FR2777905A1

FR2777905A1 - New bacteria used to produced fermented food products and flavoring chemicals

Info

Publication number: FR2777905A1
Application number: FR9805107A
Authority: FR
Inventors: Christophe Monnet; Georges Corrieu
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 1999-10-29
Anticipated expiration: 2018-04-23
Also published as: FR2777905B1; WO1999055836A1

Abstract

Bacteria (A) that overexpress alpha -acetolactate (I) and/or diacetyl (II) is deficient in alpha -acetolactate decarboxylase (ALC) and has zero, or attenuated, lactate dehydrogenase (LDH) activity. Independent claims are also included for the following: (1) method for obtaining (A) that overexpress (I); (2) medium for selecting bacteria with attenuated LDH activity; (3) preparation of compounds (B) derived from the alpha -acetolactate synthase (ALS) pathway by culturing (A); and (4) food products containing (A), or parts of them, or compounds produced by them.

Description

La présente invention est relative à des bactéries surproductrices d'aacétolactate, précurseur du diacétyle. The present invention relates to overactivating bacteria of aacetolactate, diacetyl precursor.

Elle est en outre relative à un procédé d'obtention de ces bactéries. It is furthermore related to a process for obtaining these bacteria.

La présence de diacétyle est recherchée dans des aliments tels que les fromages frais, le beurre, les margarines ou la crème fraîche. Le diacétyle confère à ces produits un arôme caractéristique de type beurre . Sa présence dans les aliments résulte, soit de l'action de bactéries lactiques au cours du processus de fabrication, lors d'une fermentation, soit de l'utilisation d'additifs aromatiques contenant du diacétyle, ou son précurseur: I'a- acétolactate. The presence of diacetyl is sought in foods such as fresh cheeses, butter, margarines or cream. Diacetyl gives these products a characteristic butter-like aroma. Its presence in foods results either from the action of lactic acid bacteria during the manufacturing process, during fermentation, or from the use of aromatic additives containing diacetyl, or its precursor: α-acetolactate .

Ce sont principalement les bactéries lactiques capables de métaboliser le citrate, telles que les souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, ou les souches appartenant au genre Leuconostoc, qui sont utilisées pour produire du diacétyle. Elles transforment le citrate présent dans le milieu de culture (le lait en contient environ 1,7 g/l) en pyruvate. Une partie du pyruvate est ensuite transformée en a-acétolactate par action de l'aacétolactate synthase, comme l'illustre la figure 1. L'a-acétolactate est un composé instable, qui se décarboxyle spontanément en diacétyle ou en acétoïne. La formation de diacétyle résulte d'une décarboxylation de type oxydative, qui est favorisée en présence d'un oxydant (par exemple en présence d'oxygène). Cependant, la plupart des bactéries lactiques capables d'utiliser le citrate n'accumulent pas d'a-acétolactate dans le milieu de culture en raison de l'action de l'a-acétolactate décarboxylase, qui transforme l'aacétolactate en acétoïne. De ce fait, la production de diacétyle par ces microorganismes est beaucoup plus faible (et en général inférieure à 5 mg/l) que celle d'acétoïne. These are mainly lactic acid bacteria capable of metabolizing citrate, such as strains of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, or strains belonging to the genus Leuconostoc, which are used to produce diacetyl. They transform the citrate present in the culture medium (the milk contains about 1.7 g / l) in pyruvate. Part of the pyruvate is then converted to α-acetolactate by the action of aacetolactate synthase, as shown in Figure 1. α-Acetolactate is an unstable compound which decarboxylates spontaneously to diacetyl or acetoin. The formation of diacetyl results from a decarboxylation of oxidative type, which is favored in the presence of an oxidant (for example in the presence of oxygen). However, most lactic acid bacteria capable of using citrate do not accumulate α-acetolactate in the culture medium due to the action of α-acetolactate decarboxylase, which converts aacetolactate to acetoin. As a result, the production of diacetyl by these microorganisms is much lower (and generally less than 5 mg / l) than that of acetoin.

Plusieurs procédés alimentaires utilisent des souches de L.l.l. diacetylactis capables d'accumuler de l'a-acétolactate dans le milieu de culture. Several food processes use L.l.l. diacetylactis capable of accumulating α-acetolactate in the culture medium.

Dans le procédé de fabrication de beurre, décrit par Veringa et al. (1976,
Milchwissenschaft, 31, 658-662), la-acétolactate produit par un ferment aromatisant est transformé en diacétyle grâce à l'aération de la culture. Un additif aromatique peut également être obtenu par culture, dans du lait, d'un ferment produisant de l'a-acétolactate, puis conversion de l'a-acétolactate en diacétyle par une distillation en présence d'oxygène (Jônsson et al., 1980;
Milchwissenschaft. 35, 461-465 et, brevet US n" 4,454,160). Il existe également des procédés de fabrication d'additifs aromatiques contenant de l'aacétolactate (demande EP-0 247.646). Celui-ci se transforme spontanément en diacétyle après son incorporation dans les aliments.In the buttermaking process, described by Veringa et al. (1976,
Milchwissenschaft, 31, 658-662), the acetolactate produced by a flavoring ferment is converted into diacetyl by the aeration of the culture. An aromatic additive can also be obtained by culturing, in milk, a ferment producing α-acetolactate and then converting the α-acetolactate to diacetyl by distillation in the presence of oxygen (Jônsson et al. 1980;
Milchwissenschaft. 35, 461-465 and US Pat. No. 4,454,160.) There are also processes for the production of aromatic additives containing aacetolactate (application EP-0247.646), which spontaneously converts to diacetyl after its incorporation into Food.

La propriété de certaines souches de L. I. I. diacetylactis d'accumuler de l'a-acétolactate dans le milieu de culture est due à une déficience en aacétolactate décarboxylase. Une souche naturellement déficiente en aacétolactate décarboxylase a été décrite (Hugenholtz, 1993, FEMS
Microbiology Reviews 12, 165-178), et plusieurs méthodes ont été développées pour sélectionner des mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase (brevet FR 2.696.191; demande de brevet FR 2.728.588; Monnet et al., 1997,
Appl. Environ. Microbiol, 63, 793-795; Goupil et al., 1996, Applied and
Environmental Microbiology, 62, 2641-2643 ).The property of some strains of LII diacetylactis to accumulate α-acetolactate in the culture medium is due to a deficiency of aacetolactate decarboxylase. A naturally deficient strain of aacetolactate decarboxylase has been described (Hugenholtz, 1993, FEMS
Microbiology Reviews 12, 165-178), and several methods have been developed for selecting mutants deficient in α-acetolactate decarboxylase (patent FR 2,696,191, patent application FR 2,728,588, Monnet et al., 1997,
Appl. About. Microbiol., 63, 793-795; Goupil et al., 1996, Applied and
Environmental Microbiology, 62, 2641-2643).

La production de diacétyle et d'a-acétolactate par les bactéries lactiques peut être augmentée en agissant sur les conditions de culture ou de mise en oeuvre de ces bactéries, en présence d'oxygène (brevet FR 2 705 015) ou en supplémentant le milieu de culture avec du citrate ou du pyruvate. II a également été proposé de réaliser des cultures continues limitées en lactose (Hugenholtz, 1993, précédemment cité). The production of diacetyl and α-acetolactate by lactic acid bacteria can be increased by acting on the conditions for culturing or using these bacteria, in the presence of oxygen (patent FR 2 705 015) or by supplementing the medium. cultured with citrate or pyruvate. It has also been proposed to carry out limited continuous cultures of lactose (Hugenholtz, 1993, previously cited).

Les travaux menés sur la modification génétique des lactocoques ont montré que seules les souches déficientes en a-acétolactate décarboxylase étaient capables de produire des quantités significatives d'a-acétolactate lors de leur culture dans du lait. Plusieurs travaux ont permis d'obtenir des souches de Lactococcus lactis déficientes en a-acétolactate décarboxylase, et dans lesquelles l'activité a-acétolactate synthase a été amplifiée (Gasson et al., 1996; Lait. 76, 3340; Bensson et al. 1996; Applied Microbiology and
Biotechnology, 45, 107-111; demande de brevet EP 0.500.188). Cependant,
I'amplification de l'a-acétolactate synthase n'a pas permis, à la connaissance du demandeur, d'augmenter fortement la production d'a-acétolactate lors de cultures dans du lait, par rapport aux souches déficientes en a-acétolactate décarboxylase utilisées actuellement dans l'industrie laitière.Work on the genetic modification of lactococci has shown that only the α-acetolactate decarboxylase-deficient strains are able to produce significant amounts of α-acetolactate when cultured in milk. Several studies have made Lactococcus lactis strains deficient in α-acetolactate decarboxylase, and in which α-acetolactate synthase activity has been amplified (Gasson et al., 1996, Milk 76, 3340, Bensson et al. 1996; Applied Microbiology and
Biotechnology, 45, 107-111; patent application EP 0.500.188). However,
The amplification of α-acetolactate synthase did not, to the applicant's knowledge, greatly increase the production of α-acetolactate when cultured in milk, compared to α-acetolactate decarboxylase deficient strains. currently used in the dairy industry.

