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FR2760750A1 - Recepteur humain a la neurotensine de type 2(hnt-r2) - Google Patents

Recepteur humain a la neurotensine de type 2(hnt-r2) Download PDF

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FR2760750A1
FR2760750A1 FR9703204A FR9703204A FR2760750A1 FR 2760750 A1 FR2760750 A1 FR 2760750A1 FR 9703204 A FR9703204 A FR 9703204A FR 9703204 A FR9703204 A FR 9703204A FR 2760750 A1 FR2760750 A1 FR 2760750A1
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Abstract

Cette invention a pour objet un polypeptide isolé constitutif du récepteur humain à la neurotensine de type 2 (hNT-R2) , ainsi que la séquence nucléotidique codant pour ce polypeptide.

Description

La présente invention concerne un polypeptide constitutif d'un sous-type du récepteur à la neurotensine appelé récepteur à la neurotensine de type 2 (hNT-R2), chez l'homme.
La neurotensine (NT) est un tridécapeptide impliqué dans la communication intracellulaire. Elle agit comme une hormone dans les organes périphériques et comme un neurotransmetteur dans le système nerveux central (Carraway R. et al., Peptides,1982, 3,115-123 et Maj. J.K.
et al., Neuroscience, 1987, 22,499-524) ). En particulier, elle module la transmission de la dopamine dans les voies nigrostriatales et mésolimbiques (Nemeroff, C.B., Psychoneuroendocrinology, 1986, 11, 15-37 et Kitabgi, P., Neurochem. Int., 1989, 14, 111-119). En outre, la NT joue un rôle dans la nociception, dans l'hypothermie, dans le contrôle de la sécrétion d'hormones hypophysaires et dans la relaxation des muscles (Vincent J.P., Cell. Mol. Neurobiol., 1995, 15, 501-512).
Dans le cerveau de rat adulte, la neurotensine se lie à deux sites différents, distinguables, d'une part, par leur sensibilité à la lévocabastine, un antagoniste du récepteur de l'histamine H1 et, d'autre part, par leur affinité différente pour la neurotensine (Schotte A. et ai.,
Naunynschmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1986, 333, 400405). Le site de basse affinité sensible à la lévocabastine apparaît après la naissance et présente une distribution dans le cerveau différente de celle du site de haute affinité insensible à la lévocabastine (Schotte A. et ai., Brain. Res., 1987, 408, 326-328).
Le récepteur de haute affinité insensible à la lévocabastine a été cloné chez le rat (Tanaka K. et ai., Neuron, 1990, 4, 847-854) et chez l'homme (Vita N. et al., FEBS lett.,1993, 317,139-142 et Watson M. et ai,
Mayo Clin. Proc., 1993, 68, 1043-1048). Ce récepteur représente moins de 30% des sites de liaison à la NT dans le cerveau du rat adulte , ii a été principalement trouvé dans la substance noire et dans la partie ventrale tégmentale. Ce récepteur à la neurotensine cloné chez le rat est une protéine de 424 acides aminés qui appartient à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G. Les propriétés biochimiques et pharmacologiques de ce récepteur ont été beaucoup étudiées. II a été démontré que sous activation, ce récepteur module la quantité intracellulaire de cGMP (Amar S. et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1985,129,117-125), de cAMP (Bozou J.C. et ai., Biochem. J., 1989, 264, 871-878 et Yamada M. et al., Eur. J. Pharmacol., 1993, 244, 99-101) et de phosphoinositides (Watson M.A. et ai., J; Neurochem., 1992, 59, 19671970 et Hermans E. et ai., Mol. Pharmacol., 1996, 49, 365-372).
L'antagoniste non-peptidique de la NT découvert récemment, L'acide (2-[( 1 -(7-chlorn-quinol inyl )-5-(2 ,6-d iméthoxyphényl) pyrazol-3-yl)carbonylamino]tricyclo(3.3.1.1.3.7)décan-2-carboxyl ique) connu sous son nom de code SR 48692 et décrit dans EP 477049, inhibe la liaison de la NT au récepteur cloné (Gully. D et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1993, 90, 6549). Cependant, une étude récente montre que chez la souris et chez le rat, I'hypothermie et l'analgésie induites par la NT sont insensibles au SR 48692 (Dubuc I. et al, Br. J. Pharmacol., 1994, 112, 352-354), suggérant donc que la NT pourrait agir différemment à travers différents sous-types de récepteurs.
II a aussi été démontré que le SR 48692 peut affecter différemment le comportement induit par la NT et les changements dans la transmission dopaminergique (Poncelet M. et ai., Naunynschiedeberg's
Arch. Pharmacol., 1994, 349, 57-60 et Steinberg R. et ai., Neuroscience, 1994, 59, 921-929). A la suite des arguments pharmacologiques en faveur des sous types de récepteurs NT, une étude récente comparant les distributions du récepteur à la neurotensine et les transcripts du récepteur cloné à la neurotensine dans le cerveau du rat a suggéré l'existence d'un autre récepteur à la neurotensine (Nicot A. et ai., J.
Comp. Neurol. 1994, 59, 921-929 et Le F. et ai., Trends Pharmacol. Sci., 1996, 17, 1-3). Les transcripts du récepteur à la neurotensine sont détectés dans différentes régions du cerveau, mais pas dans la région subfornicale, alors que les sites de liaison à la neurotensine ont été clairement associés avec les corps cellulaires de cette région (Nicot A. et ai., J. Comp. Neurol., 1994, 59, 921-929).
Par ailleurs, un nouvel et très puissant antagoniste de la neurotensine a été décrit récemment (Gully et ai.) le chlorhydrate de l'acide 2-{(5-(2,6-diméthoxyphényl)-1 -(4-( N-(3-diméthylaminopropyl)-Nméthylcarbamoyl )-2-isopropylphényl )-1 H-pyrazole-3-carbonyl )amino}adamantane-2-carboxylique, connu sous le nom de code SR 142948 A. Ce composé présente une affinité de l'ordre du nanomolaire et déplace complètement la [125I]-neurotensine et le [3H]-SR 48692 de sa liaison avec le récepteur de type 1 (Gully et ai.).
Le SR 142948 A antagonise les effets in vitro (formation d'lP1 dans les cellules HT29 (IC50 = 3.9 nM) ou mobilisation des ions calcium intracellulaires dans les cellules CHO transfectées avec le NT1 R) et in vivo de la neurotensine (libération d'acétylcholine dans le striatum chez le rat, hypothermie et analgésie chez le rat et la souris, rotation chez la souris).
Les inventeurs ont démontré l'existence d'un nouveau soustype de récepteur à la neurotensine chez le rat, appelé récepteur rNT-R2 (Chalon P., et ai, FEBS Letters, 1996, 386, 91-94).
Les inventeurs sont à présent parvenus à cloner et à séquencer le récepteur NT-R2 humain (hNT-R2).
Le profil pharmacologique du récepteur hNT-R2 a alors pu être étudié : le récepteur hNT-R2 présente une forte affinité pour la neurotensine (Kd=2nM) ainsi que pour la xénine, la neuromédine et la lévocabastine, est insensible au composé SR48692 et lie le composé
SR142948A avec une C50 de 3,9 nM.
Le récepteur hNT-R2 est une protéine membranaire constituée de sept domaines transmembranaires, précédés par un long domaine amino-terminal extracellulaire et suivis d'un long domaine carboxy-terminal intracellulaire. Une analyse d'hydropathie du hNT-R2 selon l'invention indique huit régions hydrophobes d'approximativement 20 acides aminés, correspondant à un potentiel peptide signal à l'extrémité NH2, plus sept domaines transmembranaires. Après l'enlèvement du peptide signal, le récepteur représentatif de l'invention a un poids moléculaire d'approximativement 40-45 kilodaltons.
Le récepteur hNT-R2 est in vivo couplé à des protéines G qui permettent la transduction du signal par la voie de la phospholipase
C.
La présente invention concerne donc un polypeptide isolé constitutif du récepteur humain de type 2 à la neurotensine (hNT-R2).
Plus particuliérement, l'invention a pour objet un polypeptide hNT-R2 comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n" 2, ou tout fragment polypeptidique ou dérivé de celui-ci biologiquement actif.
La séquence SEQ ID n"2 représente la séquence d'acides aminés du polypeptide hNT-R2. Les sept domaines transmembranaires potentiels de la protéine sont soulignés.
