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FR2767335A1 - Adenovirus aviaire celo recombinant comme vecteur vaccinant - Google Patents

Adenovirus aviaire celo recombinant comme vecteur vaccinant Download PDF

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Abstract

L'invention concerne des méthodes de préparation d'adénovirus aviaires CELO recombinants et leurs utilisations à titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues pour la préparation de vaccins, notamment pour la protection d'espèces aviaires contre des maladies infectieuses communes, ou a titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues impliquées dans le métabolisme.

Description

L'invention concerne des méthodes de préparation d'adénovirus aviaires CELO recombinants et leurs utilisations à titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues pour la préparation de vaccins, notamment pour la protection d'espèces aviaires contre des maladies infectieuses communes, ou a titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues impliquées dans le métabolisme.
La présentation d'un antigène efficace et durable, susceptible de mobiliser les mémoires immunologiques à court terme et long terme, reste la préoccupation majeure de toute prophylaxie à base de vaccins. Pendant longtemps, ces derniers ont été constitués par la présentation, dans le cas des virus à effets pathogènes, de la totalité du virion, soit mort (vaccin inactivé), soit plus ou moins défectif (vaccin vivant atténué). Au cours des dernières années, plusieurs stratégies sont apparues pour pallier des déficiences de ces vaccins classiques, telles que la pathogénicité plus ou moins persistante,
I'impossibilité d'obtenir le virion par culture in vitro pour obtenir suffisamment d'antigènes vaccinants. Parmi ces stratégies, deux sont, à l'heure actuelle, prédominantes: I'une est la présentation de peptides de synthèse à propriétés antigéniques, issus de la connaissance des protéines immunogènes des virus ou des bactéries étudiés ; I'autre est l'utilisation de vecteurs viraux susceptibles de porter des gènes codant pour des protéines immunogènes issues de virus totalement différents ou pour d'autres agents infectieux. Le vecteur viral est utilisé pour sa capacité à pénétrer des cellules cibles afin d'y faire pénétrer l'antigène étranger et, par ce biais, déclencher les réactions immunitaires de type humorales ou à médiation cellulaire. De plus, le vecteur viral vaccinant peut, dans certaines options, se répliquer et augmenter ainsi la production in situ des déterminants antigéniques et entraîner une stimulation du système immunitaire à plus long terme.
Parmi les particules virales recombinantes pouvant être utilisées comme vecteur d'expression de protéines hétérologues et notamment comme vecteur vaccinant, on trouve les herpesvirus, les rétrovirus et les adénovirus. Les herpesvirus sont des virus à
ADN double brin à capside et enveloppe, et sont, par exemple, responsables de deux maladies importantes : la maladie d'Aujesky chez le porc et la maladie de Marek chez le poulet. Ces virus possèdent des génomes complexes (150 kb en moyenne) et l'obtention de titres élevés nécessaire pour une application industrielle n'est pas toujours facile. Les rétrovirus sont des virus à ARN à capside et enveloppe qui, comme vecteurs recombinants, sont essentiellement étudiés et utilisés pour le transfert de gènes chez le mammifère, thérapie génique humaine, ou dans les espèces aviaires. Leur utilisation comme vecteur recombinant vaccinant est limitée par leur faible capacité de matériel exogène transmissible (environ 3 kb d'ADN), par la difficulté d'obtenir des titres élevés, par leur instabilité (recombinaison des reconstructions). D'autre part, le rétrovirus s'intégrant dans le génome du rétrovirus, il exige que la cellule cible soit une cellule en division et impose une grande sûreté sans son utilisation compte tenu du passage possible de la construction dans les lignées germinales.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin de 30 à 44 kb de long. Ce sont des virus à capside, non enveloppés. En pratique, on peut insérer, sans délétion aucune, 1,5 kb en plus de matériel exogène dans un génome originel d'adénovirus sans perturber la réplication. L'adénovirus possède pour lui les avantages suivants : c'est, en général, un agent peu pathogène, responsable d'atteintes bénignes des voies aériennes supérieures. Il peut infecter une large gamme de cellules, qu'elles soient ou non en division. Il est ainsi possible de modifier des cellules qui se divisent peu, comme les cellules pulmonaires ou les cellules musculaires. De plus, ce virus se multiplie très facilement, ce qui permet la production de virus recombinants à des titres très élevés (10lut à 1013 virus par millilitre), bien supérieurs à ceux des rétrovirus recombinants et donc d'obtenir un meilleur taux de transformation génétique des cellules cibles. Un avantage supplémentaire du vecteur adénoviral est que son génome ne s'intègre pas dans le génome cellulaire, minimisant les risques d'activation d'oncogènes, il reste à l'état d'épisomes. Enfin, vue la résistance de la capside aux agents extérieurs, la nébulisation ou la pulvérisation par voie d'aérosols des virions recombinants, associée aux forts titres, devrait permettre des vaccinations de masse, particulièrement intéressantes pour les espèces aviaires.
Il existe en effet aujourd'hui un besoin réel de disposer de vecteurs vaccinants peu coûteux, efficaces et faciles à administrer, permettant de protéger en particulier les élevages industriels de volaille contre les maladies infectieuses, notamment d'origine virale, qui sont responsables chaque année de pertes estimées à plusieurs centaines de millions de dollars. Des vecteurs vaccinants viraux recombinants ont déjà été décrits comme les poxvirus (AU-A-34353/93) ou les adénovirus aviaires recombinants de sérotypes FAV -4, -9 ou -10 (WO 94 24268), le sérotype 1 -FAV (sérotype CELO) n'ayant pas été retenu dans ce document car présenté à cette date comme vecteur de nature potentiellement oncogénique (SARMA, P.S., et al., 1965, Science, 149, 1108) malgré les résultats publiés postérieurement montrant l'innocuité de l'infection de poulets par cet adénovirus (COWEN, B.R.W., et al., 1978, Avian Diseases, 22, 459-470).
La séquence nucléotidique complète ainsi que l'organisation générale du génome de l'adénovirus aviaire CELO (sérotype 1-FAV) ont été publiés récemment par
CHIOCCA (CHIOCCA, S., 1996, J. Virol. 70, 5, 2939-2949) (voir Figure 1). Dans ce document, I'analyse comparative entre la séquence nucléotidique complète de l'adénovirus aviaire CELO et celles connues d'autres adénovirus, a permis d'établir d'une part, par homologie, la présence ou l'absence d'un certain nombre de gènes codant pour des protéines virales déjà caractérisées et d'autre part, basée sur la position des codons
ATG et d'arrêt, la présence d'au moins un certain nombre de cadres de lecture ouverte (ORF). De ces informations, il n'est pas possible de prévoir quels sont les gènes réellement transcrits et exprimés par le virus, et donc indispensables aux fonctions essentielles du virus comme celle de la réplication. La génération d'adénovirus aviaire recombinant comme vecteur recombinant pour son application comme vaccin recombinant ou pour le transfert de gène nécessite l'insertion d'un ADN hétérologue (exogène) d'intérêt dans des régions non essentielles du génome viral. Lorsque la taille de l'ADN hétérologue d'intérêt à insérer est supérieure à une valeur d'environ 1,5 kb, l'insertion doit être précédée de la délétion d'une ou plusieurs régions non essentielles du génome virale. C'est pourquoi, seule la connaissance précise de ces régions non essentielles du génome de l'adénovirus peut permettre de définir une stratégie dans la préparation de tels vecteurs recombinants.
Un des buts essentiels de la présente invention est d'obtenir des vecteurs d'expression de protéines hétérologues pour la préparation notamment de vaccin aviaire à partir de méthodes de préparation basée sur la découverte de régions non essentielles et essentielles de l'adénovirus aviaire CELO.
La présente invention concerne des méthodes de préparation d'un adénovirus aviaire CELO recombinant, caractérisées en ce qu'on insert dans une partie non essentielle de son génome une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un polypeptide hétérologue à l'adénovirus aviaire CELO, ladite séquence d'ADN pouvant comporter en outre des éléments susceptibles d'assurer l'expression dudit polypeptide dans une cellule infectée par ledit adénovirus recombinant, de préférence ladite partie non essentielle correspondant à une zone intergénique non codante de l'adénovirus aviaire
CELO.
L'invention concerne également des méthodes de préparation selon l'invention, caractérisées en ce que lesdites méthodes sont précédées d'une étape de délétion d'au moins une partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
L'invention concerne en outre des méthodes de préparation selon l'invention, caraçtérisées en ce que lesdites méthodes sont précédées d'une étape de délétion d'au moins une région essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
L'invention a également pour objet des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que ladite séquence d'ADN code pour un polypeptide d'intérêt, de préférence un polypeptide antigénique d'agent infectieux responsable de maladie chez les animaux tels que les espèces aviaires.