II a aussi été proposé de construire des souches présentant simultanément plusieurs des caractéristiques suivantes: inactivation des activités a-acétolactate décarboxylase, lactate déshydrogénase, diacétyle réductase, pyruvate formiate lyase, pyruvate déshydrogénase et surexpression des activités a-acétolactate synthase et NADH oxydase (Hugenholtz, 1993, précédemment cité). En particulier, cet auteur mentionne la possibilité de combiner des phénotypes déficients en a-acétolactate décarboxylase, et l'inactivation de la lactate déshydrogénase, ainsi qu'éventuellement d'autres enzymes de la voie du pyruvate. Hugenholtz propose deux méthodes pour augmenter la production d'a-acétolactate. Selon une première méthode, la lactate déshydrogénase serait partiellement inactivée par culture dans des conditions de limitation en lactose. II s'agit donc d'une action sur le métabolisme et non d'une modification génétique. La seconde méthode consiste , à l'aide de la séquence connue de la lactate déshydrogénase de
Lactococcus lactis, de combiner des mutations de l'acétolactate décarboxylase et de la lactate déshydrogénase. Néanmoins, cette solution nécessite obligatoirement l'utilisation de méthodes du génie génétique, et non d'une méthode de mutagenèse classique. Cette inactivation combinée des gènes codant pour la lactate déshydrogénase et l'a-acétolactate décarboxylase, par génie génétique, a aussi été mentionnée par GASSON et al. (1996, Lait, 76, 33-40).It has also been proposed to construct strains simultaneously exhibiting several of the following characteristics: inactivation of the α-acetolactate decarboxylase, lactate dehydrogenase, diacetyl reductase, pyruvate formate lyase and pyruvate dehydrogenase activities and overexpression of α-acetolactate synthase and NADH oxidase (Hugenholtz, 1993, previously cited). In particular, this author mentions the possibility of combining phenotypes deficient in α-acetolactate decarboxylase, and the inactivation of lactate dehydrogenase, as well as possibly other enzymes of the pyruvate pathway. Hugenholtz offers two methods to increase the production of α-acetolactate. According to a first method, the lactate dehydrogenase is partially inactivated by culturing under lactose limitation conditions. It is therefore an action on the metabolism and not a genetic modification. The second method consists, using the known sequence of lactate dehydrogenase
Lactococcus lactis, to combine mutations of acetolactate decarboxylase and lactate dehydrogenase. Nevertheless, this solution necessarily requires the use of genetic engineering methods, and not a conventional mutagenesis method. This combined inactivation of the genes coding for lactate dehydrogenase and α-acetolactate decarboxylase, by genetic engineering, has also been mentioned by GASSON et al. (1996, Milk, 76, 33-40).

Or, la modification de souches par génie génétique (amplification ou disruption de gènes) présente un inconvénient. En effet, I'utilisation dans l'industrie alimentaire de bactéries obtenues par génie génétique est encore difficilement acceptée par les consommateurs de certains pays contrairement à l'utilisation de mutants, qu'ils soient spontanés ou qu'ils résultent de mutations aléatoires. However, the modification of strains by genetic engineering (amplification or disruption of genes) has a disadvantage. Indeed, the use of genetically engineered bacteria in the food industry is still difficult to accept by consumers in some countries, unlike the use of mutants, whether spontaneous or because of random mutations.

En tout état de cause, la fabrication de doubles mutants par génie génétique n'a pas abouti, à la connaissance du demandeur. La non-viabilité de tels mutants peut expliquer cette absence de résultat. In any event, the manufacture of double mutants by genetic engineering has not succeeded to the knowledge of the applicant. The non-viability of such mutants may explain this lack of results.

II ressort de l'analyse de l'état de la technique effectué ci-dessus que l'homme du métier cherchant à augmenter la production en a-acétolactate de bactéries lactiques était confronté à diverses possibilités de modifications dans la voie de synthèse de l'a-acétolactate. Rien ne l'incitait à choisir des étapes particulières. En outre, I'homme du métier était plutôt incité à utiliser les techniques du génie génétique. It follows from the analysis of the state of the art carried out above that a person skilled in the art seeking to increase the production of lactic acid α-acetolactate was faced with various possibilities of modifications in the route of synthesis of the lactic acid bacteria. a-acetolactate. There was no incentive to choose particular steps. In addition, those skilled in the art were rather encouraged to use genetic engineering techniques.

Les inventeurs ont montré qu'il était possible d'obtenir, au moyen de méthodes de mutagenèse classiques, des bactéries surproductrices d'aacétolactate viables, et présentant des caractères stables.. Ces méthodes permettent aux inventeurs d'obtenir des bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase dont l'activité lactate déshydrogénase est atténuée. The inventors have shown that it is possible to obtain, by means of conventional mutagenesis methods, viable overactivating bacteria of aacetolactate, and having stable characters. These methods allow the inventors to obtain bacteria deficient in acetolactate decarboxylase whose lactate dehydrogenase activity is attenuated.

La présente invention a donc pour objet des bactéries surproductrices d'a-acétolactate et/ou de diacétyle caractérisées en ce qu'elles sont déficientes en a-acétolactate décarboxylase et atténuées pour leur activité lactate déshydrogénase. Ces bactéries sont viables et présentent des mutations stables. The present invention therefore relates to overproducing bacteria of α-acetolactate and / or diacetyl characterized in that they are deficient in α-acetolactate decarboxylase and attenuated for their lactate dehydrogenase activity. These bacteria are viable and have stable mutations.

Pour la présente invention, on entendra par bactéries déficientes en aacétolactate décarboxylase, des bactéries dans lesquelles l'activité aacétolactate décarboxylase est nulle ou suffisamment faible, pour permettre une accumulation temporaire d'a-acétolactate en présence de citrate ou de pyruvate. De manière préférentielle, cette accumulation représente au minimum plus de 20%, et préférentiellement plus de 30% de l'ensemble des composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase, c'est-à-dire l'a-acétolactate et ses dérivés (diacétyle, acétoïne et 2,3-butanediol), lorsqu'une culture de la souche est inoculée à 1% dans du bouillon MRS (De Man et al., 1960, J. Appl. For the purposes of the present invention, the term "aacetolactate decarboxylase-deficient bacteria" means bacteria in which the acetoactactolecarboxylase activity is zero or sufficiently low, to allow a temporary accumulation of α-acetolactate in the presence of citrate or pyruvate. Preferably, this accumulation represents at least more than 20%, and preferably more than 30% of all the compounds resulting from the α-acetolactate synthase pathway, that is to say the α-acetolactate and its derivatives (diacetyl, acetoin and 2,3-butanediol), when a culture of the strain is inoculated to 1% in MRS broth (De Man et al., 1960, J. Appl.

Bacteriol, 23, 130-135) modifié, supplémenté avec 10 mM de citrate ou de pyruvate de sodium. On notera que malgré la déficience en a-acétolactate décarboxylase, l'acétone constitue une partie des composés de la voie de l'aacétolactate synthase, du fait de l'existence d'autres voies de synthèse de ce composé.Bacteriol, 23, 130-135) modified, supplemented with 10 mM citrate or sodium pyruvate. Note that despite the deficiency of α-acetolactate decarboxylase, acetone is a part of the compounds of the aacetolactate synthase pathway, because of the existence of other routes of synthesis of this compound.

Des bactéries présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée sont telles que l'activité lactate déshydrogénase est suffisamment faible, pour ne permettre la synthèse que d'une quantité limitée de lactate. Bacteria with attenuated lactate dehydrogenase activity are such that the lactate dehydrogenase activity is sufficiently low to only allow the synthesis of a limited amount of lactate.

Avantageusement, cette activité est telle qu'elle permet la transformation d'au minimum 3 mM et préférentiellement plus de 10 mM dé glucose en composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase, lorsqu'une culture de la souche est inoculée dans du bouillon MRS modifié dépourvu de citrate.Advantageously, this activity is such that it allows the transformation of at least 3 mM and preferably more than 10 mM glucose into compounds derived from the α-acetolactate synthase pathway, when a culture of the strain is inoculated into modified MRS broth without citrate.

