FR2600341A1 - Procede de purification d'un produit d'expression genetique obtenu par technique d'adn recombinant - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PURIFICATION D'UN PRODUIT D'EXPRESSION GENETIQUE OBTENU PAR TECHNIQUE D'ADN RECOMBINANT. SELON L'INVENTION, IL COMPREND UNE SEQUENCE SPECIFIQUE D'ETAPES COMPRENANT UN TRAITEMENT D'ADSORPTION AU GEL DE SILICE, UN TRAITEMENT D'ADSORPTION AU CHARBON ACTIVE, UNE CENTRIFUGATION A GRADIENT DE DENSITE AU MOINS DOUBLE ET UNE CENTRIFUGATION A GRADIENT DE DENSITE A L'EQUILIBRE AU MOINS DOUBLE. LA PRESENTE INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A L'ENLEVEMENT D'UN ALLERGENE DES PRODUITS D'EXPRESSION GENETIQUE AINSI CONTAMINES, PERMETTANT LA PRODUCTION, A GRANDE ECHELLE, DE PRODUITS D'EXPRESSION GENETIQUE TRES PURIFIES.
Description
La présente invention se rapporte à un procédé pour la purification d'un
produit d'expression génétique obtenu par technique d'ADN recombinant. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour la purification de substances utiles qui sont obtenues d'une culture de transformants préparés:ar technique d'ADN recombinant, par lequel l'allergène dér- é des transformants et inévitablement contenu dans les:. bstances utiles est efficacement enlevé. Par le procédé de la présente invention, les substances utiles biologiquement produites peuvent être efficacement purifiées au point qu'aucun allergène ne soit détecté par une analyse habituelle. Le procédé de la présente invention est particulièrement utile pour la purification des ingrédients actifs pour des produits pharmaceu15 tiques et quasi-pharmaceutiques à administrer directement ou à appliquer au corps humain. Par exemple, le présent procédé est extrêmement utile pour la préparation d'antigènes de vaccin, d'enzymes pour usage pharmaceutique, d'enzymes pour pâte dentifrice et poudre dentifrice, de protéines 20 pour cosmétiques, etc. Lorsqu'un corps vivant est antigéniquement stimulé par inoculation ou inhalation d'un antigène, le corps vivant produit un anticorps qui réagit spécifiquement avec l'antigène. Ensuite, si le même type d'antigène que l'antigène cidessus mentionné entre dans le corps vivant, il se produit une réaction antigène-anticorps dans le corps vivant, provoquant la destruction de l'antigène en tant que matière étrangère. C'est un mécanisme de protection contre des infections et il est appelé phénomène d'immunité. Cependant, dans certains cas, à l'entrée d'un antigène, il se produit une réaction anormale ou hypersensible, telle qu'une inflammation locale ou un choc brusque qui est assez différent du phénomène d'immunité. Cette réaction anormale est appelée réaction allergique. Actuellement, la réaction allergique est répartie en quatre types, c'est-à-dire les Types I, II, III et IV, selon la manifestation de la réaction allergique et la condition du patient. Parmi les quatre types, le Type I est bien connu comme réaction allergique majeure et est appelé allergie du type immédiat ou anaphilaxie. Dans les cas des corps humains, on considère que l'allergie du Type I est généralement provoquée par l'anticorps de l'immunoglobuline E (IgE). A titre d'exemple, si un corps 15 humain est stimulé par un allergène en tant qu'antigène, l'anticorps IgE contre l'allergène est produit dans le corps et est ainsi porté. Ensuite, si le même type d'allergène que celui ci-dessus mentionné entre dans le corps,- il se produit une réaction antigène-anticorps entre l'allergène 20 et l'anticorps de IgE provoquant ainsi une réaction allergique. Des substances qui sont connues comme allergène ou source d'allergène sont par exemple les pollens, les insectes, les fragments de peau, les moisissures, les substances dérivées de micro-organismes, les aliments, les produits 25 pharmaceutiques, les produits chimiques, etc. En général, la quantité de l'anticorps de IgE porté par les corps humains, qui est réactive à de telles substances, peut être mesurée par un test de réaction d'anaphylaxie cutanée
passive (PCA).
La contamination des injections de vaccin et analogues, qui sont administrées directement aux corps humains, par un allergène en tant qu'impureté nuit fortement aux médicaments qui doivent être sOrs. Cependant, dans la préparation des médicaments biologiques tels qu'un vaccin, 35 il y a encore de nombreuses conditions et de nombreux problèmes à étudier concernant l'activité, la sécurité et l'homogénéité et par conséquent, les recherches couramment entreprises dans ce domaine n'ont pas encore été étendues au développement d'une technique de purification d'ordre supérieur donnant particulièrement la priorité à l'enlèvement de l'allergène E Voir par exemple, Methods in Microbiology, volume 5B, pages 425-454 (1971), Academic Press, Angleterre; Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 5601-5605 (1979);et Nucleic Acids Research, 11, 2745-2763 (1983)]. 10 Récemment, une tentative a été faite pour réduire la capacité de l'allergène à induire l'anticorps de IgE en modifiant l'allergène par du polyéthylène glycol, du pullulane, du dextrane, une polyamine, un acide gras, de
l'urée, du glutaraldéhyde, de la formaline, etc. Cependant, 15 cette étude est encore au premier stade.
Par ailleurs, le développement rapide, ces dernières années, de la technique génétique, a permis de préparer des transformants de microorganismes et de cellules somatiques et de produire diverses substances utiles à partir de cultures de tels transformants. Par ailleurs, de telles substances utiles peuvent probablement être contaminées d'un allergène dérivé des transformants. Cependant, également dans le domaine de la technique génétique, l'importance n'est pas encore placée sur la purification d'ordre supérieur 25 pour l'enlèvement de l'allergène des produits d'expression génétique ainsi contaminés. Bien qu'une chromatographie par affinité dans laquelle un anticorps monoclonal est utilisé, une électrophorèse à grande échelle et autres, aient été développées pour purifier les produits d'expression génétique, 30 elles ne sont pas encore suffisamment efficaces pour enlever l'allergène dérivé des transformants. Par ailleurs, la purification par chromatographie par affinité présente des inconvénients car, comme des valeurs extrêmement faibles de pH sont employées pour éluer le produit adsorbé, le produit protéiné à purifier peut être dénaturé, avec pour
Brevet US N 4 565 697 Brevet US NO 4 578 269.