L'invention concerne en outre des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que le polypeptide d'intérêt est un polypeptide intervenant dans le métabolisme animal ou humain.
Les vecteurs, caractérisés en ce qu'ils comprennent un adénovirus aviaire CELO recombinant obtenu par une méthode selon l'invention, font également partie de l'invention.
Sont compris également dans l'invention, les vaccins caractérisés en ce qu'ils contiennent un vecteur selon l'invention pour la protection d'espèces aviaires contre les maladies infectieuses.
L'invention concerne également les cellules transformées par un vecteur selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des procédés de préparation in vivo de polypeptides d'intérêt recombinants, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre l'infection d'un animal par un vecteur selon l'invention, dont ladite séquence d'ADN insérée code pour ledit polypeptide d'intérêt.
Enfin, I'invention a pour objet des procédés de préparation de polypeptides d'intérêt recombinants, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre la culture de cellules transformées selon l'invention.
L'invention concerne une méthode de préparation d'un adénovirus aviaire CELO recombinant, caractérisée en ce qu'on insert dans une partie non essentielle de son génome une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un polypeptide hétérologue à l'adénovirus aviaire CELO.
La famille des adénovirus est divisée en deux groupes : les Mastadenowradea, isolés à partir de cellules de mammifères et les Aviadenowradea, isolés à partir de cellules d'oiseaux. Le genre Aviadénovirus est lui-même divisé en 5 groupes d'espèce dont les adénovirus de volaille FAV ("Fowl AdenoVirus"). L'adénovirus aviaire CELO ("Chicken Embryo Lethal Orphan") représente le sérotype 1 (FAV-1) parmi les 11 sérotypes distincts de FAV reconnus.
L'adénovirus CELO est un virus à ADN double brin de 43 804 pb de long (CHIOCCA, S., et al.) (Figure 1). Sa capside est formée d'éléments de 3 types : des hexons, des pentons et des fibres (protéines II, III, IV respectivement selon leur poids moléculaire de plus en plus faible). Les motifs antigéniques (épitopes neutralisants) sont portés essentiellement par les hexons et les fibres. La fibre se fixe par son extrémité NH2 terminale à la base du penton, son extrémité carboxyle COOH se terminant en une zone en bouton, responsable de la fixation du virion à un récepteur spécifique. Entre ces deux extrémités, se trouve la hampe de la fibre, faite d'un certain nombre de motifs répétés (de 20 à 26 acides aminés selon les adénovirus).
La capside, particulièrement résistante, permet une très bonne protection de l'ADN viral ce qui explique la persistance de ce virus dans l'environnement et sa présence ubiquitaire. Cette capside a aussi un rôle essentiel dans la pénétration du virion à l'intérieur de la cellule hôte en évitant la lyse par les endosomes, comme cela se produit normalement pour tout agent infectieux capté par endocytose par la cellule. L'adénovirus
CELO, comme les Aviadénovirus, possède deux fibres dont le rôle n'est pas encore aujourd'hui expliqué, et se distingue des adénovirus de mammifère (dont les adénovirus humains) qui possèdent une fibre unique (sauf pour les adénovirus humains 40 et 41 qui possèdent également deux fibres).
Génome et transcription des gènes chez l'adénovirus
Pour une meilleure compréhension, la description ci-dessous a pour objet essentiel d'introduire les notions et vocabulaire qui seront par la suite utilisés dans la présente invention, relatifs à l'organisation du génome de l'adénovirus, la transcription des gènes et leur fonction, à partir d'adénovirus connus de mammifères.
Au niveau des mammifères, il semble que la structure des génomes des divers adénovirus soit voisine, avec des homologies importantes de gènes codant pour des protéines données (de structure essentiellement) : hexon, penton, fibre, endopeptidase, etc. Pour des adénovirus aviaires, des homologues faibles, de 30 à 50 % au mieux, existent avec des adénovirus mammifères.
Chaque adénovirus est constitué d'un ADN double brin, terminé par des répétitions inversées de 50 à 150 pb (ITR: "InverteiTerminal Repeat"). La longueur du génome varie de 30 à 44 kb (les adénovirus aviaires étant en général plus longs que les adénovirus de mammifères). Ces répétitions terminales inversées, contenant les origines de réplication de l'ADN du virion, sont fondamentales pour la réplication du virion. Dans toute construction d'adénovirus recombinant, il faut impérativement conserver au moins une de ces extrémités afin d'assurer la réplication de l'adénovirus recombinant. In vivo, à ces ITR, une protéine terminale est associée (TP) de 87 kDa à l'état de préprotéine terminale, de 55 kDa à l'état mature (encapsidée à l'intérieur du virion mature). La présence de cette TP permet d'améliorer la réplication du virion d'un facteur 100 à 1 000.
Comme pour de nombreux virus, les gènes d'adénovirus sont répartis (plus ou moins arbitrairement) en deux groupes:
- des gènes dits précoces (Early genes) s'exprimant avant la réplication de l'ADN;
- des gènes dits tardifs (Late genes) exprimés après la réplication de l'ADN et nécessitant impérativement la transcription antérieure des gènes précoces.
Quels que soient l'adénovirus et sa taille, il est de coutume de partitionner son génome en 100 unités (map unit: m. u.) et de positionner les gènes selon ces unités.
Gènes précoces:
Pour les adénovirus humains, ils sont au nombre de quatre : El à E4, avec chacun leur propre promoteur, situé tantôt sur un brin, tantôt sur l'autre. Ces gènes sont impliqués dans la régulation de la transcription virale, la transformation et la réplication de l'ADN viral (à l'inverse, les gènes tardifs produisent essentiellement les protéines de structure du virion).
El (1,3 à 11,2 m. u.) : gène essentiel, car il est l'initiateur de tout le cycle viral.
Son expression démarre 20 à 30 minutes après l'entrée du virion dans la cellule, et sa transcription dépend de facteurs cellulaires propres à l'hôte (spécificité d'hôte des adénovirus). Ce gène est décomposé en deux gènes : ElA et E1B, dont le premier est essentiel pour l'établissement de l'infection virale. Ces deux gènes E1A et E1B permettent, par des effets conjugués, la multiplication cellulaire et l'immortalisation transformation de cellules les recevant conjointement par transfection (si E1A permet l'immortalisation, E1B évite l'apoptose et permet ainsi le maintien du phénotype immortalisé).
E2 (31-11 et 66,6-61,7 m. u.) : sa transcription est sous dépendance de E1A (quoique la protéine E1A ne soit pas une DBP, "DNA binding Protein", protéine se fixant à l'ADN). Ce gène code entre autres pour une ADN polymérase de 140 kDa, une
DBP de 58 kDa et la TP ("Terminal Protein"), dont le rôle a déjà été signalé plus haut pour l'efficacité de la réplication virale (précurseur de 80 kDa ; protéine mature de 55 kDa).
E3 (76,6-86 m. u.) : gène non essentiel pour la multiplication virale in vitro. Son rôle in vivo serait de protéger le virion des défenses immunitaires de l'hôte. Il code pour plusieurs protéines, dont une protéine de 19 kDa qui bloque au niveau du réticulum endoplasmique la sortie des antigènes de type I du CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité), et aussi une protéine de 14,7 kDa qui protège la cellule infectée de l'action lytique du TNF ("Tumor Necrosis Factor").
E4 (99-91,3 m. u.) : gène qui code pour des protéines impliquées dans la régulation des gènes tardifs, et dans l'arrêt de la synthèse des protéines cellulaires, permettant ainsi le détournement des possibilités de biosynthèse de la cellule au profit du virus.
La distinction gènes précoces et gènes tardifs indique une prédominance de certains gènes à un moment donné dans le cycle de réplication du virus. Un gène dit précoce, comme par exemple E1A, peut s'exprimer pendant tout le cycle viral, ou un gène dit tardif, comme le promoteur MLP ("Major Late Promoter"), peut s'exprimer, quoique faiblement, dès les premières heures suivant l'infection.
Gènes tardifs
Ceux-ci sont au nombre de cinq : L1 à L5, codant pour les diverses protéines de structure (capside essentiellement) : L2 pour le penton, L3 pour l'hexon, L5 pour la fibre, etc.
Tous ces transcrits démarrent à partir d'un même promoteur, le MLP (pour
Major Late Promoter: promoteur majeur tardif), et possèdent tous une même extrémité 5' (TPL : "TriPartite Leader"), faite des trois premiers exons : 1, 2 et 3. Ces ARN sont produits par épissages alternatifs. Leur transcription augmente de 1 000 lors de la phase tardive de réplication du virion. Cette extraordinaire augmentation de transcription réalisée par le MLP fait de ce dernier un promoteur privilégié dans toute construction d'adénovirus recombinant vue son efficacité.
