leu Thr Ser Leu Pro Pro Glu Leu
720 725 730
GCC GAT TTG TCC CAC AGC TCA GGC CCT GAA CTC AGT TTC CTG AGT GTA 2438
Ala Asp Leu Ser His Ser Ser Gly Pro Glu Leu Ser Phe Leu Ser Val
735 740 745
GGT GGG GGT GGC AGC AGT AGC GGG GGC CAA AGC AGT GTG AGA AGG AGC 2486
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gln Ser Ser Val Arg Arg Ser
750 755 760
CAG CCC AGA CCT GAG GAG GAG GAT GCA GGG GAC GAG CTC AGT CTG AGC 2534
Gln Pro Arg Pro Glu Glu Glu Asp Ala Gly Asp Glu Leu Ser Leu Ser
765 770 775
CCA TCA CCG GAG GGC CTG GGC GAG CCT CCT GCC GTG CCT TAC CCC CGC 2582
Pro Ser Pro Glu Gly Leu Gly Glu Pro Pro Ala Val Pro Tyr Pro Arg
780 785 790 795
CGT CTG GTG GTC CTC AAG CAG CTG GCC CAC AGC GTG GTG CTG GCC TGG 2630
Arg Leu Val Val Leu Lys Gln Leu Ala His Ser Val Val Leu Ala Trp
800 805 810
GAG CCG CCT CCT GAG CAA GTG GAG CTA CAC GGC TTC CAT ATC TGT GTG 2678
Glu Pro Pro Pro Glu Gln Val Glu Leu His Gly Phe His Ile Cys Val
815 820 825
AAT GGG GAG CTG CGA CAG GCC CTG GGG CCT GGG GCG CCA CCC AAG GCC 2726
Asn Gly Glu Leu Arg Gln Ala Leu Gly Pro Gly Ala Pro Pro Lys Ala
830 835 840
GTG CTG GAG AAC CTG GAC CTG TGG GCC GGG CCC CTT CAC ATT TCT GTC 2774
Val Leu Glu Asn Leu Asp Leu Trp Ala Gly Pro Leu His Ile Ser Val
845 850 855
CAG GCC CTG ACT AGC CGG GGC AGC TCT GAC CCA CTG CGC TGT TGC TTG 2822
Gln Ala Leu Thr Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Cys Cys Leu
860 865 870 875
GCG GTG GGT GCC CGG GCC GGA GTG GTG CCC AGC CAG CTG CGG GTC CAT 2870
Ala Val Gly Ala Arg Ala Gly Val Val Pro Ser Gln Leu Arg Val His
880 885 890
CGG TTG ACA GCC ACA TCT GCT GAG ATC ACC TGG GTG CCC GGC AAT AGC 2918
Arg Leu Thr Ala Thr Ser Ala Glu Ile Thr Trp Val Pro Gly Asn Ser
895 900 905
AAC TTG GCC CAT GCC ATC TAC CTC AAT GGG GAA GAA TGC CCA CCT GCC 2966
Asn Leu Ala His Ala Ile Tyr Leu Asn Gly Glu Glu Cys Pro Pro Ala
910 915 920
AGC CCC AGT ACC TAC TGG GCC ACC TTC TGC CAC TTA CGG CCT GGC ACA 3014
Ser Pro Ser Thr Tyr Trp Ala Thr Phe Cys His Leu Arg Pro Gly Thr
925 930 935
CCC TAT CAG GCC CAA GTG GAG GCT CAG CTC CCA CCC CAA GGG CCC TGG 3062
Pro Tyr Gln Ala Gln Val Glu Ala Gln Leu Pro Pro Gln Gly Pro Trp
940 945 950 955
GAA CCA GGC TGG GAG AGG CTG GAG CAG CGG GCT GCC ACC CTG CAG TTC 3110
Glu Pro Gly Trp Glu Arg Leu Glu Gln Arg Ala Ala Thr Leu Gln Phe
960 965 970
ACC ACA CTC CCA GCA GGC CCA CCT GAT GCC CCT CTG GAT GTG CAG ATC 3158
Thr Thr Leu Pro Ala Gly Pro Pro Asp Ala Pro Leu Asp Val Gln Ile
975 980 985
GAG CCT GGG CCC TCC CCT GGG ATC TTG ATC ATC AGT TGG CTC CCA GTC 3206
Glu Pro Gly Pro Ser Pro Gly Ile Leu Ile Ile Ser Trp Leu Pro Val
990 995 1000
ACC ATC GAT GCT GCT GGC ACA TCC AAC GGT GTC CGG GTC ACA GGC TAT 3254
Thr Ile Asp Ala Ala Gly Thr Ser Asn Gly Val Arg Val Thr Gly Tyr
1005 1010 1015
GCC ATC TAC GCT GAT GGG CAG AAG ATC ATG GAG GTG GCC TCA CCC ACG 3302
Ala Ile Tyr Ala Asp Gly Gln Lys Ile Met Glu Val Ala Ser Pro Thr
1020 1025 1030 1035
GCA GGC AGT GTA CTG GTG GAG TTG TCC CAG CTG CAG CTG CTG CAG GTG 3350
Ala Gly Ser Val Leu Val Glu Leu Ser Gln Leu Gln Leu Leu Gln Val
1040 1045 1050
TGT CGT GAG GTG GTC GTG CGC ACC ATG TCG CCC CAC GGG GAG TCG GCG 3398
Cys Arg Glu Val Val Val Arg Thr Met Ser Pro His Gly Glu Ser Ala
1055 1060 1065
GAC TCC ATC CCG GCT CCT ATC ACT CCC GCC CTG GCT CCG GCC AGC CTG 3446
Asp Ser Ile Pro Ala Pro Ile Thr Pro Ala Leu Ala Pro Ala Ser Leu
1070 1075 1080
CCA GCC CGA GTC TCC TGC CCC TCA CCG CAC CCA AGC CCA GAG GCC AGA 3494
Pro Ala Arg Val Ser Cys Pro Ser Pro His Pro Ser Pro Glu Ala Arg
1085 1090 1095
GCG CCC CTT GCT TCA GCC TCC CCA GGG CCT GGA GAC CCC AGC TCT CCT 3542
Ala Pro Leu Ala Ser Ala Ser Pro Gly Pro Gly Asp Pro Ser Ser Pro
1100 1105 1110 1115
CTC CAG CAC CCT GCT CCC CTT GGA ACT CAA GAG CCT CCA GGA GCA CCC 3590
Leu Gln His Pro Ala Pro Leu Gly Thr Gln Glu Pro Pro Gly Ala Pro
1120 1125 1130