Par "dérivé", on entend tout polypeptide variant du polypeptide de séquence SEQ ID n" 2 ou toute molécule résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID n" 2, c'est-à-dire obtenue par mutation, délétion, addition, substitution et/ou modification chimique d'un seul ou d'un nombre limité d'acides aminés, ainsi que toute séquence isoforme, c'est-à-dire une séquence identique à la séquence SEQ ID n" 2, à l'un de ses fragments ou séquences modifiées, contenant un ou plusieurs acides aminés sous la forme d'énantiomère D, lesdites séquences variantes, modifiées ou isoformes ayant conservé au moins l'une des propriétés les rendant biologiquement actives.
L'expression "biologiquement actif" signifie que le composé auquel elle se rapporte est capable de se lier à la neurotensine ou à des ligands apparentés à la neurotensine et/ou de participer à la transduction du signal induit par la neurotensine au niveau de la membrane cellulaire, et/ou capable d'induire des anticorps qui reconnaissent le polypeptide hNT-R2 selon l'invention. Les ligands apparentés à la neurotensine peuvent être notamment des molécules présentant au moins 20 % d'homologie avec la séquence d'acides aminés de la neurotensine humaine naturelle, les fragments ou dérivés de celles-ci. Des exemples de ligands apparentés à la neurotensine sont la xénopsine, la xénine et la neuromédine.
L'invention comprend donc tout polypeptide ayant une séquence d'acides aminés substantiellement identique à la séquence ID n" 2 dans laquelle un ou plusieurs résidus ont été conservativement substitués par un résidu fonctionnellement similaire et qui démontre son habilité à mimer le hNT-R2 comme décrit dans la présente invention. Des exemples de substitutions conservatives incluent la substitution d'un résidu hydrophobe tel que l'isoleucine, la valine, la leucine ou la méthionine par un autre résidu hydrophobe, la substitution d'un résidu hydrophile polaire tel que l'arginine par la lysine, la glutamine par l'asparagine, la glycine par la serine, la substitution d'un résidu basique comme la lysine, l'arginine ou l'histidine par un autre résidu basique ou la substitution d'un résidu acide tel que l'acide aspartique et l'acide glutamique par un autre résidu acide.
De même, l'invention comprend tout polypeptide ayant un ou plusieurs résidus chimiquement dérivés par réaction d'un groupe fonctionnel. De telles molécules dérivées incluent, par exemple, les molécules dans lesquelles les groupes amino libres ont été substitués pour former des chlorhydrates d'amine, des groupes p-toluène sulfonyles, des groupes carbobenzoxy, des groupes tert-butyloxycarbonyles, des groupes chloroacétyles ou des groupes formyles. Les groupes libres acides carboxyliques peuvent être dérivés pour former des sels, des esters méthyliques ou éthyliques ou d'autres types d'esters ou d'hydrazides. Les groupes hydroxyles libres peuvent être substitués pour former des dérivés O-acyle ou O-alkyle. L'azote imidazolique de 'histidine peut être substitué pour former la N-imidazole-benzylhistidine. Les peptides qui contiennent un ou plusieurs dérivés d'acide aminé dans sa forme naturelle parmi les 20 acides aminés naturels sont aussi inclus comme dérivés chimiques. Par exemple la proline peut être substituée par la 4-hydroxyproline la lysine peut être substituée par la 5 hydroxylysine ; I'histidine peut être substituée par la 3-méthylhistidine ; la sérine peut être substituée par l'homosérine, et la lysine peut être substituée par l'ornithine. Les polypeptides de la présente invention incluent aussi tout polypeptide ayant une ou plusieurs additions et/ou suppressions de résidus par rapport à la séquence ID n" 2 dans la mesure où l'activité biologique est maintenue.
Lorsque d'autres résidus ont été ajoutés soit au niveau terminal dans le but de fournir un peptide "accepteur" par lequel les polypeptides de l'invention peuvent être facilement attachés à un marqueur ou à une matrice solide, soit à un support, les résidus " accepteurs " ne forment pas d'épitopes du hNT-R2.
Les accepteurs peuvent comporter jusqu'à 40 résidus ou plus, de préférence de 1 à 10 résidus. Les résidus d'acides aminés communs utilisés pour la liaison sont la tyrosine, la cystéine, la lysine,
L'acide glutamique et l'acide aspartique. En outre, un polypeptide de l'invention peut différer, de la séquence ID n" 2 de hNT-R2 par modification de la séquence par exemple par acylation N-terminale, par acétylation ou réaction avec l'acide thioglycolique, et par amidification C-terminale, par exemple, avec de l'ammoniac ou de la méthylamine.
Les polypeptides hNT-R2 de la présente invention peuvent être synthétisés par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier, y compris les techniques d'ADN recombinant. Les polypeptides hNT-R2 peuvent être synthétisés par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. Un résumé des différentes techniques disponibles peut être trouvé dans J. M.
Steward et J. D. Young, "Sol id phase peptide synthesis", W. H. Freeman
Co., San Francisco, 1969 ; M; Bodansky et ai., "Peptide synthesis", John
Wiley & Sons, second édition, 1976 et J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", 1983, 2, 46, Academic Press (New York), pour la synthèse en phase solide de peptides et dans E. Schroder and K. Kubke, "The
Peptides", 1965, 1, Academic Press (New York) pour la synthèse en solutions classiques. Les groupes protecteurs appropriés utilisables dans une telle synthèse sont décrits dans les textes cités ci-dessus et dans J.
F. W. Mc Omie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press,
New York.
L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique isolée choisie parmi la séquence SEQ ID n" 1, les séquences nucléotidiques dérivées de la séquence ID n" 1 du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de délétion, d'insertion, d'un épissage alternatif ou d'une variabilité allélique, et les séquences nucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec la séquence
ID n" 1.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. II peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n" 1. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques.
Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes nucléotidiques, codant pour un polypeptide selon l'invention ou un fragment biologiquement actif de celui-ci. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5"C) et (Tm moins 30"C) et de préférence encore, à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5"C) et (Tm moins 10"C) (forte stringence), Tm étant la température théorique de fusion, définie comme étant la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, de transcripts spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais épissage.
Les sondes de l'invention comportent au minimum 10 nucléotides, et de préférence au moins 14 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 50 nucléotides, et au maximum comportent la totalité de la séquence nucléotidique SEQ ID n" 1 ou de son brin complémentaire.
Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.
Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et le réarrangement génétique, au niveau des séquences nucléiques codant pour un polypeptide hNT-R2 ou un fragment biologiquement actif, sont incluses dans la présente invention. Un tel type de méthode comprend:
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique de l'invention avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et ladite séquence nucléotidique contenue dans l'échantillon biologique, éventuellement après une étape préalable d'amplification de ladite séquence nucléotidique;
- la détection du complexe d'hybridation éventuellement formé;
- éventuellement le séquençage de la séquence nucléotidique formant le complexe d'hybridation avec la sonde de l'invention.
Les sondes d'ADNc de l'invention sont en outre avantageusement utilisables pour la détection d'anomalies chromosomiques.
Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques sens et/ou antisens pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction de polymérisation en chaîne) ou toute autre variante de celle-ci.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont par ailleurs des utilisations dans le domaine thérapeutique, pour la réalisation de séquences anti sens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager, utilisables en thérapie génique. L'invention a ainsi pour objet des séquences ante sens capables d'inhiber, au moins partiellement, la production de polypeptides hNT-R2, tels que définis précédemment. De telles séquences sont avantageusement constituées par celles qui constituent le cadre de lecture codant pour hNT-R2 au niveau du transcript.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de polypeptides recombinants ayant une activité de récepteur hNT-R2 tels que précédemment définis.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs et/ou terminateurs de transcription.
Un tel vecteur d'expression peut être notamment un plasmide, un phage, ou tout type de virus recombinant.
Parmi les vecteurs de transformation procaryotes bien connus de l'homme du métier, on peut citer le vecteur phage ZAP Lambda et le plasmide pBluescript (Stratagene). D'autres vecteurs appropriés pour la transformation des cellules E. Coli incluent des vecteurs d'expression pET (Novagen, cf brevet US 4,952,496) par exemple, le pEIl la, qui contient le promoteur T7, le terminateur T7, I'opéron Lac inductible E. Coli et le gène répresseur Lac; et le pET 1 2a-c, qui contient le promoteur T7, le terminateur T7, et le signal de sécrétion dans E.Coli omPT.
Les vecteurs particulièrement préférés pour la transfection de cellules de mammifères sont les vecteurs comportant les promoteurs cytomégalovirus (CMV) tels que le pcADN1 (Invitrogen), les vecteurs comportant le promoteur MMTV tels que le pMAMNeo (Clontech) et le pMSG (Catalog N" 274506-01 de Pharmacia) et les vecteurs comportant le promoteur SV40 tels que le pSVp (Clontech).