Avantageusement, de telles bactéries présentent une activité spécifique en lactate déshydrogénase inférieure à 10, et préférentiellement inférieure à 5 U/mg de protéines, et une activité a-acétolactate décarboxylase inférieure à environ 0,1 U/mg et préférentiellement inférieure à 0,01 U/mg de protéines. Ces activités sont mesurées comme décrit par Boumerdassi et al. Advantageously, such bacteria have a specific lactate dehydrogenase activity of less than 10, and preferably less than 5 U / mg of proteins, and an α-acetolactate decarboxylase activity of less than about 0.1 U / mg and preferably less than 0.01. U / mg of protein. These activities are measured as described by Boumerdassi et al.

(1997, Appl. Environ. Microbiol., 63, 2293-2299). L'activité spécifique de la lactate déshydrogénase est mesurée en suivant la décroissance de
I'absorbance à 340 nm. La mesure est effectuée dans un tampon de trismaléate à 50 mM pH 7, contenant 100 ,ul d'extrait cellulaire, 10 mM de pyruvate de sodium, 1 mM de fructose 1,6-diphosphate et 0,15 mM de NADH.(1997, Appl., Microbiol., 63, 2293-2299). The specific activity of lactate dehydrogenase is measured by following the decay of
Absorbance at 340 nm. The measurement is carried out in a 50 mM trismaleate buffer pH 7, containing 100 μl of cell extract, 10 mM sodium pyruvate, 1 mM fructose 1,6-diphosphate and 0.15 mM NADH.

L'activité a-acétolactate décarboxylase est mesurée plus précisément comme décrit par Phalip et al. (1994, FEBS Lett., 351, 95-99). L'activité est mesurée à 30"C dans un milieu réactionnel contenant 200 mM de phosphate de potassium, 40 mM de L-leucine (pH 6) et la solution enzymatique. La réaction est initiée par addition de 50 mM de D-a-acétolactate. La concentration en acétoïne a été mesurée juste après l'addition d'a-acétolactate dans le milieu réactionnel et à nouveau 15 min après par la méthode de
Westerfeld. L'a-acétolactate subissant une décarboxylation non-enzymatique lente (3 % par heure à pH 6 à 30oC) en diacétyle ou en acétoïne, qui donne une coloration similaire, un témoin a été effectué sans l'enzyme et la production d'acétoïne a été corrigée en fonction de la décarboxylation non-enzymatique.The α-acetolactate decarboxylase activity is measured more precisely as described by Phalip et al. (1994, FEBS Lett., 351, 95-99). The activity is measured at 30 ° C. in a reaction medium containing 200 mM potassium phosphate, 40 mM L-leucine (pH 6) and the enzyme solution The reaction is initiated by the addition of 50 mM Da-acetolactate. The concentration of acetoin was measured just after the addition of α-acetolactate in the reaction medium and again 15 minutes later by the method of
Westerfeld. Since α-acetolactate undergoes a slow non-enzymatic decarboxylation (3% per hour at pH 6 at 30 ° C.) of diacetyl or acetoin, which gives a similar coloration, a control was carried out without the enzyme and the production of acetoin was corrected for non-enzymatic decarboxylation.

Une unité d'activité a-acétolactate décarboxylase représente la formation de 1 mole d'acétoïne par minute.One unit of α-acetolactate decarboxylase activity represents the formation of 1 mole of acetoin per minute.

De telles bactéries peuvent être des bactéries rentrant dans la fabrication d'aliments. Elles sont préférentiellement des bactéries lactiques. Such bacteria may be bacteria in food manufacturing. They are preferably lactic acid bacteria.

Elles appartiennent avantageusement aux genres Lactobacillus ou
Lactococcus.They advantageously belong to the genera Lactobacillus or
Lactococcus.

De telles bactéries sont encore plus préférentiellement les souches de
Lactococcus lactis déposées auprès de la Collection Nationale de Culture des
Microorganismes de l'lnstitut Pasteur le 19 Mars 1998, respectivement sous les N 1-1993 (MR3-Tl), 1-1994 (MR3 T5) et 1-1995 (MR3 T7).Such bacteria are even more preferentially the strains of
Lactococcus lactis deposited with the National Collection of Culture of
Microorganisms of the Pasteur Institute on March 19, 1998, respectively under N 1-1993 (MR3-Tl), 1-1994 (MR3 T5) and 1-1995 (MR3 T7).

L'invention n'est néanmoins pas limitée à ces deux genres, et s'applique à tout genre de bactéries présentant ces activités enzymatiques. The invention is nevertheless not limited to these two genera, and applies to any kind of bacteria exhibiting these enzymatic activities.

De telles bactéries peuvent être obtenues par un procédé comprenant les étapes suivantes:
- mutagenèse de bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase,
- ensemencement des bactéries sur un milieu de sélection adapté, et
- sélection des mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase, et présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée.Such bacteria can be obtained by a process comprising the following steps:
mutagenesis of bacteria deficient in α-acetolactate decarboxylase,
- seeding bacteria on a suitable selection medium, and
selection of mutants deficient in α-acetolactate decarboxylase, and having an attenuated lactate dehydrogenase activity.

Un tel procédé peut être mis en oeuvre à partir de bactéries déjà déficientes en a-acétolactate décarboxylase. II peut aussi être mis en oeuvre à partir de bactéries ne présentant pas de déficience ou d'atténuation pour les deux enzymes, auquel cas le procédé comprendra une ou plusieurs étapes supplémentaires de sélection de bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase. Such a method can be implemented from bacteria already deficient in α-acetolactate decarboxylase. It can also be carried out from non-deficient or attenuating bacteria for both enzymes, in which case the process will include one or more additional steps of selecting α-acetolactate decarboxylase deficient bacteria.

Ainsi, un tel procédé peut comprendre les étapes suivantes:
- mutagenèse de bactéries présentant une activité a-acétolactate décarboxylase et lactate deshydrogénase,
- ensemencement des bactéries sur un milieu adapté à la sélection de mutants présentant une activité lactate deshyd rogénase atténuée,
- sélection de mutants présentant une activité lactate deshydrogénase atténuée,
- ensemencement des bactéries sur un milieu permettant la sélection de mutants déficients en activité a-acétolactate décarboxylase,
- sélection de mutants présentant une activité lactate deshydrogénase atténuée et déficients en a-acétolactate décarboxylase
La sélection des bactéries pour leur déficience en a-acétolactate décarboxylase, peut être effectuée avant l'étape de sélection pour leur activité lactate déshydrogénase atténuée, mais peut être aussi effectuée après cette dernière étape de sélection.Thus, such a method can comprise the following steps:
mutagenesis of bacteria having α-acetolactate decarboxylase and lactate dehydrogenase activity,
inoculation of the bacteria on a medium adapted to the selection of mutants having an attenuated lactate dehydrogenase activity,
selection of mutants with attenuated lactate dehydrogenase activity,
inoculation of the bacteria on a medium allowing the selection of mutants deficient in α-acetolactate decarboxylase activity,
selection of mutants exhibiting attenuated lactate dehydrogenase activity and deficient in α-acetolactate decarboxylase
The selection of bacteria for their α-acetolactate decarboxylase deficiency may be performed prior to the selection step for their attenuated lactate dehydrogenase activity, but may also be performed after this last selection step.

La sélection de bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase, peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier. Elle peut être effectuée par mutagenèse aléatoire puis criblage des bactéries mutées sur un milieu gélosé comme décrit par Monnet et al. (1997, précédemment cité). The selection of bacteria deficient in α-acetolactate decarboxylase can be carried out by any method known to those skilled in the art. It can be carried out by random mutagenesis and then screening of the mutated bacteria on an agar medium as described by Monnet et al. (1997, previously cited).

Cette sélection est basée sur une conversion du diacétyle produit en un réactif présentant une coloration rouge intense constituée de diméthylglyoximate ammonioferreux.This selection is based on a conversion of the product diacetyl into a reagent having an intense red color consisting of ammonioferrous dimethylglyoximate.

Cependant, toute autre technique d'obtention de mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase est utilisable, et en particulier les techniques décrites dans la demande de brevet FR 2 696 191 ou par Goupil et al. (1996, précédemment citée). II serait également possible d'utiliser une souche naturellement déficiente en a-acétolactate décarboxylase. However, any other technique for obtaining mutants deficient in α-acetolactate decarboxylase is usable, and in particular the techniques described in patent application FR 2 696 191 or by Goupil et al. (1996, previously cited). It would also be possible to use a naturally deficient strain of α-acetolactate decarboxylase.

