FR2616804A1 - Sonde d'adn destinee a la detection de listeria monocytogenes, kit analytique et methode permettant d'effectuer cette detection - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une sonde d'ADN utile pour la détection de Listeria monocytogenes, ainsi qu'une méthode pour effectuer cette détection. Ladite méthode consiste à tester l'hybridation dans des conditions rigoureuses de l'ADN caractéristique de L. monocytogenes à une sonde dérivée du gène codant pour une protéine sécrétée de 60 kd. Application : détection de L. monocytogenes dans des échantillons biologiques, notamment des produits alimentaires.

Description

La présente invention a pour objet la prévention de la contamination et de l'altération des aliments et d'autres produits, et l'analyse médicale.

Plus précisément, elle concerne la détection de la presence d'organismes appartenant à l'espèce Listeria monocytogenes dans des échantillons biologiques.

Listeria monocytogenes est un coccobacille
Gram-positif qui a été tout d'abord identifié comme agent pathogène chez l'homme en lu29. On sait à présent que L. monocytogenes est très répanduedans l'environnement et peut être isolé de vecteurs humains ; et, ce qui est plus important, qu'il s'agit d'un facteur responsable d'épidémies, parfois fatales, d'empoisonnement alimentaire. Par exemple, c est L. monocytogenes qui était responsable des épidémies d'empoisonnement survenues à Jalisco et Ado Bera à partir de fromages contaminés, respectivement, en Californie et en Arizona.

L'infection par la bactérie produit des symptômes analogues à ceux de la grippe dont peuvent guérir aisément la plupart des gens ; cependant, des personnes qui sont immunodéprimées, telles que les nouveaux-nés, les personnes alcooliques, les patients atteints de cancers et les femmes 'enceintes, peuvent présenter des complications graves, et l'infection, chez ces individus, est souvent fatale.

Actuellement, la détection de la contamination par L. monocytogenes nécessite une culture de la bactérie à partir d'un échantillon d'aliment ou d'un échantillon biologique, puis des méthodes classiques d'identification de la bactérie, un procédé qui, en raison des caractéristiques de croissance de l'isolat, peut prendre plusieurs semaines ou plusieurs mois (Albritton, W.L., et collaborateurs, -dans Manual of
Clinical Microbiology, Lenette, E.H., et collaborateurs, éds. (1980), American Society for Microbiology, Washington, D.C. pages 139-142).

En conséquence, il serait utile de disposer d'un mode opératoire, qui soit plus rapide et plus sensible, pour la détection et l'identification de cet organisme. L'utilisation du gène codant pour une protéine produite par L. monocytogenes, qui est liée étroitement au schéma d'infection par cette espèce bactérienne, se révèle constituer une telle méthode.

La protéine en question, une protéine sécrétée de 60 kd, est la protéine principale trouvée dans les cultures de cellules de L. monocytogenes. Cette protéine possède une activité d'hémolysine. Elle peut etre apparentée à des protéines similaires présentes dans d'autres souches bactériennes desquelles L. monocytogenes doit être distinguée, mais le gêne, de la manière indiquée ci-dessous, est caractéristique de cette espèce d'organisme.

L'aptitude de L. monocytogenes à provoquer la maladie peut, en effet, dépendre de la présence d'hémolysine. A l'opposé de la plupart des autres agents infectieux envahissants, cette bactérie se multiplie dans des macrophages sensibles et produit des foyers dans les cellules du parenchyme qui sont résistants aux leucocytes polynucléaires (PN). La formation de ces foyers résistants dépend de leur ingestion par les phagocytes, de la fusion du phagosome et du lysosome et de la lyse ultérieure de la cellule. Il semble que l'hémolysine soit associée à ce procédé et que sa présence soit nécessaire pour ce dernier. Il a été en outre établi que de l'hémolysine partiellement purifiée peut léser des lysosomes isolés, provoquant la libération d'enzymes hydrolytiques et la destruction des
PN.

