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FR2600897A1 - Pansement proteolytique et absorbant et procede pour sa preparation - Google Patents

Pansement proteolytique et absorbant et procede pour sa preparation Download PDF

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FR2600897A1
FR2600897A1 FR8609750A FR8609750A FR2600897A1 FR 2600897 A1 FR2600897 A1 FR 2600897A1 FR 8609750 A FR8609750 A FR 8609750A FR 8609750 A FR8609750 A FR 8609750A FR 2600897 A1 FR2600897 A1 FR 2600897A1
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FR
France
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trypsin
support
sep
pyrophosphate buffer
glutaraldehyde
Prior art date
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Withdrawn
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FR8609750A
Other languages
English (en)
Inventor
Isabelle Aliaga
Pierre Monsan
Francois Fauran
Jean-Pierre Couzinier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pierre Fabre Medicament SA
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament SA
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Publication date
Application filed by Pierre Fabre Medicament SA filed Critical Pierre Fabre Medicament SA
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Publication of FR2600897A1 publication Critical patent/FR2600897A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
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Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN NOUVEAU PANSEMENT PROTEOLYTIQUE ET ABSORBANT ET PROCEDE POUR SA PREPARATION. LE PANSEMENT SELON L'INVENTION SE CARACTERISE EN CE QU'IL COMPORTE UN SUPPORT A BASE D'UN DERIVE D'AMIDON SUR LEQUEL EST GREFFE, PAR L'INTERMEDIAIRE D'UNE LIAISON CHIMIQUE, DE LA TRYPSINE.

Description

La présente invention concerne un pansement protéolytique et absorbant pour plaies et son procédé de préparation.
Si, depuis des millénaires l'homme s'intéresse à la guérison des plaies et si de nos jours, de nombreux travaux sont encore consacrés à ce sujet, il s'avère que chacune des méthodes de soin déjà préconisées comporte des lacunes et/ou insuffisances quant à l'efficacité obtenue.
Une des premières méthodes de soins de l'Antiquité a été l'utilisation de miel en pansement pour les brûlures, les engelures, les petites plaies et les ulcères. L'eau oxygénée produite par action de la glucose oxydase du miel stimule, en début de traitement, la formation du tissu de granulation et diminue parfois la douleur locale.
Le sucre est également à nouveau largement utilisé. Lorsqu'il est appliqué sur une plaie, il se dissout et crée un environnement où l'activité de l'eau est basse, ce qui inhibe toute croissance bactérienne.
Ainsi, après un débridement chirurgical, I'application de sucre sur des plaies infectées entraîne une modification de l'odeur de celle-ci et une disparition des sécrétions en 72 à 96 heures.
En fait, le revêtement selon la présente invention procure tous les avantages des méthodes précitées, à savoir, la formation du tissu de granulation, la diminution de la douleur, la désodorisation et l'inhibition de la croissance bactérienne.
Mais en outre, le pansement selon la présente invention a pour but de favoriser la guérison de la lésion bien plus que ne le faisaient les matériaux traditionnels.
En effet, ledit pansement protéolytique et absorbant pour plaies est caractérisé en ce qu'il comporte un support à base d'un dérivé d'amidon sur lequel est greffé, par l'intermédiaire d'une liaison chimique, de la trypsine.
Le terme "pansement" désignera tout au long de la description un objet de forme et de constitution quelconques, destiné à être appliqué sur une plaie.
Le pansement selon la présente invention permet la lyse des protéines, ou protéolyse. Il s'agit en effet, de dégrader rapidement les tissus dévitalisés et nécrosés et ce, au moyen de la trypsine qui est une enzyme pancréatique connue pour accélérer efficacement l'autolyse naturelle des protéines.
Ce débridement enzymatique des plaies sera notamment utile en tant que complément du traitement chirurgical des lésions nécrosées et inertes, principalement les brûlures, dont la guérison est facilitée par une dégradation rapide des tissus nécrosés.
Selon la présente invention, la trypsine est greffée par une liaison chimique sur un dérivé d'amidon dont le pouvoir d'absorption élevé permet de supprimer rapidement les exsudats ou excès de sécrétion de la plaie.