Le milieu de sélection des mutants présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée est préférentiellement le milieu présentant la composition suivante: Tryptone:entre environ 1 et 5 g/l
Peptone papaïnique de soja: entre environ 2 et 10 g/I
Peptone pepsique de viande: entre environ 1 et 5 g/l
Extrait de viande : entre environ 2 et 10 g/l
Extrait de levure : entre environ 1 et 5 g/l
Glycérophosphate de sodium, 6H2O: entre environ 5 et 30 g/l
Acide ascorbique : entre environ 0,2 et 1 g/l
Sulfate de magnésium : entre environ 0,1 et 0,52 g/l
Hydrogénophosphate de potassium : entre environ 0,2 et 1 g/l
Agar: entre environ 5 et 30 g/l
Glucose : entre environ 5 et 30 g/I
Chlorure de 2,3,5-triphényl tétrazolium: entre environ 0,05 et 0,2 g/l
Eau distillée qsp Il
II peut être néanmoins tout autre milieu permettant de sélectionner des mutants ayant une activité lactate déshydrogénase nulle ou atténuée.The selection medium for the mutants exhibiting an attenuated lactate dehydrogenase activity is preferably the medium having the following composition: Tryptone: between approximately 1 and 5 g / l
Papainic peptone of soy: between about 2 and 10 g / I
Peptone peptone of meat: between about 1 and 5 g / l
Meat extract: between about 2 and 10 g / l
Yeast extract: between about 1 and 5 g / l
Sodium glycerophosphate, 6H2O: between about 5 and 30 g / l
Ascorbic acid: between about 0.2 and 1 g / l
Magnesium sulphate: between about 0.1 and 0.52 g / l
Potassium hydrogen phosphate: between about 0.2 and 1 g / l
Agar: between about 5 and 30 g / l
Glucose: between about 5 and 30 g / I
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride: between about 0.05 and 0.2 g / l
Distilled water qsp It
However, it may be any other medium for selecting mutants having a null or attenuated lactate dehydrogenase activity.

De manière préférentielle, la mutagenèse est aléatoire et est effectuée à l'aide de nitrosoguanidine ou rayons ultraviolets. Néanmoins, d'autres agents mutagènes, tels que des agents mutagènes chimiques, peuvent être utilisés. Preferably, the mutagenesis is random and is carried out using nitrosoguanidine or ultraviolet rays. Nevertheless, other mutagenic agents, such as chemical mutagens, can be used.

Ces mutants peuvent aussi être des mutants spontanés, c'est-à-dire des souches dont les mutations sont apparues sans l'utilisation d'un agent mutagène. These mutants can also be spontaneous mutants, that is to say strains whose mutations have appeared without the use of a mutagenic agent.

Les mutants obtenus peuvent être utilisés en tant que bactéries lactiques aromatisantes dans la fabrication de produits laitiers fermentés (fromages, laits fermentés), de beurre, de crème fraîche. Ils peuvent également être utilisés pour produire un additif alimentaire contenant de l'a-acétolactate ou du diacétyle. Ce type d'additif est utilisé dans la formulation de nombreux aliments (margarines, produits de viennoiseries....). The mutants obtained can be used as flavoring lactic acid bacteria in the manufacture of fermented dairy products (cheeses, fermented milks), butter and cream. They can also be used to produce a food additive containing α-acetolactate or diacetyl. This type of additive is used in the formulation of many foods (margarines, pastries ...).

La présente invention est donc relative à un produit alimentaire contenant au moins une bactérie décrite ci-dessus, ou une partie de cette bactérie, ou un composé de la voie de l'a-acétolactate synthase obtenu à l'aide de cette bactérie. De manière avantageuse, un tel produit est issu du lait ou du lactosérum. The present invention therefore relates to a food product containing at least one bacterium described above, or a part of this bacterium, or a compound of the α-acetolactate synthase pathway obtained with this bacterium. Advantageously, such a product is derived from milk or whey.

La présente invention a en outre pour objet un procédé de production d'arômes du type a-acétolactate ou diacétyle, ou de dérivés de l'a-acétolactate, comprenant les étapes suivantes:
- mise en culture dans des conditions appropriées, d'une bactérie surproductrice en a-acétolactate, telle que décrite ci-dessus, et
- récupération des arômes.The subject of the present invention is furthermore a process for producing aromatics of the α-acetolactate or diacetyl type, or of α-acetolactate derivatives, comprising the following steps:
- culturing under appropriate conditions, a bacterium overproducing α-acetolactate, as described above, and
- recovery of aromas.

Ces arômes peuvent être récupérés par des moyens connus de l'homme du métier, et en particulier par distillation, ou par séchage (atomisation ). These flavors can be recovered by means known to those skilled in the art, and in particular by distillation, or by drying (atomization).

L'utilisation des bactéries selon la présente invention présente de nombreux avantages. Elle permet d'augmenter la teneur en diacétyle des produits laitiers fermentés. En outre, I'utilisation de ces bactéries permet d'améliorer les procédés de fabrication des additifs aromatiques contenant du diacétyle et de l'a-acétolactate, du fait des diminutions des coûts de production de ces additifs. En effet, on note des productivités en a-acétolactate des bactéries surproductrices selon la présente invention, de l'ordre de dix fois supérieures aux souches à partir desquelles des mutations ont été effectuées. The use of bacteria according to the present invention has many advantages. It increases the diacetyl content of fermented dairy products. In addition, the use of these bacteria makes it possible to improve the processes for producing aromatic additives containing diacetyl and α-acetolactate, because of the decreases in the production costs of these additives. Indeed, we note productivities of α-acetolactate overproducing bacteria according to the present invention, of the order of ten times greater than the strains from which mutations have been made.

La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent. The present invention is illustrated without being limited by the following examples.

La figure 1 représente schématiquement la voie métabolique de l'aacétolactate. Figure 1 schematically shows the metabolic pathway of aacetolactate.

Les figures 2A à 2D illustrent respectivement les courbes d'évolution du pH ( figure 2A), des concentrations en diacétyle (figure 2B), en acétoïne (figure 2C), et en a-acétolactate (figure 2D) des souches MR3-T1, MR3-T5 et
MR3-T7, cultivées en anaérobiose partielle dans du lait écrémé à 30"C. FIGS. 2A to 2D respectively illustrate the pH evolution curves (FIG. 2A), diacetyl (FIG. 2B), acetoin (FIG. 2C), and α-acetolactate (FIG. 2D) concentrations of the MR3-T1 strains, MR3-T5 and
MR3-T7, grown in partial anaerobiosis in skim milk at 30 ° C.

Les figures 3A à 3D représentent respectivement les courbes d'évolution du pH (figure 3A) de la concentration en diacétyle (figure 3B), en acétoïne (figure 3C), et en a-acétolactate (figure 3D) lors de cultures aérobies de la souche MR3-T7 (1-1995) dans du lait écrémé, ainsi que dans du lait supplémenté en extrait de levure, en catalase ou en hémoglobine. FIGS. 3A to 3D represent respectively the evolution curves of the pH (FIG. 3A) of the diacetyl concentration (FIG. 3B), acetoin (FIG. 3C), and α-acetolactate (FIG. 3D) during aerobic cultures of the strain MR3-T7 (1-1995) in skimmed milk, as well as in milk supplemented with yeast extract, catalase or hemoglobin.

Les figures 4A à 4C illustrent respectivement l'évolution des concentrations en diacétyle (figure 4A), en acétoïne (figure 4B) et en aacétolactate (figure 4C) du mutant Y8T3, cultivé à 30"C et à pH 5,8 sur un milieu à base de lactosérum, avec 0%, 21% ou 100% d'oxygène dissous. FIGS. 4A to 4C respectively show the evolution of the concentrations of diacetyl (FIG. 4A), acetoin (FIG. 4B) and aacetolactate (FIG. 4C) of the mutant Y8T3, grown at 30 ° C. and at pH 5.8 on a medium. whey based, with 0%, 21% or 100% dissolved oxygen.