En conséquence, dans le domaine de la technique génétique comprenant la production biologique de médicaments, il est d'une nécessité urgente d'établir une technique de purification d'ordre supérieur pour l'enlèvement de l'allergène dérivé de transformants et contenu dans des produits
d'expression génétique.
Etant donné la situation actuelle décrite ci-dessus, 10 les présents inventeurs ont effectué des études intensives afin de développer un procédé efficace pour l'enlèvement d'un allergène des produits d'expression génétique ainsi contaminés. Par suite, ils ont trouvé de manière inattendue qu'un procédé de purification comprenant une séquence 15 d'étapes d'un traitement d'adsorption au gel de silice, d'un traitement d'adsorption au charbon activé, d'au moins deux fois une centrifugation à gradient de densité et d'au moins deux fois une centrifugation à gradient de densité à l'équilibre est extrêmement efficace pour l'enlèvement d'un 20 allergène des produits d'expression génétique obtenus par technique d'ADN recombinant. Par un tel nouveau procédé de purification, on peut obtenir un produit d'expression génétique très purifié dont l'allergène dérivé du transformant est enlevé au point que l'on ne détecte plus d'aller25 gène par test de réaction PCA. Par ailleurs, en utilisant le nouveau procédé de purification, on peut effectuer, de manière stable, une purification d'ordre élevé et à grande échelle. La présente invention a été accomplie en se basant
sur la nouvelle découverte.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de purification des produits d'expression génétique, qui est extrêmement efficace pour enlever complètement l'allergène dérivé des transformants et contenu dans
les produits d'expression génétique.
Selon la présente invention, on prévoit un procédé résultat une faible immunogénicité du produit et lorsque le produit souhaité adsorbé dans la colonne est élué, il est nécessairement contaminé par l'anticorps, donc une purification supplémentaire est nécessaire pour l'enlève5 ment de l'anticorps. Par ailleurs, dans la purification par électrophorèse, il y a également divers inconvénients tels qu'une restriction du milieu pouvant être employé, une sensibilité du degré de purification aux conditions de
l'opération, donc l'électrophorèse n'est pas adaptée à une 10 purification à grande échelle.
Outre les méthodes ci-dessus mentionnées de purification, la purification par filtration sur gel et chromatographie en colonne échangeuse de cations ont été proposées,mais elles sont également défect-euses. Par exemple, dans 15 le cas o un produit brut contenant l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (antigène HBs) est purifié par filtration sur gel, le rendement de l'antigène HBs est très faible, par exemple n'atteignant que 5 à 20% et l'antigène HBs peut être inactivé dans la colonne du fait de la faible 20 concentration de cet antigène. Dans le cas o un produit brut contenant l'antigène de HBs est purifié par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions, la pureté du produit après purification est insuffisamment basse En ce qui concerne les méthodes habituelles ci-dessus 25 mentionnée de purification, on peut se référer à ce qui suit: Publication de demande de brevet international (PCT) N W085/05631 Publication de demande de brevet européen N 0 140 386 Brevet US N 4 503 035 Brevet US N 4 505 893 Brevet US N 4 508 709 Brevet US N 4 508 833 Brevet US N 4 514 506 Brevet US N 4 525 459 Brevet US N 4 552 758 Brevet US N 4 554 157 de purification d'un produit d'expression génétique obtenu par technique d'ADN recombinant, qui comprend les étapes de: (a) soumettre une solution aqueuse brute contenant un produit d'expression génétique, laquelle solution est obtenue d'une culture d'un transformant préparé par technique d'ADN recombinant, à un traitement d'adsorption au gel de silice, pour ainsi provoquer l'adsorption du produit d'expression génétique sur ledit gel de silice, (b) éluer ledit produit d'expression génétique adsorbé sur ledit gel de silice pour obtenir un éluat contenant le produit d'expression génétique, (c) soumettre ledit élu&t à un traitement d'adsorption au charbon activé, pour ainsi provoquer l'adsorption 15 des impuretés dans ledit éluat sur ledit charbon activé, avec ensuite récupération de l'éluat résultant, (d) soumettre ledit éluat résultant traité à l'étape (c) à une centrifugation par gradient de densité au moins deux fois pour obtenir une fraction préliminaire 20 contenant le produit d'expression génétique, et (e) soumettre ladite fraction préliminaire obtenue à l'étape (d) à une centrifugation par gradient de densité à l'équilibre au moins deux fois pour obtenir une fraction
finale contenant le produit d'expression génétique.
Par le procédé de la présente invention, on peut efficacement enlever non seulement l'allergène dérivé des transformants mais également l'allergène dérivé de microorganismes naturels et de cellules somatiques. Par ailleurs, comme la purification d'un produit d'expression génétique 30 selon le procédé de la présente invention peut être accomplie en conditions de pH modéré dans toutes les étapes concernées, le produit d'expression génétique ne subit pas de dénaturation et par conséquent l'on peut obtenir un
produit d'expression génétique de haute qualité.
Les produits d'expression génétique que l'on peut purifier par le procédé de la présente invention signifient une substance produite directement par expression génétique dans un transformant. Comme produits primaires, on peut mentionner, par exemple,,des substances protéinées telles 5 que des antigènes de virus comprenant un virus de l'hépatite B et des antigènes de flavivirus, des enzymes,
hormones, l'interféron et autres substances physiologiquement actives, protéinées.
Une solution aqueuse brute contenant un produit d'expression génétique qu'il faut soumettre à un traitement
d'adsorption au gel de silice peut être préparée comme suit.