L'amidon est un polymère, ou mieux un polycondensé du glucose, dans lequel les radicaux de glucopyranose alpha (cycles en forme "bateau") forment des chaînes où ils sont unis par la fonction réductrice et l'oxhydryle alcoolique en position 4. Il n'y a pas d'autre mode de liaison dans l'amidon linéaire, à chaîne droite, tandis qu'on en rencontre un second type dans l'amidon dit ramifié, où les ramifications se font par une liaison glucosidique alpha à partir de l'oxhydryle de l'alcool primaire en position 6:
Figure img00020001
De préférence, selon la présente invention, la liaison chimique s'effectue sur les atomes de carbone 2 et 3 des fragments glucopyranosiques, à savoir les atomes de carbone portant les fonctions hydroxy.
En particulier, la liaison peut être établie sur chacun desdits atomes de carbone 2 et 3 , par l'intermédiaire du groupement
Figure img00030001

dans lequel
G représente le glutaraldéhyde,
T représente la trypsine, et
n est un nombre entier compris entre 1 et 4, de préférence égal
à 2.
Le support utilisé de préférence selon la présente invention est le copolymère amidon-acrylonitrile dont les groupes cyanés sont partiellement hydrolysés en amide et en carboxylate de sodium (ou de potassium). Ce copolymère d'amidon, lorsqu'il est hydrolysé et évaporé à sec, possède un pouvoir d'absorption, particulièrement performant avec l'eau distillée. Il se présente sous la forme d'une poudre brun clair, très hygroscopique, dont la structure est définie par son mode d'obtention.
Le nombre d'unités de base et de liaisons de ce copolymère reste indéterminé.
Il peut être représenté par la formule I suivante
Figure img00030002

dans laquelle
n, m, x et z sont des facteurs indépendants les uns des autres et varient de O à l'infini.
Le copolymère peut être synthétisé grâce à diverses techniques connues de lghomme de l'art. En particulier, on peut réaliser la copolymérisation en faisant réagir de l'amidon, tel que l'amidon de mais, avec l'acrylonitrile dans l'eau en présence d'un catalyseur, tel qu'un sel de sérium, permettant de générer des radicaux libres. Des chaînes de polyacrylonitrile se forment au niveau de ces radicaux libres. Il suffit ensuite de saponifier le copolymère ainsi formé par une hydrolyse dans un alcali tel que de la potasse ou de l'hydroxyde de sodium et de le sécher sous vide ou par tout autre procédé convenable connu de l'homme de l'art.Le schéma réactionnel suivant illustre un mode de préparation du copolymère amidon-acrylonitrile
Figure img00040001
Le pansement absorbant et protéolytique selon la présente invention est préparé par les étapes successives suivantes
a) on oxyde les fonctions OH portées par les atomes de carbone 2
et 3 des fragments glucopyranosiques du dérivé d'amidon à
l'aide d'un sel de l'acide métapériodique, il s'agira, de préfé
rence de métapériodate de sodium
b) on rince par le tampon pyrophosphate et on récupère par
filtration le produit issu de l'étape a), on procédera de préfé
rence, à une filtration sous vide sur un frité de porosité adé
quatre
c) on amine les fonctions oxydées au cours de l'étape a) à l'aide
d'un alkylènediamine en solution aqueuse, il s'agira de préfé
rence de l'éthylènediamine
d) on rince par le tampon pyrophosphate et on récupère par
filtration le produit issu de l'étape c), la filtration sera de
préférence une filtration sous vide sur un frité de porosité
adéquate
e) on active e les fonctions aminées au cours de l'étape c) en les
mettant en contact avec une solution de glutaraldéhyde dans
du tampon pyrophosphate, cette activation se fera de préfé
rence à un pH légèrement basique
f) on élimine l'excès de glutaraldéhyde par lavages répétés du
produit Issu de étape e) avec le tampon pyrophosphate, on
renouvellera de préférence ces lavages jusqu'à ce que--de-sm-Hw
geant donne une réaction négative à un test de détection des aldéhydes
g) on greffe les fonctions activées au cours de l'étape e) avec une
solution de trypsine dans du tampon pyrophosphate, ce greffage
se fera de préférence à un pH légèrement basique , et
h) on élimine la trypsine non greffée par lavages répétés du
produit issu de Itétape g) avec du tampon pyrophosphate puis
du chlorure de sodium.