Il est à signaler dans cette phase tardive, la transcription du gène de la protéine
IX, unité transcriptionnelle juste en 3' de E1B, dont la synthèse est essentielle pour l'assemblage du virion (entrée de l'ADN dans le capside).
Il est possible de sous cloner des fragments d'adénovirus dans des plasmides, et par cotransfection de fragments se chevauchant et représentant le génome entier, par recombinaison homologue, obtenir des recombinants reproduisant le virion d'origine.
Pour réussir, deux contraintes minimales sont à réunir dans les constructions : i) un fragment doit posséder une répétition terminale (ITR, nécessaire à la réplication du virus, et ii) les deux fragments à joindre doivent avoir au moins une unité (360 à 440 nucléotides) de recouvrement pour permettre la recombinaison homologue. Deux plasmides circulaires portant chacun deux fragments complémentaires, ayant au moins de 400 à 500 nucléotides en commun, représentant à eux deux la totalité du génome, peuvent ainsi recombiner pour produire des adénovirus recombinants.
La délétion dans la région E3, non indispensable pour la réplication in vitro, peut permettre des insertions jusqu'à 4 kb. Enfin, la délétion de la région El peut, avec les précédentes, permettre, a priori, des insertions jusqu'à 7 kb.
Quatre sites d'insertion sont possibles 1) après le MLP, 2) dans El, 3) dans E3 ou 4) à droite de E4, à environ 150 nucléotides de 1'ITR droite (entre E4 et ITR). Le plus souvent l'insertion se fait dans la région El, avec conservation des 50 bases terminales qui représentent l'origine gauche de réplication de l'ADN, du signal d'encapsidation (entre 194 et 358 nucléotides) et de la séquence à droite de E1B qui code pour la protéine IX permettant l'ajustement de l'ADN à la capside. Dans ce dernier cas, les fonctions de E1A et E1B sont fournies en trans dans des lignées de type 293 dans lesquelles les gènes E1A et E1B ont été transfectés et s'expriment de façon permanente. La construction adénovirale recombinante est alors à son tour transfectée dans de telles lignées transcomplémentantes et le virion recombinant peut alors être produit dans de telles lignées. La lignée 293 peut être appelée lignée helper par analogie avec ce qui se passe pour les rétrovirus, le principe reste le même, fournir en trans des gènes que l'on a précédemment enlevés pour libérer de la place pour les gènes exogènes que l'on veut exprimer dans sa construction virale.
Deux possibilités de vecteurs existent :
i) Réplicatifs ou ii) non réplicatifs (défectif). A priori, le premier cas est plus favorable permettant d'une part la multiplication, donc des copies plus nombreuses du gène à exprimer. D'autre part on sait que l'intervention d'éléments cis de réplication favorise la transcription des gènes tardifs, ainsi, si le gène à exprimer est sous dépendance du promoteur MLP, cela favorise aussi la transcription de ce dernier.
Choix des promoteurs:
Habituellement, pour un gène inséré dans la région E3, on choisit le promoteur de
E3, pouvant comporter en outre le promoteur MLP. Pour un gène inséré dans la région
El, on peut choisir soit un tout autre promoteur, ou soit plus généralement une combinatoire artificiellement recréée en cette place : MLP + TLP ("tripartite leader" formée de trois exons présents en 5' de tous les transcrits tardifs), le TLP permettant la reconnaissance des transcrits adénoviraux et leur transfert du noyau au cytoplasme, pour leur traduction, transfert inhibé pour tous les autres ARN cellulaires.
Contrôle de la traduction:
Les ARN viraux sont également préférentiellement traduits, et cela grâce à deux
ARNs de l'adénovirus transcrits par l' ARN polymérase III de la cellule hôte, nommée VAI et VAII (pour "virus associated RNA"). Ces ARNs favoriseraient la traduction des autres ARNs viraux en empêchant la phosphorylation du facteur d'élongation elF2y, phosphorylation qui inhibe l'activité de ce dernier.
Le développement de ces vecteurs adénoviraux a démarré en 1977 par l'établissement d'une lignée cellulaire de complémentation (cellule helper ) qui contient les gènes essentiels à la réplication virale (11 % du génome de l'adénovirus humain de type 5, essentiellement les gènes ElA et E1B, lignée embryonnaire de rein d'homme, 293, GRAHAM, F.L. et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-72). Les adénovirus recombinants obtenus, comme les rétrovirus recombinants obtenus à partir des lignées transcomplémentantes (type Isolde en aviaire, voir Nigon, Verdier, Lab. CNRS-TNRA associés, Lyon-Villeurbanne) sont incapables de se reproduire par eux-mêmes, mais sont capables d'infecter les cellules cibles et d'y synthétiser la protéine hétérologue, codée par le gène introduit en lieu et place de El. Si le gène introduit est placé dans la région E3, la lignée transcomplémentante n'est pas nécessaire, le vecteur recombinant conservant tout pouvoir de réplication autonome.
Par partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO dans laquelle peut être insérée une séquence codant pour un polypeptide hétérologue, on entend particulièrement les régions du génome dans lesquelles cette insertion n'empêche pas la réplication dudit adénovirus recombinant. Les régions du génome qui après délétion n'empêchent pas la réplication dudit adénovirus recombinant sont également des parties non essentielles du génome. Parmi ces parties non essentielles du génome, on préfère les zones dénommées zones intergéniques non codantes, qui sont naturellement silencieuses d'un point de vue transcriptionnel et où l'insertion d'une séquence d'ADN hétérologue, ne perturbe pas la transcription de l'un ou l'autre des deux brins de l'ADN génomique.
La délétion de ces zones intergéniques non codantes n'affecte pas non plus la réplication dudit adénovirus recombinant.
Par parties essentielles du génome de l'adénovirus aviaire CELO, on entend les parties dudit génome constituées d'au moins une partie strictement essentielle dudit génome et pouvant comporter en outre une ou plusieurs parties non essentielles dudit génome. On entend par partie strictement essentielle dudit génome une partie dans laquelle l'insertion d'une séquence d'ADN hétérologue perturbe la transcription de l'un ou l'autre des deux brins de l'ADN génomique, ne permettant plus la réplication autonome dudit adénovirus recombinant. Par partie strictement essentielle dudit génome, on entend également les parties qui sont indispensables à la réplication autonome dudit adénovirus, la délétion de l'une au moins desdites parties strictement essentielles empêchant la réplication autonome dudit adénovirus recombinant. Ces parties non essentielles et essentielles dont la découverte est la base de la présente invention sont décrites dans les exemples de la présente description.
Par polypeptide hétérologue, on entend tout polypeptide ou toute protéine, polypeptide et protéine ayant la même signification dans la présente description, non exprimée naturellement par l'adénovirus aviaire CELO ou tout polypeptide dont la séquence nucléique codante n'est pas incluse dans le génome dudit adénovirus.
Parmi les polypeptides hétérologues d'intérêt dont la séquence nucléique peut être incorporée dans les parties non essentielles du génome de l'adénovirus aviaire CELO, on peut citer:
a) Les polypeptides antigéniques
Les polypeptides antigéniques sont les polypeptides correspondant à des déterminants antigéniques d'organismes contre lesquels il est désirable de générer une immunité par médiation cellulaire ou par la production d'anticorps. Les déterminants antigéniques sont de préférence les déterminants antigéniques d'agent infectieux, de type viral ou autres, et qui sont responsables de maladies infectieuses chez les animaux et notamment chez les espèces aviaires comme par exemple la maladie de Marek, les bronchites infectieuses, la larynchotrachéite, le gumboro, la maladie de Newcastle, les infections à mycoplasmes, l'anémie du poulet, l'encéphalomyélite aviaire, l'influenza aviaire ou la maladie de la bourse de Fabricus d'origine virale Gumboro. I1 est possible également d'utiliser l'adénovirus aviaire CELO recombinant comme vecteur vaccinant pour les mammifères en substituant les fibres originelles (MICHAEL, S.I., 1995, Gene
Therapie, 660-668).
Parmi ces agents infectieux, on préfère particulièrement les agents infectieux responsables de la maladie de Marek, des bronchites infectieuses, de la larynchotrachéite, du gumboro ou de la maladie de Newcastle.
La présente invention comprend également les méthodes selon l'invention dans lesquelles la séquence d'ADN codant pour un polypeptide hétérologue d'intérêt résulte de la combinaison de plusieurs séquences d'ADN codant chacune pour un polypeptide hétérologue d'intérêt.