CCT GCA AGC CCT TCC AGA GAG ATG GCA AAA GGG TCC CAC GAG GAC CCT 3638
Pro Ala Ser Pro Ser Arg Glu Met Ala Lys Gly Ser His Glu Asp Pro
1135 1140 1145
CCA GCA CCT TGC TCC CAG GAG GAG GCT GGG GCA GCA GTG CTG GGC ACC 3686
Pro Ala Pro Cys Ser Gln Glu Glu Ala Gly Ala Ala Val Leu Gly Thr
1150 1155 1160
TCA GAG GAG AGG ACA GCC AGC ACA TCT ACC CTG GGT GAG AAG GAC CCT 3734
Ser Glu Glu Arg Thr Ala Ser Thr Ser Thr Leu Gly Glu Lys Asp Pro
1165 1170 1175
GGC CCC GCA GCT CCC TCA CTG GCC AAG CAG GAG GCC GAG TGG ACT GCA 3782
Gly Pro Ala Ala Pro Ser Leu Ala Lys Gln Glu Ala Glu Trp Thr Ala
1180 1185 1190 1195
GGA GAG GCC TGT CCG GCC TCC AGC TCC ACC CAG GGA GCA CGG GCC CAG 3830
Gly Glu Ala Cys Pro Ala Ser Ser Ser Thr Gln Gly Ala Arg Ala Gln
1200 1205 1210
CAG GCG CCA AAT ACC GAG ATG TGC CAA GGA GGA GAC CCA GGG TCT GGG 3878
Gln Ala Pro Asn Thr Glu Met Cys Gln Gly Gly Asp Pro Gly Ser Gly
1215 1220 1225
CTG AGG CCC AGG GCT GAG AAG GAG GAC ACA GCA GAG CTT GGG GTT CAT 3926
Leu Arg Pro Arg Ala Glu Lys Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gly Val His
1230 1235 1240
CTG GTG AAC TCC CTC GTG GAC CAC GGC CGC AAC TCA GAC CTG TCA GAC 3974
Leu Val Asn Ser Leu Val Asp His Gly Arg Asn Ser Asp Leu Ser Asp
1245 1250 1255
ATC CAG GAG GAA GAG GAA GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAA GAG GAG CTG 4022
Ile Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Leu
1260 1265 1270 1275
GGT TCC AGG ACT TGC TCC TTC CAG AAG CAG GTT GCT GGC AAC AGC ATC 4070
Gly Ser Arg Thr Cys Ser Phe Gln Lys Gln Val Ala Gly Asn Ser Ile
1280 1285 1290
AGG GAG AAT GGG GCC AAG TCC CAG CCC GAC CCC TTT TGT GAG ACT GAC 4118
Arg Glu Asn Gly Ala Lys Ser Gln Pro Asp Pro Phe Cys Glu Thr Asp
1295 1300 1305
AGC GAT GAG GAG ATC TTG GAG CAG ATC CTG GAG CTG CCC CTC CAG CAG 4166
Ser Asp Glu Glu Ile Leu Glu Gln Ile Leu Glu Leu Pro Leu Gln Gin
1310 1315 1320
TTC TGT AGC AAG AAG CTC TTT AGC ATC CCG GAG GAG GAG GAA GAG GAA 4214
Phe Cys Ser Lys Lys Leu Phe Ser Ile Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1325 1330 1335
GAG GAG GAC GAG GAG GAG GAG AAG TCT GGG GCA GGC TGT TCT TCC CGA 4262
Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Lys Ser Gly Ala Gly Cys Ser Ser Arg
1340 1345 1350 1355
GAC CCT GGC CCG CCT GAA CCT GCA TTG CTG GGG CTG GGC TGT GAC AGT 4310
Asp Pro Gly Pro Pro Glu Pro Ala Leu Leu Gly Leu Gly Cys Asp Ser
1360 1365 1370
GGT CAG CCC CGA AGA CCT GGC CAG TGT CCC TTG TCT CCT GAG TCC TCC 4358
Gly Gln Pro Arg Arg Pro Gly Gln Cys Pro Leu Ser Pro Glu Ser Ser
1375 1380 1385
AGG GCT GGA GAC TGC CTG GAA GAC ATG CCT GGA TTA GTT GGT GGA AGC 4406
Arg Ala Gly Asp Cys Leu Glu Asp Met Pro Gly Leu Val Gly Gly Ser
1390 1395 1400
AGC CGG AGG AGA GGA GGG GGC TCC CCT GAG AAG CCC CCA AGC CGC AGG 4454
Ser Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ser Pro Glu Lys Pro Pro Ser Arg Arg
1405 1410 1415
CGG CCT CCA GAT CCC CGA GAA CAC TGC AGC CGA CTT CTC AGC AAC AAT 4502
Arg Pro Pro Asp Pro Arg Glu His Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asn Asn
1420 1425 1430 1435
GGG CCC CAG GCC TCT GGA CGA CTG GGC CCC ACA CGG GAG AGG GGT GGC 4550
* Gly Pro Gin Ala Ser Gly Arg Leu Gly Pro Thr Arg Glu Arg Gly Gly
1440 1445 1450
CTC CCC GTA ATT GAG GGC CCC AGG ACT GGA CTA GAG GCT AGC GGG AGA 4598
Leu Pro Val Ile Glu Gly Pro Arg Thr Gly Leu Glu Ala Ser Gly Arg
1455 1460 1465
GGC CGG CTG GGC CCT TCC CGG AGG TGC TCC CGT GGC CGG GCG CTG GAG 4646
Gly Arg Leu Gly Pro Ser Arg Arg Cys Ser Arg Gly Arg Ala Leu Glu
1470 1475 1480 CCT GGC CTG GCC AGC TGC CTT TCC CCC AAG TGC TTG GAA ATC AGC ATT 4694
Pro Gly Leu Ala Ser Cys Leu Ser Pro Lys Cys Leu Glu Ile Ser Ile
1485 1490 1495
GAA TAT GAT TCG GAG GAT GAG CAG GAG GCG GGC AGC GGG GGC ATC AGC 4742
Glu Tyr Asp Ser Glu Asp Glu Gln Glu Ala Gly Ser Gly Gly Ile Ser
1500 1505 1510 1515