Dans la présente invention, un promoteur fait référence à un segment d'ADN qui contrôle la transcription d'ADN auquel il est lié de manière opérante. La région promotrice inclut des séquences spécifiques qui sont suffisantes pour la reconnaissance des polymérases de l'ARN, pour la liaison et l'initiation de la transcription. En outre, la région promotrice inclut des séquences qui modulent cette reconnaissance, et l'initiation de la liaison et de la transcription de l'activité ARN polymérase.
Comme exemples de promoteurs considérés pour l'utilisation dans les expériences selon la présente invention, on peut citer le promoteur de
SV40, le promoteur du cytomegalovirus, le promoteur (induit par les stéroïdes) du virus tumoral mammaire de la souris, le promoteur viral de la leucémie murine de Moloney.
Les signaux contrôlant l'expression des polypeptides (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison..) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation.
Les vecteurs d'expression tels que décrits ci-dessus, contenant au moins l'une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention font également partie de la présente invention.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Des exemples d'organismes hôtes incluent les bactéries (par exemple E. Coli), les levures (par exemple, Saccharomyces cerevisiae,
Candida tropicalis, Hansenula polimorpha et P. pastoris, voir par exemple, les brevets US 4,882,279, 4,837,148, 4,929,555 et 4,885,231), les cellules de mammifères (par exemple, HEK293, CHO, CV-I et les cellules Ltk), et les cellules d'insectes.
De manière préférentielle, les cellules hôtes pour l'expression du récepteur hNT-R2 recombinant fonctionnel expriment des protéines G endogènes ou recombinantes.
Les protéines G sont une famille hautement conservée de protéines associées à des membranes composées de sous unités a, Q et y. La sous unité a qui se lie avec GDP et GTP diffère dans les différentes protéines G. Dans sa forme active, la sous unité a, liée à GTP, se dissocie du complexe py et les sous unités agissent spécifiquement les unes avec les autres avec des molécules effecteurs cellulaires afin de provoquer une réponse cellulaire. Parce que différentes protéines G peuvent interagir avec différents systèmes effecteurs (par exemple, la voie de la phospolipase C et la voie de l'adénylate cyclase), il est utile de rechercher différentes cellules hôtes pour l'expression de différents soustypes de hNT-R2 recombinant. Alternativement, les cellules hôtes peuvent être transfectées avec de l'ADN codant pour des sous unités de protéines
G pour l'expression hétérologue de différentes protéines G.
Les cellules hôtes exprimant le récepteur hNT-R2 utilisées pour ces tests biologiques peuvent être notamment des cellules CHO et des cellules COS transformées par un vecteur d'expression tel que défini précédemment. Les vecteurs d'expression utilisés peuvent être par exemple des plasmides comportant notamment une origine de réplication de SV40 et éventuellement un gène rapporteur et/ou un gène marqueur.
Les cellules hôtes selon l'invention sont utilisables dans un procédé de production d'un polypeptide hNT-R2, procédé dans lequel on cultive des cellules transfectées selon l'invention dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide de séquence SEQ ID n" 2 ou tout fragment, homologue ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et que l'on récupère ledit polypeptide, fragment, dérivé ou homologue de celui-ci biologiquement actif, que l'on purifie.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc.
Les anticorps mono ou polyclonaux capables de reconnaître spécifiquement le récepteur hNT-R2 font également partie de l'invention.
Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre le récepteur hNT-R2 selon les modes opératoires usuels.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique synthétique approprié auquel un résidu Tyrosine a été ajouté à l'extrémité C-terminale de façon à le coupler à la sérum albumine bovine (BSA) par une liaison benzidique bisdiazotée par réaction pendant 2 heures à 4"C. Le mélange réactionnel est dialysé pour ôter les fractions de faible poids moléculaire, et le résidu est refroidi dans de l'azote liquide et stocké à -20 C. Des lapins blancs néo-zélandais âgés de trois mois sont immunisés avec l'équivalent de 1mg de l'antigène peptidique selon ia procédure décrite par Benoit et al.,
PNAS USA, 1982, 79, 917-921. A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 pg d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, l'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion CMC. Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Seps pour obtenir la fraction IgG.
Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisant en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (Nature (1975) p. 195).
Des anticorps particulièrement avantageux sont des anticorps dirigés contre le domaine extracellulaire du récepteur hNT-R2.
Les anticorps selon l'invention sont par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Par exemple, ils peuvent être associés à une toxine, telle la toxine diphtérique ou à un produit radioactif. Ces immunotoxines peuvent dans ce cas constituer des agents thérapeutiques utilisables pour le traitement de certaines pathologies impliquant une surexpression du récepteur hNT-R2.
Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour l'analyse par immunohistochimie des récepteurs hNT-R2 sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase...
Les anticorps anti-hNT-R2 selon la présente invention peuvent également être utilisés dans les méthodes thérapeutiqu mise en contact d'au moins un anticorps tel que défini précédemment avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre un récepteur hNT-R2 et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.
L'invention a également pour objet un kit pour le diagnostic in vitro d'une expression anormale du récepteur hNT-R2 dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression du récepteur hNT-R2 dans ledit prélèvement comprenant:
- au moins un anticorps spécifique du récepteur hNT-R2, éventuellement fixé sur un support,
- des moyens de révélation de la formation de complexes antigèneslanticorps spécifiques entre le récepteur hNT-R2 et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.
L'invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de se lier au polypeptide hNT-R2 selon l'invention dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide hNT-R2 et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ledit polypeptide hNT-R2.
Un grand nombre de composés peut ainsi être criblé rapidement pour tester la capacité de ces composés de se lier au récepteur hNT-R2 selon l'invention.
Ces tests de liaison peuvent être également appliqués à la détermination de la présence ou de l'absence de neurotensine dans un échantillon biologique, ainsi qu'à l'isolement de nouveaux ligands endogènes.
L'invention a donc également pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de la neurotensine ou de ses analogues dans un prélévement biologique et/ou de mesure du taux d'expression de celle-cilceux-ci dans ledit prélèvement
omprenant la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre un ledit polypeptide et la neurotensine ou ses analogues et la détection des complexes immunologiques spécifiques formés.
Ces tests de liaison peuvent être réalisés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. On peut notamment marquer préalablement les composés susceptibles de se lier au polypeptide récepteur, qui peuvent être utilisés seuls ou en compétition avec d'autres composés non marques.
Plus particulièrement, on peut réaliser par exemple des tests de liaison compétitifs, des tests de type ELISA ou IRMA.
Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser des moyens de marquage pour détecter le polypeptide récepteur hNT-R2 selon l'invention, les anticorps anti-hNT-R2 et/ou les ligands du récepteur hNT
R2.
Les moyens de marquage utilisés peuvent être notamment un agent de marquage fluorescent qui se lie chimiquement à des anticorps ou à des antigènes sans dénaturation pour former un fluorochrome colorant qui est un indicateur immunofluorescent utile. Les agents de marquage fluorescents appropriés peuvent être des fluorochromes tels que l'isocyanate de fluorescéine (FIC), l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), le chlorure de 5-diméthyl-amino-1 naphtalênesulfonyle (DANSC), I'isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC), la lissamine, le chlorure de rhodamine 8200 sulfonyle (RB-200
SC). Une description des techniques analytiques d'immunofluorescence peuvent être trouvées dans DeLuca, "Immunofluorescence analysis", dans Marchalonis et ai., "Antibody as a tool", 1982, 189-231, eds. John
Wiley & sons, Ltd.
L'agent de marquage peut aussi être une enzyme, telle que la peroxydase (HRP) ou la glucose oxydase.
Des éléments radioactifs peuvent être utilisés comme agents de marquage. Un agent de radiomarquage de référence est un élément radioactif qui produit des émissions de rayons gamma. Les éléments qui émettent des rayons gamma, tels que 1241 1251 1261 1311 et 51Cr, représentent une classe de groupes indicateurs d'élément radioactif. Le 1251 est particulièrement préféré. Un autre groupe de moyens de marquage utile est constitué d'éléments tels que le 11C, 1 8F, 150 et 13N qui émettent des positrons. Les positrons ainsi émis produisent des rayons gamma lorsqu'ils rencontrent les électrons présents dans le corps de l'animal. Le rayonnement bêta, tel que le 32p, le 1 11 In, ou le 3H est aussi utile.