Il est bien entendu que la présente invention comprend également les méthodes selon l'invention dans lesquelles on insert plusieurs séquences d'ADN codant chacune pour un polypeptide hétérologue d'intérêt.
b) Les polypeptides intervenant dans le métabolisme
Sous un autre aspect, l'invention vise également à produire in vivo, notamment dans la volaille, des facteurs polypeptidiques intervenant dans le métabolisme de l'animal infecté par l'adénovirus aviaire CELO recombinant. Parmi ces polypeptides d'intérêt, on peut citer par exemple les polypeptides impliqués dans le métabolisme des graisses tels que A9 désaturase, l'acétyl coA carboxylase, la lipase, etc., les hormones de croissance ou leur facteur inducteur (comme le GRF) ou des immunopotentiateurs comme les cytokines, les interleukines, etc..
Dans le cadre de la présente invention, le polypeptide d'intérêt peut être un polypeptide intracellulaire, membranaire présent à lasurface de la cellule hôte ou secrété hors de la cellule hôte. Sa séquence d'acide nucléique peut donc comprendre en outre des éléments additionnels appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signal de sécrétion, ces signaux étant connus de l'homme de l'art.
L'invention vise en outre l'utilisation de l'adénovirus aviaire CELO recombinant comme vecteur d'expression de protéine hétérologue dans le cadre de traitement par thérapie génique appliqué à l'homme, l'adénovirus aviaire CELO recombinant étant en effet très peu susceptible de se recombiner avec les adénovirus humains habituellement utilisés. Parmi les polypeptides d'intérêt pouvant être exprimés dans le cadre de traitement par thérapie génique appliqué à l'homme, on préfère tout particulièrement ceux capables d'inhiber ou retarder l'établissement et/ou le développement d'une maladie génétique ou acquise comme par exemple la mucoviscidose, l'hémophilie A ou B, la myopathie de Duchenne ou de Becker, le cancer, le SIDA ou des maladies infectieuses dues à un organisme pathogène. On préfère tout particulièrement les polypeptides d'intérêt suivants
- une cytokine et notamment une interleukine, un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de croissance et notamment hématopoïétique (G-CSF,
GM-CSF),
- un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notamment le facteur
VIII, le facteur von Willebrand, I'antithrombine III, la protéine C, la thrombine et l'hirudine
- un produit d'expression d'un gène suicide comme la thimidine kinase du virus
HSV (virus de l'herpès) de type 1,
- un activateur ou un inhibiteur de canaux ioniques,
- un polypeptide dont l'abscence, la modification ou la dérégulation de l'expression est responsable d'une maladie génétique, telle que la protéine CFTR, la dystrophine ou minidystrophine, l'insuline, l'ADA (adénosine diaminose), la glucocérébrosidase et la phénylhydroxylase,
- un polypeptide capable d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, tel que les produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple les gènes
P53,
- un polypeptide capable de stimuler une réponse immunitaire ou un anticorps,
- un polypeptide capable d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigéniques du virus en cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer en compétition avec les protéines virales natives.
Par ailleurs, un polypeptide d'intérêt en usage dans la présente invention, peut être également un marqueur de sélection permettant de sélectionner ou d'identifier les cellules hôtes transfectées par un vecteur selon l'invention. On peut citer par exemple le polypeptide codé par le gène néo (néomycine) conférant une résistance à l'antibiotique
G418, par le gène dhfr (dihydrofolate réductase), par le gène CAT (Chloramphenicol
Transférase) ou encore par le gène gpt (xanthine phosphoribosyl).
Par polypeptide d'intérêt, on entend également les polypeptides recombinants d'intérêt industriel ou thérapeutique qui peuvent être préparés soit in vitro par culture de cellules, notamment aviaires, transformées par l'adénovirus CELO recombinant, ou soit in vivo chez l'animal.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, la séquence nucléique peut coder pour un polypeptide d'intérêt correspondant à tout ou partie d'une protéine native telle que trouvée dans la nature. Il peut également s'agir d'une protéine chimérique, par exemple provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses ou d'un mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel mutant peut être obtenu par des techniques de biologie classiques par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs résidus acides aminés.
On entend par partie de polypeptide, un fragment biologiquement actif du polypeptide capable d'exercer en totalité ou partiellement l'activité biologique du polypeptide dont il est dérivé.
L'invention concerne également une méthode selon l'invention, caractérisée en ce ladite séquence d'ADN comprend en outre les éléments susceptibles d'assurer l'expression dudit polypeptide hétérologue dans une cellule infectée par ledit adénovirus recombinant.
La séquence d'ADN codant pour un polypeptide d'intérêt peut être associée à un promoteur ou à une séquence leader dans le but d'exprimer la séquence d'ADN avec la meilleure efficacité possible. Tout promoteur permettant d'exprimer la séquence d'ADN avec efficacité peut etre utilisé. Parmi les promoteurs ou séquences leader préférés, on peut citer ceux des adénovirus humains, du virus SV40, du cytomégalovirus ou des adenovirus aviaires, particulièrement préféré est le promoteur MLP de l'adénovirus aviaire CELO, la séquence leader TPL (ici bipartite : L1 + L3).
L'invention concerne également des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que la partie non essentielle correspond à une zone intergénique non codante de l'adénovirus aviaire CELO, de préférence ladite partie non essentielle est choisie parmi les sites suivants, repérés en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence publiée de 43 804 pb (CHIOCCA, S. et al.,1996) et telle que définie à la Figure 1:
a) entre 600 et 650,
b) entre750 et 780,
c) entre 3 380 et 3 520,
d) entre 10 160 et 10 260,
e) entre 12 160 et 12 180,
f) entre 21 775 et 21 818,
g) entre 26 650 et 27 060,
h) entre 27 970 et 28 170,
i) entre 30500 et 30510,
j) entre 32 480 et 32 730,
k) entre 33 720 et 33 880, I) entre 36 210 et 36 340,
m) entre 36 640 et 36 740,
n) entre 37 220 et 37 380, o) entre 38 280 et 38 650,
p) entre 42 380 et 43 040.
L'invention comprend également des méthodes selon l'invention caractérisées en ce qu'elles comportent une étape de délétion d'au moins une partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO, de préférence ladite partie non essentielle est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la Figure 1
a) partie comprise entre 1 970 et 2 850,
b) partie comprise entre 1 970 et 3 000,
c) partie comprise entre 3 130 et 3 520,
d) partie comprise entre 33 210 et 33 450.
L'invention comprend également des méthodes selon l'invention caractérisées en ce qu'elles comportent une étape de délétion d'au moins une partie essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO, de préférence ladite partie essentielle est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la Figure 1 :
a) partie comprise entre 300 et 5 300,
b) partie comprise entre 10 170 et 11 280,
c) partie comprise entre 15 100 et 17 560,
d) partie comprise entre 15 100 et 21 800,
e) partie comprise entre 16 050 et 17 540,
f) partie comprise entre 16 050 et 21 800,
g) partie comprise entre 16 050 et 23 170,
h) partie comprise entre 17 540 et 21 800,
i) partie comprise entre 21 800 et 23 170,
j) partie comprise entre 23 180 et 27 960,
k) partie comprise entre 23 670 et 27 050,
l) partie comprise entre 24 800 et 27 060,
m) partie comprise entre 27 100 et 31 790,
n) partie comprise entre 28 100 et 31 800,
o) partie comprise entre 35 620 et 36 440.
L'invention concerne également des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que l'étape de délétion conduit à l'obtention d'un adénovirus aviaire CELO recombinant comportant au moins 2 séquences d'acide nucléique codant pour un ITR et une séquence d'acide nucléique codant pour un signal d'encapsidation T.
La préparation de tels vecteurs, basée en particulier sur la localisation des signaux d'encapsidation de l'adénovirus aviaire CELO, permet de générer des vecteurs à grande capacité d'incorporation d'ADN hétérologue, plus sûrs et à immunogénicité réduite. De tels vecteurs sont notamment préférés comme vecteur de transfert de gène hétérologue dans des cellules de mammifère dans le cadre de traitement par thérapie génique. Le principe d'obtention de tels vecteurs est connu de l'homme de l'art (PARKS, R.J. et al., 1996, PNAS, 93, 13565-13570, WANG, P. et al., 1995, Somatic Cell and Mol. Gen., 21, 6, 429-441). Le principe repose sur la Cre-recombinase qui reconnaît la séquence
LoxP et permet d'exciser tout gène compris entre 2 sites LoxP. Des vecteurs adénovirus défectifs recombinants sont ainsi créés, pouvant être réduits à leur plus simple expression (2 ITR (inverted terminal repeat) et un signal d'encapsidation w), ce qui dans le cas de l'adénovirus aviaire CELO, laisse une place pour environ 43 kb d'ADN exogène.