Dans le cas o le produit d'expression génétique est excrété par les cellules, celle:-ci sont enlevées de la culture par un procédé habituel puis la culture résultante est utilisée 15 en tant que solution aqueuse brute contenant le produit d'expression génétique. Dans le cas o le produit d'expression génétique n'est pas excrété par les cellules, cellesci sont recueillies et la culture est interrompue, avec ensuite enlèvement des résidus des cellules interrompues 20 pour préparre une solution aqueuse brute contenant le produit d'expression génétique. Pour l'interruption des cellules, on peut employer divers traitements connus comme une lyse par un enzyme, un traitement d'interruption utilisant la pression osmotique, un traitement aux ultrasons, et un traitement avec divers types d'homogénéiseurs. Parmi ceux-ci, on préfère un traitement avec un homogénéiseur
de pression.
La solution aqueuse brute ainsi préparée contenant un produit d'expression génétique est soumise à un traitement 30 d'adsorption au gel de silice. Ce traitement peut être effectué, par exemple, en ajoutant du gel de silice à la solution aqueuse brute, avec ensuite agitation pour provoquer l'adsorption du produit d'expression génétique sur le gel de silice. Alors, le liquide surnageant est enlevé, et le 35 gel de silice est lavé, par exemple, à l'aide d'un tampon
de carbonate.
Le gel de silice à utiliser dans cette étape n'est pas particulièrement limité et l'on peut utiliser un gel de silice généralement employé en tant qu'adsorbant, par 5 exemple, une poudre de gel de silice du commerce pour la purification par chromatographie en colonne. La quantité du gel de silice est généralement comprise entre environ 0,1 et 10% en poids/volume en se basant sur la solution aqueuse brute contenant un produit d'expression génétique. 10 L'agitation est généralement effectuée entre 10 et 30 C
pendant 10 à 100 minutes.
Subséquemment, le produit d'expression génétique adsorbé sur le gel de silice est élué. L'élution peut par exemple être-effectuée en ajoutant un éluant approprié au 15 gel de silice, en soumettant le miélange à agitation, en soumettant le mélange à centrifugation ou analogue,et en enlevant le gel de silice pour obtenir un éluat. L'agitation est généralement effectuée entre 10 et 30 C pendant 10 à
minutes.
L'étape ci-dessus expliquée du traitement d'adsorption au gel de silice et l'étape d'élution peuvent également
être effectuées par chromatographie en colonne habituelle.
L'adsorption du produit d'expression génétique sur le gel de silice et la désorption, c'est-à-dire l'élution du produit peuvent être efficacement effectuées en ajustant de manière appropriée la valeur du pH et le pouvoir ionique
de la solution aqueuse brute et de l'éluant.
Ensuite, l'éluat obtenu à l'étape ci-dessus est
soumis à un traitement d'adsorption au charbon activé pour 30 provoquer l'adsorption des impuretés sur le charbon activé.
Avant de soumettre au traitement d'adsorption au charbon activé, l'éluat peut être soumis à une ultrafiltration pour
le concentrer, avec ensuite addition d'un tampon frais.
Le traitement d'adsorption au charbon activé peut être effectué en ajoutant le charbon activé à l'éluat, avec ensuite agitation généralement à 10 à 30 C pendant 5 à minutes. Par ce traitement, seules les impuretés sont adsorbées sur le charbon activé tout en laissant le produit d'expression génétique non adsorbé. Après l'agitation, le charbon activé est enlevé par séparation par centrifugation ou analogue pour obtenir un produit surnageant. L'éluat résultant, c'est-à-dire le produit surnageant obtenu, peut être concentré par une méthode habituelle pour l'étape
suivante de centrifugation par gradient de densité comme 10 on le mentionnera ci-après.
Le charbon activé à utiliser dans cette étape n'est
pas particulièrement limité et des charbons activés du commerce tels que ceux en poudre peuvent être utilisés.
La quantité du charbon activé est généralement comprise entre environ 0,1 et 10% en poids/volume en se basant sur l'éluat. L'étape ci-dessus expliquée du traitement d'adsorption au charbon activé peut également être effectuée par
chromatographie en colonne habituelle.
Avant de le soumettre à une centrifugation par gradient de densité, l'éluat résultant peut être soumis à
un traitement acide pour mieux en enlever les impuretés.
Par exemple, une solution aqueuse d'acide chlorhydrique est ajoutée à l'éluat résultant pour abaisser son pH à environ 4,0 à 6,5, provoquant la précipitation des impuretés et le précipité est enlevé par séparation par centrifugation ou analogue. Après le traitement acide, le pH de l'éluat est ajusté entre 7,0 et 9,0 au moyen d'une solution
alcaline telle qu'une solution de soude aqueuse.
Selon la nécessité, l'éluat résultant obtenu par le traitement d'adsorption au charbon activé peut être soumis à un traitement additionnel d'adsorption-désorption à
l'alumine, à la Celite (marque déposée) ou analogue.
L'éluat résultant traité au charbon activé est alors 35 soumis au moins deux fois à une centrifugation avec gradient de densité. La centrifugation avec gradient de densité peut être effectuée par une méthode connue habituelle. Le gradient de densité du milieu véhicule dans une colonne centrifuge peut être tel que la densité du milieu véhicule augmente linéairement ou de manière discontinue à partir de la portion la plus haute jusqu'à la portion la plus basse de ce milieu. Le changement discontinu et échelonné de densité peut être obtenu en superposant un certain nombre
de solutions ayant des densités différentes pour former 10 un gradient de densité.
En tant que solutés que l'on peut utiliser pour obtenir le gradient de densité, on peut mentionner des substances habituellement employ es comprenant le saccharose, l'oxyde de -deutérium, la diodone Ficoll (marque déposée), 15 le bromure de potassium, la poly-inyl pyrrolidone, le chlorure de césium, etc. Parmi ceux-ci, on préfère le saccharose du point de vue stabilité du gradient de densité pendant la centrifugation, économie, sécurité et facilité d'utilisation. Les traitements respectifs de centrifugation avec gradient de densité, qui sont entrepris au moins deux fois, peuvent être effectués en utilisant des colonnes centrifuges ayant le même gradient de densité ou alternativement en utilisant des colonnes centrifuges ayant des gradients 25 différents de densité. Dans le cas o les traitements respectifs de centrifugation avec gradient de densité sont effectués en utilisant des colonnes centrifuges ayant des
gradients différents de densité, le gradient de densité est changé de manière que la plage des densités diminue tandis 30 que le traitement est répété.