Les hémolysines appartiennent à un groupe de cytolysines activées par le groupe sulfhydryle, qui comprennent la streptolysine O de Streptococcus pyrogenes, et la céréolysine de Bacillus cereus. Une protéine ayant une activité d'hémolysine est la protéine principale sécrétée par L. monocytogenes, et possède un poids moléculaire approximativement égal à 60 kd.

D'autres espèces du genre Listeria se sont également révélé avoir une activité hémolytique mais, de la manière décrite ci-dessous, les protéines sécrétées par ces espèces, telles que L. ivanoii ou L. seeligeri, ne sont pas identiques à celle caractéristique de L.

monocytogenes. L'hémolysine sécrétée de 60 kd produite par L. monocytogenes n'est apparemment pas non plus homologue de cytolysines apparentées, pouvant être activées par le groupe sulfhydryle, produites par B.

thuringiensis ou S. pneumoniae.

Il est montré ci-dessous que le gène codant pour la protéine de 60 kd sécrétée par L. monocytogenes, ayant une activité d'hémolysine est utile comme sonde d'ADN pour la détection de souches de cette espèce dans différents échantillons. La nature de la "protéine" sécrétée, qu'il s'agisse d'un seul constituant ou d'un mélange, n'est pas établie nettement ; cependant, il est évident que la fraction protéique de 60 kd présente dans le surnageant possède une activité hémolytique.

L'utilisation de sondes d'ADN, en général, pour la détection d'organismes particuliers dans des échantillons biologiques est, bien entendu, connue.

Le brevet réexaminé des Etats-Unis d'Amérique N" B1 4 358 535 au nom de Falkow et collaborateurs décrit de manière générale des méthodes de détection d'organismes particuliers dans des échantillons au moyen de sondes d'ADN. La voie habituelle classique pour l'obten- tion de l'ADN à partir d'échantillons à des fins d'hybridation est, dans son principe, celle de Southern,
E., J.Mol.Biol. (1975) 98:503-517, cité à titre de référence dans le présent mémoire. Cependant, d'autres procédés d'obtention d'ADN en des quantités appropriées peuvent également être utilisés.Par exemple, l'amplification des séquences d'ADN désirées afin d'accroitre la sensibilité de l'essai peut etre effectuée en utilisant le procédé de Mullis, K., et collaborateurs, Science (1985).

La présente invention propose une catégorie de sondes qui sont utiles pour détecter la présence des organismes de l'espèce L. monocytogenes dans des échantillons biologiques, comprenant des échantilons alimentaires, en utilisant des techniques classiques d'extraction et d'hybridation d'ADN. La présente invention a plus particulièrement pour objet le gène codant pour une protéine sécrétée de 60 kd ayant une activité d'hémolysine caractéristique des souches de l'espèce
L. monocytogenes. Des sondes préparées à partir de ce gène s'hybrident dans des conditions drastiques à des fragments d'ADN de L. monocytogenes, tout en étant incapables de s'hybrider dans des conditions comparables à de l'ADN codant putativement pour des protéines analogues provenant d'autres espèces bactériennes. En raison de la spécificité des sondes, la présente invention propose'une méthode présentant une spécificité, une sensibilité et une vitesse suffisantes pour permettre de déterminer plus efficacement une contamination alimentaire ou bien d'effectuer plus efficacement une vérification de l'infection de patients par cet organisme particulier.

En conséquence, dans un aspect, la présente invention concerne des sondes utiles dans une méthode de détection de la présence de Listeria monocytogenes dans des échantillons biologiques, méthode qui consiste à détecter la présence ou l'absence d'ADN dans l'échantillon qui s'hybride à la sonde dans des conditions drastiques. La sonde d'ADN de la présente invention est obtenue à partir du gène codant pour une protéine sécrétée de 60 kd d'une souche classique de L. monocytogenes. Dans d'autres aspects, la présente invention, concerne des sondes particulières, des méthodes les utilisant et des kits de réactifs les contenant.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins annexés sur lesquels
la figure 1 représente une carte du fragment
SalI/EcoRI de 5,2 kb contenant le gène codant pour la protéine de 60 kd et
la figure 2 présente l'immunoréactivité des surnageants de cultures cellulaires de l'espèce de Listeria avec un antisérum préparé contre la protéine de 60 kd sécrétée par L. monocytogenes.