La liaison d'un marqueur à un substrat, c'est à dire, le marquage des sondes d'acide nucléique, des anticorps, des polypeptides, des molécules d'anticorps, est bien connue de l'homme du métier. Par exemple, les molécules d'anticorps peuvent être marquées par l'incorporation métabolique d'amino acides radiomarqués présents dans le milieu de culture. Voir par exemple, Gaffre et ai., Meth. Enzymol., 1981, 73, 3-46. Les moyens conventionnels de conjugaison ou de liaison de protéines par l'activation de groupes fonctionnels sont particulièrement appropriés. Voir par exemple, Aurameas et al., Scand. J. Immunol., 1978, 8, Suppl. 7, 7-23, Rodwell et ai., Biotech., 1984, 3, 889-894 et le brevet
US 4,493,795.
L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier au polypeptide récepteur hNT-R2, appelés ligands du récepteur hNT-R2, comprenant les étapes consistant à:
a) cultiver des cellules exprimant le polypeptide hNT
R2, en présence d'au moins un ligand du récepteur hNT-R2; et
b) évaluer la capacité du ligand à moduler la transduction du signal.
L'hNT-R2 de l'invention est, dans sa forme fonctionnelle, couplé à des protéines G hétérotrimériques. Les protéines G s'associent avec les récepteurs transmembranaires au niveau de la face intracellulaire de la membrane plasmatique, les différentes sous-unités a de la protéine G stimulant ou inhibant des effecteurs particuliers. La spécificité de la transduction du signal peut être ainsi déterminée par la spécificité de la protéine G couplante.
Ainsi, on peut évaluer la capacité d'un ligand à moduler la transduction du signal en déterminant la concentration en VAMP, intracellulaire formée par l'activation de l'adénylate cyclase, et/ou la concentration en inositolphosphates et en calcium intracellulaire produits par l'activation de la voie de la phospholipase C.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on peut évaluer la capacité d'un ligand à moduler la transduction du signal en surveillant l'expression de gène(s) induite par l'activation ou l'inactivation du récepteur hNT-R2.
A cet effet, on peut de manière avantageuse transformer des cellules exprimant hNT-R2 avec un gène rapporteur lié de manière opérante au(x)dit(s) gène(s) dont la transcription est induite par l'activation ou l'inactivation du récepteur hNT-R2. Après culture de ces cellules en présence d'au moins un ligand du récepteur hNT-R2, on peut évaluer la capacité de celui-ci à moduler la transduction du signal en surveillant l'expression dudit gène rapporteur.
Selon une variante de ce mode de réalisation, on peut de manière avantageuse cultiver lesdites cellules en présence:
- soit de concentrations accrues d'au moins un ligand du récepteur hNT-R2 dont la capacité à moduler la transduction du signal est recherchée et d'une concentration déterminée d'au moins un agoniste connu de hNT-R2;
- soit de concentrations accrues d'au moins un agoniste connu de hNT-R2 et d'une concentration déterminée d'au moins un ligand du récepteur hNT-R2 dont la capacité à moduler la transduction du signal est recherchée.
La capacité dudit ligand à moduler la transduction du signal est alors évaluée en déterminant de manière quantitative l'expression dudit gène rapporteur, en fonction de la concentration dudit ligand.
Les tests biologiques selon l'invention tels que décrits cidessus permettent ainsi d'évaluer le profil pharmacologique des composés testés, notamment de déterminer si les composés testés sont capables d'agir comme agonistes ou antagonistes du récepteur hNT-R2 selon l'invention.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide récepteur hNT-R2, un fragment polypeptidique, ou un dérivé de celui-ci biologiquement actif, une séquence nucléotidique isolée choisie parmi la séquence ID n 1, des séquences nucléotidiques dérivées de la séquence ID n" 1, du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de délétion, d'insertion, d'un épissage alternatif ou d'une variabilité allélique, les séquences nucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec la séquence
ID n" 1, ou un anticorps dirigé contre un polypeptide récepteur hNT-R2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne enfin l'utilisation d'un polypeptide hNT
R2, dérivé, ou fragment polypeptidique, une séquence nucléotidique, ou un anticorps tels que décrits précédemment pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les troubles hormonaux ou neurologiques impliquant le récepteur hNT-R2 naturel et/ou la neurotensine, notamment liés à la surexpression de la neurotensine et /ou à la stimulation exacerbée du récepteur hNT-R2.
Plus particulièrement, de tels médicaments peuvent être utiles dans le traitement des troubles de la thermorégulation, de la tension, des troubles liés à la contraction musculaire, notamment du muscle lisse du tractus digestif, ainsi que dans le traitement de la douleur.
Un polypeptide hNT-R2 selon l'invention peut être notamment utile pour la fabrication de médicaments à effet analgésique et/ou hypothermique.
Les médicaments selon l'invention peuvent être également utiles pour agir sur le système dopaminergique et pour le traitement de pathologies neurologiques telles que la schizophrénie.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être administrée par voie orale, parentérale, intraveineuse, intramusculaire sous-cutanée, percutanée ou par administration intra-nasale ou intracérébro-ventriculaire.
La préparation de compositions pharmaceutiques qui contiennent des principes actifs dissous ou dispersés dans ces dernières, est bien connue de l'homme du métier. Généralement, ces compositions sont préparées sous la forme de solutions ou de suspensions injectables.
Cependant, elles peuvent aussi être sous des formes solides appropriées pour préparer des solutions, ou des suspensions extemporanément. Les préparations peuvent aussi être émulsifiées.
Le principe actif peut être mélangé à des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec le principe actif en quantité appropriée. Des excipients appropriées peuvent être par exemple, l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ainsi que des combinaisons de deux ou plusieurs d'entre eux. En outre, le cas échéant, les compositions peuvent contenir des quantités mineures de substances auxiliaires telles que des agents d'humidification ou d'émulsion, des tampons pH qui améliorent l'efficacité du principe actif.
La composition thérapeutique de la présente invention peut inclure des sels pharmaceutiquement acceptables des composants de cette invention. Des sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables incluent les sels d'additions acides (formés avec le groupe amino acide libre du polypeptide) qui sont formés avec des acides inorganiques tel que par exemple l'acide chlorhydrique, L'acide bromhydrique, L'acide perchlorique, L'acide nitrique, L'acide thiocyanique, L'acide sulfurique,
L'acide phosphorique, L'acide acétique, L'acide propionique, L'acide glycolique, L'acide lactique, L'acide pyruvique, L'acide oxalique, L'acide malonique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide anthranilique, L'acide cinnamique, L'acide naphtalène sulfonique, L'acide sulfanilique.
D'autres sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables incluent les sels d'addition de bases. Les sels formés avec les groupes carboxyles libres peuvent ainsi être dérivés de bases organiques telles que, par exemple, I'hydroxyde de sodium, I'hydroxyde d'ammonium,
I'hydroxyde de potassium, et des bases organiques telles que des amines mono-, di-, tri-alkyle et aryle (par exemple, la triéthylamine, la diisopropylamine, la méthylamine, la diméthylamine) et des éthanolam i nes éventuellement substituées.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme pour exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc.
Les exemples et les figures dont les légendes suivent illustrent l'invention sans la limiter:
LEGENDE DES FIGURES
- la figure 1 illustre la comparaison des séquences d'acides aminés du récepteur hNT-R1 (Vita N. et ai., FEBS lett.,1993, 317, 139142) et hNT-R2.
- les figures 2a et 2b illustrent les caractéristiques pharmacologiques du hNT-R2 transitoirement exprimé dans les cellules
COS-7. La figure 2a représente la courbe de saturation de la [125l]-NI sur des cellules COS-7 exprimant le récepteur hNT-R2. La transformation de ces données selon Scatchard est donnée dans le graphe inséré. La figure 2b présente le résultat du déplacement de [125,]-NT par la neurotensine (e), xénine (A), levocabastine ( I ), SR 48692 (À), SR 142948(0). Les données sont issues d'une expérience représentative répétée au moins 3 fois.
- la figure 3a illustre la distribution cellulaire du récepteur hNT-R2 en comparaison avec le récepteur hNT-R1 sur différentes lignées cellulaires d'origine humaine. La figure 3b illustre la distribution tissulaire du récepteur hNT-R2.
- la figure 4 illustre l'obtention d'une ligne CHO exprimant de façon stable le récepteur hNT-R2.
a) Structure du plasmide utilisé,
b) Sélection des clones et sous clones,
c) Courbe de saturation de la [1251]-NT sur la cellule
CHO exprimant de façon stable le récepteur hNT-R2, la transformation de ces données selon Scatchard est donnée dans le graphe inséré,
d) Déplacement de [125.]-NT par la neurotensine (g), xénine (A), levocabastine ( I ), SR 48692 (A), SR 142948(0). Les données sont issues d'une expérience représentative répétée au moins 3 fois.