La trypsine peut avoir des origines diverses. Dans les exemples détaillés ci-après, on utilise de la trypsine SIGMA, type IX, que l'on extrait de pancréas de porc et qui contient de 1 à 5% d'acétate de calcium. Elle est, de préférence selon la présente invention, mise en solution dans du tampon pyrophosphate de sodium 0,05 M à pH 8,6. Le procédé d'immobilisation préféré selon la présente invention (figure 1) est le suivant
Un échantillon de 500 mg de support est oxydé par 100 ml de métapériodate de sodium (MERCK) puis aminé par de l'éthylène- diamine (FLUKA), en solution dans l'eau. Le volume occupé par le support étant beaucoup plus faible dans le tampon pyrophosphate que dans l'eau distillée, le tampon a servi à rincer le support entre chaque étape.Le support est récupéré par filtration sous vide sur un frité de porosité adéquate.
Le support activé est mis en contact avec 100 ml de glutaraldéhyde (MERCK à 25%) dans du tampon pyrophosphate de sodium 0,05 M, pH 8,6.
L'excès de glutaraldéhyde est enlevé par lavages répétés avec 100 ml du même tampon, jusqu'à ce que le surnageant donne une réaction négative au test du réactif de Schiff (détection des aldéhydes).
Le support activé est alors soit, à nouveau rincé avec du tampon pyrophosphate pour servir de témoin, soit mis en contact avec 100 ml de solution de trypsine dans du tampon pyrophosphate (PROLABO) 0,05 M, pH 8,6.
La trypsine non fixée est éliminée par lavages répétés avec le même tampon pyrophosphate puis du chlorure de sodium (PROLABO) 1M.
Le pansement ainsi obtenu se présente sous forme de particules sèches. De préférence, selon la présente invention, il est partiellement humidifié jusqu'à l'obtention d'un gel.
Les pansements pourront être appliqués tels quels sur la plaie, sous forme de poudre ou de gel. Ils pourront aussi comporter un autre matériau d'application tel qu'une gaze, du coton, une bande ou un sparadrap.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants et à l'aide des figures annexées.
La figure 1 représente le procédé de préparation du pansement. Sur cette figure : a) correspond à l'oxydation par NaIO4, c) représente l'amination par H2N-(CH2)2-NH2, e) représente l'activation par le glutaraldéhyde (G) de formule : OHC-(CH2)3-CHO et g) correspond à l'étape de fixation de la trypsine ).
La figure 2 représente l'évolution de l'activité par gramme de support et du rendement d'immobilisation, en fonction de la quantité de trypsine introduite, dans les conditions suivantes
Métaperiodate de sodium : 2 mM, 10 min. à 20 C;
Ethylènediamine : 5 mM, 10 min. à 20 C
Glutaraldéhyde : 2,5%, 6 h à 20 C
Trypsine : 12 h à 40C.
La figure 3 représente l'évolution de l'activité de la trypsine immobilisée par gramme de support sec, en fonction de la concentration en éthylènediamine, à différentes températures, dans les conditions suivantes
Métaperiodate de sodium : 5 mM, 10 min. à 20 C;
Ethylènediamine : 10 min.;
Glutaraldéhyde : 2,5%, 6 h a'? 20 C
Trypsine : 19900 U/g support, 12 h à 4 C.
La figure 4 représente l'influence de la durée de contact sur l'activité par gramme de support sec, pour différentes quantités initiales de trypsine, dans les conditions suivantes
Métaperiodate de sodium : 5 mM, 10 min. à 200C
Ethylènediamine : lOO mM, 10 min. à 20 C
Glutaraldéhyde : 2,5 %, 1 h à 200C
Trypsine : +4 C.
La figure 5 représente l'évolution du rendement d'immobilisation en fonction de la quantité initiale de trypsine, pour différents temps de contact, dans les conditions suivantes
Métaperiodate de sodium : 5mM, 10 min. à 20 C
Ethylènediamine : 100 mM, 10 min. à 20 C
Glutaraldéhyde : 2,5%, 1 h à 20 C
Trypsine : +4 C.
Méthodes employées
A/ Mesure de l'activité enzymatique
L'activité enzymatique est ensuite mesurée au pH-stat en utilisant un substrat synthétique de la trypsine : N-Benzoyl-L-Arginine
Ethyl Ester (B.A.E.E.) (LASKOWSKI, 1955 ; WALSH et WILCOX, 1970).