A. Définitions
Telle qu'elle est utilisée dans le present mémoire, l'expression "conditions drastiques" désigne l'hybridation dans les conditions décrites par Southern,
E.M., J Mol Biol (1975) (ci-dessus) telle qu'elle a été modifiée par Thomashow, M.F., et collaborateurs,
Cell (1980) 19:729-739, tous deux cités à titre de références dans le présent mémoire, un lavage étant effectué en utilisant 0,3 x SSC et 0,1 X de dodécylsulfate de sodium (DSS) à 68'C, ou bien d'autres protocoles de caractères drastiques comparables.L'expression "conditions non drastiques" désigne des conditions drastiques comparables à celles obtenues en utilisant la méthode ci dessus mais dans lesquelles les taches sont lavées dans 3 x SSC, 0,2 % de DSS et 5 mM d'acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA) à 55"C. On sait qu'il existe un continuum entre des conditions drastiques et des conditions non drastiques ; cependant, la présente invention a été définie de manière opérationnelle en termes de conditions drastiques qui sont connues pour permettre une distinction adéquate entre la protéine de 60 kd sécrétée par L. monocytogenes et des protéines comparables provenant d'autres espèces.

L'expression "échantillon biologique" désigne toute matière présentant un intérêt en ce qui concerne la contamination par L. monocytogenes. En général, ces échantillons se répartissent en deux catégories -- les échantillons alimentaires et les échantillons prélevés chez des personnes ou des animaux suspectés d'héberger l'infection. Bien entendu, la méthode peut être appliquée à des échantillons obtenus à partir de n'importe quelle matière pouvant permettre la croissance de ces bactéries.

B. Description générale
Manipulation de l'échantillon
Les sondes de la présente invention sont appliquées à l'analyse d'échantillons en utilisant des modes opératoires qui sont généralement connus; pour l'application des techniques d'hybridation d'ADE à la détection d'ADN particuliers présents dans des échantillons. L'ADN peut être isolé d'un échantillon approprié de matière biologique en utilisant, par exemple, le procédé de Flamm, R.K., et collaborateurs,
Infect Immunol (1984) 44:157-161. L'ADN total est ensuite généralement traité par un enzyme de restriction tel que EcoRI, BamHI, SalI ou HindIII afin d'obtenir des fragments de dimensions aléatoires qui sont ensuite soumis à une séparation en fonction des dimensions en uti lisant, par exemple, l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, suivant la méthode décrite par Southern,
E.M. (ci-dessus).Les fragments d'ADN séparés sont ensuite dénaturés et hybridés à une sonde convenable dans des conditions appropriées aux caractères drastiques choisis. Les méthodes d'hybridation d'ADN présent dans des échantillons à des sondes d'ADN sont ellesmêmes bien connues dans la pratique.