EXEMPLE 1: Sélection de mutants surproduisant de l'ascétolactate
Un milieu de culture gélosé (milieu LDHA-20) (tableau 1) a été mis au point pour détecter les mutants de Lactococcus lactis produisant moins de lactate que les souches parentales . 1 ml d'une solution à 10 g/l de TTC (chlorure de 2,3,5-triphényl tétrazolium) stérilisée par filtration est ajouté à 100 ml de gélose avant de couler les boîtes de Pétri. On verse approximativement 60 ml de gélose pour une boite de Pétri de diamètre égal à 14 cm.EXAMPLE 1 Selection of Mutants Overproducing Ascetolactate
An agar culture medium (LDHA-20 medium) (Table 1) was developed to detect mutants of Lactococcus lactis producing less lactate than parental strains. 1 ml of a 10 g / l solution of TTC (filter 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) sterilized by filtration is added to 100 ml of agar before pouring the Petri dishes. About 60 ml of agar are poured into a petri dish of diameter equal to 14 cm.

Sur ce milieu, les souches de Lactococcus lactis sont généralement de couleur blanche. Les mutants moins acidifiants que les souches parentales forment des colonies dont le centre est de couleur brune. Dans le cas où la souche parentale formerait déjà des colonies brunes sur ce milieu, il serait nécessaire d'abaisser sa teneur en glycérophosphate, de sorte que la couleur des colonies soit blanche. On this medium, Lactococcus lactis strains are usually white in color. Less acidifying mutants than parental strains form colonies whose center is brown in color. In the case where the parental strain already forms brown colonies on this medium, it would be necessary to lower its glycerophosphate content, so that the color of the colonies is white.

L'utilisation du milieu LDHA-20 présente plusieurs avantages. Sa mise en oeuvre est simple et de plus il est possible d'examiner rapidement un grand nombre de clones (plus de 1000 clones peuvent être ensemencés sur une boîte de Pétri ayant un diamètre égal à 14 cm). The use of LDHA-20 medium has several advantages. Its implementation is simple and moreover it is possible to rapidly examine a large number of clones (more than 1000 clones can be seeded on a Petri dish having a diameter equal to 14 cm).

A partir de mutants déficients a-acétolactate décarboxylase Y8, MR3 et NO8, sélectionnés à partir des souches de L.I.I. diacetylactis Y, MR et NO, comme décrit par Monnet et al., (1997 précédemment cités) on réalise les opérations suivantes. From mutants deficient α-acetolactate decarboxylase Y8, MR3 and NO8, selected from strains of L.I.I. diacetylactis Y, MR and NO, as described by Monnet et al., (1997 cited above) the following operations are carried out.

Des bactéries sont cultivées pendant 12 h à 30"C dans 5 ml de bouillon M17 (Terzaghi et Sandine, 1975, Applied Microbiology. 29, 807-813). Bacteria are cultured for 12 h at 30 ° C in 5 ml of M17 broth (Terzaghi and Sandine, 1975, Applied Microbiology, 29, 807-813).

Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation, lavées deux fois avec du tampon phosphate (100 mM, pH 7), puis remises en suspension dans 1 ml de tampon contenant du N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG). La concentration en NTG dépend de la souche utilisée, elle est ajustée de manière à obtenir un taux de survie des cellules proche de 10%. Après une incubation d'une heure à 30"C, les cellules sont récupérées par centrifugation, lavées deux fois avec 5 ml de tampon, puis remises en suspension dans 5 ml de bouillon M17. Après une incubation d'une heure à 30"C, la suspension est diluée dans de l'eau peptonée (1 g/l de bactopeptone), puis elle est ensemencée sur des boîtes de Pétri contenant de la gélose LDHA-20. Les boîtes de Pétri sont incubées pendant 48 h à 30"C avant d'être examinées.The cells are then recovered by centrifugation, washed twice with phosphate buffer (100 mM, pH 7), and resuspended in 1 ml of buffer containing N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG). The concentration of NTG depends on the strain used, it is adjusted so as to obtain a cell survival rate close to 10%. After incubation for one hour at 30 ° C, the cells are recovered by centrifugation, washed twice with 5 ml of buffer and then resuspended in 5 ml of M17 broth, after incubation for one hour at 30 ° C. the suspension is diluted in peptone water (1 g / l of bactopeptone), then it is seeded on Petri dishes containing LDHA-20 agar. Petri dishes are incubated for 48 hours at 30 ° C before being examined.

Tous les clones formant des colonies brunes sont ensuite testés individuellement pour leur capacité de production d'a-acétolactate à partir des sucres. Cependant, en raison de l'instabilité de l'a-acétolactate, sa concentration en fin de culture est généralement très inférieure à la concentration maximale observée pendant la culture. Elle ne reflète donc pas la potentialité de production d'a-acétolactate d'une souche. Etant donné que l'aacétolactate ne se dégrade qu'en acétoïne et en diacétyle, et que ces deux composés peuvent être éventuellement réduits en 2,3 butanediol, la concentration totale en diacétyle, acétoïne, a-acétolactate et 2,3 butanediol en fin de culture reflète davantage la capacité de production d'a-acétolactate d'une souche. Tous ces composés sont issus de la voie de l'a-acétolactate synthase. All clones forming brown colonies are then individually tested for their ability to produce α-acetolactate from sugars. However, because of the instability of α-acetolactate, its concentration at the end of culture is generally much lower than the maximum concentration observed during the culture. It does not therefore reflect the potentiality of α-acetolactate production of a strain. Since aacetolactate is only degraded to acetoin and diacetyl, and these two compounds may be reduced to 2,3 butanediol, the total concentration of diacetyl, acetoin, α-acetolactate and 2,3 butanediol in the end of culture more closely reflects the production capacity of α-acetolactate of a strain. All these compounds are derived from the α-acetolactate synthase pathway.

Les résultats relatifs à la recherche de mutants à partir des souches
Y8, MR3 et NO8, sont présentés dans le tableau 2. On constate que seule une faible proportion des clones formant des colonies brunes ont une production de composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase supérieure à 3 mM, dans du bouillon MRS (De Man et al., 1960 J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135) modifié dépourvu de citrate.Results relating to the search for mutants from strains
Y8, MR3 and NO8 are shown in Table 2. It is found that only a small proportion of the clones forming brown colonies have a production of compounds from the α-acetolactate synthase pathway greater than 3 mM in broth. MRS (De Man et al., 1960 J. Appl., Bacteriol 23, 130-135) modified without citrate.

Les valeurs de production des composés issus de la voie de l'aacétolactate synthase sont présentées dans le tableau 3. Les simples mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase (souches Y8, MR3, NO8, FC10,
FM2, CM5, 3M1 et 6M1) ont une production inférieure ou égale à 0,1 mM. Les 46 mutants sélectionnés au cours de cette étude ont une production comprise entre 3,4 et 32,8 mM. Sachant qu'une mole de glucose (sucre contenu dans le bouillon MRS) est nécessaire pour former une mole de diacétyle, d'acétoïne, d'a-acétolactate ou de 2,3 butanediol, les mutants sélectionnés ont donc transformé entre 3,4 et 32,8 mM de glucose en composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase. De plus, tous les mutants produisent encore du lactate, ce qui indique que leur activité lactate déshydrogénase n'est pas nulle.The production values of the compounds resulting from the aacetolactate synthase pathway are presented in Table 3. The simple mutants deficient in α-acetolactate decarboxylase (strains Y8, MR3, NO8, FC10,
FM2, CM5, 3M1 and 6M1) have a production less than or equal to 0.1 mM. The 46 mutants selected in this study produced between 3.4 and 32.8 mM. Given that one mole of glucose (sugar contained in the MRS broth) is necessary to form one mole of diacetyl, acetoin, α-acetolactate or 2,3 butanediol, the mutants selected have therefore transformed between 3,4 and 32.8 mM glucose in compounds derived from the α-acetolactate synthase pathway. In addition, all the mutants still produce lactate, indicating that their lactate dehydrogenase activity is not zero.

Les valeurs d'activité lactate déshydrogénase et a-acétolactate décarboxylase d'une partie des mutants sélectionnés sont présentées dans le tableau 4. Comme pour les souches parentales, aucune activité a-acétolactate décarboxylase n'est détectable pour les mutants sélectionnés. A titre de comparaison les sondes Y, MR et NO, avaient cune activité a-acétolactate décarboxylase égale à 0,64, 0,55 et 0,48 U/mg, respectivement. Cependant,
L'activité lactate déshydrogénase des mutants est inférieure à celle des souches parentales. Ceci confirme le fait que la forte production, par les mutants, de composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase, est due à une faible activité lactate déshydrogénase. De plus, aucun des mutants sélectionnés ne possède une activité lactate déshydrogénase nulle. De ce fait, ils produisent encore du lactate, en quantité variable, lorsqu'ils sont cultivés sur du bouillon MRS modifié (tableau 3).The lactate dehydrogenase and α-acetolactate decarboxylase activity values of a portion of the selected mutants are shown in Table 4. As for the parental strains, no α-acetolactate decarboxylase activity is detectable for the selected mutants. By way of comparison, the Y, MR and NO probes had α-acetolactate decarboxylase activity equal to 0.64, 0.55 and 0.48 U / mg, respectively. However,
The lactate dehydrogenase activity of the mutants is lower than that of the parental strains. This confirms that the high production by the mutants of compounds from the α-acetolactate synthase pathway is due to low lactate dehydrogenase activity. In addition, none of the selected mutants has zero lactate dehydrogenase activity. As a result, they still produce lactate in varying amounts when grown on modified MRS broth (Table 3).