- la figure 5 illustre les expériences de microphysiométrie effectuées avec les cellules CHO-hNT-R2.
a) dose réponse du SR142948,
b) inhibition de la réponse du SR142948 par la neurotensine.
EXEMPLE 1
Clonage de l'ADNc du hNT-R2
1. Préparation de ARN messager
a) Extraction de 'ARN messager.
Du cortex (provenant de cerveau humain adulte prélevé post-mortem) congelé est réduit en poudre par martelage.
Le culot cellulaire est mis en suspension dans le tampon de lyse de composition suivante . guanidine-thiocyanate 4M citrate de sodium 25mM pH 7 ; sarcosyl 0,5 % , ss-mercaptoéthanol 0,1 M. La suspension est soniquée à l'aide d'un sonicateur ultra Turax n" 231256 (Janke et Kundel) à puissance maximale pendant une minute. On ajoute de l'acétate de sodium pH 4 jusqu'à 0,2 M. La solution est extraite avec un volume d'un mélange phénolichloroforme (v/v; 5/1). On précipite à -20 "C l'ARN contenu dans la phase aqueuse à l'aide d'un volume d'isopropanol. Le culot est resuspendu dans le tampon de lyse. La solution est à nouveau extraite avec un mélange phénol/chloroforme et l'ARN est précipité avec de l'isopropanol. Après lavage du culot avec de méthanol 70 % puis 100 %, I'ARN est resuspendu dans de l'eau.
b) Purification de la fraction poly A+ de l'ARN
La purification de la fraction poly A+ de 'ARN est réalisée à l'aide du kit Dynabeads oligo (dT)25 de DYNAL (référence 610.05) suivant le protocole préconisé par le fabricant. Le principe est basé sur l'utilisation de billes de polystyrène super-paramagnétique sur lesquelles est attaché un oligonucléotide poly(dT)25. La fraction poly A+ de L'ART est hybridée sur I'oligo(dT)25 couplé aux billes que l'on piège sur un support magnétique.
2. Constitution de la banque d'ADN complémentaire
a) Préparation de 'ADN complémentaire
A partir de 1 g des ARN-poly A+ du cortex (cerveau) obtenues à l'issue de l'étape 2, on prépare l'ADN complémentaire simplebrin marqué au 32PdCIP (I'ADN complémentaire obtenu présente une activité spécifique de 3000 dpm/ng) avec l'amorce synthétique de séquence suivante (comprenant un site BamHI) .
5' < GATCCGGGCC CTTTTTTTTT TTT < 3'
Dans un volume de 40 ,wli de tampon de composition Tris
HCI 50 mM pH 8,3, MgCl2 6 mM, DTT 3 mM, KCI 40 mM, contenant 0,5 mM de chacun des désoxynucléotides tri phosphates, 40 uCi de dCTP a 32p et 40 U de RNasin (promega). Après une heure d'incubation à 37 C, puis 10 minutes à 50 C, puis de nouveau 10 minutes à 37 C, avec 200 unités de l'enzyme transcriptase inverse RNase H- (GIBCO-BRL référence 18064-014), on ajoute 2,5 u d'EDTA.
b) Hydrolyse alcaline de la matrice ARN
On ajoute 7,5 u1 d'une solution de NaOH 2N, puis on incube pendant 5 minutes à 65 C.
c) Purification sur colonne sephacryl S400
Afin d'éliminer l'amorce synthétique, on purifie l'ADN complémentaire sur une colonne de 1 ml de sephacryl S400 (Pharmacia), équilibrée dans du tampon TE.
Les deux premières fractions radioactives sont regroupées et précipitées avec 1/10 de volume d'une solution d'acétate d'ammonium 10 M et 2,5 volumes d'éthanol, ceci après une extraction, avec un volume de chloroforme.
d) Addition homopolymérique de dG
On allonge l'ADN complémentaire en 3' avec une "queue" de dG avec 30 unités de l'enzyme terminale transférase (Pharmacia 27073001). On incube dans 30 ul de tampon de composition : Tris HCI 30 mM pH 7,6 , chlorure de cobalt 1mM, acide cacodylique 140 mM. DTT 0,1mM, dGTP 1 mM, pendant 15 minutes à 37 C, puis on ajoute 2 ul d'EDTA 0,5 M.
e) On répète à nouveau les étapes b) et c)
f) Appariement du vecteur de clonage PT7T31 8R (Pharmacia, ref:27-3512) et de l'ADN complémentaire en présence de l'adaptateur.
On centrifuge, dissout le culot dans 5 ,ul de tampon TE, on ajoute 6 Cil (120 ng) de vecteur de clonage PT7T318R, 1 |11 (100 ng) de l'adaptateur de séquence suivante (comprenant un site Apal), 5'AAAÀAAAAAAAAGGGCCCG3'
1,3 Cil d'une solution de NaCI 500 mM, on incube pendant 5 minutes à 65"C puis on laisse refroidir le mélange réactionnel jusqu'à température ambiante.
g) Ligation
On ligature le vecteur de clonage et l'ADNc simple brin dans un volume de 200 1ll avec 10 unités de l'enzyme ADN ligase du phage T4 (Pharmacia référence 270 87002) pendant 2 h à température ambiante dans un tampon de composition: Tris HCI 50 mM pH 7,5, MgC12 10 mM, ATP 1 mM.
h) Synthèse du deuxième brin de l'ADNc
On élimine les protéines par extraction au phénol suivie d'une extraction au chloroforme, puis on ajoute 1/10ème de volume d'une solution d'acétate d'ammonium 10 mM, puis 2,5 volumes d'éthanol. On centrifuge, le culot est dissous dans le tampon de composition Tris acétate 33 mM pH 7,9 acétate de potassium 62,5 mM, acétate de magnésium 1 mM et dithiothréitol (DTT) 1 mM, le deuxième brin d'ADN complémentaire est synthétisé dans un volume de 30 ul avec 30 unités de l'enzyme ADN polymérase du phage T4 (Pharmacia, référence 270718) et un mélange de 1 mM des quatre désoxynucléotides tri phosphates de dATP, dCTP, dGTP et dTTP, ainsi que deux unités de la protéine du gène 32 du phage T4 (Pharmacia, référence 27-0213)) pendant une heure à 37 "C. On extrait au phénol et on retire les traces de phénol par passage sur une colonne de polyacrylamide P10 (Biogel P10-200-400 mesh référence 15011050 - Biorad).
i) Transformation par électroporation
On transforme des cellules E. Coli MC 1061 avec l'ADN recombinant obtenu précédemment par électroporation à l'aide de l'appareil Biorad Gene Pulser (Biorad) utilisé à 2,5 kV dans les conditions prescrites par le fabricant, puis on fait pousser les bactéries pendant une heure dans du milieu dit milieu LB (Sambrook op cite) de composition bactotryptone 10 g/l ; extrait de levure5 g/I; NaCI 10 g/l.
On détermine le nombre de clones indépendants en étalant une dilution au 1/1000ème de la transformation après la première heure d'incubation sur une boîte de milieu LB additionné de 1,5 % d'agar (p/v) et de 100 llg/ml d'ampicilline, appelé par la suite milieu LB gélosé. Le nombre de clones indépendants est de 6. 105.