Sondes
Les sondes de la présente invention, desquelles dépend la méthode de la présente invention, sont obtenues à partir du gène codant pour une protéine de 60 kd sécrétée par L. monocytogenes ; la protéine sécrétée possède une activité hémolytique. Elles contiennent une séquence d'ADN qui est équivalente au transcript inverse de l'ARNm codant pour la protéine et/ou des régions adjacentes de ces séquences telles qu'elles se trouvent dans le génome, c'est-à-dire le gène natif. Par exemple, le gène concerné consiste en un fragment EcoRI/Sa1I de 5,2 kb de pRFîO2 qui est déposé (dans E. coli Le392) dans l'American Type Culture
Collection, Rockville, MD, et porte le numéro de dépôt
ATCC ; ce fragment de 5,2 kb est obtenu à partir du génome de L. monocytogenes 10403.De la manière illustrée ci-dessous, ce fragment de 5,2 kb peut être utilisé directement comme sonde dans la méthode de la présente invention ou bien, de préférence, un fragment HincII/HindIII de 500 pb de ce fragment peut être utilisé. En général, les sondes de la présente invention contiennent au moins une partie de la séquence codant pour une protéine de 60 kd. Ainsi, en plus du fragment de longueur totale de 5,2 kb contenant le gène, la séquence codante seule comprenant le gène peut être utilisée, ou bien encore une sousséquence de cette dernière, comprenant au moins une séquence de 12 pb.De la manière illustrée ci-dessous, le fragment entier de 5,2 kb contenant le gène cloné dans pBR325 a été appelé pRF102 ; le fragment HincII/ Hindili de 500 pb a été clone dans pUC8 pour obtenir pRF106. Ainsi, pRF102 et/ou pRF106 constituent des sondes de la présente invention et contiennent des séquences intercalaires qui renferment la séquence d'ADN génomique codant pour la protéine sécrétée de 60 kd présente dans t. monocytogenes 10403. Ces sondes peuvent être utilisées dans la méthode de la présente invention, comme peuvent l'être des sondes "équi valentes".

L'expression "séquence génomique codant pour" la protéine sécrétée de 60 kd désigne la séquence présente dans le génome de L. monocytogenes, qu'elle soit obtenue matériellement à partir du gène ou bien synthétisée ou préparée par un autre procédé, du moment que la même séquence de nucléotides est obtenue.

L'expression "sondes équivalentes" désigne un sous-fragment des séquences intercalaires, dérivées de L. monocytogenes, de pRF102 ou pRFîO6 ou bien ces segments modifiés seulement si faiblement qu'ils conservent leur spécificité initiale par des substitutions peu importantes de bases. Ces séquences modifiées comprennent spécifiquement les portions correspondantes des gènes associés aux souches de L. monocytogenes différant de celles desquelles les séquences intercalaires de pRF102 et pRF106 ont été isolées.

La possibilité de disposer de l'ADN génomique approprié de pRF102 et pRF106, en particulier, offre un moyen d'obtenir ces sondes équivalentes. Plus précisément, d'autres souches peuvent être utilisées comme source pour ces équivalents, l'ADN provenant de ces souches, préparé de la manière décrite dans le présent mémoire et soumis à une séparation par élec- trophorèse sur gel de polyacrylamide ou d'agarose, étant soumis à une sélection en ce qui concerne les fragments appropriés. Les gels sont explorés avec le clone déposé ou un de ces fragments pour identifier l'ADN s'hybridant dans les conditions drastiques requises. Cet ADN est excisé des gels et amplifié dans
E. coli d'une manière analogue à celle décrite dans le présent mémoire.

De la manière indiquée ci-dessous, la spécificité du sous-fragment présent dans pRF106 est supérieure à celle du plus gros fragment présent dans pRFl02.

En conséquence, dans des procédés pour obtenir des sondes équivalentes, il est également préféré d'utiliser pRF106. La probabilité de retrouver des séquences de spécificité comparable est ainsi accrue. Dans une autre voie, pRF102 et pRF106 peuvent être utilisées en association pour obtenir des fragments convenables.

Quelle que soit l'association de sondes initiales, pRF106 seule, pRF106/pRF102 associées ou pRF102 seule, les fragments de gènes extraits d'autres souches de
L. monocytogenes présentent une forte probabilité de contenir les sites HincII/HindIII appropriés pour donner les fragments correspondant'à pRF106, et la spécificité des ADN extraits peut être améliorée par traitement avec ces enzymes. Ainsi, une série de sondes analogues à pRF106 peut être obtenue à partir d'autres souches.

De la manière indiquée ci-dessus, des modifications de faible importance de la séquence nucléotidique peuvent être tolérées, du moment qu'elles ne sont pas suffisantes pour supprimer la spécificité de la sonde.