EXEMPLE 2: Culture des mutants dans du lait ou du milieu à base de lactosérum
Pour une utilisation dans un procédé industriel, il est préférable que les mutants sélectionnés soient capables de produire de l'a-acétolactate dans du lait, ou dans un milieu à base de lactosérum.EXAMPLE 2 Culture of Mutants in Whey or Whey Medium
For use in an industrial process, it is preferred that the selected mutants be capable of producing α-acetolactate in milk, or in a whey-based medium.

1 ) Cultures sur du lait en anaérobiose partielle
Les mutants MR3-T1 (1-1993), MR3-T5 (1-1994) et MR3-T7 (1-1995), ainsi que la souche parentale MR3, ont été cultivés à 30"C dans du lait écrémé (figure 2). La souche parentale, qui est déficiente en a-acétolactate décarboxylase, produit 2,6 mM d'a-acétolactate après 6 heures de culture. La concentration en a-acétolactate diminue ensuite en raison de l'instabilité de ce composé. Les mutants MR3-T1, MR3-T5 et MR3-T7, produisent respectivement 8,4, 13.5 et 10,0 mM d'a-acétolactate.1) Cultures on milk under partial anaerobic conditions
The mutants MR3-T1 (1-1993), MR3-T5 (1-1994) and MR3-T7 (1-1995), as well as the parental strain MR3, were cultured at 30 ° C. in skimmed milk (FIG. The parental strain, which is deficient in α-acetolactate decarboxylase, produced 2.6 mM α-acetolactate after 6 hours of culture, and the α-acetolactate concentration subsequently decreased due to the instability of this compound. mutants MR3-T1, MR3-T5 and MR3-T7 produce 8.4, 13.5 and 10.0 mM of α-acetolactate, respectively.

Lors de ces cultures, on constate que la capacité de production d'aacétolactate par les différents mutants varie en sens inverse de leur activité acidifiante. De plus, on constate que la souche MR3-T1 atteint une valeur de pH identique à celle de la souche parentale, ce qui est intéressant dans le cas ou l'on recherche également une acidification du lait (I'acidification est plus lente que pour la souche parentale, mais la valeur de pH finale est identique). In these cultures, it can be seen that the capacity of the various mutants to produce aacetolactate varies inversely with their acidifying activity. In addition, it is found that the MR3-T1 strain reaches a pH value identical to that of the parental strain, which is interesting in the case where one also seeks an acidification of the milk (the acidification is slower than for the parental strain, but the final pH value is identical).

La production de diacétyle est égale à 0,16, 0,25, 0,38 et 0,26 mM pour les souches MR3, MR3-T1, MR3-T5 et MR3-T7, respectivement. Cette production est relativement faible en raison des conditions d'anaérobiose. Diacetyl production is 0.16, 0.25, 0.38 and 0.26 mM for the MR3, MR3-T1, MR3-T5 and MR3-T7 strains, respectively. This production is relatively low due to anaerobic conditions.

2") Cultures aérobies sur du lait
Le mutant MR3-T7 a été cultivé en aérobiose sur du lait (culture de 300 ml dans une fiole Erlenmeyer de 2 I, agitée à 200 tr/min) (figure 3). On constate que cette souche ne produit que 3,5 mM d'a-acétolactate dans ces conditions et n'acidifie quasiment pas le milieu de culture. Lorsque le milieu est supplémenté avec de l'extrait de levure (5 g/l), de la catalase (70 U/ml) ou de l'hémoglobine (0,2 g/l), la production d'a-acétolactate atteint 14,5, 13,9 et 32.4 mM, respectivement.2 ") Aerobic cultures on milk
The MR3-T7 mutant was aerobically grown on milk (300 ml culture in a 2 l Erlenmeyer flask, shaken at 200 rpm) (Figure 3). It is found that this strain produces only 3.5 mM of α-acetolactate under these conditions and hardly acidifies the culture medium. When the medium is supplemented with yeast extract (5 g / l), catalase (70 U / ml) or hemoglobin (0.2 g / l), the production of α-acetolactate 14.5, 13.9 and 32.4 mM, respectively.

L'extrait de levure et la catalase décomposent le peroxyde d'hydrogène. De plus, certaines bactéries lactiques sont capables de décomposer le peroxyde d'hydrogène en présence d'hémoglobine. La faible acidification et production d'a-acétolactate par la souche MR3-T7 en aérobiose, était donc probablement due à une accumulation toxique de peroxyde d'hydrogène. Yeast extract and catalase break down hydrogen peroxide. In addition, some lactic acid bacteria are able to break down hydrogen peroxide in the presence of hemoglobin. The low acidification and α-acetolactate production by the aerobic MR3-T7 strain was therefore probably due to a toxic accumulation of hydrogen peroxide.

Pour favoriser la production d'a-acétolactate par des mutants sélectionnés selon l'invention, il est donc préférable de réaliser des cultures aérobies, en présence d'un composé permettant de limiter l'accumulation de peroxyde d'hydrogène. To favor the production of α-acetolactate by selected mutants according to the invention, it is therefore preferable to carry out aerobic cultures, in the presence of a compound making it possible to limit the accumulation of hydrogen peroxide.

De plus, la production de diacétyle est élevée en raison des conditions de culture aérobies. Elle atteint 5,9 mM dans la culture supplémentée avec de la catalase. In addition, diacetyl production is high because of aerobic culture conditions. It reaches 5.9 mM in the culture supplemented with catalase.

3 ) Cultures dans du milieu à base de lactosérum
Le mutant Y8-T3 a été cultivé sur un milieu contenant 50 g/l de lactosérum clarifié, 5 g/l de bactopeptone et 3 g/l d'extrait de levure (ce milieu ne contenait pas de citrate). Les cultures ont été réalisées à 30"C dans un fermenteur de 7 I contenant 5 I de milieu, et à un pH régulé à une valeur de 5,8.3) Cultures in whey medium
The Y8-T3 mutant was cultured on a medium containing 50 g / l of clarified whey, 5 g / l of bactopeptone and 3 g / l of yeast extract (this medium contained no citrate). Cultures were performed at 30 ° C in a 7 L fermenter containing 5 I medium, and at a pH regulated at 5.8.

La concentration en oxygène dissous a été régulée à 0, 21 et 100% de la saturation du milieu par de l'oxygène (figure 4). La production la plus élevée d'a-acétolactate (43 mM, ce qui représente 5,7 g/l) a été obtenue après 17 h de culture à 21 % d'oxygène dissous. La production de diacétyle la plus élevée (3,5 mM, ce qui représente 0,3 g/l) a été obtenue à 100% d'oxygène dissous. The concentration of dissolved oxygen was controlled at 0, 21 and 100% of the saturation of the medium with oxygen (FIG. 4). The highest production of α-acetolactate (43 mM, which represents 5.7 g / l) was obtained after 17 h of 21% dissolved oxygen culture. The highest diacetyl production (3.5 mM, which represents 0.3 g / l) was obtained at 100% dissolved oxygen.

EXEMPLE 3:
Stabilité des mutants sélectionnés
Tous les caractères phénotypiques induits par des mutations (qu'il s'agisse de mutations spontanées, ou réalisées à l'aide d'agents chimiques ou de certains types de rayons), sont plus ou moins stables. II est donc important d'étudier la stabilité des mutants obtenus afin de s'assurer qu'ils sont utilisables dans un procédé industriel.EXAMPLE 3
Stability of selected mutants
All the phenotypic characters induced by mutations (whether spontaneous mutations, or carried out using chemical agents or certain types of rays), are more or less stable. It is therefore important to study the stability of the mutants obtained to ensure that they can be used in an industrial process.