3. Criblage de la banque
a) Préparation des membranes
Les clones de la banque sont étalés sur du milieu LB gélosé (boîtes de petri diamètre 150) revêtu de membranes Biodyne A ( PALL référence BNNG 132). Après une nuit à 37"C, les clones sont transférés par contact sur de nouvelles membranes. Ces dernières sont traitées en les déposant sur du papier Whatman 3 MM imbibé des solutions suivantes : NaOH 0.5 N, NaCI 1.5 M pendant 5 minutes puis Tris HCI 0.5
M pH 8 , NaCI 1.5 M pendant 5 minutes. Après un traitement à la protéinase K dans le tampon suivant : Tris HCI 10 mM pH 8 , EDTA 10 mM, NaCI 50 mM, SDS 0.1 %, protéinase K 100 ,ug/ml pendant une heure à température ambiante, les membranes sont lavées abondamment dans du 2 x SSC (citrate de sodium NaCI), séchées, puis incubées au four sous vide à 80"C pendant 20 minutes.
b) Préparation de la sonde
100 ng de la séquence nucléotidique de rNT-R2, servant de sonde sont marqués par translation de coupure (" nick translation") (kit
Boehringer ref: 976776) suivant le protocole préconisé par le fabricant avec 100 pCi de dCTP a32P 3000 Ci/mmole (Amersham référence PB 10205). Les nucléotides radiomarqués non incorporés sont éliminés sur une colonne de polyacrylamide P10 (Biorad, référence 1504144). La sonde obtenue a une activité spécifique environ de 5.108 dpm/pg.
c) Préhybridation et hybridation
Les membranes préparées en a) sont préhybridées 30 minutes à 42"C dans 6 x SSC, 5 x Denhart's, 0,1 % SDS, 50% formamide puis hybridées quelques heures dans le même tampon additionné de la sonde préparée en b) à raison de 106 dpm/ml.
d) Lavage et exposition des membranes
Les membranes sont lavées deux fois à température ambiante dans le tampon 2 x SSC/SDS 0.1 % puis une heure à 50"C en 2 x SSC/SDS 0.1 %. Les clones hybridés sont révélés avec des films
KODAK XOMAT.
4) Séquençage de hNT-R2 et analyse de la séquence
La séquence est obtenue à l'aide du kit Applied Biosystem (référence 401628) avec le "373DNA sequencer" Les amorces utilisées sont les amorces complémentaires à la région en amont ou en aval de clonage et des oligonucléotides spécifiques de l'ADNc de hNT-R2.
EXEMPLE 2
Construction du plasmide p2076
La séquence codant pour le récepteur hNT-R2 a été amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne PCR à partir du rNT
R2 (Chalon et al. FEBS Lett., 1996, 386, 91-94) avec une amorce "sens" portant un site Hindili suivi d'une séquence consensus de Kozak (Kozak
M., J. Mol. Bol., 1987, 196, 947-950)
(5' CAACTCAAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCAGCAGCC
CGC-3') et une amorce "antisens" portant un site EcoRl (5'CCGCGAAITCTCAGGICCGGGIUCTGGG-3').
L'amplimère obtenu a été digéré par les enzymes de restriction Hindili et EcoRI et inséré dans le plasmide p658, un vecteur d'expression dérivé du p7055 (Miloux B. et al, Gene, 1994, 149, 341-344) dans lequel la séquence codant pour l'lL-2 a été remplacée par un site multiple de clonage " polylinker ". Le plasmide obtenu est le p2076.
EXEMPLE 3
Etablissement de la lignée stable exprimant le hNT-R2
Les cellules CHO-dhfr (Urlaub G. et al, prot. Natl. Acad.
Sci., 1980, 77, 42164220) ont été transformées avec le plasmide p2076 et les clones exprimant de récepteur hNT-R2 ont été isolés en milieu sélectif et soumis à des tests de liaison selon les techniques préalablement décrites (Poinot-Chazel et al, Biochemical J., 320, 145 151,1996,).
Le clone CHO-2076-62 exprimant le plus de récepteurs hNT-R2 a été retenu pour les études de caractérisation et pour effectuer le sous-clonage par dilution limite. Une trentaine de sous-clones ont été isolés et soumis à des tests de liaison (FIGURE 4b).
Le sous-clone CHO-207642-1 présentant le meilleur niveau de liaison a été retenu pour les études de caractérisation.
EXEMPLE 4
Expression de l'ARNm du hNT-R2.
a) Préparation de l'ADN complémentaire:
L'ARN total est préparé comme décrit dans l'EXEMPLE 1.a.
.L'ADNc est préparé de manière similaire à celle décrite dans l'exemple 2.a avec Spg d'ARN total en utilisant une amorce poly(T)12 La réaction n'est pas interrompue avec de l'E DIA.
b) Amplification spécifique de l'ADNc humain par la technique dite de PCR.
La polymérisation est réalisée avec 2 pI d'ADNc dans 50 ,ul final avec le tampon suivant: Tris-HCI 10mM pH 8,3 , 50mM Kcl, 2,5mM MgCl2, en présence de 10% DMSO, dNTP 0,5 mM, 2,ug/ml de chacune des 2 amorces nucléotidiques et de 2,5 unités de iaq polymérase (Beckman).
Les couples d'amorces ont été choisis sur la séquence nucléotidique du hNI-R2 (clone 6.1), (SEQ ID n 1) en position 736 pour l'amorce sens et la position 1269 pour l'amorce anti-sens.
amorce sens: 5 CTGGCCCTCTGCTCCCAA 31
amorce antisens: 5,ICAGGTCCGGGIUCTGGG 3
La réaction est réalisée durant 30 cycles, 94"C/1 minute, 58 C /1 minute, 72"C/1 minute suivi d'un dernier cycle de 72 C pendant 10 minutes.
c) Expression de 'ARN messager de hNT-R2 par la technique dite de Northern Blot.
Les ARN messagers sont préparés comme décrit dans l'EXEMPLE 1.b et analysés par électrophorése sur gel d'agarose 1% en présence de formaldéhyde ("Molecular cloning" T. Maniatis, E.F. Fritsch,
J. Sambrook CHS)., suivie d'un transfert sur membrane de nylon (hybond
N+ Amersham) .L'expression des messagers de différentes parties de cerveau humain est analysé sur un Northern de chez Clontech (réf: 77501). L'hybridation est effectuée selon le protocole décrit ci-après.
La membrane est hybridée avec une sonde radiomarquée avec du dCTP a32P(Amersham) fabriquée à partir de l'ADNc du clone 6.1 par la technique dite de PCR par polymérisation de la partie codante de l'ADNc avec les amorces nucléiques en position 37 pour l'amorce sens et en position 1286 pour l'amorce anti-sens.
amorce sens: 5,AIGGAAACCAGCAGCCCGC3,
amorce antisens: 5,TCAITCTTGCAITACA11CAGG3,
La polymérisation est réalisée avec 10 ng du plasmide 6.1 dans les conditions décrites dans l'EXEMPLE 4 paragraphe b. Le radiomarquage est réalisé par la méthode de "random-priming" dans les conditions décrites par le fabricant (Gibco-BRL réf: 8187SA).
Le clonage du hNTR-2 et la construction de la lignée CHO 2076.62 (hNT-R2) a permis la caractérisation pharmacologique de ce récepteur. Les expériences de liaison sur cette lignée ont montré des résultats équivalents à ceux obtenus en expression transitoire sur cellules
COS ou sur des cellules CHO exprimant le récepteur de rat (Chalon et al.
FEBS lett., 386, 91-94, 1996).
Pour les expériences de liaison, les cellules adhérentes (CHO-207642) ensemencées en plaques de six puits ont été lavées deux fois avec 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,2 % BSA, 0,1 % NaN3, 1 mM 1,10 ortho-phénanthroline (tampon de liaison). Les expériences de saturation ont été effectuées dans un volume finale de 1,5 ml de tampon de liaison contenant différentes concentrations de [1251]-NT (de 0,05 à 10 nM).
Après 1 h à température ambiante, le tampon est aspiré et les cellules lavées deux fois avec le même tampon. Finalement, les cellules sont solubilisées avec 2 ml de 1N NaOH et la radioactivité liée quantifié dans un compteur y . La liaison non-spécifique a été définie comme la liaison obtenue en présence d'un excès (500 fois) de ligand non radiactif.
Les expériences de compétition ont été effectuées de façon similaire en utilisant une concentration de 0,2 nM de [1251]-NT comme ligand. Différentes concentrations de ligands non radiactifs ont été utilisées neurotensine, neuromedine, levocabastine, SR48692, SR142948.
Les résultats de liaison dérivées des expériences de saturation et compétition ont été analysées avec le logiciel GraphPad
Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego CA).
En sachant que la levocabastine se lie à ce récepteur, ce produit a été testé sur la lignée hNT-R2. Un signal faible mais reproductible et significatif a été trouvé en utilisant 1 mM de levocabastine. D'autre part, le SR142948 (antagoniste non peptidique du hNTR-1) pouvait induire une réponse en absence de levocabastine ou autre "agoniste"
Cette réponse agoniste du SR142948 a été étudiée à fond dans le Cytosensor. En effet, des courbes dose-réponse ont été effectuées avec ce produit ainsi qu'avec le SR48692, pour lequel un effet agoniste, mais moins marqué, a été trouvé.
Plus encore, L'effet agoniste du SR142948 peut être antagonisé par la neurotensine ou par le SR48692 (à des doses où il n'y a pas d'effet agoniste). Les courbes d'inhibition ont démontré que le
SR48692 est plus efficace que la neurotensine pour inhiber l'effet du SR142948.