ATC ACC AGC TCC TGC TAC CCT GGA GAT AGG GAG GCC TGG GGC ACA GCA 4790
Ile Thr Ser Ser Cys Tyr Pro Gly Asp Arg Glu Ala Trp Gly Thr Ala
1520 1525 1530
ACT GTA GGA AGG CCC AGG GGG CCT CCG AAG GCC AAT TCA GGC CCC AAG 4838
Thr Val Gly Arg Pro Arg Gly Pro Pro Lys Ala Asn Ser Gly Pro Lys
1535 1540 1545
CCC TAC CCA CGC CTC CCA GCC TGG GAG AAA GGG GAA CCA GAG CGG AGA 4886
Pro Tyr Pro Arg Leu Pro Ala Trp Glu Lys Gly Glu Pro Glu Arg Arg
1550 1555 1560
GGC CGC AGT GCG ACG GGC AGA GCC AAG GAG CCA CTC TCC CGG GCA ACA 4934
Gly Arg Ser Ala Thr Gly Arg Ala Lys Glu Pro Leu Ser Arg Ala Thr
1565 1570 1575
GAG ACC GGA GAG GCC AGA GGG CAG GAC GGC TCT GGG CGG AGG GGC CCC 4982
Glu Thr Gly Glu Ala Arg Gly Gln Asp Gly Ser Gly Arg Arg Gly Pro
1580 1585 1590 1595
CAG AAG AGA GGT GTC CGA GTC CTC AGG CCA AGC ACT GCA GAG CTA GTC 5030
Gln Lys Arg Gly Val Arg Val Leu Arg Pro Ser Thr Ala Glu Leu Val
1600 1605 1610
CCT GCG AGG AGC CCC TCA GAA ACA CTG GCT TAC CAG CAC CTA CCC GTC 5078
Pro Ala Arg Ser Pro Ser Glu Thr Leu Ala Tyr Gln His Leu Pro Val
1615 1620 1625
AGG ATC TTT GTG GCT CTG TTT GAC TAT GAC CCC GTG TCA ATG TCG CCC 5126
Arg Ile Phe Val Ala Leu Phe Asp Tyr Asp Pro Val Ser Met Ser Pro
1630 1635 1640
AAT CCT GAT GCT GGA GAA GAA GAG CTT CCC TTC CGA GAG GGT CAG ATC 5174
Asn Pro Asp Ala Gly Glu Glu Glu Leu Pro Phe Arg Glu Gly Gln Ile
1645 1650 1655
CTG AAG GTG TTT GGG GAC AAG GAT GCC GAT GGC TTC TAC CAG GGC GAA 5222
Leu Lys Val Phe Gly Asp Lys Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Gln Gly Glu
1660 1665 1670 1675
GGT GGG GGC CGG ACA GGC TAC ATT CCC TGC AAC ATG GTG GCT GAG GTG 5270
Gly Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ile Pro Cys Asn Met Val Ala Glu Val
1680 1685 1690
GCT GTG GAC AGC CCT GCT GGG AGA CAG CAA CTG CTC CAG CGG GGT TAT 5318
Ala Val Asp Ser Pro Ala Gly Arg Gln Gln Leu Leu Gln Arg Gly Tyr
1695 1700 1705
TTG TCC CCA GAT ATT CTC CTT GAG GGC TCA GGG AAT GGT CCG TTT GTG 5366
Leu Ser Pro Asp Ile Leu Leu Glu Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Val
1710 1715 1720
TAC TCC ACA GCC CAC ACA ACT GGG CCT CCT CCC AAG CCC CGC CGC TCC 5414
Tyr Ser Thr Ala His Thr Thr Gly Pro Pro Pro Lys Pro Arg Arg Ser
1725 1730 1735
AAG AAA GCT GAG TCG GAA GGC CCT GCC CAG CCC TGT CCA GGC CCC CCT 5462
Lys Lys Ala Glu Ser Glu Gly Pro Ala Gln Pro Cys Pro Gly Pro Pro
1740 1745 1750 1755
AAG CTG GTC CCC TCT GCT GAC CTG AAA GCT CCC CAC TCC ATG GTG GCT 5510
Lys Leu Val Pro Ser Ala Asp Leu Lys Ala Pro His Ser Met Val Ala
1760 1765 1770
GCA TTT GAC TAC AAC CCC CAG GAG AGT TCC CCC AAT ATG GAC GTG GAG 5558
Ala Phe Asp Tyr Asn Pro Gln Glu Ser Ser Pro Asn Met Asp Val Glu
1775 1780 1785
GCA GAG CTG CCC TTC CGG GCA GGG GAT GTC ATT ACT GTG TTT GGG GGC 5606
Ala Glu Leu Pro Phe Arg Ala Gly Asp Val Ile Thr Val Phe Gly Gly
1790 1795 1800
ACG GAC GAT GAC GGT TTC TAC TAT GGG GAA TTA AAT GGA CAA AGG GGC 5654
Thr Asp Asp Asp Gly Phe Tyr Tyr Gly Glu Leu Asn Gly Gln Arg Gly
1805 1810 1815
CTG GTT CCA TCC AAC TTC CTG GAG GGC CCT GGG CCT GAG GCA GGC GGC 5702
Leu Val Pro Ser Asn Phe Leu Glu Gly Pro Gly Pro Glu Ala Gly Gly
1820 1825 1830 1835
CTG GAC AGG GAA CCC AGG ACA CCC CAG GCT GAG AGT CAG AGA ACG AGG 5750
Leu Asp Arg Glu Pro Arg Thr Pro Gln Ala Glu Ser Gln Arg Thr Arg
1840 1845 1850
AGG AGA AGA GTC CAG TGC TAGATGGAGA TAGATATATG TAGAGAGAGC 5798
Arg Arg Arg Val Gln Cys
AACATGACTG GGGCTGCACC ACACAAGGGT CCCCAGGGCC CCCAGGTGGG CCTTGTACCC 5858
CCAGCTCTGG CAGCGCCCCC AGGATTGAAC GTGGGGAGCC CCAGGGCAGA AGCGAGAAGG 5918
TGTGGGTTTT TTTCCAAGGG GAAGCAGCTC CTCAGGAGGA TGGGCTCTGG GAAGAAGGAG 5978
TGAAGCTGTG GCCCATCCTG CAGGCAGAAG AGGCCCTGAG AGGCCCCCAG ATCACTGTTT 6038
TTGCTGAGCA GGGAAGGCTC AGAATGGGCC CAGAGCCCCC GTTCTTTTGC GTTAACACTG 6098
TGGCATTCAG AGGGAATCAA AGAGCCTTGG TGAAGGTCAG AGCTAAATGG CTCCTTAAGG 6158
ATGAACTTTT TAGAGAAGCA CCTTCCTCCT ACAGGAGGGG AAACTGAGCC CACAGTGAGT 6218