La trypsine SIGMA type IX correspond. à 14900 U de B.A.E.E.
par mg de protéine. 1 unité B.A.E.E. provoque une variation d'absor bance à 253 nm de 0,001 min 1 à pH 7,6 ; 25"C dans 3,2 ml.
Le B.A.E.E. (SIGMA et BOEHRINGER). est en solution dans du tampon Tris-Hcl 50 mM et CaCl2 20 mM ; pH 8,0. La concentration est 100 mM.
* Principe de la mesure
L'activité enzymatique est déterminée en mesurant la vitesse initiale de la réaction qui correspond à la quantité de protons libérés.
en effet, la trypsine, comme toutes les protéases, hydrolyse les liaisons peptidiques du substrat (ici le BAEE) et libère des protons dans le milieu réactionnel. La diminution de pH qui en résulte est compensée par l'addition en continu d'un volume précis de soude préalablement titrée. Le pH est ainsi maintenu constant tout au long de l'hydrolyse.
Le volume de soude ajouté permet donc d'avoir accés à la concentration de protons libérés. L'appareillage utilisé est un pH-stat TACUSSEL composé d'un pH-mètre pin81, d'un titrateur TTS et d'une burette électronique. La température du mélange réactionnel est assurée par un bain thermostaté.
* Dosage de l'activité enzymatique
L'activité enzymatique est déterminée en introduisant le support sur lequel est immobilisée la trypsine dans une cellule thermostatée munie d'un système d'agitation et dans laquelle plonge l'élec- trode du pH-mètre. La réaction est placée sous bullage d'azote afin d'éviter l'interférence de l'anhydride carbonique. Lorsque l'équilibre thermique est atteint, on introduit 10 ml de BAEE également thermostaté et dont le pH a été ajusté à celui de la consigne (8,0). Le volume de soude versé est mesuré pendant une dizaine de minutes par un enregistreur relié à la burette automatique.
* Calcul
Unité : unité = l pmole de NaOH versée/min.
pente à l'origine = #y (ml.min-1)
N N: normalité de la soude
A A: activité enzymatique exprimée en moles de
soude versée -par minute
A - x N x î03 (pmol.min l) = U #x
m m: masse sèche de support sur lequel l'activité A
a été mesurée.Cette masse est obtenue par
lavage et lyophilisation de l'échantillon dosé
A5 : activité enzymatique immobilisée par gramme
de support sec
A = A (pmoles.min~l .g = U.g l sec)
m
B/ Calcul du rendement d'immobilisation
Le rendement d'immobilisation R est le ratio
Figure img00090001
A : Activité de l'enzyme immobilisée (U/g) par gramme de support sec
M : Masse totale de support en fin de manipulation (g) A1 : Activité introduite : nombre d'unités contenues dans le volume de
solution enzymatique mise en contact avec le support activé
AL : Activité récupérée : nombre d'unités recueillies au cours des
différents lavages.
C1 Mise au point du protocole d'immobilisation
Le protocole de mise au point du pansement a été réalisé
suivant un plan d'expériences factoriel qui permet de faire varier les
facteurs expérimentaux agissant sur les réactions et d'estimer la signi
fication des effets sur la réponse envisagée.
Aspect et comportement du support
Le lot définitif de support se présente sous l'aspect de
particules de granulométrie irrégulière de couleur claire. Humides, elles
ne forment pas de gel homogène. Les particules hydratées restent
individuelles, quelle que soit leur taille.
Les capacités d'absorption du support sont grandes et varient
de manière importante suivant la nature du liquide absorbé. Cette
modification du volume absorbé semble être due à un effet des sels.
Une fois lyophilisé, le support est rapidement hydraté et
absorbe.
Avant de débuter l'optimisation des différentes étapes du
processus d'immobilisation, la mise au point du protocole expérimental
a été approfondie. En particulier, l'évolution de la désorption de la
trypsine a été étudiée, ainsi que l'influence de la concentration d'en
zyme introduite sur l'activité et sur le rendement.
Ces essais ont été réalisés en choisissant des concentrations
et des temps de contact arbitraires mais identiques d'une manipulation .à-l'autre, afin de pouvoir comparer les résultats.
* Influence des lavages sur la désorption de la trypsine non
immobilisée
Le but de cette étude est de déterminer le nombre minimal
de lavages après la mise en contact du support activé avec la trypsine,
pour que toute ltenzs me non immobilisée par liaison covalente soit
éliminée.