Le principe est décrit ci-contre. Une lignée LMH (Kawaguchi T., Nomura K.,
Hirayama Y., Kitagawa T. (1987): Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. Cancer Research, 47, pp. 4460-4464) est obtenue avec la Cre-recombinase par rétrovirus recombinant classique, le virus assistant ( helper ) possédant de part et d'autre du site d'encapsidation g des séquences LoxP.
Le virion recombinant est ensuite délété du nombre choisi de parties non essentielles et essentielles du génome à l'exception des éléments suivants : les deux ITR terminales et la séquence d'encapsidation (les premières permettant la réplication de l'adénovirus aviaire recombinant et la deuxième séquence permettant l'encapsîdation dudit adénovirus recombinant).
La présence de deux sites LoxP de part et d'autre de la séquence d'encapsidation dans le virus assistant l'empêche d'être encapsidé dans la lignée transcomplémentante
LMH/Cre-recombinase. Le virus assistant est, en dehors des sites LoxP, identique à l'adénovirus sauvage CELO.
De telles constructions sont obtenues avec le plasmide ppoly II/extrémités CELO (Figures 2, 3 et 4), ainsi qu'avec le plasmide CELO/rec.
Les lignées de cellules transcomplémentantes nécessaires à la réplication d'adénovirus aviaires CELO défectifs, obtenues par les méthodes de préparation selon l'invention, permettent de construire des virus assistants recombinants plus sûrs.
Par ce biais, il est possible d'envisager de produire un adénovirus aviaire CELO recombinant porteur de gènes à intérêt vaccinant, dans une configuration identique aux gènes sauvages . promoteurs, leaders, épissages, etc., afin d'avoir une efficacité maximale.
L'invention a également pour objet des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que la séquence d'ADN code pour un polypeptide d'intérêt, de préférence un polypeptide antigénique correspondant à un déterminant antigénique d'agent infectieux responsable de maladies infectieuses chez les animaux, notamment chez les espèces aviaires.
Parmi les maladies infectieuses, on préfère la maladie de Marek, la bronchite infectieuse, la larynchotrachéite, le gumboro ou la maladie de Newcastle.
L'invention comprend également des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que le polypeptide d'intérêt est un polypeptide intervenant dans le métabolisme animal, de préférence aviaire, ou humain.
Font également partie de l'invention, les vecteurs, caractérisés en ce qu'ils comprennent un adénovirus aviaire CELO recombinant obtenu par une méthode selon l'invention.
L'invention concerne également des vaccins caractérisés en ce qu'ils contiennent un vecteur selon l'invention, notamment des vaccins pour la protection d'espèces aviaires contre les maladies infectieuses.
Un vaccin selon l'invention peut être fabriqué de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel vecteur à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. Il peut être administré selon n'importe quelle voie d'administration et ceci en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La nébulisation, la pulvérisation par aérosol ou l'administration par l'intermédiaire d'aliments solides ou liquides, sont les modes d'administration préférés, en particulier pour les espèces aviaires La quantité à administrer sera choisie en fonction de certains critères, en particulier la voie d'administration, I'animal, le type de maladie à traiter et son état d'évolution, la durée du traitement, etc.. A titre indicatif, un vaccin selon l'invention, comprend entre 1011 et 1014 de particules adénovirales/ml, de préférence, entre 109 et 1012 pfu/ml (plaque forming unit).
L'invention concerne également des cellules transformées par un vecteur selon l'invention. Parmi lesdites cellules, on préfère les cellules caractérisées en ce qu'elles sont des cellules eucaryotes permettant la réplication d'un adénovirus aviaire CELO recombinant défectif.
Les cellules eucaryotes permettant la réplication d'un adénovirus aviaire CELO recombinant défectif, c'est-à-dire incapable, normalement, de se répliquer, sont appelées cellules transcomplémentantes. Ces cellules permettent d'obtenir des titres suffisamment élevés d'adénovirus aviaire CELO recombinant défectif ayant intégré l'ADN codant pour le polypeptide hétérologue d'intérêt. Les méthodes d'obtention de telles cellules transcomplémentantes sont connues de l'homme de l'art et sont basées notamment sur la connaissance des parties essentielles et non essentielles du génome du virus que l'on veut répliquer.
L'adénovirus recombinant défectif est un vecteur susceptible de déclencher une première réaction immunitaire en cas d'entrée dans la cellule cible, sans possibilité d'atteindre d'autres cellules voisines. Le vecteur est inoffensif, car plus ou moins délété, et incapable de dissémination dans l'animal et entre animaux. En plus de l'innocuité de cet OGM (organisme génétiquement modifié), on peut libérer de plus en plus de place, voire la totalité des gènes du virus pour apporter un maximum d'informations exogènes ( gutless virus , virus déboyauté et Cre-recombinase). C'est un avantage qui peut compenser très largement les inconvénients liés à la non réplication autonome. De plus, en vaccination, l'efficacité de la première prise vaccinale est essentielle mais il n'est pas forcément nécessaire de multiplier les injections.
Parmi les cellules eucaryotes permettant la réplication d'un adénovirus aviaire
CELO recombinant défectif, on préfère les lignées cellulaires transcomplémentantes d'origine aviaire, type LMH ou QT6 (ATCC CRL 1708-fibrosarcoma-Moscovici et al.
1977).
On préfère également les lignées cellulaires transcomplémentantes d'origine aviaire telle que la lignée LMH ou QT6 ou celles dont l'immortalisation est faite à la base par l'antigène T de SV40 (Institut Mérieux). De telles lignées cellulaires transcomplémentantes d'origine aviaire nécessitent de préférence l'utilisation de rétrovirus aviaires permettant d'obtenir des lignées aviaires CELOtranscomplémentantes.
Les rétrovirus aviaires peuvent porter de 3 à 7 kb d'ADN exogène. Ces rétrovirus infectent facilement les lignées LMH (portant éventuellement le récepteur des rétrovirus aviaires pour faciliter leur infectabilité) et s'intègrent dans le génome de la cellule hôte. Les cellules transcomplémentantes sont obtenues rapidement puis sélectionnées sur leur efficacité à produire les gènes de l'adénovirus aviaire CELO.
L'invention comprend de plus des procédés de préparation in vivo d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre l'infection d'un animal par un vecteur selon l'invention, vecteur dont ladite séquence d'ADN insérée code pour ledit polypeptide d'intérêt.
L'invention concerne enfin des procédés de préparation d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre la culture de cellules selon l'invention.
Les techniques de transformation in vivo ou in vitro de cellules à partir de vecteurs adénovirus recombinants visant à préparer des polypeptides recombinants, sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas décrites.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ciaprès.
Légendes des figures Figure 1: séquence nucléotidique complète du génome viral CELO, Figure 2 : construction du plasmide ppoly II /extrémités CELO; . Figure 3 : construction du plasmide ppoly II/CELO recombinant par recombinaison
homologue entre l'ADN total du virus CELO et la plasmide ppoly II/extrémités
CELO; . Figure 4 : plasmide ppoly II :CELO recombinant avec ses 4 fragments constitutifs A, B, CetD; . Figure 5 : sites potentiels d'insertion ou de délétion sur le génome viral de
l'adénovirus aviaire CELO, . Figure 6 : principe de recombinaison homologue entre deux plasmides pour la
création d'adénovirus CELO recombinants; . Figure 7 : les quatre plasmides A, B, C et D représentant la totalité du génome du
CELO et permettant la construction de recombinants (délétés et/ou par insertion) par
sous clonages successifs; . Figure 8 : schéma des quatre plasmides A, B, C et D ainsi que du plasmide ppoly
Il/CELO recombinant porteur de la totalité du génome viral CELO; Figure 9 : création de lignées transcomplémentantes pour les gènes tardifs du CELO . Figure 10: utilisation des lignées transcomplémentantes pour la fabrication de virus
CELO recombinants vaccinants; . Figure 11: création de CELO gutless recombinant par le biais de la CRE
recombinase.
EXEMPLES
Matériel et méthodes
Cultures cellulaires et infections
Des cellules embryonnaires de reins de poulet (embryons EOPS) de 19 jours sont cultivées en 2. cultivées en flasques de 75 cm2 à raison de 106 cellules/ml dans 20 ml de milieux BHK21/5 % SVF (sérum de veau foétale) à 37 "C et 2 % CO2.
Un jour après, les cellules sont lavées et infectées à 20 pfu 5PLAGES
FORMANT DES UNIT2SO par cellule dans un volume minimal (= 4 ml) pendant 1 heure à 37"C CO2 2 %. Le milieu est ensuite ajusté à 20 ml.