ATGTAACTTG ACCAAGGTCA CTGAGCCAGG ACTGGACCCA GGACCCTCGC GTCCTGGTCC 6278
ACCCACCTCG TCTACTAGTG TCCCACAGTG CTGCGCTAGT CCCTTTTGCC ACCCTTCCCA 6338
GTCCCAGGAC GGGCCCTGGA GGGAGAAAGG AGCCTGTGCC CCCTGATGGC TCTGGCTGTC 6398
CTGATCCTGT CTTCCCTCCC CTGAAGGAAA GTTTGCACTG GATTTTATTG GAGCCCCATC 6458
TCCCCAGCGG GCAGGCGGGC GGAGCCTGTA TATATGTATA TACTCAGTGC CTCAGTTCAG 6518
CTTCCTCCAC CTCGCTTCCA CTGCACAGGC CCAGGAAGGA GAAAGGCCAA GCCAAAGTGG 6578
GCCCCACCCT GCCCCCGTCG TGCTCCATCC TTCCCTGCCG GGGCCTGCTG GCCCCTGTAA 6638
GGTCCCGCCC CCAAAGACCC TGGGGCCAGC GGGGCCGAAA GCGGAGTTGG GTTTGCTTAT 6698
TTTGCTCATT GGATTCAAGT TCTTTTGCAT AGTTTTTTTC TAACCCCTGT TGGAGTCCAG 6758
GGGCTGGAGA AAAGGACAGA TTTATGCAGC TATTTTCATA CATTCCCTGT TCAGAGTGGG 6818
GTAGGGGTTT TCCGCCGTTA CCCGATCCAA TCCATCCCCC ACCCTTTGAG GGGTGAGTGT 6878
GTCTTTGCAT GTTTCCTTTG CTGTGGTGGG AGATAGTTTG ACTGAACCCC CACCTTGACC 6938
TTGGTCTCCA GGGGTGTGGA ATGGTGGGGG AATTTGTTTA AAAAGACATT TTATTATAAT 6998
AAAGTCTATT TTCACAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 7033
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1857 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Glu Gln Leu Thr Thr Leu Pro Arg Pro Gly Asp Leu Gly Ala Met
1 5 10 15
Glu Pro Trp Ala Leu Pro Thr Trp His Ser Trp Thr Pro Gly Arg Gly
25 30
Gly Glu Pro Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ile Ala Asp Thr Pro Pro Ala
40 45
Ala Leu Gin Leu Gln Glu Leu Arg Ser Glu Glu Ser Ser Lys Pro Lys
55 60
Gly His Gly Ser Ser Arg Pro Val Gly Gly Thr Asp Pro Glu Gly Ala
70 75 80
Gln Ala Cys Leu Pro Ser Leu Gly Gln Gln Ala Ser Ser Ser Gly Pro
90 95
Ala Cys Gln Arg Pro Glu Asp Glu Glu Val Glu Ala Phe Leu Lys Ala
105 110
Lys Leu Asn Met Ser Phe Gly Asp Arg Pro Asn Leu Glu Leu Leu Arg
120 125
Ala Leu Gly Glu Leu Arg Gln Arg Cys Ala Ile Leu Lys Glu Glu Asn
135 140
Gln Met Leu Arg Lys Ser Ser Phe Pro Glu Thr Glu Glu Lys Val Arg
150 155 160
Arg Leu Lys Arg Lys Asn Ala Glu Leu Ala Val Ile Ala Lys Arg Leu
170 175
Glu Glu Arg Ala Arg Lys Leu Gln Glu Thr Asn Leu Arg Val Val Ser
185 190
Ala Pro Leu Pro Arg Pro Gly Thr Ser Leu Glu Leu Cys Arg Lys Ala
200 205
Leu Ala Arg Gln Arg Ala Arg Asp Leu Ser Glu Thr Ala Ser Ala Leu
210 215 220
Leu Ala Lys Asp Lys Gln Ile Ala Ala Leu Gln Arg Glu Cys Arg Glu
225 230 235 240
Leu Gln Ala Arg Leu Thr Leu Val Gly Lys Glu Gly Pro Gln Trp Leu
245 250 255
His Val Arg Asp Phe Asp Arg Leu Leu Arg Glu Ser Gin Arg Glu Val
260 265 270
Leu Arg Leu Gln Arg Gin Ile Ala Leu Arg Asn Gln Arg Glu Thr Leu
275 280 285
Pro Leu Pro Pro Ser Trp Pro Pro Gly Pro Ala Leu Gin Ala Arg Ala
290 295 300
Gly Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro Gly Glu Ala Thr Pro Gln Glu Asp
305 310 315 320
Ala Asp Asn Leu Pro Val Ile Leu Gly Glu Pro Glu Lys Glu Gin Arg
325 330 335
Val Gln Gln Leu Glu Ser Glu Leu Ser Lys Lys Arg Lys Lys Cys Glu
340 345 350
Ser Leu Glu Gln Glu Ala Arg Lys Lys Gln Arg Gln Cys Glu Glu Leu
355 360 365
Glu Leu Gln Leu Arg Gln Ala Gln Asn Glu Asn Ala Arg Leu Val Glu
370 375 380
Glu Asn Ser Arg Leu Ser Gly Arg Ala Thr Glu Lys Glu Gln Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Asn Ala Glu Leu Arg Gly Gln Leu Leu Gly Val Thr Gln Glu
405 410 415
Arg Asp Ser Ala Leu Arg Lys Ser Gln Gly Leu Gln Ser Lys Leu Glu
420 425 430
Ser Leu Glu Gln Val Leu Lys His Met Arg Glu Val Ala Gln Arg Arg
435 440 445
Gln Gln Leu Glu Val Glu His Glu Gln Ala Arg Leu Ser Leu Arg Glu
450 455 460
Lys Gln Glu Glu Val Arg Arg Leu Gln Gln Ala Gln Ala Glu Ala Gln
465 470 475 480
Arg Glu His Glu Gly Ala Val Gln Leu Leu Glu Ser Thr Leu Asp Ser
485 490 495
Met Gln Ala Arg Val Arg Glu Leu Glu Glu Gln Cys Arg Ser Gln Thr
500 505 510
Glu Gln Phe Ser Leu Leu Ala Gln Glu Leu Gln Ala Phe Arg Leu His
515 520 525
Pro Gly Pro Leu Asp Leu Leu Thr Ser Ala Leu Asp Cys Gly Ser Leu
530 535 540
Gly Asp Cys Pro Pro Pro Pro Cys Cys Cys Ser Ile Pro Gln Pro Cys