Pour cela, l'activité enzymatique a été mesurée après différents lavages, sur le support et dans le "surnageant" de lavage afin de calculer le rendement d'immobilisation.
Ces mesures ont été effectuées lors de deux immobilisations, dont l'une servait de témoin. Pour cette manipulation témoiru,- le glu taraldéhyde a été remplacé par du tampon pyrophosphate 0,05 M, pH 8,6.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau l sui vant
TABLEAU l
Evolution de l'activité enzymatique mesurée sur le support en fonction du nombre de lavages.
Figure img00110001
<tb>
<SEP> Activité <SEP> (U/g <SEP> support <SEP> sec)
<tb> <SEP> Etape <SEP> Témoin <SEP> Essai
<tb> <SEP> Retrait <SEP> enzyme <SEP> 1961 <SEP> 2404
<tb> <SEP> ler <SEP> lavage <SEP> pyrophosphate <SEP> 487 <SEP> 652
<tb> <SEP> 2ème <SEP> lavage <SEP> pyrophosphate <SEP> 94 <SEP> 185
<tb> <SEP> ler <SEP> lavage <SEP> NaCI <SEP> 21 <SEP> ; <SEP> 140
<tb> <SEP> 2ème <SEP> lavage <SEP> NaCI <SEP> 25149 <SEP>
<tb> <SEP> 3ème <SEP> lavage <SEP> NaCl <SEP> 20 <SEP> 125
<tb> Rendement <SEP> d'immobilisation <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> 4,3 <SEP> %
<tb>
Comme le montrent nettement les résultats obtenus lors des deux manipulations, la trypsine qui n'est pas immobilisée par liaison covalente est rapidement désorbée au cours des lavages.
L'activité mesurée nqévolue pratiquement plus après deux lavages au tampon pyrophosphate 0,05 M, pH 8,6 et un lavage au
NaCI 1M.
Pour la manipulation témoin, il ne reste plus que 20 U/g support sec. Cela correspond à la trypsine incluse dans le gel de support. Cette valeur est suffisamment faible, par rapport à l'activité mesurée lors de l'immobilisation, pour pouvoir être négligée.
Après que le support ait été lavé deux fois avec du tampon pyrophosphate, un seul lavage au NaCI 1 M suffit à désorber la trypsine non immobilisée.
* Influence de la quantité de trypsine
La figure 2 montre que la variation de 990 à 20 000 du nombre d'unités de trypsine mises en contact avec un gramme de support s'accompagne d'une hausse continue - et importante de l'activité par gramme de support sec.
Au-delà de cette valeur, le phénomène est moins marqué et pour une concentration initiale d'enzyme cinq fois plus importante (99 000 U/g), I'activité n'est multipliée que par un facteur 1,5.
Le rendement d'immobilisation quant à lui, diminue lorsque la concentration en trypsine augmente.
La quantité d'enzyme utilisée est fixée à 19800 U/g de support. Cette valeur est un bon compromis entre la quantité de trypsine à utiliser et l'activité par gramme de support sec.
a) Importance relative et dépendance éventuelle des différentes
étapes
Dans le plan d'expériences utilisé, les facteurs sont au nombre de trois : oxydation, amination et activation. La fixation de l'enzyme n'est pas prise en compte car cette étape est indépendante de l'activation du support.
La matrice d'expérience a permis le calcul des effets des trois facteurs précités : effets principaux, effets d'interaction d'ordre 1 et effets d'interaction d'ordre 2.
L'analyse de ces effets a permis de conclure que les trois étapes : oxydation, amination et activation étaient dépendantes.
Cet effet est particulièrement marqué pour l'oxydation et l'amination qui devront donc être optimisées ensemble.
L'activation au glutaraldéhyde est l'étape qui exerce l'influence la plus importante sur la préparation du support.
Au cours de l'optimisation des différentes étapes, il faut tenir compte du comportement physico-chimique du support qui doit conserver ses propriétés de gel.
b) Optimisation de l'oxydation et de l'amination
La matrice d'expérience a permis de mettre en évidence l'influence exercée par les trois facteurs étudiés sur les étapes d'oxydation et d'amination. L'effet le plus marqué est dû aux concentrations en réactifs dont l'augmentation provoque un accroissement de l'activité de l'enzyme immobilisée.