Le cas échéant, les sondes peuvent être marquées en utilisant des techniques classiques. (Dans certains cas, il peut ne pas être nécessaire de marquer directement les sondes, des méthodes existant pour la détection de l'ADN bicaténaire en présence d'ana logues monocaténaires). Cependant, plus classiquement, les sondes sont marquées directement en utilisant des isotopes, le plus souvent 32p, par translation de cou- pure ou bien traitement par une kinase. En variante, l'ADN peut être lié à des résidus fluorescents, tels qu'un résidu fluorescéine ou dansyle ; à des enzymes, tels que la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline ; ou à des substances chromophores.

C. Kits
La méthode de la présente invention pour la détection de L. monocytogenes dans des échantillons biologiques peut être convenablement mise en oeuvre en utilisant des kits de réactifs contenant les sondes appropriées. Les sondes peuvent être marquées par différentes techniques, de la manière décrite ci-dessus.

Les sondes sont dénaturées juste avant hybridation, par exemple par incubation dans un bain d'eau bouillante, puis par refroidissement rapide dans un mélange de d'eau et de glace.

Si les sondes doivent être marquées au
32 moyen de P, elles sont généralement fournies à l'état non marqué en raison de la courte demi-vie du marqueur. Cependant, l'ADN ,marqué par un enzyme ou par un corps fluorescent peut être fourni sous forme marquée.

Le kit peut renfermer en outre des réactifs supplémentaires dans des récipients appropriés pour l'extraction de l'ADN des cellules présentes dans l'échantillon, la digestion de l'ADN avec un enzyme de restriction convenable, et la séparation des fractions sur des gels servant de supports. Les gels classiques servant de supports comprennent le polyacrylamide et l'agarose.

La nature et la quantité des réactifs et supports dépendent des commodités et de la conception de la méthode particulière de marquage utilisée, du type d'échantillon et de la quantité d'échantillons analysés. Ces variantes entrent dans le domaine de l'homme de l'art, et sont proposées à titre de commodité. Le kit contient également les instructions permettant la mise en oeuvre de l'analyse.

D. Exemple de procédé de séparation
Préparation de la protéine appelée hémolysine et d'antisérums
Le gène codant pour l'hémolysine de L.

monocytogenes 10403 a eté recherché en utilisant la réactivité immunologique de la protéine codée visà-vis des antisérums produits contre la protéine sécrétée soluble. (La présence fréquente d'hémolysine soluble dans L. monocytogenes a été démontrée par Njokubi
Obi et collaborateurs, J Bacteriol (1963) 86:1-8, qui ont testé l'activité hémolytique de 112 souches de
L. monocytogenes sur des plaques de gélose au sang de mouton. 91 % des souches présentaient une telle activité. L'hémolysine s'est révélé faire partie de manière générale des cytolysines à activation sulfhydryle (Smyth, C.J., et collaborateurs, dans Bacterial
Toxins and Cell Membranes (1978), Jeljaszewicz et collaborateurs, éds., Academic Press Inc., NY, pages 129183)).

La protéine de 60 kd présentant une activité d'hémolysine, provenant de cette souche particulière, a été purifiée à partir de L. monocytogenes 10403 cultivée pendant une nuit dans 2 litres de bouillon EHI qui ont été dialysés, en partant de bouillon
BHI concentré (4x), pendant une nuit à 4"C pour éliminer les grosses protéines (diamètre des pores 2,4 Nananètres). Le surnageant de la culture a été recueilli par centrifugation à 10 000 g et le surnageant a été ajusté au moyen de 10 mM de EDTA et 0,02 X d'azoture de sodium.Du sulfate de sodium cristallin a été ajoute à 70 % de saturation sous agitation lente, puis préci pitation pendant une nuit à 4 C. Le précipité a été recueilli par centrifugation à 10 000 g pendant 10 10 minutes à pH 7,2, et remis en suspension dans de l'eau distillée. La suspension a été dialysée contre du tris 100 mM.

La protéine remise en suspension s'est révélé avoir une activité d'hémolysine en utilisant la méthode de Kingdon, G.C., et collaborateurs, Infect
Immunol (1970) 1:356-362 en utilisant des hématies lavées de mouton en suspension à 1 %.