545 550 555 560
Arg Gly Ser Gly Pro Lys Asp Leu Asp Leu Pro Pro Gly Ser Pro Gly
565 570 575
Arg Cys Thr Pro Lys Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ala Thr Leu Thr Gly
580 585 590
Val Pro Arg Arg Thr Ala Lys Lys Ala Glu Ser Leu Ser Asn Ser Ser
595 600 605
His Ser Glu Ser Ile His Asn Ser Pro Lys Ser Cys Pro Thr Pro Glu
610 615 620
Val Asp Thr Ala Ser Glu Val Glu Glu Leu Glu Ala Asp Ser Val Ser
625 630 635 640
Leu Leu Pro Ala Ala Pro Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ile Gln
645 650 655
Val Phe Leu Ala Arg Tyr Ser Tyr Asn Pro Phe Glu Gly Pro Asn Glu
660 665 670
Asn Pro Glu Ala Glu Leu Pro Leu Thr Ala Gly Glu Tyr Ile Tyr Ile
675 680 685
Tyr Gly Asn Met Asp Glu Asp Gly Phe Phe Glu Gly Glu Leu Met Asp
690 695 700
Gly Arg Arg Gly Leu Val Pro Ser Asn Phe Val Glu Arg Val Ser Asp
705 710 715 720
Asp Asp Leu Leu Thr Ser Leu Pro Pro Glu Leu Ala Asp Leu Ser His
725 730 735
Ser Ser Gly Pro Glu Leu Ser Phe Leu Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser
740 745 750
Ser Ser Gly Gly Gln Ser Ser Val Arg Arg Ser Gln Pro Arg Pro Glu
755 760 765
Glu Glu Asp Ala Gly Asp Glu Leu Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly
770 775 780
Leu Gly Glu Pro Pro Ala Val Pro Tyr Pro Arg Arg Leu Val Val Leu
785 790 795 800
Lys Gln Leu Ala His Ser Val Val Leu Ala Trp Glu Pro Pro Pro Glu
805 810 815
Gln Val Glu Leu His Gly Phe His Ile Cys Val Asn Gly Glu Leu Arg
820 825 830
Gln Ala Leu Gly Pro Gly Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Glu Asn Leu
835 840 845
Asp Leu Trp Ala Gly Pro Leu His Ile Ser Val Gin Ala Leu Thr Ser
850 855 860
Arg Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Cys Cys Leu Ala Val Gly Ala Arg
865 870 875 880
Ala Gly Val Val Pro Ser Gln Leu Arg Val His Arg Leu Thr Ala Thr
885 890 895
Ser Ala Glu Ile Thr Trp Val Pro Gly Asn Ser Asn Leu Ala His Ala
900 905 910
Ile Tyr Leu Asn Gly Glu Glu Cys Pro Pro Ala Ser Pro Ser Thr Tyr
915 920 925
Trp Ala Thr Phe Cys His Leu Arg Pro Gly Thr Pro Tyr Gln Ala Gln
930 935 940
Val Glu Ala Gln Leu Pro Pro Gln Gly Pro Trp Glu Pro Gly Trp Glu
945 950 955 960
Arg Leu Glu Gln Arg Ala Ala Thr Leu Gln Phe Thr Thr Leu Pro Ala
965 970 975
Gly Pro Pro Asp Ala Pro Leu Asp Val Gln Ile Glu Pro Gly Pro Ser
980 985 990
Pro Gly Ile Leu Ile Ile Ser Trp Leu Pro Val Thr Ile Asp Ala Ala
995 1000 1005
Gly Thr Ser Asn Gly Val Arg Val Thr Gly Tyr Ala Ile Tyr Ala Asp
1010 1015 1020
Gly Gln Lys Ile Met Glu Val Ala Ser Pro Thr Ala Gly Ser Val Leu
1025 1030 1035 1040
Val Glu Leu Ser Gln Leu Gln Leu Leu Gln Val Cys Arg Glu Val Val
1045 1050 1055
Val Arg Thr Met Ser Pro His Gly Glu Ser Ala Asp Ser Ile Pro Ala
1060 1065 1070
Pro Ile Thr Pro Ala Leu Ala Pro Ala Ser Leu Pro Ala Arg Val Ser
1075 1080 1085
Cys Pro Ser Pro His Pro Ser Pro Glu Ala Arg Ala Pro Leu Ala Ser
1090 1095 1100
Ala Ser Pro Gly Pro Gly Asp Pro Ser Ser Pro Leu Gin His Pro Ala
1105 1110 1115 1120
Pro Leu Gly Thr Gln Glu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Ala Ser Pro Ser
1125 1130 1135
Arg Glu Met Ala Lys Gly Ser His Glu Asp Pro Pro Ala Pro Cys Ser
1140 1145 1150
* Gln Glu Glu Ala Gly Ala Ala Val Leu Gly Thr Ser Glu Glu Arg Thr
1155 1160 1165
Ala Ser Thr Ser Thr Leu Gly Glu Lys Asp Pro Gly Pro Ala Ala Pro
1170 1175 1180
Ser Leu Ala Lys Gln Glu Ala Glu Trp Thr Ala Gly Glu Ala Cys Pro
1185 1190 1195 1200
Ala Ser Ser Ser Thr Gln Gly Ala Arg Ala Gln Gln Ala Pro Asn Thr
1205 1210 1215
Glu Met Cys Gln Gly Gly Asp Pro Gly Ser Gly Leu Arg Pro Arg Ala
1220 1225 1230
Glu Lys Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gly Val His Leu Val Asn Ser Leu
1235 1240 1245
Val Asp His Gly Arg Asn Ser Asp Leu Ser Asp Ile Gln Glu Glu Glu
1250 1255 1260
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gly Ser Arg Thr Cys