La durée et -la température de contact exercent des effets du même ordre de grandeur. Lorsque les valeurs de ces facteurs augmentent, I'activité immobilisée diminue.
Les facteurs étudiés sont dépendants, en particulier les concentrations en réactif et la durée de contact.
Pour obtenir les activités maximales, les températures devront être basses, les temps de contact courts et les concentrations en réactifs les plus élevées possible.
Les manipulations précédentes permettent de fixer les valeurs de certains paramètres des étapes d'oxydation et d'amination.
Les temps de contact qui doivent être brefs, sont fixés à 10 minutes.
Les concentrations en métaperiodate de sodium et éthylènediamine doivent être élevées.
Celle du métaperiodate doit être 5 mM car, toutes les autres conditions étant identiques, pour des valeurs inférieures, I'activité est moindre et pour des concentrations supérieures, le support est dégradé.
Seule la concentration en éthylènediamine reste donc à déterminer, sachant que la valeur optimale est comprise entre 5 et 500 mM. En effet, une concentration supérieure entraîne une perte des propriétés de gel du support. Des immobilisations ont été réalisées pour des concentrations de 5, 50,100, 250 et 500 mM.
La température qui donne les activités les plus élevées est +40C. Les manipulations ont néanmoins été effectuées en double, une série avec oxydation et amination à +40C et une autre avec ces étapes à +20"C, afin de mieux cerner l'effet de la température.
Les conditions des différentes immobilisations sont présentées dans le Tableau 2 ci-après et les résultats à la figure 3.
Tableau 2
Conditions d'immobilisation
Figure img00140001
<tb> <SEP> Etape <SEP> Durée <SEP> Concentration
<tb> <SEP> réactif
<tb> Oxydation <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 5 <SEP> mM
<tb> Amination <SEP> 10 <SEP> min. <SEP> 5-50-100-250-500mM
<tb> Activation <SEP> (20"C) <SEP> 6 <SEP> h <SEP> 2,5 <SEP> 96 <SEP>
<tb> Immobilisation <SEP> (4"C) <SEP> 15 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> non <SEP> mg/l
<tb>
L'activité par gramme de support sec suit la même évolution en fonction de la concentration en éthylènediamine, lorsque l'oxydation et l'amination sont réalisées à +400C et à +20"C. Les courbes présentent une cassure assez nette autouc~de la concentration 100 mM.
En deça de cette valeur, l'activité augmente fortement avec la concentration en éthylènediamine, alors qu'au-delà, l'augmentation est beaucoup moins rapide.
Cette cassure dans la courbe correspond à une observation visuelle. En effet, dans les essais où la concentration en éthylènediamine est supérieure à 100 mM, une coloration jaune-orangée du support se produit lors de la mise en contact avec le glutaraldéhyde.
Cette coloration s'intensifie lorsque la concentration augmente.
Cet effet est particulièrement marqué pour les essais où l'oxydation et l'amination ont été réalisées à 200C. A cette température, le support aminé avec l'éthylènediamine- 250 et 500 mM a pratiquement perdu son aspect de gel.
L'oxydation et l'amination à +40C conduisent à des activités plus élevées que lorsqu'elles ont été réalisées à 20"C (effet négatif de la température). Cette différence s'atténue lorsque la concentration en éthylènediamine devient supérieure à 100. mu.
Cette série de manipulations indique que la concentration optimale en éthylènediamine est 100 mM.
Il reste à déterminer la température d'oxydation et d'amination.
Lorsque la concentration en éthylènediamine est 100 mM,
I'activité est sensiblement la même (3 G d'écart), à 20"C ou à 40C.
Conclusion
Des étapes successives ont permis de déterminer les conditions optimales d'oxydation et d'amination. Ces conditions sont les suivantes : pour 550 mg de support dans un volume de 100 ml.
Oxydation
Métaperiodate de sodium : 5 mM
Durée : 10 min.
Température : 200C
Amination
Ethylènediamine : 100 mM
Durée : 10 min.
Température : 20"C c) Optimisation de l'activation au glutaraldéhyde
La matrice d'expérience fait apparaître que, dans l'étape d'activation au glutaraldéhyde, le facteur le plus important est la concentration, dont l'effet est très supérieur à ceux de la durée et de la température de contact. Ces deux derniers sont du même ordre de grandeur et les paramètres qu'ils caractérisent sont dépendants.