La capacité de production d'a-acétolactate dans du lait par les mutants, a été mesurée avant et après 10 repiquages successifs (ce qui représente un nombre de générations supérieur à 65) dans du bouillon M17 (Terzaghi et Sandine, 1975 précédemment cité) (tableau 5). Sur les 46 mutants testés, seuls 8 d'entre eux étaient stables dans ces conditions. Pour tous les autres mutants, I'instabilité résultait probablement de modifications génétiques entraînant une augmentation de l'activité lactate déshydrogénase, car ces souches devenaient plus acidifiantes après 10 repiquages . Auc The capacity of production of α-acetolactate in milk by the mutants was measured before and after 10 successive subcultures (which represents a number of generations greater than 65) in M17 broth (Terzaghi and Sandine, 1975 cited above). (Table 5). Of the 46 mutants tested, only 8 of them were stable under these conditions. For all other mutants, the instability probably resulted from genetic modifications leading to increased lactate dehydrogenase activity, as these strains became more acidic after transplanting. auc

TABLEAU 1
Préparation du milieu LDHA-20

TABLE 1
Preparation of LDHA-20 medium

<tb> Tryptone <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> papaïnique <SEP> de <SEP> soja <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> pepsique <SEP> de <SEP> viande <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Glycérophosphate <SEP> de <SEP> sodium, <SEP> 6H2O <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Acide <SEP> ascorbique <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> Hydrogénophosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> qsp <SEP> Il <SEP>
<tb> pH <SEP> 7
<tb> Autoclavage <SEP> 115 C <SEP> 15 <SEP> min
<tb>
TABLEAU 2
Recherche de mutants de L.LI. diacetylactis produisant de i'a-acétoiactate dans un milieu dépourvu de citrate et de pyruvate

<tb> Tryptone <SEP> 2.5 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> Papainic <SEP> of <SEP> Soybeans <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> Pepsic <SEP> of <SEP> Meat <SEP> 2.5 <SEP> g
<tb> Extract <SEP> of <SEP> meat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 2.5 <SEP> g
<tb> Glycerophosphate <SEP> of <SEP> sodium, <SEP> 6H2O <SEP> 20 <SEP> g
<tb><SEP> ascorbic acid <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> of <SEP> Magnesium <SEP> 0.25 <SEP> g
<tb> Hydrogen Phosphate <SEP> of <SEP> Potassium <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Water <SEP> distilled <SEP> qsp <SEP> It <SEP>
<tb> pH <SEP> 7
<tb> Autoclaving <SEP> 115 C <SEP> 15 <SEP> min
<Tb>
TABLE 2
Research of L.LI mutants. diacetylactis producing α-acetolactate in a medium lacking citrate and pyruvate

<tb> <SEP> Souche <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> clones <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> clones
<tb> 2 <SEP>
<tb> <SEP> LDHA-20 <SEP> des <SEP> colonies
<tb> <SEP> brunes
<tb> <SEP> Y8 <SEP> 380 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 300 <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> MR3 <SEP> 120 <SEP> 000 <SEP> 258 <SEP> 14
<tb> <SEP> NO8 <SEP> 140 <SEP> 000 <SEP> 110 <SEP> 27
<tb> (1) Les souches parentales sont déficientes en a-acétolactate décarboxylase.<tb><SEP> Strain <SEP> Number <SEP> of <SEP> clones <SEP> Number <SEP> of <SEP> Number <SEP> of <SEP> clones
<tb> 2 <SEP>
<tb><SEP> LDHA-20 <SEP> of <SEP> colonies
<tb><SEP> brunettes
<tb><SEP> Y8 <SEP> 380 <SEP> 000 <SEP> 1 <SEP> 300 <SEP> 5 <SEP>
<tb><SEP> MR3 <SEP> 120 <SEP> 000 <SEP> 258 <SEP> 14
<tb><SEP> NO8 <SEP> 140 <SEP> 000 <SEP> 110 <SEP> 27
<tb> (1) Parental strains are deficient in α-acetolactate decarboxylase.

(2) Correspond aux clones formant des colonies brunes sur gélose LDHA-20 et
dont la production totale de diacétyle, d'acétoïne, d'a-acétolactate et de 2,3
butanediol est supérieure à 3 mM. Cultures de 24 h, en anaérobiose partielle et
à 30 C, sur du bouillon MRS modifié dépourvu de citrate. (2) Correspond to clones forming brown colonies on LDHA-20 agar and
whose total production of diacetyl, acetoin, α-acetolactate and 2,3
butanediol is greater than 3 mM. 24 h cultures, partial anaerobic and
at 30 C, on modified MRS broth without citrate.

Tableau 3. Production de lactate et de composés issus de la voie de l'α-acétolactate synthase par des
souches déficientes en α-acétolactate décarboxylasse, ainsi que par les muitants sélectionnés selon
l'invention. Valeurs après 24 h de culture en aneérobiose parielle et à 30 C, sur du bouillon MRS
modifié dépourvu de citrate.Table 3. Production of lactate and compounds derived from the α-acetolactate synthase pathway by
α-α-acetolactate decarboxylase deficient strains, as well as selected
the invention. Values after 24 h of culture in anerobiosis parielle and at 30 C on MRS broth
modified without citrate.