1265 1270 1275 1280
Ser Phe Gln Lys Gln Val Ala Gly Asn Ser Ile Arg Glu Asn Gly Ala
1285 1290 1295
Lys Ser Gln Pro Asp Pro Phe Cys Glu Thr Asp Ser Asp Glu Glu Ile
1300 1305 1310
Leu Glu Gln Ile Leu Glu Leu Pro Leu Gln Gln Phe Cys Ser Lys Lys
1315 1320 1325
Leu Phe Ser Ile Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
1330 1335 1340
Glu Glu Lys Ser Gly Ala Gly Cys Ser Ser Arg Asp Pro Gly Pro Pro
1345 1350 1355 1360
Glu Pro Ala Leu Leu Gly Leu Gly Cys Asp Ser Gly Gln Pro Arg Arg
1365 1370 1375
Pro Gly Gln Cys Pro Leu Ser Pro Glu Ser Ser Arg Ala Gly Asp Cys
1380 1385 1390
Leu Glu Asp Met Pro Gly Leu Val Gly Gly Ser Ser Arg Arg Arg Gly
1395 1400 1405
Gly Gly Ser Pro Glu Lys Pro Pro Ser Arg Arg Arg Pro Pro Asp Pro
1410 1415 1420
Arg Glu His Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asn Asn Gly Pro Gin Ala Ser
1425 1430 1435 1440
Gly Arg Leu Gly Pro Thr Arg Glu Arg Gly Gly Leu Pro Val Ile Glu
1445 1450 1455
Gly Pro Arg Thr Gly Leu Glu Ala Ser Gly Arg Gly Arg Leu Gly Pro
1460 1465 1470
Ser Arg Arg Cys Ser Arg Gly Arg Ala Leu Glu Pro Gly Leu Ala Ser
1475 1480 1485
Cys Leu Ser Pro Lys Cys Leu Glu Ile Ser Ile Glu Tyr Asp Ser Glu
1490 1495 1500
Asp Glu Gln Glu Ala Gly Ser Gly Gly Ile Ser Ile Thr Ser Ser Cys
1505 1510 1515 1520
Tyr Pro Gly Asp Arg Glu Ala Trp Gly Thr Ala Thr Val Gly Arg Pro
1525 1530 1535
Arg Gly Pro Pro Lys Ala Asn Ser Gly Pro Lys Pro Tyr Pro Arg Leu
1540 1545 1550
Pro Ala Trp Glu Lys Gly Glu Pro Glu Arg Arg Gly Arg Ser Ala Thr
1555 1560 1565
Gly Arg Ala Lys Glu Pro Leu Ser Arg Ala Thr Glu Thr Gly Glu Ala
1570 1575 1580
Arg Gly Gln Asp Gly Ser Gly Arg Arg Gly Pro Gln Lys Arg Gly Val
1585 1590 1595 1600
Arg Val Leu Arg Pro Ser Thr Ala Glu Leu Val Pro Ala Arg Ser Pro
1605 1610 1615
Ser Glu Thr Leu Ala Tyr Gln His Leu Pro Val Arg Ile Phe Val Ala
1620 1625 1630
Leu Phe Asp Tyr Asp Pro Val Ser Met Ser Pro Asn Pro Asp Ala Gly
1635 1640 1645
Glu Glu Glu Leu Pro Phe Arg Glu Gly Gln Ile Leu Lys Val Phe Gly
1650 1655 1660
Asp Lys Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Gln Gly Glu Gly Gly Gly Arg Thr
1665 1670 1675 1680
Gly Tyr Ile Pro Cys Asn Met Val Ala Glu Val Ala Val Asp Ser Pro
1685 1690 1695
Ala Gly Arg Gln Gln Leu Leu Gln Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Asp Ile
1700 1705 1710
Leu Leu Glu Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Val Tyr Ser Thr Ala His
1715 1720 1725
Thr Thr Gly Pro Pro Pro Lys Pro Arg Arg Ser Lys Lys Ala Glu Ser
1730 1735 1740
Glu Gly Pro Ala Gln Pro Cys Pro Gly Pro Pro Lys Leu Val Pro Ser
1745 1750 1755 1760
Ala Asp Leu Lys Ala Pro His Ser Met Val Ala Ala Phe Asp Tyr Asn
1765 1770 1775
Pro Gln Glu Ser Ser Pro Asn Met Asp Val Glu Ala Glu Leu Pro Phe
1780 1785 1790
Arg Ala Gly Asp Val Ile Thr Val Phe Gly Gly Thr Asp Asp Asp Gly
1795 1800 1805
Phe Tyr Tyr Gly Glu Leu Asn Gly Gln Arg Gly Leu Val Pro Ser Asn
1810 1815 1820
Phe Leu Glu Gly Pro Gly Pro Glu Ala Gly Gly Leu Asp Arg Glu Pro
1825 1830 1835 1840
Arg Thr Pro Gln Ala Glu Ser Gln Arg Thr Arg Arg Arg Arg Val Gln
1845 1850 1855
Cys

Claims (32)

REVENDICATIONS
1. Polypeptide purifié, comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi: a) la séquence SEQ ID n 2; b) une séquence biologiquement active dérivée de SEQ ID n 2; et c) un fragment de la séquence SEQ ID n 2 ayant une activité biologique de même nature que celle du polypeptide de séquence SEQ ID n 2,
ou immunologiquement apparenté au polypeptide de séquence SEQ ID n 2.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence comprise entre: le résidu 1564 et le résidu 1857 de SEQ
ID n 2.
3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il
résulte d'un épissage alternatif de l'ARN messager du gène correspondant.
4. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications
précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide recombinant produit
sous la forme d'une protéine de fusion.
5. Séquence d'acides nucléiques isolée codant pour un
polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes.
6. Séquence d'acides nucléiques isolée selon la revendication , caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: a) la séquence SEQ ID n 1; b) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID n 1; c) les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider spécifiquement à la séquence SEQ ID n 1, ou à leurs séquences complémentaires, ou de s'hybrider spécifiquement à leurs séquences proximales. d) les séquences dérivées des séquences a), b) et c), du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de délétion, d'insertion, d'un
épissage alternatif ou d'une variabilité allélique.
7. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une
séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 5 et 6.
8. Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit du
plasmide pZeoSV2+.
9. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 7 ou 8.
10. Cellule hôte transfectée selon la revendication 9,
caractérisée en ce qu'il s'agit de E. coi MC 1061.
11. Séquence nucléotidique utilisable comme sonde ou amorce caractérisée en ce qu'elle s'hybride spécifiquement avec l'une quelconque des
séquences selon les revendications 5 et 6 ou leurs séquences complémentaires
ou les ARN messagers correspondants ou les gènes correspondants.
12. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 utilisable comme sonde ou amorce, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 16 nucléotides.
13. Séquence nucléotidique selon la revendication 12 utilisable comme sonde, caractérisée en ce qu'elle comprend l'intégralité de la séquence
du gène codant pour l'un des polypeptides de la revendication 1.
14. Sonde ou amorce nucléotidique choisie parmi les oligonucléotides suivants ou leurs complémentaires: SEQ ID n 3: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC SEQ IDn 4: AACTTG AATCCAATGAGC AA SEQ ID n 5: TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC SEQ ID n 6: CCA TCA GGG GGC ACA GGC TC SEQ ID n 7:TGG GCCTTGTAC CCC CAG CT SEQ ID n 8: TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC SEQ ID n 9: CCC CTG CCC GGAAGG GCA GC SEQ ID n 10: TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC SEQ ID n 11: GGG CCT GCT GGC CCC TGT AA SEQ ID n 12: GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC SEQ ID n 13: CCT CTC CGG TCT CTG TTG CCC G SEQ ID n 14: AGG CCC AGG GGG CCT CCG MAAG GC SEQ ID n 15: CGC TGC CCG CCT CCT GCT CAT CCT C SEQ ID n 16: TCC TCC AGG GCT GGA GAC TGC CT SEQ ID n 17: GGT TCC AGG ACT TGC TCC TTC CAG AAMG SEQ ID n 18: CAG CTC CCT CAC TGG CCAAG SEQ ID n 19: TGG CTC CGG CCA GCC TGC C SEQ ID n 20: TCC GGG TCA CAG GCT ATG CCA T SEQ ID n 21: CC CAG TAC CTA CTG GGC CAC CT SEQ ID n 22: GCT TCC ATA TCT GTG TGA ATG GG SEQ ID n 23: GGT MAAG GCA CGG CAG GAG GCT C SEQ ID n 24: GCT GGC TCC C TC TCA CAC TG SEQ ID n 25: GGA GAG CTC ATG GAT GGC CGA AG SEQ ID n 26: CCA GTG AGG TAG AGG AGC TGG SEQ ID n 27: TCC ATT CCC CAG CCT TGC CGG GG SEQ ID n 28: GCT CGA AGA ACA GTG CCG CAG CC SEQ ID n 29: TCG CMAA GAG CCA GGG CCT GCA GA SEQ ID n 30: GCT GGA ATC GGA GOT CAG CMAA G SEQ ID n 31: CCC GTG ATT CTA GGG GAG CCA GAG SEQ ID n 32: GAG TGC AGG GAG CTG CAG GCC A SEQ ID n 33: GGC TGA AGC GGA AGA ACG CCG AG SEQ ID n 34: CMAA TCT GGA GCT GCT GAG GG SEQ ID n 35: TGA GGT CTG AGG AGA GTT CCA AG SEQ ID n 36: ATG GAG CCA TGG GCA CTG CCC
15. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des
revendications 5 et 6 pour la fabrication d'amorces oligonucléotidiques pour des
réactions de séquenç,age ou d'amplification spécifique selon la technique de PCR ou toute variante de celle-ci.