Cette série de manipulations permet de savoir que l'activation au glutaraldéhyde peut être réalisée à 200C. L'effet positif de la température de contact est peu important et va dans le sens d'une simplification des manipulations.
En conséquence, la concentration en glutaraldéhyde doit être élevée et les temps de contact plutôt longs, pour. que l'activité de l'enzyme immobilisée soit maximale.
La température d'activation est donc fixée à 20"C. La concentration et la durée de contact restent à déterminer, la première étant comprise entre 0,5 ,ó et 6%, la seconde entre 10 minutes et 6 heures. Ces bornes correspondent aux limites acceptables compte tenu des contraintes expérimentales et du comportement mécanique du support.
Les essais ont donc été réalisés pour des concentrations en glutaraldéhyde de 0,596 ; 1,25%; 2,596 et 596. Dans chaque cas les durées de contact ont été : 10 min., 1 h, 3 h et 6 h.
La trypsine est toujours utilisée dans la proportion de 19 900 U/g de support, l'immobilisation étant effectuée à +4"C. Les activités obtenues par gramme de support dans ces différents cas, sont présentées dans la figure 4.
Au fur et à mesure que la durée de contact augmente, l'activité maximale croît et elle est atteinte pour des concentrations en glutaraldéhyde de plus en plus faibles.
Pour une durée de contact de 6 h, seule la partie décroissante de la courbe, après que l'activité maximale ait été atteinte, a pu être décrite dans les conditions choisies.
Les valeurs retenues pour la concentration en glutaraldéhyde
et la durée de contact sont : 2,5 % pendant 3 heures. En effet, pour
ces valeurs, I'activité est élevée (2000 U/g de support) et elle est peu
modifiée par de faibles variations de la concentration en glutaraldé
hyde. Les conditions 1,25 96 pendant 3 heures permettent d'obtenir une
activité plus importante (2900 U/g de support) mais dès que l'on
s'écarte un tant soit peu de la concentration 1,25 %, cette activité diminue rapidement.
Conclusion
Les conditions donnant les meilleurs résultats choisies pour la suite des manipulations sont les suivantes
Glutaraldéhyde : Concentration : 2,5 %
Durée de contact : 1 heure
Température de contact : 20"C d) Optimisation de l'immobilisation de la trypsine
Le plan d'expériences a mis en évidence la forte influence de la quantité initiale de trypsine sur l'activité.
Il indique également qu'une température basse est préférable.
Dans les essais suivants, I'immobilisation de la trypsine sera donc réalisée à +4"C, pendant une durée plutôt longue, la quantité de trypsine mise en contact avec un gramme de support étant élevée.
Au cours de la mise au point du protocole expérimental d'immobilisation, I'influence de la quantité initiale de trypsine par gramme de support sur l'activité a été mise en évidence. Dans des conditions qui n' avaient pas encore été opltimisées, activité atteignait un plateau lorsque la quantité de trypsine atteignait 19 900 U/g. Les différentes étapes ayant été optimisées, I'étude a été reprise, mais uniquement pour trois quantités d'enzyme. Les valeurs choisies : 9 900, 19 800 et 39 600 U/g de support sont centrées sur la quantité déterminée lors de l'étude préalable.
Dans chaque cas, les durées de contact sont : 2h, 4h et 12h.
Au cours de ces différents essais, les rendements d'immobilisation ont également été déterminés. Les résultats obtenus sont présent tés dans la figure 5.
Lorsque l'on suit l'évolution de l'activité en fonction du temps de contact, il apparaît que pour deux quantités de trypsine sur trois, I'activité passe par un maximum puis diminue. Ce phénomène est très faible pour 9 900 U/g de support. Dans les deux autres cas, l'activité maximale atteinte est identique (1623 U/g sec et 1695 U/g) alors que la quantité de trypsine est multipliée par deux (19 900 U introduites/g et 39 600 U introduites/g).
Par ailleurs, on retrouve le phénomène mis en évidence dans le plan d'expériences : lorsque le temps de contact devient très grand,
I'activité décroît. Dans cette série d'essais, il n'a été que de 12 heures au plus, et l'effet est déjà sensible.
La figure 7 perm-et de constater que le rendement d'immobilisation passe également par des maxima (25% et 28%) lorsque la quantité de trypsine introduite est 19 900 U/g de support, pendant 2h ou 4h. Pour 12h de contact, le rendement est bien plus faible, quelle que soit la quantité initiale de trypsine.