Extraction des ARNs totaux
Le protocole RNAnow avec phénol de Biogentex a été suivi. Le RNAnow est utilisé à raison de 1 ml / 10 cm2 (ou 1 à 5 106 cellules). L'homogénat est couplé à 0,2 volume de chloroforme. Les ARNs sont précipités en présence d'isopropanol (V/V) puis lavés à l'éthanol 70 % et repris dans un Tris-EDTA 10:0,1 (RNAse free). Chaque extraction est suivie d'une analyse sur gel d'agarose de la qualité des ARNs.
Construction des banques d'ADNc
La première banque est construite dans le plasmide pSPORTl à partir du kit
SuperScript Plasmid System for cDNA synthesis and plasmid cloning de Life
Technologies. Les ADNc avec des amorces oligo(dT) associées à des primersadaptateurs avec quatre sites de restriction SpeI,XbaI, NruI, NotI, en présence de
SuperScript II RT ont été synthétisés. Le deuxième brin est synthétisé au moyen du cocktail E. coli DNApol + RNAse H + DNA ligase à 16"C. Un adaptateur SalI est fixé aux extrémités après traitement à la T4 DNApol. Les ADNc sont ensuite digérés par
NotI et sous clonés dans SPORT1 par SalI/NotI.
La deuxième banque est construite dans le plasmide pBluescript BS/KS+ (Stratagène). Le premier brin est synthétisé en présence d'amorces oligo(dT)1 5 et d'hexanucléotides. Le deuxième brin est réalisé selon le protocole précédent. Un adaptateur de EcoRi/NotI est fixé aux extrémités des ADNc qui sont ensuite sous clonés dans pBS/KS+ sans orientation.
Les plasmides sont ensuite amplifiés dans des bactéries XL1 Blue compétentes.
Criblage des banques
Le Kit DIG high Prime DNA labeling and detection starter kit II de Boehringer a été utilisé pour détecter les clones positifs dans XLlblue. La sonde a été réalisée par marquage d'ADN CELO total digéré par Hind III ou SalI avec du digoxige-nine-dUTP.
Les clones sont transférés et fixés sur membranes de nylon spéciales pour colonies (Boehringer). Les étapes d'hybridation et de détection sont effectuées dans les conditions décrites par le fabricant. L'hybridation est faite dans un tampon 50 % formamide à une température de 42"C sur une nuit. La révélation se fait par chemiluminiscence. Les clones repérés positifs sur les autoradiographies sont recriblés une deuxième fois. Les troubles positifs sont amplifiés puis séquencés.
Analyse des séquences
Les séquences nucléiques sont analysées à partir du logiciel MacDNASIS version 3.5 Hitachi Software par comparaison avec la séquence du CELO (Chiocca, 1996, u46933) représentée à la Figure 1.
Cinétique par RT-PCR (transcriptase reverse et PCR)
On effectue une ARN-PCR avec un traitement préalable à la DNase I. Dans un premier temps, les ADNc sont synthétisés dans une réaction de 20 ,ul (Huang, 1996) contenant pour 1 ,ug d'ARN:1 x PCR buffer II (Boehringer), 5 mM MgCl2, 1 mM dNTP mix, 1U DNAseI 20U RNase inhibiteur, 2,5 UM oligo(dt)15, 1 I1M hexanucléotides. La réaction de DNAseI est placée 2 heures à 37"C puis 5 minutes à 75"C pour détruire l'enzyme. Un microlitre de 50U/ll murine leukemia virus (MuLV) reverse transcriptase est ajouté suivi d'un cycle de 42"C pendant 30 minutes de RT, de 5 minutes à 90"C et d'un retour à 4"C. Dans les contrôles négatifs la reverse transcriptase est remplacée par 2 Ill d'H20 RNase free. Deux microlitres de ce stock dilué au 1:30 sont ajoutés à 23 pl de réaction PCR, pour un volume final de 25 ,ul contenant:1 x PCR buffer II, 2 mM MgC12, 25 pmol de chaque primer, 1 mM dNTP mix, et 0,5U Taq polymérase (Boehringer). Les conditions d'amplification varient en fonction des amorces choisies. Le nombre de cycles varie entre 25 et 34.
5' race
Le kit Marathon cDNA amplification de Clontech a été utilisé. Dans un premier temps, des ADNc simples brins à partir d' 1 ,ug d'ARN extraits de cellules infectées ont été réalisés. Des amorces oligo(dT)15 liguées à un adaptateur EcoRi-NotI et la reverse transcriptase MuLV ont été utilisées. Après la synthèse du deuxième brin les ADNc sont rendus à bouts francs au moyen de la T4DBA polymérase. Un adaptateur NotI-SfrI
XmaI spécifique est fixé aux extrémités. Des amplifications ont ensuite été effectuées par
PCR (réaction en chaîne à la polymérase) avec une amorce sens AP 1 spécifique de cet adaptateur et une amorce antisens choisie en 5' de nos ORFs (généralement dans la région de l'ATG). Les produits d'amplification sont ensuite séquencés et analysés sur
MacDNasis.
Exemple 1
L'ADN génomique de l'adénovirus aviaire CELO (sérotype 1), virus à ADN double brin, est séquencé entièrement (cf. Figure 1). L'ADN est obtenu après culture sur des oeufs S.P.F. (exempts de pathogène spécifique) embryonnés et récoltés quelques jours après infection de liquide allantoïdien. Il est purifié par les protocoles classiques de purification de virus. Environ 300 llg d'ADN viral (soit environ 150 oeufs embryonnaires infectés) sont isolés pour un litre de liquide allantoïdien infecté. L'ADN de l'adénovîrus aviaire CELO (sérotype 1) comporte ainsi 43 804 pb et code pour au moins une quarantaine de gènes.
La transcription de son génome est étudiée de façon détaillée. Pour cela, on utilise un modèle de culture cellulaire infectée in vitro par l'adénovirus aviaire CELO (cellules embryonnaires de reins de poulet S.P.F.). Les ARNs messagers produits par ces cellules infectées sont extraits à divers temps post-infection et employés à la constitution de banques d'ADNc. Le criblage est ensuite effectué au moyen d'un kit d'hybridation à la digoxygénine. Dans ces conditions, il est établi un modèle transcriptionnel pour l'adénovirus aviaire CELO.
Les diverses zones promotrices ont été localisées, principalement pour les gènes
ORF1, ORF2 (promoteur situé vers 350-510), poules gènes tardifs avec le promoteur majeur tardif (major late promoter : MLP, situé vers 7 310 - 7 520) et ses deux leaders L1 et L3 (situés respectivement à 7 533 - 7 545 (22 pb) ; et 11 285 - 1 1 413 (129 pb), pour le gène ORF22 (promoteur vers 43 400 - 43 700), pour les gènes ORF18 et 19 (promoteur vers 36 460 - 36 770)
La connaissance précise des épissages des ARNs messagers déduite du modèle transcriptionnel permet de localiser les parties non essentielles et essentielles du génome de l'adénovirus aviaire CELO et de prédire les zones d'insertion d'ADN exogène et/ou de délétion d'ADN adénoviral. Cette connaissance précise permet d'établir les méthodes de préparation de vecteurs adénoviraux aviaires recombinants suivantes
A) Insertions, adénovirus aviaire CELO recombinant réplicatif (cf. Figure 5).
Les résultats obtenus précédemment sur la transcription permettent de déterminer les sites putatifs d'insertion d'ADN exogènes (de 2,5 kb au maximum). Les sites suivants sont repérés en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence de la figure 1.
1/vers ORFI : entre 600 et 650,
entre 750 et 780, pas de perturbation sur l'autre brin,
2/ vers ORF3 : entre 3 380 et 3 520, pas de perturbation pour la transcription d'ORF3,
3/ après l'ADN polymérase : entre 10 160 et 10 260 (éviter éventuellement un signal poly A),
4/ entre pTP et 52K:12 160 à 12 180,
5/ entre les deux signaux de polyadénylation et DBP : 21 775 à 21 818,
6/ entre le codon stop 100K et la réinitiation de pVIII (en respectant le leader d'ORF12) : 26 650 à 27 060,
7/ entre poly A pVIII (27 970) et début d'initiation fibre 1 (28 170),
8/ entre 30 500 et 30 510 (entre les deux fibres; en antisens par rapport aux deux fibres), 9/ entre démarrage OFR22 et stop ORF21: 32 480 à 32 730,
10/ entre initiation ORF2O : 33 720 à 33 880,
11/ entre a/ 36 210 et 36 340 : zone non transcrite,
b/36640et36740,
12/ entre fin d'ORF7 et début d'ORF8 : 37 220 à 37 380,
13/ entre 38 280 à 38 650 ; rien de transcrit dans cette zone,
14/ entre 42 380 à 43 040.