La protéine remise en suspension contenant l'hémolysine a été ensuite soumise à une électrophorèse sur gel par mise en suspension dans du tampon de lyse (tris HCl 125 mM, pH 6,8, DSS 2 %, glycérol 10 %, mer captoéthanol 0,7 M et bleu de bromophénol 0,003 %) et traitée à la vapeur d'eau pendant 10 minutes avant de soumettre les échantillons à une électrophorèse suivant la technique classique de Laemmli. Les protéines séparées ont été isolées du gel, le cas échéant, ou bien transférées sur nitrocellulose par électrophorèse à 500 mA pendant 3 heures.

Seule une bande protéique principale a été observée dans le surnageant ; elle présentait une mobilité électrophorétique correspondant à un peptide de 60 kd. Ce peptide de 60 kd présentait une activité hémolytique en outre, des hématies lysées avec le surnageant brut ont été associées à un peptide de 60 60 kd, et des antisérums produits contre la protéine purifiée de 60 kd inhibaient l'activité hémolytique du surnageant brut.

Des antisérums ont été produits contre le surnageant brut et contre le peptide purifié de 60 kd. La préparation a été effectuée par des procédés classiques en utilisant des doses d'injection émulsionnées dans l'adjuvant complet de Freund, avec des doses ultérieures d'injection de rappel dans l'adjuvant incomplet de Freund. Des lapins ont été soumis à des injections sous-cutanées à plusieurs endroits d'approxima vivement 500 mg de protéine du surnageant brut ou 200 mg d'hémolysine purifiée à des intervalles de deux semaines, et ont été saignés une semaine après la troisième injection.

Préparation du gène
L. monocytogenes 10403 obtenue auprès de M.L. Gray a été utilisée comme source de banque génomique. L'ADN total a été préparé de la manière décrite par Flamm et collaborateurs, Infect Immunol (1984) (ci-dessus), digéré avec Sau3AI et les fragments ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les fragments de 15 à 23 kb ont été séparés des gels et fixés par ligation à de l'ADN vecteur de EMBL3A (Frischauf, A. et collaborateurs, J Mol Biol (1983) qui a été digéré avec BamHI et EcoRI. Le mélange de ligation a été introduit dans un phage en utilisant la méthode in vitro de Hohn, B., Methods Enzymol (1979) 68:209-218) et amplifié dans E. coli NM535 (Frischauf,
A., et collaborateurs (ci-dessus)).

Des colonies séparées de E. coli infecté ont été testées en utilisant la technique de soulèvement de plaques (Young, R.A. et collaborateurs, Proc Natl
Acad Sci USA (1983) 80:1194-1198) pour mettre en évidence la présence du polypeptide de 60 kd, en utilisant les deux antisérums anti-hémolysine décrits ci-dessus.

Plusieurs plaques se sont révélé réagir avec les antisérums et le phage provenant d'une des plaques,
L5, a été sélectionné.

L'analyse de restriction a montré que les dimensions de la séquence intercalaire dans L5 correspondaient à 15,7 kb, et la séquence intercalaire a été séparée et digérée avec EcoRI/Sa1I, puis clonée dans pBR325 digéré par EcoRI/Sa1I et transformée dans E.

coli LE392 obtenue auprès de Anquist, L. La digestion de L5 avec SA1I/EcoRI a donné trois fragments de 5,2 kb (SA1I/EcoRI) ; 3,5 kb (EcoRI/EcoRI) ; et 7,0 kb (EcoRI/SalI). L'analyse immunologique des taches effectuée pour le polypeptide de 60 kd dans les bactéries transformées a montré que la séquence codant pour la protéine de 60 kd se situe dans le fragment SalI/EcoRI de 5,2 kb.