Le gradient de densité de la colonne peut varier selon le type du produit d'expression génétique et le type des contaminants. Cependant, en général, pour la première centrifigation avec gradient de densité, la plus faible concentration du soluté dans le milieu véhicule peut ne pas être plus faible que 5% en poids et la plus forte concentration du soluté dans le véhicule peut ne pas dépasser 60% en poids, et la différence entre la plus faible et la plus forte concentration du soluté dans le véhicule peut être comprise entre 10 et 55% en poids. Pour la seconde centrifugationavec gradient de densité et toute centrifugation subséquenteavec gradient de densité, la plus faible concentration du soluté dans le véhicule peut ne pas être plus faible que 5% en poids et la plus forte concentration du 10 soluté dans le véhicule peut ne pas dépasser 50% en poids, et la différence entre la plus faible et la plus forte concentration du soluté dans le véhicule peut être comprise entre 5 et 45% en poid- La centrifugation avecgradient de
densité peut généralemn.it être effectuée entre environ 15 20.000 et 40. 000 t/mn pendant environ 2 à 30 heures.
Après le premier traitement de centrifugation avec gradient de densité, on recueille une fraction contenant le produit d'expression génétique souhaité.. La fraction ainsi obtenue peut être soumise à un traitement de concentration, une dialyse et/ou une filtration selon des méthodes connues, avant d'être soumise au second traitement de centrifugation
avec gradient de densité.
La fraction obtenue par au moins deux centrifugations
avec gradient de densité est alors soumise au moins deux fois 25 à une centrifugation avecgradient de densité à l'équilibre.
la centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre peut être effectuée par une méthode usuelle. Le véhicule dans la colonne centrifuge à utiliser dans cette étape peut avoir une concentration uniforme du soluté, ou bien peut 30 avoir une concentration variant de manière discontinue du soluté, qui est formé par superposition, par exemple, de deux ou trois solutions ayant des concentrations différentes
du soluté.
En tant que solutés que l'on peut utiliser pour la 35 préparation du véhicule, on peut mentionner les mêmes types de substances que celles cidessus décrites pour la centrifugation avec gradient de densité. Cependant, du point de vue facilité de formation du gradient de densité pendant
la centrifugation, économie et facilité d'évacuation de 5 déchets industriels, on préfère le bromure de potassium.
Les traitements respectifs de centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre, qui sont entrepris au moins deux fois, peuvent être effectués en utilisant les
colonnes centrifuges ayant la même densité ou en utilisant 10 des colonnes centrifuges ayant des densités différentes.
Dans le cas o les traitements de centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre sont effectués en utilisant des colonnes centrifuges ayant des densités différentes,
la densité est changée de manière à diminuer tandis que le 15 traitement est répété.
La densité du véhicule dans la colonne peut varier selon le type du produit d'expression génétique et le type des agents contaminants. Cependant, en général, pour la première centrifugation avecgradient de densité à l'équilibre, 20 la concentration du soluté du véhicule peut être comprise entre 10 et 40% en poids. Pour la seconde centrifugation par gradient de densité à l'équilibre et toute centrifugation subséquente avec gradient de densité à l'équilibre, la concentration du soluté du véhicule peut être comprise entre 20 et 40% en poids. La centrifugation peut généralement être effectuée à environ 30.000 à 60.000 t/mn pendant
environ 30 à 80 heures.
Après le premier traitement de centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre, on recueille une fraction 30 contenant le produit d'expression génétique souhaité. La fraction ainsi obtenue peut être soumise à un traitement de concentration, une dialyse et/ou une ultrafiltration selon des méthodes connues, avant d'être soumise au second traitement de centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre. 35 On peut ainsi obtenir un produit très purifié
d'expression génétique.
Comme on l'a expliqué ci-dessus, le procédé de la présente invention concerne une combinaison spécifique de techniques de purification. Etant donné la combinaison 5 spécifique des techniques de purification, l'allergène contenu dans le produit d'expression génétique qui est dérivé du transformant peut être efficacement et presque complètement enlevé et par conséquent on peut obtenir un produit d'expression génétique très purifié. Par ailleurs, 10 un produit d'expression génétique peut être purifié en conditions de pH modéré dans toutes les étapes de la présente invention, donc le produit purifié a une haute
qualité, qui le diffère du produit obtenu par la chromatographie habituelle par affinité qui nécessite des conditions 15 de pH extrêmement faible pour son étape d'élution.
Dans la mise en pratique du procédé de la présente invention, le choix des facteurs physico-chimiques tels que la température, la pression, le pH, la concentration et le pouvoir ionique, le choix des réactifs de purification tels qu'un adsorbant, un éluant et un agent dispersant et le choix des instruments de purification ainsi que de l'appareil comme une centrifugeuse, un filtre, un instrument pour l'électrophorèse et un homogénéiseur peuvent être faits de manière appropriée selon le type du produit d'expression 25 génétique souhaité, le type des agents contaminants et analogues. L'invention sera maintenant décrite en détail en se référant aux Exemples suivants, Exemples de Référence et Exemple de Comparaison, mais ils ne doivent pas être
considérés comme limitant le cadre de la présente invention.
A l'Exemple 1, la détection et la mesure de l'antigène HBs après chaque étape de purification ont été effectuées sensiblement de la même manière qu'à l'Exemple de
Référence 2.