Souche Composés issus de la voie de Lactate (mM)
l'α-acétolactate synthase (mM)
Souche Y 0 46,1
Souche MR 0 64,3
Souche No 0 63,2
Souches déficientes en α-acétolactate décarboxylase
Y8 0.0 53.7
MR3 0.0 57.7
NO8 0.1 58.3
FC10 0.1 68.8
FM2 0.1 64.6
CM5 0.1 66.2 3M1 0.1 58.5
6M1 0.1 68.5
Mutants sélectionnés
Y8-T1 4.4 30.5
Y8-T2 6.5 17.1
Y8-T3 8.9 18.8
Y8-T4 11.2 13.3
Y8-T5 5.3 42.5
MR3-T1 6.6 44.6
MR3-T2 15.4 37.8
MR3-T3 14.1 54.4
MR3-T4 11.3 38.5
MR3-T5 24.8 14.3
MR3-T6 30.4 16.7
MR3-T7 15.2 43.7
MR3-T8 3.7 47.4
MR3-T9 26.8 39.2
MR3-T10 33.6 30.2
MR3-T11 6.4 56.6
MR3-T12 13.1 47.6
MR3-T13 8.3 52.7
MR3-T14 16.8 37.6
NO8-T1 5.6 32.3
NO8-T2 10.6 31.0
NO8-T3 6.8 44.2
NO8-T4 18.3 26.1
NO8-T5 27.5 13.0
NO8-T6 19.2 45.2
NO8-T7 22.0 25.1
NO8-T8 10.2 18.5
NO8-T9 25.7 19.0
NO8-T10 18.5 16.9
NO8-T11 20.1 8.6
NO8-T12 9.5 13.2
NO8-T13 19.9 26.1
NO8-T14 21.6 14.1
NO8-T15 16.3 42.4
NO8-T16 32.8 22.6
NO8-T17 9.2 52.4
NO8-T18 9.9 8.5
NO8-T19 4.6 27.6
NO8-T20 24.5 14.0
NO8-T21 26.2 17.5
NO8-T22 23.0 12.4
NO8-T23 11.6 28.2
NO8-T24 15.3 18.4
NO8-T25 25.2 13.6
NO8-T26 24.4 11.6
NO8-T27 31.8 22.8 (1) Production totale de diacétyle. d'acétoïne, d'α-acétolactate et de 2,3 butanediol (2) Les premières lettres désignent la souche parentale dont est issu chaque mutant
TABLEAU 4
Activités enzymatiques mesurées à partir d'extraits cellulaires des souches parentales Y8. MR3 et NO8 ainsi que des mutants
issus de ces souches
Activités spécifiques (U/mg de
protéines)
Lactate a-Acétolactate
deshydrogénase décarboxylase
Souche Y 19,50 0,64
Y8 21,81 < 0,01 mutants
Y8-T1 2,33 < 0,01
Y8-T2 4,30 < 0,01
Y8-T3 0,32 < 0,01
Y8-T4 0,01 < 0,01
Y8-T5 0,91 < 0,01
Souche MR 12,90 0,55
Souche MR3 10,84 < 0,01 mutants
MR3-T1 1,09 < 0,01
MR3-T3 1,69 < 0,01
MR3-T5 0,01 < 0,01
MR3-T7 7,07 < 0,01
MR3- T?2 0,86 < 0,01
MR3-T13 1,48 < 0,01
Souche NO 16,34 0,48
Souche N08 14,00 < 0,01
mutants
N08-T1 1,99 < 0,01
N08-T11 5,59 < 0,01
N08-T16 11,63 < 0,01
N08-T25 0,01 < 0,01
TABLEAU 5
Etude de la stabilité des mutants après
10 repiquages successifs1
Mutants issus de Nombre de Nombre de Code des souches
la mutants mutants stables
souche instables stables2 parentale
Y8 4 1 Y8-T5
MR3 9 5 MR3-T1, MR3-T3, MR3-T5,
MR3-T7, MR3-T13
NO8 25 2 NO8-T1, NO8-T25
(1) Repiquages à 1% dans du bouillon M17.Strain compounds from the Lactate pathway (mM)
α-Acetolactate Synthase (mM)
Strain Y 0 46.1
MR 0 64.3 strain
Strain No. 0 63.2
Strains deficient in α -acetolactate decarboxylase
Y8 0.0 53.7
MR3 0.0 57.7
NO8 0.1 58.3
FC10 0.1 68.8
FM2 0.1 64.6
CM5 0.1 66.2 3M1 0.1 58.5
6M1 0.1 68.5
Selected mutants
Y8-T1 4.4 30.5
Y8-T2 6.5 17.1
Y8-T3 8.9 18.8
Y8-T4 11.2 13.3
Y8-T5 5.3 42.5
MR3-T1 6.6 44.6
MR3-T2 15.4 37.8
MR3-T3 14.1 54.4
MR3-T4 11.3 38.5
MR3-T5 24.8 14.3
MR3-T6 30.4 16.7
MR3-T7 15.2 43.7
MR3-T8 3.7 47.4
MR3-T9 26.8 39.2
MR3-T10 33.6 30.2
MR3-T11 6.4 56.6
MR3-T12 13.1 47.6
MR3-T13 8.3 52.7
MR3-T14 16.8 37.6
NO8-T1 5.6 32.3
NO8-T2 10.6 31.0
NO8-T3 6.8 44.2
NO8-T4 18.3 26.1
NO8-T5 27.5 13.0
NO8-T6 19.2 45.2
NO8-T7 22.0 25.1
NO8-T8 10.2 18.5
NO8-T9 25.7 19.0
NO8-T10 18.5 16.9
NO8-T11 20.1 8.6
NO8-T12 9.5 13.2
NO8-T13 19.9 26.1
NO8-T14 21.6 14.1
NO8-T15 16.3 42.4
NO8-T16 32.8 22.6
NO8-T17 9.2 52.4
NO8-T18 9.9 8.5
NO8-T19 4.6 27.6
NO8-T20 24.5 14.0
NO8-T21 26.2 17.5
NO8-T22 23.0 12.4
NO8-T23 11.6 28.2
NO8-T24 15.3 18.4
NO8-T25 25.2 13.6
NO8-T26 24.4 11.6
NO8-T27 31.8 22.8 (1) Total production of diacetyl. of acetoin, α-acetolactate and 2,3 butanediol (2) The first letters designate the parental strain from which each mutant is derived
TABLE 4
Enzymatic activities measured from cell extracts of parental strains Y8. MR3 and NO8 as well as mutants
from these strains
Specific activities (U / mg of
proteins)
Lactate a-Acetolactate
dehydrogenase decarboxylase
Strain Y 19.50 0.64
Y8 21.81 <0.01 mutants
Y8-T1 2.33 <0.01
Y8-T2 4.30 <0.01
Y8-T3 0.32 <0.01
Y8-T4 0.01 <0.01
Y8-T5 0.91 <0.01
Strain MR 12,90 0,55
MR3 strain 10.84 <0.01 mutants
MR3-T1 1.09 <0.01
MR3-T3 1.69 <0.01
MR3-T5 0.01 <0.01
MR3-T7 7.07 <0.01
MR3-T? 2 0.86 <0.01
MR3-T13 1.48 <0.01
Strain NO 16.34 0.48
Strain N08 14.00 <0.01
mutants
N08-T1 1.99 <0.01
N08-T11 5.59 <0.01
N08-T16 11.63 <0.01
N08-T25 0.01 <0.01
TABLE 5
Study of the stability of mutants after
10 successive subcultures1
Mutants derived from Number of Code Number of strains
stable mutant mutants
unstable strain stable2 parental
Y8 4 1 Y8-T5
MR3 MR3-T1, MR3-T3, MR3-T5,
MR3-T7, MR3-T13
NO8 25 2 NO8-T1, NO8-T25
(1) 1% bran in M17 broth.

(2) Mutants dont la capacité de production d'a-acétolactate dans du lait n'est
pas modifiée de façon significative après 10 repiquages successifs. (2) Mutants whose capacity to produce α-acetolactate in milk is
not significantly changed after 10 successive transplants.

Claims

1. Bacterium overproducing α-acetolactate, and / or diacetyl, characterized in that it is deficient in α-acetolactate decarboxylase and has an attenuated or no lactate dehydrogenase activity.

2. Bacteria according to claim 1 characterized in that it temporarily accumulates α-acetolactate.

3. Bacteria according to one of claims 1 and 2 characterized in that, when cultured in MRS broth supplemented with 10 mM citrate or sodium pyruvate, its α-acetolactate decarboxylase activity is zero or low enough to allow a temporary accumulation of a quantity of α-acetolactate representing at least 20% of all the compounds of the α-acetolactate synthase pathway.

4. Bacterium according to one of claims 1 to 3 characterized in that it has a specific activity of α-acetolactate decarboxylase less than about 0, 1U / mg.

5. Bacteria according to one of claims 1 to 4 characterized in that when grown in citrate-modified MRS broth, its lactate dehydrogenase activity is low enough to allow the transformation of more than 3 mM of glucose into compounds from the pathway of α-acetolactate synthase.

6. Bacteria according to one of claims 1 to 5 characterized in that it is a lactic acid bacterium.

7. Bacteria according to one of claims 1 to 6 characterized in that it belongs to the genera Lactobacillus or Lactococcus.

8. Bacteria according to one of claims 1 to 7 characterized in that it belongs to the species Lactococcus lactis.

9. Strain according to one of claims 1 to 8 characterized in that it has been deposited with the National Collection of Culture of

Microorganisms of the Institut Pasteur on March 19, 1998 under No. 1-1993 (MR3 T1).

10. Strain according to one of claims 1 to 8 characterized in that it has been deposited with the National Collection of Culture of

Microorganisms of the Institut Pasteur on March 19, 1998 under No. 1-1994 (MR3

T5).

11. Strain according to one of claims 1 to 8 characterized in that it has been deposited with the National Collection of Culture of

Microorganisms of the Institut Pasteur on March 19, 1998 under No. 1-1995 (MR3

T7).

12. A process for obtaining mutants of overactivating aacetolactate bacteria comprising the following steps:

mutagenesis of bacteria deficient in α-acetolactate decarboxylase activity,

- seeding bacteria on a suitable selection medium, and

selection of mutants deficient in α-acetolactate decarboxylase and exhibiting attenuated lactate dehydrogenase activity.

13. Process for obtaining mutants of overactivating aacetolactate bacteria comprising the following steps:

mutagenesis of bacteria having α-acetolactate decarboxylase and lactate dehydrogenase activity,

inoculation of the bacteria on a medium adapted to the selection of mutants having an attenuated lactate dehydrogenase activity,

selection of mutants with attenuated lactate dehydrogenase activity,

inoculation of the bacteria on a medium allowing the selection of mutants deficient in α-acetolactate decarboxylase activity,

selection of mutants exhibiting attenuated lactate dehydrogenase activity and deficient in α-acetolactate decarboxylase

14. Mutant selection medium having an attenuated lactate dehydrogenase activity, characterized in that it has the following composition:

Tryptone: between about 1 and 5 g / l

Papainic peptone of soy: between about 2 and 10 gtl

Peptone peptone of meat: between about 1 and 5 g / l

Meat extract: between about 2 and 10 g / l

Yeast extract: between about 1 and 5 g / l

Sodium glycerophosphate: 6H2O between about 5 and 30 g / I

Ascorbic acid: between about 0.2 and 1 g / l

Magnesium sulphate: between about 0.1 and 0.52 gll

Potassium hydrogen phosphate: between about 0.2 and 1 g / l

Agar: between about 5 and 30 g / l

Glucose: between about 5 and 30 g / l

2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride: between about 0.05 and 0.2 g / l

Distilled water qsp It

15. Production method according to one of claims 12 and 13, characterized in that the agar medium for selecting bacteria having attenuated lacate dehydrogenase activity comprises the medium according to claim 14.

16. A process for producing compounds derived from the aacetolactate synthase pathway comprising the following steps:

culturing under appropriate conditions of a bacterium according to one of claims 1 to 11,

- recovery of aromas.

17. A food product characterized in that it contains at least one bacterium according to one of claims 1 to 11, or a part thereof, or a compound obtained with this bacterium.

18. Product according to claim 16 characterized in that it is derived from milk or lactoserum.