Le plasmide pBR325 contenant la séquence intercalaire de 5,2 kb a été appelé pRF7o2 et l'orientation de la séquence intercalaire a été étudiée en utilisant le transposon TnphoA. Ce transposon s 'in- sère de manière aléatoire dans l'ADN présent dans d'autres plasmides et porte une partie du gène de la phosphatase alcaline, ce qui permet la détection du produit obtenu par translation. En conséquence, des colonies renfermant les séquences intercalaires appropriées dans la direction de transcription et de translation des séquences de gènes envahies sont détectables par un test de -coloration.L'utilisation de cette méthode et l'analyse de l'ADN de colonies qui se sont révélé sécréter de manière détectable de la phosphatase alcaline et présenter une activité d'hémolysine a permis d'obtenir la carte représentée sur la figure 1.

La portion HincII/HindIII de la séquence codante d'approximativement 500 pb mentionnée sur la figure 1 a été clonée dans pUC8 digéré par HincII/ Hindili pour obtenir le plasmide supplémentaire pRF106.

Utilisation des sondes
pRF102 et pRF106 sont utiles comme sondes pour détecter la présence de L. monocytogenes en présence d'autres bactéries Gram-positives. Dix-sept souches de L. monocytogenes ont été examinées pour déterminer la présence d'un fragment d'ADN présentant une homo logie avec pRF106 après extraction de l'ADN, digestion avec EcoRI et séparation par électrophorèse sur gel.

Dans des conditions drastiques d'hybridation, de la manière définie ci-dessus, toutesles souches possédaient un fragment EcoRI d'approximativement 13 kb qui s'hybridaient avec la sonde. Il n'y avait aucun autre fragment hybridé, même dans des conditions faiblement drastiques.

La spécificité de pRF106, sonde utilisée pour -L. monocytogenes par opposition aux autres bactéries Gram-positives, a été testée de la maniere décrite dans le paragraphe précédent, les résultats étant présentés sur la figure 2. Les résultats concernant les souches suivantes sont présentés sur les voies 1 à 11 des figures 2a et 2b, respectivement, pour des conditions drastiques et non drastiques
voie 1, L. murrayi, ATCC 25401
voie 2, L. denitrificans, ATCC 14870
voie 3, L. grayi, ATCC 19120
voie 4, L. innocua, ATCC 33090
voie 5, L. seeligeri, ATCC 35967
voie 6, L. ivanovii, ATCC 19119
voie 7, L. monocytogenes, 10403
voie 8, L. monocytogenes, D3A
voie 9, L. monocytogenes, Scott A
voie 10, L. monocytogenes, EGD
voie 11, L. monocytogenes, ATCC 19111.

Comme -le montre la figure 2a, dans des conditions drastiques répondant à la définition cidessus, seules les voies 7 à 11, contenant lXADN digéré par EcoRI provenant des souches de L. monocytogenes, 32 ont montre une hybridation à la sonde marquée au P.

Pour l'utilisation dans cette analyse, pRFîO6 a été marquée par la méthode de translation de coupure de
Maniatis, T. et collaborateurs, Proc Natl Acad Sci
USA (1975) 72:1184-1188, modifiée de la maniere decrite par Thomashow, M.F., et collaborateurs, Cell (1980) 19:729-739.

Comme le montre la figure lb, dans des conditions faiblement drastiques répondant à la définition précitée, les souches des voies 4 à 6 ont présent également une hybridation à la sonde pRF106 par un petit fragment ; même dans ces conditions, les souches testées dans les voies 1 à 3 n'ont pas donné de fragments d'hybridation.

Ces résultats sont conformes à ceux obtenus en utilisant comme critère l'immunoréactivité. Lorsque les surnageants de culture de la même espèce de
Listeria que celle testée sur la figure 2 ont été fractionnés sur un gel de polyacrylamide(PAGE) à 10% de DSS, transferés sur nitrocellulose et traités avec un antisérum produit contre l'hémolysine de 60 kd purifiée sur gel, les résultats présentés sur la figure 3 ont été obtenus
Les souches de L. monocytogenes présentées sur les voies 7 à 11 montraient une immunoréactivité nette avec les antisérums contre la protéine de 60 kd. Il existait une ré activité croisée avec les antisérues par les surnageant s des souches (voies 4 à 6) qui présentaient une hybridation avec la sonde dans des conditions faiblement drastiques. Seule L. innocua a montré la présence de la seule protéine de 60 kd. L. seeligeri a montré la présence d'une seule protéine de 60 ka, tandis que L. ivanovii a donné deux composés de 60 kd et 67 kd.