Si l'on suppose que la capacité d'encapsidation est de 105 %, pour l'adénovirus aviaire CELO de 43 804 kb on peut insérer au maximum 2,4 kb d'ADN exogène, soit un gène à intérêt vaccinant, ou thérapeutique, ou une enzyme impliquée dans une voie métabolique et environ 400 pb d'un promoteur spécifique (placé en sens ou en antisens de la transcription naturelle dans cette zone).
L'incorporation de cet ADN exogène est faite selon les méthodes bien connues de l'homme de l'art. On peut citer par exemple:
a) soit par recombinaison homologue (cf. Figure 6): la totalité du génome de l'adénovirus CELO a été sous clonée dans un plasmide par ce type de méthode (CHARTRIER, C. et al., 1996, J. ofVirology, 70, 7, 4805-4810). De la même façon, on insère l'ADN exogène au site choisi en tenant compte des sites de restriction unique autour de la zone d'insertion (CHIOCCA, S. et al., 1996);
b) soit par construction classique : à partir de plasmides porteurs de la région d'insertion, puis réintégration par étapes successives dans des plasmides de plus en plus larges. La dernière étape consiste à substituer le fragment sauvage dans le plasmide portant la totalité du génome de l'adénovirus aviaire CELO par le nouveau. Cette voie est également possible à partir de 4 plasmides qui représentent la totalité du génome de l'adénovirus aviaire CELO divisé en 4 fragments (cf. Figures 7 et 8):
fragment A (Pacl/Pmel) : 7 430 pb
fragment B (Pmel/Notl): 9 956 pb fragment C (Notl/Fsel) 18 298 pb
fragment D (Fsel/Pacl) : 8 116 pb,
permettant à chaque fois, quel que soit le site d'insertion, de reconstituer artificiellement
l'adénovirus recombinant voulu.
La zone M à modifier est entourée de deux sites de restriction unique dans le fragment : X et Y.
Le sous fragment XY est sous cloné dans un plasmide et rectifié par mutation, délétion ou insertion.
Après la modification XY est réintégré dans pBS/KS+ fragment A.
Possibilité de recombinaison homologue avec le plasmide ppolyII/celo rec qui contient tout le génome CELO (cf. Figures 2, 3 et 4).
Possibilité de remplacer le fragment A de ppolyII/celo rec par le fragment A modifié.
Tous ces cas d'insertion reposent sur les résultats de la précédente étude de transcription du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
Le promoteur utilisé pour la construction exogène est choisi parmi les promoteurs suffisamment forts pour exprimer l'ADN exogène. L'adénovirus recombinant restant répli
1/ Elimination de l'ORF2 : de 1 970 à 2 850 (880 pb libérées)
Cette délétion permet avec une augmentation de taille de 5 % de disposer théoriquement d'environ 3 kb pour une insertion) ; ce gène sur le brin up n'a pas de contrepartie sur le brin down . Il semble être une des positions privilégiées pour les délétions, même si les signaux de polyadénylation pour pTP, DNA pol. et IV a2 peuvent passer par cette zone. On ne ferait qu'augmenter la taille des ARNs messagers correspondants dans leur partie 3' non traduite.
2/ Elimination de l'ORF6 : cette zone est plus critique, car elle comporte le leader de l'ORF22 (de 33 070 à 33 204 : 135 pb) à respecter pour que sa transcription s'accomplisse normalement (gène important, car il appartient aux gènes précoces apparaissant dès 4 heures post-infection). On trouve aussi la zone de terminaison de l'ORF2O, et une partie de 1'ORF5 (dans sa partie codante, néanmoins ce dernier gène n'a jamais été mis en évidence avec les divers moyens techniques utilisés jusqu'alors). Tenant compte de ces divers éléments, on peut déléter la zone entre 33 210 et 33 450 (soit 240 pb, ce qui, joint à l'augmentation de taille, permet l'adjonction d'environ 2,5 kb d'ADN exogène).
3/ ORF14 : ce gène situé sur le brin down n'a pas été décelé par nos techniques (banques ADNc et RT-PCR). On pourrait ainsi supprimer une zone allant de 1 970 à 3 520 (1 550 pb). Il semble cependant que la zone 3 000 à 3 120 serve de promoteur à l'ORF3. En tenant compte de la délétion sur l'ORF2, on peut donc déléter deux zones : de 1 970 à 3 000 et de 3 130 à 3 520, libérant 1 030 pb et 390 pb respectivement.
C) Lignées transcomplémentantes et virus défectif, système Cre-recombinase
Avec ces techniques bien connues de l'homme de l'art (voir par exemple WANG,
Q.J.X. et al., 1995, Gene Therapie, 2, 775-783 et ZHOU, B., 1996, J. Virol., 70, 70307038) et la connaissance de la localisation des parties essentielles et non essentielles sur le génome de l'adénovirus aviaire CELO, il est possible d'obtenir des vecteurs adénovirus aviaires CELO recombinants défectifs, de titre suffisant, à grande capacité d'insertion d'ADN exogène pouvant atteindre 43 kb, notamment par la méthode Crerecombinase d'excision de gène.
Les gènes à remplacer dans les cellules transcomplémentantes sont plus ou moins longs, fonction de la délétion choisie et de la longueur de l'ADN exogène à insérer. La figure 10 représente comme exemple le schéma général du procédé de préparation de vecteurs vaccinants CELO défectifs recombinants à partir de cellules transcomplémentantes rétrovirales de type Isolde, la réplication du vecteur vaccinant étant assurée par la lignée cellulaire LMH, préalablement transformée par le rétrovirus, après transfection par le vecteur vaccinant recombinant.
On peut citer l'exemple ci-après, comme exemple de délétion de parties essentielles nécessitant l'utilisation de cellules transcomplémentantes pour obtenir la réplication de l'adénovirus aviaire CELO recombinant.
Délétion de l'ORF7 : il faut alors complémenter avec les produits des gènes ORF 18 et ORF 19 situés sur le brin opposé (brin down) mis en évidence en banque
ADNc et RT-PCR (gènes très précoces à précoces dès 2 heures et 4 heures après injection et dont, par conséquent, le rôle est essentiel pour le cycle viral. La suppression de l'ORF7 peut se faire de 35 620 à 36 440 (soit 820 pb libérées ; avec l'augmentation de taille de 5 %, possibilité d'insertion d'environ 3 kb).
Exemples de lignée transcomplémentante
a) Lignée transcomplémentante pTP
La pTP se fixe aux extrémités de l'ADN du génome de l'adénovirus aviaire
CELO (ou de tout autre recombinant porteur des ITR à ses extrémités) et par sa présence favorise la réplication de la matrice virale, en favorisant la fixation de la l'ADN polymérase et de la DBP ( DNA Binding Protein , vitale pour l'élongation avec l'ADN pol de la matrice virale). Cette lignée peut donc de cette manière favoriser la production des constructions d'adénovirus aviaire CELO recombinant pour fournir des titres très élevés. Dans le rétrovirus porteur de la pTP, on peut placer cette dernière sous le contrôle d'un promoteur inductible (heat-shock promoter, hormono-dépendant ou tétracycline dépendant ; dans ce dernier cas, le promoteur fonctionnera en présence de tétracycline dans le milieu). Nous avons montré que la pTP utilise le leader de l'ORFî2, et le leader y de la DBP, on peut faire ainsi une construction appropriée pour avoir, avec ces éléments, une efficacité de production maximale de la pTP. On libère ainsi sur l'ADN génomique de l'adénovirus aviaire CELO de 10 170 à 11 280, soit 1,1 kb, ceci afin de ne pas toucher au leader 3 utilisé par les gènes tardifs. Néanmoins, l'adénovirus aviaire
CELO recombinant peut utiliser la totalité de la partie codante de la pTP (de 10 170 à 12 050 soit 1 880 pb), à condition de réinsérer le leader 3 dans la construction du recombinant afin que les gènes tardifs puissent s'exprimer sans problème.
Lignée transcomplémentante DBP:
La connaissance exacte de la transcription de la DBP permet d'envisager 3 constructions possibles : 1'ORF DBP seul, l'ORF DBP + leaders g et 7 et, l'ORF DBP avec tous ses leaders : a, ss, e et y. La stabilité de l'ARNm correspondant pourrait être supérieure avec les leaders. Dans tous les cas, on libère la zone correspondante dans la
DBP s'étendant (sur le brin don ) de : 21 800 à 23 170, soit une place de 1,37 kb sur l'adénovirus aviaire CELO recombinant et ceci sans toucher à aucun autre gène (juste entre EP endopeptidase et 100 K).