EXEMPLE DE REFERENCE 1
De E. coli X 1776/pMlB11 (déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-1081), contenant un plasmide pMIB11 porteur d'un ADN codant pour l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (que l'on appellera ci-après antigène HBs), on a extrait le plasmide pBMlB11 au phénol. Du plasmide pMIB11 a été extrait un fragment d'ADN contenant un ADN codant pour l'antigène HBs, au moyen d'enzymes de restriction XoHI et BamHI. Par ailleurs, le plasmide pH05 obtenu selon Kenji Arima et autres, Nucleic Acid Research, 11, 1657-1672 (1983) a été digéré par les enzymes de restriction BamHI et Sall pour obtenir un fragment d'ADN d'envi:on 0,6 kb contenant un promoteur PH05. A l'extrémité en aval de l'ADN ainsi obtenu 15 contenant un promoteur du gène Pl35, qui code pour la phosphatase acide répressible de la levure, le fragment d'ADN ci- dessus obtenu contenant un ADN codant pour l'antigène HBs a été lié au moyen de l'ADN ligase T4, pour ainsi obtenir un fragment d'ADN. Le fragment d'ADN a été inséré au site de BamHI d'un plasmide pBR325, avec ensuite clonage pour obtenir un plasmide capable d'exprimer le gène codant pour l'antigène HBs. En utilisant le plasmide ainsi obtenu, on a transformé une levure Saccharomyces cerevisiae
SHY4 (ATCC N 44772), pour ainsi obtenir une levure trans25 formante.
EXEMPLE 1
Etape 1 La levure transformante obtenue à l'Exemple de référence 1 a été mise en culture dans un milieu synthétique 30 complet de Burkholder [milieu contenant 20 pg/ml-d'uracil, de L-tryptophane et de L-histidine; Burkholder P.R. et autres, Am. J. Botany 30, 206 (1943)] contenant 1,5 g/1
de dihydrogénophosphate de potassium à 30 C pendant 24 heures.
La culture obtenue a été soumise à centrifugation à 12.000 g 35 pendant 10 minutes et les cellules ont été recueillies.
On a lavé 50 g descellules humides ainsi obtenues dans 500 ml d'un tampon de phosphate 1/10 M (pH 9,0) avec
ensuite centrifugation dans les mêmes conditions que cidessus pour récupérer les cellules. Le lavage et la récupé5 ration des cellules cidessus ont de nouveau été répétés.
Etape 2 Les cellules obtenues à l'étape 1 ont été mises en suspension dans 500 ml d'un tampon de phosphate 1/100 M (pH 9,0). La suspension a été traitée avec un homogénéiseur 10 de pression (fabriqué et vendu par Gaulin Co., EUA) entre 552 et 690 bars pour interrompre les cellules. Alors, la suspension ainsi traitée a été soumise à centrifugation à 12. 000 g pendant 20 minrtes pour séparer la suspension entre un produit surnageant et une boulette, et le produit sur15 nageant a été recueilli. Le produit surnageant ainsi obtenu sous la forme d'un extrait brut contenant un antigène HBs
a été soumis à l'étape subséquente.
Etape 3 A l'extrait brut obtenu à l'étape 2, on a ajouté du chlorure desodium de manière que la concentration finale en chlorure de sodium soit de 0,2 mole, avec ensuite mélange. Au mélange résultant, on a ajouté du gel1 de silice de manière que la teneur en gel de silice soit de 2% en poids/volume. Subséquemment, le mélange a été soumis à agitation à température ambiante pendant 30 minutes, pour ainsi provoquer l'adsorption de l'antigène HBs sur le gel
de silice. Le gel de silice adsorbant l'antigène HBs a été recueilli par centrifugation à 5.000 g pendant 10 minutes.
Au gel de silice ainsi recueilli, on a ajouté 250 ml d'un 30 tampon de carbonate (pH 10), avec ensuite agitation à température ambiante pendant 40 minutes pour éluer l'antigène HBs du gel de silice. Alors, le mélange résultant contenant un éluat et le gel de silice a été soumis à centrifugation à 5.000 g pendant 10 minutes pour séparer 35 le mélange en éluat et gel de silice, et le gel de silice
a été enlevé et l'éluat recueilli.
Etape 4 A l'éluat obtenu à l'étape 3, on a ajouté du charbon activé de manière que la teneur en charbon activé soit de 1% en poids/volume avec ensuite agitation à température ambiante pendant 10 minutes. Le mélange a alors été soumis à centrifugation à 10.000 g pendant 10 minutes pour le séparer en charbon activé-et un produit surnageant, et le charbon activé a été enlevé et le produit surnageant recueilli. Au produit surnageant, on a ajouté goutte à goutte de l'acide chlorhydrique à 0,02 N pour ajuster le pH du produit surnageant à 6,0, et le mélange résultant a été soumis à agitation à 10 C pendant 30 minutes. Par suite, un précipité acide s'est formé. Le précipité a été enlevé 15 par centrifugation à 10. 000 g perdant 10 minutes et le produit surnageant recueilli. Au oroduit surnageant, on a ajouté goutte à goutte une solution aqueuse à 0,2 N de soude pour ajuster le pH du produit surnageant à 8,0 et celui-ci a alors été concentré par un moyen d'ultrafiltration (produit et vendu par Millipore Co., EUA) pour obtenir 25 ml
d'un concentré contenant un antigène HBs.
Etape 5 Le concentré obtenu à l'Etape 4 a été soumis à une centrifugation avec-gradient de densité à 30.000 t/mn pendant 18 heures et l'on a recueilli une fraction contenant l'antigène HBs. Le véhicule utilisé était un milieu de gradient de densité de saccharose ayant une concentration inférieure en saccharose de 20% en poids et une concentration supérieure en saccharose de 30% en poids. La centrifu30 geuse utilisée était un rotor zonal RPZ-35T fabriqué et vendu par Itachi Koki Co., Ltd., Japon). La fraction ainsi obtenue a été dialysée avec un tampon de phosphate 1/200 M
(pH 9,0) pendant 24 heures pour enlever le saccharose.
L'opération ci-dessus mentionnée a de nouveau été 35 répétée.
Etape 6 On a mélangé 10 ml de la fraction d'antigène HBs obtenue à l'étape 5 à 40 ml d'un tampon de phosphate
1/200 M contenant 40% en poids de bromure de potassium.