Des effets agonistes du SR142948 sur la lignée CHO 2076.62 (hNT-R2), ont ainsi été mis en évidence.
La lignée CHO-2076.62 (hNT-R2) a été utilisée pour étudier les mécanismes de signaiisation impliqués. Par exemple, en étudiant la voie de production des phosphoinositides, une augmentation légère et transitoire (20 secondes) d'lP3 a été constatée en réponse au SR142948 mais pas avec la neurotensine.
En accord avec les résultats de microphysiométrie, L'effet agoniste du SR142948 et du SR48692 peut être antagonisé par la neurotensine.
En parallèle, il a été mesuré la concentration de Ca2+ intracellulaire en réponse à la neurotensine, le SR142948, et le SR48692.
Dans ces conditions, le SR48692 et le SR142948 montrent une réponse significative. En principe, cette augmentation de la concentration d'ions calcium intracellulaire est due à la libération des réservoirs internes et non à l'entrée du calcium extracellulaire puisque la même réponse a été trouvée en l'absence de calcium extracellulaire.
Le fait que globalement la neurotensine n'exerce pas un effet agoniste net sur le hNT-R2 suggère qu'il puisse exister un autre ligand naturel potentiel pour le récepteur hNT-R2. A partir des homogénats de cerveau de boeuf suivi s des étapes de purification par différents types de colonnes (échange d'ions, gel filtration), des fractions ont été choisies sur la base de l'inhibition de la liaison de la [1251] neurotensine sur le hNT-R2. En utilisant cette approche, deux peptides ont été identifiés Le séquençage de ces peptides a permis sa caractérisation et sa synthèse. Les peptides synthétiques testés en expériences de la liaison inhibent la liaison de la [1251]-neurotensine sur des membranes de cellules CHO-hNT-R2, avec une IC50 d'environ 30 nM.
EXEMPLE 6
Etudes de microphysiométrie
Les expériences de microphysiométrie ont été effectuées avec le Cytosensor Microphysiometer (Molecular Devices, Menlo Park,
CA). Chaque chambre de l'instrument contenant 3 x 105 cellules a été perfusée avec le milieu DMEM (Sigma, St. Louis, MO) contenant 40 mM
NaCI à 37"C. La vitesse d'acidification a été mesurée toutes les 60 secondes (débit 100 ml/min). Des injections de 15 secondes d'agonistes ont été effectuées. Pour les expériences d'inhibition des cellules ont été exposées avec les antagonistes pendant 30 minutes avant d'être perfusées avec l'agoniste.
La lignée CHO 2076.62 (hNT-R2) a été utilisée avec succès dans nos expériences de microphysiométrie (Cytosensor). Cependant, la neurotensine ne déclenche aucun signal en utilisant cette technique sur le hNTR-2 (dans les mêmes conditions, la neurotensine avait une réponse de 200 % avec le hNTR-1).
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: SANOFI
(B) RUE: 32-34 rue Marbeuf
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75008
(G) TELEPHONE: 0153774000
(H) TELECOPIE: 0153774133
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Récepteur humain à la neurotensine de type 2(hNT-R2)
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1575 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 37..1266
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAGTGAGAGG GAGGGAGCGC CGGCCGCGGG AGCGGG ATG GAA ACC AGC AGC CCG 54
Met Glu Thr Ser Ser Pro
1 5
CGG CCC CCG CGG CCC AGC TCC AAC CCG GGG CTG AGC CTG GAC GCC CGG 102
Arg Pro Pro Arg Pro Ser Ser Asn Pro Gly Leu Ser Leu Asp Ala Arg
10 15 20
CTG GGC GTG GAC ACT CGC CTC TGG GCC AAG GTG CTG TTC ACC GCG CTC 150
Leu Gly Val Asp Thr Arg Leu Trp Ala Lys Val Leu Phe Thr Ala Leu
25 30 35
TAC GCA CTC ATC TGG GCG CTG GGC GCG GCG GGC AAT GCG CTG TCC GTG 198
Tyr Ala Leu Ile Trp Ala Leu Gly Ala Ala Gly Asn Ala Leu Ser Val
40 45 50
SAC GTG GTG CTG AAG GCG CGG GCC GGG CGC GCG GGG CGC CTG CGC SAC 246 dis Val Val Leu Lys Ala Arg Ala Gly Arg Ala Gly Arg Leu Arg His
55 60 65
CAC GTG CTC AGC CTG GCG CTC GCG GGC CTG CTG CTG CTG CTG GTC GGC 294
His Val Leu Ser Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly 75 80 85
GTG CCG GTG GAG CTC TAC AGC TTC GTG TGG TTC CAC TAC CCC TGG GTC 342
Val Pro Val Glu Leu Tyr Ser Phe Val Trp Phe His Tyr Pro Trp Val
90 95 100
TTC GGC GAC CTG GGC TGC CGC GGC TAC TAC TTC GTG CAC GAG CTG TGC 390
Phe Gly Asp Leu Gly Cys Arg Gly Tyr Tyr Phe Val His Glu Leu Cys
105 110 115
GCC TAC GCC ACG GTG CTG AGC GTG GCA GGC CTG AGC GCC GAG CGC TGC 438
Ala Tyr Ala Thr Val Leu Ser Val Ala Gly Leu Ser Ala Glu Arg Cys
120 125 130
CTA GCC GTG TGC CAG CCC CTG CGT GCC CGC AGC CTG CTG ACG CCA CGC 486
Leu Ala Val Cys Gln Pro Leu Arg Ala Arg Ser Leu Leu Thr Pro Arg 135 140 145 150
CGG ACC CGG TGG CTG GTG GCG CTC TCG TGG GCC GCC TCG CTC GGC CTC 534
Arg Thr Arg Trp Leu Val Ala Leu Ser Trp Ala Ala Ser Leu Gly Leu
155 160 165
GCC CTG CCC ATG GCC GTC ATC ATG GGG CAG AAG CAC GAA CTC GAG ACG 582
Ala Leu Pro Met Ala Val Ile Met Gly Gln Lys His Glu Leu Glu Thr
170 175 180
GCG GAC GGG GAG CCG GAG CCC GCC TCG CGA GTG TGC ACG GTG CTG GTG 630
Ala Asp Gly Glu Pro Glu Pro Ala Ser Arg Val Cys Thr Val Leu Val
185 190 195
AGC CGC ACC GCG CTC CAA GTC TTT ATC CAG GTG AAT GTG CTG GTG TCC 678
Ser Arg Thr Ala Leu Gln Val Phe Ile Gln Val Asn Val Leu Val Ser
200 205 210
TTC GTG CTC CCC TTG GCA CTA ACT GCT TTC CTG AAT GGG GTC ACA GTG 726
Phe Val Leu Pro Leu Ala Leu Thr Ala Phe Leu Asn Gly Val Thr Val 215 220 225 230
AGC CAC CTG CTG GCC CTC TGC TCC CAA GTG CCG TCC ACT TCT ACC CCG 774
Ser His Leu Leu Ala Leu Cys Ser Gln Val Pro Ser Thr Ser Thr Pro
235 240 245
GGC AGC TCC ACC CCC AGC CGC CTG GAG CTG CTG AGT GAG GAG GGT CTC 822
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Arg Leu Glu Leu Leu Ser Glu Glu Gly Leu
250 255 260
CTC AGC TTC ATC GTA TGG AAG AAG ACC TTT ATC CAG GGA GGC CAG GTC 870
Leu Ser Phe Ile Val Trp Lys Lys Thr Phe Ile Gln Gly Gly Gln Val
265 270 275
AGC CTG GTG AGA CAT AAA GAC GTG CGC CGG ATC CGC AGC CTC CAG CGC 918
Ser Leu Val Arg His Lys Asp Val Arg Arg Ile Arg Ser Leu Gln Arg
280 285 290
AGC GTC CAG GTT CTC AGA GCC AT GTG GTC ATG TAT GTC ATC TG@ @@@ 966
Ser Val Gln Val Leu Arg Ala lie Val Val Met Tyr Val Ile Cys Trp 295 300 305 3@@
CTG CCG TAC CAT GCC CGC AGG CTC ATG TAC TGC TAC GTA CCT GAT GAC 1014
Leu Pro Tyr His Ala Arg Arg Leu Met Tyr Cys Tyr Val Pro Asp A5:D
315 320 325
GCG TGG ACT GAC CCA CTG TAC AAT TTC TAC CAC TAC TTC TAC ATG GTG l062
Ala Trp Thr Asp Pro Leu Tyr Asn Phe Tyr His Tyr Phe Tyr Met Val
330 335 343
ACC AAC ACA CTT TTC TAC GTC AGC TCA GCT GTG ACT CCT CTT CTC TAC
Thr Asn Thr Leu Phe Tyr Val Ser Ser Ala Val Thr Pro Leu Leu Tyr
345 350 355
AAC GCC GTG TCC TCC TCC TTC AGA AAA CTC TTC CTG GAA GCC GTC AGC 1358
Asn Ala Val Ser Ser Ser Phe Arg Lys Leu Phe Leu Glu Ala Val Ser
360 365 370
TCC CTG TGT GGA GAG CAC CAC CCC ATG AAG CGG TTA CCC CCG AAG CCC 1206
Ser Leu Cys Gly Glu His His Pro Met Lys Arg Leu Pro Pro Lys Pro 375 380 385 390 CAG AGT CCC ACC CTA ATG GAT ACA GCT TCA GGC TTT GGG GAT CCC CCA 1254 Gln Ser Pro Thr Leu Met Asp Thr Ala Ser Gly Phe Gly Asp Pro Pro