Lignées transcomplémentantes et gènes tardifs
On transcomplémente des unités tardives en totalité à l'aide de rétrovirus dont les constructions sont représentées selon la figure 9 les schémas ci-contre. Les entités L2, ou
L3, ou L2 + L3, voire L2 + L3 + D.B.P.
- Dans le premier cas : entité L2 (penton à pX) 16 050 à 17 540, libération d'environ 1,5 kb.
- Dans le deuxième cas : entités L2 + L3 (penton à E.P.) 16 050 à 21 800, libération d'environ 5 kb.
- Dans le troisième cas : entités L2 + L3 + DBP 16 050 à 23 170, libération de 7 kb environ.
(En fait, du début réel du penton vers 15 100 à E.P. : 21 800, il y a 6 700 pb, soit envirion 7 kb). L'entité L2 (15 100 à 17 560) fait 2.460 pb, l'entité L3 (17 540 à 21 800) fait 4 260 pb.
De même, selon les mêmes schémas, on peut effectuer les délétions des entités suivantes : L4 (pVIII, 100 K, entre les ORF12 et 22 : 27 100 et 31 790 : 4 690 pb). L5 (fibres 1 et 2) et L4 + L5, selon des schémas équivalents à ceux utilisés précédemment
100 K début 23 180 à27 960 (fin pVIII) 4 780 pb.
Fibre 1, début : 28 100 à 31 800 (fin fibre 2): 3 700 pb, d'où une libération totale de 8 480 pb.
Lignées transcomplémentantes de type 293
Comme les adénovirus humains avec les gènes immortalisants E1A et E1B, il peut exister des équivalents de ces gènes chez l'adénovirus aviaire CELO. il y aurait donc un gène immortalisant équivalent à El A, favorisant la multiplication cellulaire (à rechercher parmi les gènes très précoces) et un gène empêchant l'apoptose comme le fait ElB. D'après une publication récente (CHIOCCA, S. et al, 1997, J. Virol., 71, 31683177) on sait qu'il s'agit de 1'ORF8 (gène à effet anti-apoptose, de type Bc12 dans son mode d'action).
- Parmi les gènes candidats très précoces, il y a : ORF4, ORF5, ORF16, ORF18, ORF19, ORF20 et ORF21. Les ORF4 et ORF18 semblent les plus pertinents pour ce faire.
On teste les combinaisons ORF8 + ORF4 (combinaison la plus pertinente), ORF8 + ORF4, ORF8 + ORF18, ORF8 + ORF19, ORF8 + ORF5, ORF8 + ORF16, ORF8 +
ORF20 et ORF8 + ORF21, sur cellules embryonnaires de foie ou de rein de poulet. Puis on retient la combinaison permettant d'obtenir l'immortalisation ce qui offre la possibilité d'avoir un système équivalent à la lignée 293 de GRAHAM (GRAHAM, F.L. et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-72, SHAAK, O., 1995, J. Virol., 69, 4079-4085).
Autres lignées transcomplémentantes particulières:
100 K : libère en tenant compte du leader ss de 1'ORF12 : 24 800 à 27 060, soit environ 2,2 kb.
En enlevant la totalité de la 100 K 23 670 à 27 050, environ 3,38 kb sont libérés, à condition de recréer artificiellement le leader ss de 1'ORF12 (27 068 à 27 095 28 pb) pour obtenir une transcription fonctionnelle de ce dernier cadre de lecture.
Partie gauche du Celo : de 300 à 5 300, environ 5 kb libérés, complémentant pour les ORFs 1, 2, 3, 14 et 15 avec obligation de recréer un promoteur pour ORF4 dans la construction et pour ORF15, décelé comme précoce dès 4 h après injection en RT
PCR).
Lignées transcomplémentantes système Cre-recombinase
La figure 1 1 représente comme exemple le schéma général du procédé de préparation de vecteurs vaccinants CELO défectifs recombinants suivant le système Crerecombinase, à partir de cellules transcomplémentantes rétrovirales de type Isolde. La réplication ou production du vecteur vaccinant est assurée par la lignée cellulaire LMH, préalablement transformée par un rétrovirus recombinant Cre-recombinase, après cotransfection par le vecteur vaccinant recombinant et un adénovirus assistant.

Claims (21)

  1. REVENDICATIONS 1. Méthode de préparation d'un adénovirus aviaire CELO recombinant, caractérisée en ce qu'on insert dans une partie non essentielle de son génome une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un polypeptide hétérologue à l'adénovirus aviaire CELO.
  2. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN comprend en outre les éléments susceptibles d'assurer l'expression dudit polypeptide hétérologue dans une cellule infectée par ledit adénovirus recombinant.
  3. 3. Méthode selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que la partie non essentielle correspond à une zone intergénique non codante de l'adénovirus aviaire
    CELO.
  4. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la partie non essentielle correspond à une zone choisie parmi les sites suivants, repérés en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la figure 1
    a) entre 600 et 650,
    b) entre750 et 780,
    c) entre 3380 et 3520,
    d) entre 10 160 et 10 260,
    e) entre 12 160 et 12 180,
    f) entre 21 775 et 21 818,
    g) entre 26 650 et 27 060,
    h) entre 27 970 et 28 170, i) entre 30500 et 30510,
    j)entre32480et32730,
    k) entre 33 720 et 33 880,
    l) entre 36 210 et 36 340,
    m) entre 36 640 et 36 740, n) entre 37 220 et 37 380,
    o) entre 38 280 et 38 650,
    p) entre 42 380 et 43 040.
  5. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape de délétion d'au moins une partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
  6. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite partie non essentielle est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la figure 1:
    a) partie comprise entre 1 970 et 2 850,
    b) partie comprise entre 1 970 et 3 000,
    c) partie comprise entre 3 130 et 3 520,
    d) partie comprise entre 33 210 et 33 450.
  7. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape de délétion d'au moins une partie essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
  8. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite partie essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numérique (pb) relatives à la séquence telle que définie à la figure 1:
    a) partie comprise entre 300 et 5 300,
    b) partie comprise entre 10 170 et 11 280,
    c) partie comprise entre 15 100 et 17 560,
    d) partie comprise entre 15100 et 21 800,
    e) partie comprise entre 16 050 et 17 540,
    f) partie comprise entre 16 050 et 21 800,
    g) partie comprise entre 16 050 et 23 170,
    h) partie comprise entre 17 540 et 21 800,
    i) partie comprise entre 21 800 et 23 170,
    j) partie comprise entre 23 180 et 27 960,
    k) partie comprise entre 23 670 et 27 050,
    1) partie comprise entre 24 800 et 27 060,
    m) partie comprise entre 27 100 et 31 790,
    n) partie comprise entre 28 100 et 31 800,
    o) partie comprise entre 35 620 et 36 440.
  9. 9. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'étape de délétion conduit à l'obtention d'un adénovirus aviaire CELO recombinant comportant au moins 2 séquences d'acide nucléique codant pour un ITR et une séquence d'acide nucléique codant pour un signal d'encapsidation T.
  10. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la séquence d'ADN code pour un polypeptide hétérologue d'intérêt.
  11. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que le polypeptide hétérologue d'intérêt est un polypeptide antigénique.
  12. 12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que le polypeptide antigénique est un déterminant antigénique d'agent infectieux responsable de maladie infectieuse chez les animaux, de préférence chez les espèces aviaires.
  13. 13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que la maladie infectieuse est choisie parmi la maladie de Marek, la bronchite infectieuse, la larynchotrachéite, le gumboro ou la maladie de Newcastle.
  14. 14. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que le polypeptide hétérologue d'intérêt est un polypeptide intervenant dans le métabolisme, de préférence aviaire, ou humain.
  15. 15. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend un adénovirus aviaire CELO recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14.
  16. 16. Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un vecteur selon la revendication 15.
  17. 17. Vaccin selon la revendication 16, pour la protection d'espèces aviaires contre les maladies infectieuses.
  18. 18. Cellule transformée par un vecteur selon la revendication 15.
  19. 19. Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle est une cellule eucaryote permettant la réplication d'un adénovirus aviaire CELO recombinant défectif.
  20. 20. Procédé de préparation in vivo d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre l'infection d'un animal par un vecteur selon la revendication 15 dont ladite séquence d'ADN insérée code pour ledit polypeptide d'intérêt, et en ce que ledit polypeptide d'intérêt est ensuite extrait dudit animal.
  21. 21. Procédé de préparation d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre la culture de cellules selon la revendication 18.
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