Le mélange résultant a été soumis à une centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre à 45.000 t/mn pendant 48 heures, et l'on a recueilli une fraction contenant l'antigène HBs. La centrifugeuse utilisée était le rotor RP-50T-2 fabriqué et vendu par Hitachi Koki Co., Ltd., Japon. Alors, la fraction recueillie a été dialysée avec un tampon de phosphate 1/200 M (pH 9,0), pendant 24 heures pour enlever le bromure de potassium. L'opération ci-dessus mentionnée a de nouveau été répétée pour obtenir un antigène HBs produit très purifié. 15 Etape 7 La pureté de l'antigène HBs obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 1 a été déterminée en utilisant une trousse d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (trousse SDS-PAGE) fabriquée et vendue par Daiichi Kagaku Co., Ltd., 20 Japon. En effet, l'antigène HBs produit purifié a été soumis à une dilution de doublement en série avec un tampon contenant 20% en poids de glycérol, Tris 0,1 M (pH 6,8), 2% en poids de SDS, 0,004% en poids de Bleu de Bromophénol et 10% en poids de 2-mercaptoéthanol pour préparer des
échantillons d'antigène HBs ayant des dilutions respectives.
Chacun des échantillons a été appliqué à un gel de polyacrylamide-SDS et soumis à une électrophorèse avec ensuite coloration à l'argent. Alors, la pureté de l'antigène HBs a été calculée à partir d'un rapport d'un degré de dilution de l'antigène HBs purifié produit au delà duquel les impuretés ne sont plus colorées à l'argent au degré de dilution au delà duquel l'antigène HBs n'est plus coloré à l'argent. Par suite, on a trouvé que la pureté de
l'antigène HBs était de 99,5% ou plus.
Etape 8 Des sérums de souris anti-antigène Hbs ont été obtenus de souris BALB/c femelles (âgées de 5 semaines) immunisées par l'antigène HBs purifié obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 1. Par ailleurs, des sérums de souris antilevure ont été obtenus de souris BALP/c femelles (âgées de semaines) immunisées par un extrait brut de cellules de levure que l'on avait obtenu sensiblement de la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1. Les doses de l'antigène HBs purifié et de l'extrait brut de levure utilisés pour l'immunisation ont été modifiées comme cela
est indiqué au Tableau 1.
Pour chacun des sérums a:n$i obtenus, on a évalué la teneur en anticorpsde IgE contzi la levure selon le test 15 de réaction d'anaphylaxie cutanée passive (PCA). En effet, chacun des sérums a été soumis à Jne dilution de doublement en série avec une solution saline physiologique, et séparément inoculé de manière sous-cutanée à des rats femelles respectifs SW, à la peau du dos en une quantité de 0,1 ml. 20 24 heures après l'inoculation, on a injecté, à chacun des rats, par sa veine caudale, I ml d'une solution saline physiologique contenant 0,5% en poids/volume de Bleu Evans et I mg, en termes de la quantité d'azote protéiné, d'un extrait brut de cellules de levure obtenu sensiblement de 25 la même manière qu'à l'étape 2 de l'Exemple 1. 30 minutes après l'injection, on a observé, sur chaque rat, la présence de taches bleues au site d'injection. L'apparition des taches bleues montre la présence de l'anticorps de IgE chez le rat, et leur non apparition montre l'absence de 30 l'anticorps IgE. Les résultats sont montrés au Tableau 1 o le titre de PCA indique la dilution minimale (temps) du sérum à laquelle les taches bleues apparaissent. Il est apparent par les résultats que l'allergène dérivé de
cellules de levure était enlevé de manière satisfaisante 35 de l'antigène HBs obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 1.
TABLEAU 1
15 20
Immunogène Dose de Dose Titre Anticorps de l'antigène d'extrait PCA IgE HBs purifié de levure produit brut (pg protéine) (jg -protéine) 4,0 > 40 présence 1,0 40 présence Sérum souris 0,25 10 présence anti-levure 0,0625 5 présence 0,016 < 5 absence 8,0 ó 5 absence Sérum souris 4,0 < 5 absence anti antigène HBs 2,0 < 5 absence 1,0 i 5 absence 0,5 < 5 absence
EXEMPLE 2
De E. coli JM83/pS22 (déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-1047), contenant un plasmide pS22 porteur d'un ADN codant pour l'anti25 gène du virus de l'encéphalite du Japon V3, le plasmide pS22 a été extrait au phénol. Subséquemment, le site MluI du plasmide pS22 a été scindé au moyen de l'enzyme de restriction MluI pour obtenir un plasmide linéaire ayant deux bouts formés par scission par MluI. Les deux bouts du 30 plasmide linéaire ont été convertis en bouts émoussés en utilisant l'ADN polymérase T4. Aux bouts émoussés résultants, on a lié des linkers XhoI, avec ensuite recuit. Ainsi, le
site MluI du plasmide a été converti en un site XhoI.
Ensuite, un terminateur Universel (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals Co., Suède) a été lié au plasmide en son site SphI. Le plasmide résultant a été désigné par plasmide pS22XS. Du plasmide pS22XS, on a prélevé un fragment d'ADN contenant un ADN codant pour l'antigène du virus de l'encéphalite du Japon V3, par les enzymes de restriction XhoI et SalI. Sensiblement de la même manière qu'à l'Exemple de référence 1, le fragment d'ADN ainsi prélevé a été lié à l'extrémité en aval d'un ADN contenant un promoteur du gène PH05 qui code pour la phosphatase acide répressible de la levure, et le fragment d'ADN obtenu a été inséré au site XhoI d'un plasmide YEpI3 (ATCC NI 37115) pour obtenir un plasmide capable d'exprimer le gène codant pour l'antigène du virus de l'encéphalite du Japon V3. En utilisant le plasmide ainsi obte j, une levure Saccharomyces 15 cerevisiae SHY4 (ATCC NI 44772) e été transformée, pour
ainsi obtenir une levure transformante.
La levure transformante ainsi obtenue a été mise en culture et traitée sensiblement des mêmes manières qu'aux étapes 1 et 2 de l'Exemple 1 pour ainsi obtenir un extrait 20 brut contenant un antigène du virus de l'encéphalite du Japon V3. En utilisant l'extrait brut, on a répété sensiblement les mêmes processus qu'aux étapes 3 à 6 de l'Exemple 1 pour obtenir un antigène produit du virus de l'encéphalite du Japon V3 très purifié. La pureté de l'antigène V3 a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1, et on a trouvé qu'elle était de 99,5% ou plus. Cela a montré que les allergènes dérivés des cellules de levure étaient enlevés de manière satisfaisante.