395 400 405 GAA ACC CGG ACC TGAATGTAAT GCAAGAATGA ACAGAACAAG CAAAATGACC 1306
Glu Thr Arg Thr
410 AGCTGCTTAG TCACCTGGCA AAGCAGGTGA GCAACCTCAT CACTAATCAT TCAAGCTTCG 1366 CAGCCAGGGC GACTTCTATC AACCCCTGCT CTGCTGAGAA CCATCAAGCG CAGGGAAGCC 1426 ACGTGACCCC TCCTAGCCTC AGGCTCCCTC GTCTGTGTAG TGGAGATAAA GAACAGCACC 1486
CATCTCTTAG TGTTGCCTGA GACTAAAGTG CTTAGCACAG AACCTGGTGC GTAGTAGATG 1546
CTCAATAAAT TTTTGCTGGC ACGAAAAAA 1575
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 410 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Glu Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Arg Pro Ser Ser Asn Pro Gly
1 5 10 15
Leu Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gly Val Asp Thr Arg Leu Trp Ala Lys
20 25 30
Val Leu Phe Thr Ala Leu Tvr Ala Leu Ile Trp Ala Leu Glv Ala Ala
35 40 45 01v Asn Ala Leu Ser Val His Val Val Leu Lys Ala Arg Ala Gly Arg
50 55 60
Ala Gly Arg Leu Arg His His Val Leu Ser Leu Ala Leu Ala 01v Leu
65 70 75 80
Leu Leu Leu Le Val Gly Val Pro Val Glu Leu Tyr Ser Phe Val Trp
85 90 95
Phe His Tyr Pro Trp Val Phe Gly Asp Leu Gly Cys Arg Glv Tyr Tv
100 105 110
Phe Val His Glu Leu Cys Ala Tyr Ala Thr Val Leu Ser Val Ala Gly
115 120 125
Leu Ser Ala Glu Arg Cys Leu Ala Val Cys Gln Pro Leu Arg Ala Arg
130 135 140
Ser Leu Leu Thr Pro Arg Arg Thr Arg Trp Leu Val Ala Leu Ser Trp 145 150 155 160
Ala Ala Ser Leu 01v Leu Ala Leu Pro Met Ala Val Ile Met Gly Gln
165 170 175
Lys His Glu Leu Glu Thr Ala Asp Gly Glu Pro Glu Pro Ala Ser Arg
180 185 190
Val Cys Thr Val Leu Val Ser Arg Thr Ala Leu Gln Val Phe Ile Gln
195 200 205
Val Asn Val Leu Val Ser Phe Val Leu Pro Leu Ala Leu Thr Ala Phe
210 215 220
Leu Asn 01v Val Thr Val Ser His Leu Leu Ala Leu Cys Ser Gln Val 225 230 235 240
Pro Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Arg Leu Glu Leu
245 250 255
Leu Ser Glu Glu Gly Leu Leu Ser Phe Ile Val Trp Lys Lys Thr Phe
260 265 270
Ile Gln Gly Gly Gln Val Ser Leu Val Arg His Lys Asp Val Arg Arg
275 280 285
Ile Arg Ser Leu Gln Arg Ser Val Gln Val Leu Arq Ala Ile Val Val
290 295 300
Met Tvr Val Ile Cys TrP Leu Pro Tyr His Ala Arg Arg Leu Met Tyr 305 310 315 320
Cys Tyr Val Pro Asp Asp Ala Trp Thr Asp Pro Leu Tyr Asn Phe Tyr
325 330 335
His Tvr Phe Tvr Met Val Thr Asn Thr Leu Phe Tyr Val Ser Ser Ala
340 345 350
Val Thr Pro Leu Leu Tyr Asn Ala Val Ser Ser Ser Phe Arg Lys Leu
355 360 365
Phe Leu Glu Ala Val Ser Ser Leu Cys Gly Glu His His Pro Met Lys
370 375 380
Arg Leu Pro Pro Lys Pro Gln Ser Pro Thr Leu Met Asp Thr Ala Ser 385 390 395 400
Gly Phe Gly Asp Pro Pro Glu Thr Arg Thr
405 410

Claims (15)

REVENDICATIONS
1. Polypeptide isolé constitutif du récepteur humain à la neurotensine de type 2 (hNT-R2).
2. Polypeptide hNT-R2 selon la revendication 1 comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n" 2, ou tout fragment polypeptidique, ou dérivé de celui-ci biologiquement actif.
3. Séquence nucléotidique isolée choisie parmi la séquence SEQ ID n" 1, les séquences nucléotidiques dérivées de la séquence SEQ ID n" 1 du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de délétion, d'insertion, d'un épissage alternatif ou d'une variabilité allélique, et les séquences nucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID n" 1.
4. Vecteur de clonage etlou d'expression contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 3.
5. Cellule hôte transformée par un vecteur selon la revendication 4.
6. Anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide récepteur selon l'une des revendications 1 et 2, dérivé, ou fragment polypeptidique de celui-ci biologiquement actif, administré à un animal, et sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2.
7. Procédé de production d'un polypeptide recombinant hNT-R2, fragment, ou dérivé de celui-ci biologiquement actif, dans lequel on cultive des cellules transformées selon la revendication 5 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide de séquence SEQ ID n" 2 ou tout fragment, ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et on récupére ledit polypeptide, fragment, ou dérivé de celui-ci biologiquement actif.
8. Procédé de criblage de composés susceptibles de se lier au polypeptide hNT-R2 selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide hNT-R2 et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ledit polypeptide hNT-R2.
9. Procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier au polypeptide hNT
R2 selon l'une des revendications 1 et 2, appelés ligands du récepteur hNT-R2, comprenant les étapes consistant à:
a) cultiver des cellules exprimant le polypeptide hNT
R2, en présence d'au moins un ligand du récepteur NT-R2 ; et
b) évaluer la capacité du ligand à moduler la transduction du signal.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel on évalue la capacité du ligand à moduler la transduction du signal en déterminant la concentration en inositolphosphates, en calcium cellulaire et/ou en AMPc.
11. Procédé d'identification de ligands du récepteur hNT
R2 comprenant les étapes consistant à:
a) mettre en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des ligands du récepteur hNT-R2 avec un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 ou une cellule selon la revendication 5 exprimant ledit polypeptide,
b) isoler les complexes ligand-récepteur formés,
c) identifier les ligands du récepteur hNT-R2.
12. Méthode de diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de récepteur hNT-R2 dans un prélèvement biologique et/ou de mesure du taux d'expression de celui-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps selon la revendication 6 avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre un récepteur hNT-R2 et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques formés.
13. Méthode de diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de la neurotensine ou de ses analogues dans un prélèvement biologique et/ou de mesure du taux d'expression de celle-ci/ceux-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre un ledit polypeptide et la neurotensine ou ses analogues et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.
14. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide récepteur hNT-R2, dérivé, ou fragment polypeptidique selon l'une des revendications 1 et 2, une séquence nucléotidique selon la revendication 3, ou un anticorps selon la revendication 6 associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
15. Utilisation d'un polypeptide récepteur hNT-R2, dérivé ou fragment polypeptidique selon l'une des revendications 1 et 2, d'une séquence nucléotidique selon la revendication 3, ou d'un anticorps selon la revendication 6 pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les troubles hormonaux ou neurologiques impliquant le récepteur hNT-R2 naturel et/ou la neurotensine.
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