16. Couples d'amorces nucléotidiques choisies parmi les séquences suivantes: - couple n 1 amorce sens: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n 3) amorce antisens: MAAC TTG AAT CCA ATG AGC AA (SEQ ID n 4) - couple n 2: amorce sens: TCT GCT GAC CTG AAA GCT CC (SEQ ID n 5) amorce antisens: TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n 8) - couple n 3: amorce sens: TTG ACC AAG GTC ACT GAG CC (SEQ ID n 1 0) amorce antisens: AAC TTG AAT CCA ATG AGC MAA (SEQ ID n 4) - couple n 4: amorce sens: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n 3) amorce antisens: GCC ATC GGC ATC CTT GTC CC (SEQ ID n 12) - couple n 5: amorce sens: GCT CTG TTT GAC TAT GAC CC (SEQ ID n 3) amorce antisens: TCC TCC TGA GGA GCT GCT TC (SEQ ID n 8)
17. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des
revendications 5 et 6, pour la fabrication d'un médicament utilisable en thérapie
génique.
18. Utilisation d'une séquence selon l'une quelconque des
revendications 5 et 6, pour la réalisation de sondes ou d'amorces nucléotidiques
de diagnostic, ou de séquences antisens utilisables pour la fabrication d'un
médicament utilisable en thérapie génique.
19. Utilisation d'amorces nucléotidiques selon l'une quelconque
des revendications 11 et 12 pour le séquençage.
20. Utilisation d'une sonde ou amorce selon l'une quelconque
des revendications 11 à 16, comme outil de diagnostic in vitro pour la détection,
par des procédures d'hybridation, de séquences d'acides nucléiques codant
pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans des
échantillons biologiques, ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes
ou d'anomalies génétiques.
21. Méthode de diagnostic in vitro pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques au niveau des séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des
revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique selon l'une
quelconque des revendications 11 à 16 avec un échantillon biologique dans des
conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et ladite séquence nucléotidique, éventuellement après une étape préalable d'amplification de ladite séquence nucléotidique; - la détection du complexe d'hybridation éventuellement formé; éventuellement, séquenç,age de la séquence nucléotidique
formant le complexe d'hybridation avec la sonde de l'invention.
22. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une
quelconque des revendications 5 et 6, pour la production d'un polypeptide
recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
23. Méthode de production d'une protéine recombinante PRAX-1 ou fragment ou dérivé biologiquement actif de celle-ci ou fragment immunologiquement apparenté à celle-ci, caractérisée en ce que l'on cultive des cellules transfectées selon la revendication 9 ou 10 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant de séquence SEQ ID n 2 ou fragment ou dérivé biologiquement actif de celui- ci, et que l'on récupère ledit
polypeptide recombinant.
24. Anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont spécifiquement
dirigés contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
25. Utilisation des anticorps selon la revendication précédente, pour la purification ou la détection d'un polypeptide selon l'une quelconque des
revendications 1 à 4 dans un échantillon biologique.
26. Procédé de diagnostic in vitro de pathologies corrélées à une expression ou une accumulation anormale de protéines PRAX-1, à partir d'un prélèvement biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact au moins un anticorps selon la revendication 24 avec ledit prélèvement biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre une protéine PRAX-1 et le ou lesdits anticorps et en ce que l'on détecte les
complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.
27. Kit pour le diagnostic in vitro d'une expression ou une accumulation anormale de protéines PRAX-1 dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression de celles-ci dans ledit prélèvement comprenant: - au moins un anticorps selon la revendication 24, éventuellement fixé sur un support, - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre une protéine PRAX-1 et ledit anticorps
et/ou des moyens de quantification de ces complexes.
28. Méthode de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une insertion, d'une perte d'hétérozygotie ou d'une anomalie génétique du gène PRAX-1 caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre au moins un nucléotide ayant une séquence nucléotidique selon l'une
quelconque des revendications 5 ou 6.
29. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe
actif, un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
30. Composition pharmaceutique selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon la
revendication 2.
31. Composition pharmaceutique contenant un inhibiteur ou un activateur de l'activité du PRAX-1 et de toute interaction protéine- protéine faisant
intervenir PRAX-1.
32. Composition pharmaceutique contenant un polypeptide dérivé
d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en
ce qu'il est un inhibiteur ou un activateur du PRAX-1, ou de toute interaction
protéine-protéine faisant intervenir PRAX-1.
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