EXEMPLE 3
De la souche SK-01 produisant la mutanase (déposée au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-9), qui appartient au. genre Pseudomonas, on a extrait un ADN selon la méthode décrite dans "Experiment 35 With Gene Fusion", pages 137-139, Cold Spring Harver Laboratory, EUA (1984). A l'extrait d'ADN ainsi obtenu, on a ajouté une enzyme de restriction EcoRI pour la digestion partielle de l'ADN. On a ainsi obtenu un fragment d'ADN. Le fragment d'ADN a été ligaturé au plasmide du vecteur d'expression du commerce pYLJOO1 L Catalogue de Biologie Moléculaire, page 67, Pharmacia P-1, Biochemicals Co., (1985). En utilisant le plasmide ainsi obtenu, des cellules de la souche HB101 de E. coli K12 (ATCC N 35673) ont été transformées pour obtenir des transformants. Des 10 transformants, ceux qui sont sensibles au chloramphénicol ont été choisis et isolés. Subséquemment, des transformants sensibles au chloramphénicol, on a sélectionné et isolé un transformant produisant la mutanase. Le transformant ainsi obtenu a été désigné par E. coli K12HB10/pYEJMO1. 15 De même, le plasmide contenu dans le transformant a été désigné par pYEJMO1. Ce transformant- a été mis en culture et traité sensiblement de la même manière qu'aux étapes 1 et 2 de l'Exemple 1, pour ainsi obtenir un extrait brut contenant la mutanase. En utilisant l'extrait brut, on a répété sensiblement les mêmes processus qu'aux étapes 3 à 6 de l'Exemple 1 pour obtenir une mutanase produite très purifiée. La pureté de la mutanase a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 et elle s'est révélée être de 99,5% ou plus. Cela montre 25 que les allergènes dérivés de E. coli étaient enlevés de
manière satisfaisante.
EXEMPLE 4
Du transformant producteur de la mutanase obtenu à l'Exemple 3, on a extrait, au phénol, un plasmide pYEJM01. 30 Alors, du plasmide pYEJM0I, on a prélevé un fragment d'ADN contenant un ADN codant pour la mutanase, par l'enzyme de restriction EcoRI. Par ailleurs, un plasmide pPL608 (ATCC N 37108) en tant que vecteur d'expression, a été scindé au moyen de l'enzyme de restriction HindIII et a été ligaturé au fragment d'ADN ci- dessus obtenu contenant un gène codant pour la mutanase au moyen de l'ADN ligase T4 pour obtenir un plasmide. En utilisant le plasmide ainsi obtenu, des cellules de Bacillus subtilis BR151 (ATCC N 33677) ont ététransformées pour obtenir des transformants. 5 Des transformants, on a sélectionné et isolé un transformant produisant la mutanase. Le transformant ainsi obtenu a été désigné par Bacillus subtilis BR151/pPLM01. Ce transformant a été mis en culture et traité sensiblement de la même manière qu'aux étapes 1 et 2 de l'Exemple 1 pour ainsi obtenir un extrait brut contenant la mutanase. En utilisant l'extrait brut, on a répété sensiblement les mêmes processus qu'aux étapes 3 à 6 de l'Exemple 1, pour obtenir une mutanase produite très purifiée. La pureté de la mutanase a été déterminée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1 et elle s'est révélée être de 99,5% ou plus. Cela montre que les allergènes dérivés de
Bacillus subtilis étaient enlevés de manière satisfaisante.
EXEMPLE DE REFERENCE 2
Le titre d'antigène pour l'antigène HBs obtenu à 20 l'étape 6 de l'Exemple 1 a été déterminé par radiodétermination d'immunité comme suit. L'antigène HBs a été soumis à une dilution de doublement en série avec une
solution saline d'un tampon de phosphate 1/75 M contenant 0,02% en poids/volume de gélatine pour préparer des échan25 tillons d'antigène HBs ayant des dilutions respectives.
En utilisant la trousse Auslia II fabriquée et vendue par Abott Co., EUA, on a fait réagir chacun des échantillons d'antigènes HBs séparément avec les anticorps HBs adsorbés sur des perles à température ambiante pendant 24 heures. Alors, les anticorps HBs marqués 125I (trousse Auslia II, fabriquée et vendue par Abott Co., EUA),ont été ajoutés à chacun des échantillons traités ci-dessus, et les mélanges obtenus ont été maintenus à 45 C pendant 1 heure. Subséquemment, pour les perLes ainsi obtenues.qui étaient liées à l'antigène HBs qui à son tour était lié aux anticorps HBs marqués 125I, l'intensité de la radioactivité (cpm) a été mesurée par un compteur de scintillation. De l'intensité de la radio-activité (cpm), le titre d'antigène pour l'antigène HBs a été calculé par la détermination de lignes parallèles en utilisant l'intensité de la radioactivité (cpm) d'un antigène témoin. [Voir par exemple "Seibutsugakuteki Seizai Kijun Kaisetsu (Interpretation of Minimum Requirements for Biological Products) ", pages 435-448 (1973), Association des Fabricants Biologiques au Japon] Par suite, on a trouvé que le titre d'antigène de l'antigène HBs était de 10,44 pg/ml, ce qui montre que l'antigène HBs obtenu par le procédé de la présente invention a une excellente antigénicité EXEMPLE DE REFEqENCE 3 En utilisant l'antigène HBs obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 1, on a préparé un vaccin selon le standard pour les vaccins produits adsorbés contre l'hépatite B, qui sont donnés dans Minimum Requirements for Biological Products (Notification NI 159 du Ministère de la Santé et du Bien 20 Public au Japon). En effet, les antigènes HBs ont été mis en suspension dans une solution saline physiologique à une concentration de 40 pg/ml. Séparément, de l'hydroxyde d'aluminium a été mis en suspension dans une solution saline physiologique à une concentration de 0,4 mg/ml. Alors, des 25 volumes égaux des deux suspensions ont été mélangés pour préparer un vaccin de l'hépatite B adsorbé sur l'hydroxyde
d'aluminium. Le vaccin ainsi préparé satisfaisait à toutes les conditions imposées par le standard ci-dessus mentionné.