Conclusion
De ces deux séries de manipulations, il ressort que les conditions les plus favorables à l'immobilisation de la trypsine sur le support sont
Trypsine : Quantité introduite : 19 900 U/g de support
Durée de contact : 4 h
Température de contact : +4"C.
Les meilleurs résultats ont été obtenus dans les conditions suivantes : pour 500 mg de support dans un volume de 100 ml
Oxydation
Métaperiodate de sodium 5 mM en solution aqueuse pendant 10 min. à 20"C.
Amination
Ethylènediamine : 100 mM en solution aqueuse pendant 10 min. à 20 C.
Activation
Glutaraldéhyde : 2,5% en solution dans du tampon- pyrophosphate de sodium 0,05 M, pH 8,6 pendant 1h à 20"C.
Immobilisation
Trypsine introduite dans la proportion de 19 800 U/g de support, pendant 4h à +4"C. L'enzyme est en solution dans du tampon pyrophosphate de sodium 0,05 M, pH 8,6.
L'activité de la trypsine immobilisée dans ces conditions est d'environ 1600 U/g de support sec, avec un rendement de 26%.

Claims (11)

REVENDICATIONS
1. Pansement protéolytique et absorbant pour plaies, caractérisé en ce qu'il comporte un support à base d'un dérivé d'amidon sur lequel est greffée, par l'intermédiaire d'une liaison chimique, de la trypsine.
2. Pansement selon la revendication 1, caractérisé en ce que la liaison chimique est établie au niveau des atomes de carbone 2 et 3 de fragments glucopyranosiques du dérivé d'amidon.
3. Pansement selon la revendication 2, caractérisé en ce que les atomes de carbone 2 et 3 portent chacun un groupement de formule
Figure img00200001
dans laquelle
G représente le glutaraldéhyde
T représente la trypsine, et
n est un nombre entier compris entre 1 et 4.
4. Pansement selon la revendication 3, caractérisé en ce que n est égal à 2.
5. Pansement selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le support est un copolymère amidon-acrylonitrile dont les groupes cyanés sont partiellement hydrolysés en amide et en carboxylate de sodium.
6. Procédé de préparation du pansement selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes sui vantes
a) on oxyde les fonctions OH portés par les atomes de carbone 2
et 3 des fragments glucopyranosiques du dérivé d'amidon à
l'aide d'un sel de l'acide métapériodique
b) on rince par le tampon pyrophosphate et on récupère par
filtration le produit issu de l'étape a)
c) on amine les fonctions oxydées au cours de l'étape a) à l'aide
d'un alkylènediamine en solution aqueuse ;;
d) on rince par le tampon pyrophosphate et on récupère par
filtration le produit issu de l'étape c)
e) on active les fonctions aminées au cours de l'étape c) en les
mettant en contact avec une solution de glutaraldéhyde dans
du tampon pyrophosphate
f) on élimine l'excès de glutaraldéhyde par lavages répétés du
produit issu de l'étape e) avec le tampon pyrophosphate
g) on greffe les fonctions activées au cours de l'étape e) en les
mettant en contact avec une solution de trypsine dans du
tampon pyrophosphate, et
h) on élimine la trypsine non fixée par lavages répétés du produit
issu de l'étape g) avec du tampon pyrophosphate, puis du chlo
rure de sodium.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que pour 500 mg de support on greffe une quantité de trypsine comprise entre 10 000 et 30 000 unités/ & de support.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape a) est effectuée à l'aide d'une solution aqueuse de métapériodate de sodium 5mM pendant environ 10 minutes à environ 20"C.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape c) est effectuée à l'aide d'une solution aqueuse d'éthylènediamine 100 mM pendant environ 10 minutes à environ 200C.
10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape e) est effectuée à l'aide d'une solution -de glutaraldéhyde à 2,5% dans du tampon pyrophosphate de sodium 0,Q5 M à un pH d'environ 8,6 pendant environ 1 heure et à une température approximative de 20"C.
11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape g) est effectuée en introduisant une solution de trypsine dans du tampon pyrophosphate de sodium 0,05 M à pH d'environ 8,6 à raison de 19 900 unités/g de support pendant environ 4 heures à une température approximativement de 4"C.
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