Des résultats négatifs, dans toutes les conditions drastiques, ont été également obtenus lorsque des éléments de digestion d'ADN provenant de différentes autres bacteries Gram-positives ont été testés en utilisant la sonde pRF106. Aucun ADN d'hybridation nta été détectable dans les surnageants de B. cereus, B thuringiensis, S. pyrogenes et S. pneumoniae.

La sonde pRF102 présente une spécificité légèrement inférieure, comme elle reconnait des fragments d'ADN provenant de L. seeligeri, L. innocua et t. ivanovii, en plus de L. monocytogenes, dans des conditions faiblement et fortement drastiques. Ainsi, la sonde pRF106 est nettement préférée.

Le 6 janvier 1988, le plasmide pRF102 transformé dans E. coli LE392 a été déposé dans l'American Type Culture Collection, à Rockville, MD, et a été admis conformément au Traité de Budapest. Le numéro de dépôt pour cette culture est 67599. Toutes les restrictions concernant l'obtention de ce dépot seront levées de manière irrévocable par la délivrance des brevets des Etats-Unis d'Amérique, sur la base de la présente demande. Ce dépôt est effectué pour des raisons de commodité pour le praticien, et ne doit pas être interprété comme une admission qu'une description écrite puisse être inadéquate. Au contraire, la Demanderesse considère que la description écrite figurant dans le présent mémoire permet totalement à l'homme de l'art la mise en pratique de la présente invention. En outre, l'accessibilité de ce dépôt ne constitue pas une licence à la mise en pratique de la présente invention en contravention avec les droits attribués à la Demanderesse en raison d'une loi quelconque sur les brevets nationaux.

Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'â titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Sonde d'ADN utile pour la détection de la présence de Listeria monocytogenes, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'ADN génomique codant pour la protéine de 60 kd sécrétée par L. monocytogenes 10403 ou bien, au moins, un fragment de 12 pb de celle-ci, ou une sonde équivalente.

2. Sonde suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence intercalaire d'ADN présente dans pRF102 ou son équivalent, ou bien au moins un fragment de 12 pb de celle-ci.

3. Sonde suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence intercalaire d'ADN de pRF106 ou son équivalent, ou bien au moins un fragment de 12 pb de celle-ci.

4. Sonde suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la sonde équivalente est la séquence.

d'ADN génomique codant pour la protéine de 60 kd sécrétée par une souche de L.monocytogenes autre que la souche 10403, ou bien au moins un fragment de 30 pb de celle-ci.

5. Sonde suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est conjuguée à un marqueur.

6. Sonde suivant la revendication 5, carac

32 térisée en ce que le marqueur est le P.

7. Sonde suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit de pRF106.

8. Méthode de détection de la présence de Listeria monocytogenes dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle consiste

à détecter dans l'échantillon la présence ou l'absence d'ADN qui s'hybride dans des conditions drastiques avec une sonde d'ADN comprenant la séquence d'ADN génomique codant pour la protéine de 60 kd sécrétee par L. monocytogenes 10403, ou bien au moins un fragment de 30 bp de celle-ci, ou une sonde équivalente.

9. Méthode suivant la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à effectuer la digestion de l'ADN de l'échantillon avec un enzyme de restriction, à séparer les fragments sur gel, et à tester les fragments séparés en ce qui concerne l'hybridation dans des conditions drastiques avec la sonde d'ADN.

10. Méthode suivant la revendication 9, caractérisée en ce que l'enzyme de restriction est

EcoRI.

11. Kit de réactifs utile pour la détection de la présence de L. monocytogenes dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend la sonde d'ADN suivant la revendication 1, avec des réactifs supplémentaires pour la préparation d'ADN à partir de l'échantillon et les instructions permettant la mise en oeuvre de l'analyse.