Le titre du vaccin ainsi préparé a été déterminé en utilisant des souris. En effet, on a.inoculé, de manière sous-cutanée, 1 ml du vaccin à chacune de 10 souris BALB/c (âgées de 5 semaines), au dos. Cinq semaines après l'inoculation, le sang a été recueilli des 10 souris, et le
titre d'anticorps a été déterminé pour le sang par 35 hémagglutination passive.
Séparément, une détermination de contrôle a été effectuée en utilisant un "Adsorbed Hepatitis B Reference Vaccine" disponible pour les déterminations de titre, au National Institute of Health, Tokyo, Japon. Par suite, on a trouvé que le titre relatif du vaccin préparé à partir de l'antigène HBs purifié était de 1,76, en fonction de 1,0 pour le vaccin témoin. Ce résultat indique que le vaccin préparé à partir de l'antigène HBs purifié par le
procédé de la présente invention est d'une excellente 10 immunogénicité.
EXEMPLE DE COMPARAISON 1
On a répété sensiblement les mêmes processus qu'aux étapes 1 à 6 à l'exception que l'un des traitements de purification a été omis comme indiqué au Tableau 2-1 pour 15 obtenir séparément les antigènes HBs produits A à D. En utilisant les antigènes HBs produits A à O ainsi obtenus à la place de l'antigène HBs purifié obtenu à l'étape 6 de l'Exemple 1, un test de réaction PCA a été entrepris sensiblement de la même manière qu'à l'étape 8 de
l'Exemple 1. Les résultats sont montrés au Tableau 2-2.
Il est apparent, par les résultats, que les antigènes HBs produits A à D contiennent des allergènes restants non
enlevés, qui sont dérivés des cellules de levure.-
TABLEAU 2-1
Traitement Antigènes HBs produits de purification A B C D Traitement d'adsorption entrepris entrepris entrepris omis au gel de silice Traitement d'adsorption entrepris entrepris omis entrepris au charbon activé Centrifugation avec entrepris entrepris entrepris entrepris gradient une fois deux deux deux de densité fois fois fois Centrifugation avec gradient entrepris entrepris entrepris entrepris de densité deux une fois deux deux à l'équi- fois fois fois libre
Table 2-2
Antigènes Dose de Titre de Anticorps HBs l'antigène PCA IgE produits HBs produit (pg protéine) 8,0 10 présence 4,0 5 présence A 2,0 < 5 absence 1, 0 < 5 absence 0,5 < 5 absence 8,0 5 présence 4,0 < 5 présence B 2,0 < 5 absence 1,0 < 5 absence 0,5 < 5 absence 8,0 10 présence 4,0 5 présence C 2,0 < 5 absence 1,0 < 5 absence 0,5 < 5 absence 8,0 40 présence 4,0 10 présence D 2,0 5 présence 1,0 < 5 absence 0,5 < 5 absence
R E V E ND I C A T I 0 N S
1.- Procédé de purification d'un produit d'expression génétique obtenu par technique d'ADN recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: (a) soumettre une solution aqueuse brute contenant un produit d'expression génétique, laquelle solution est obtenue d'une culture d'un transformant préparé par technique d'ADN recombinant, à un traitement d'adsorption au gel de silice, pour ainsi provoquer l'adsorption du 10 produit d'expression génétique sur ledit gel de silice, (b) éluer ledit produit d'expression génétique adsorbé sur ledit gel de silice pour obtenir un éluat contenant le produit d'expression génétique, (c) soumettre:.dit éluat à un traitement d'adsorp15 tion au charbon activé, pour ainsi provoquer l'adsorptiondes impuretés dans ledit éluat sur ledit charbon activé, avec ensuite récupération de l'éluat résultant, (d) soumettre ledit éluat résultant traité à l'étape (c) à une centrifugation avec gradient de densité, 20 au moins deux fois, pour obtenir une fraction préliminaire contenant le produit d'expression génétique et (e) soumettre ladite fraction préliminaire obtenue à l'étape (d) à une centrifugationavec gradient de densité à l'équilibre, au moins deux fois, pour obtenir une
fraction finale contenant le produit d'expression génétique.
2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité du gel de silice utilisé à l'étape (a) est comprise entre 0,1 et 10% en poids/volume en se basant
sur la solution aqueuse brute.
3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité du charbon activé utilisé à l'étape (c) est comprise entre 0,1 et 10% en poids/volume en se basant
sur l'éluat.
4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape (d): la première centrifugation avec gradient de densité est effectuée en utilisant une colonne centrifuge qui 5 contient un véhicule ayant un gradient de densité d'un soluté, ledit gradient de densité étant tel que la plus basse concentration du soluté dans ledit véhicule ne soit pas plus faible que 5% en poids et la plus forte concentration du soluté dans ledit véhicule ne soit pas supérieure 10 à 60% en poids et en ce que la différence entre ladite concentration la plus faible et la plus forte est comprise entre 10 et 55% en poids, et la seconde centrifugatior avec gradient de densité et toute centrifugation subséquente avec gradient de densité 15 sont effectuées en utilisant une colonne centrifuge qui contient un véhicule ayant un gradient de densité d'un soluté, ledit gradient de densité étant tel que la plus faible concentration du soluté dans ledit véhicule ne soit pas inférieure à 5% en poids et la plus forte concentration du soluté dans ledit véhicule ne soit pas supérieure à 50% en poids et en ce que la différence entre la plus faible et la plus forte concentration du soluté est comprise entre et 40% en poids. 5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape (e): la première centrifugation avec gradient de densité à l'équilibre est effectuée en utilisant une colonne centrifuge qui contient un véhicule ayant une concentration du soluté de 10 à 40% en poids, et avec la seconde concentration par gradient de densité à 30 l'équilibre et toute centrifugation avecgradient de densité à l'équilibre subséquente sont effectuées en utilisant une colonne centrifuge qui contient un véhicule ayant une
concentration du soluté de 20 à 40% en poids.
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