FR2691161A1 - Enzyme de lévane saccharase, procédé pour sa préparation, micro-organismes qui le produisent et compositions le contenant. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un enzyme de lévane saccharase stable aux acides et qui n'est pas induite par la saccharose. La présente invention concerne un procédé de préparation de cet enzyme et les microorganismes qui produisent l'enzyme de lévane saccharase. La présente invention vise également des compositions contenant cet enzyme.
Description
Enzyme de lévane saccharase, procédé pour sa préparation micro- organismes
qui le produisent et compositions le contenant La présente invention concerne un enzyme de lévane saccharase stable aux acides, des micro-organismes qui le produisent, un procédé de préparation de cet
enzyme de lévane saccharase stable aux acides et des compositions le contenant.
Les enzymes de lévane sacharase catalysent le transfert du fructose Plus précisément, les enzymes de lévane saccharase (E C 2 4 1 10) catalysent le transfert de résidus de fructosyle du saccharose, du raffinose ou du stachyose à un co-substrat approprié, produisant des polymères, généralement appelés lévanes, contenant diverses quantités de résidus de fructosyle constitués de liaisons bêta 2-> 6 Les lévanes ont de larges applications dans l'industrie chimique et dans l'industrie
alimentaire ainsi qu'en médecine et dans la recherche.
Des enzymes de lévane saccharase ont été isolés d'une variété de sources microbiennes, de micro-organismes tels que l'Acetobacter suboxydans, l'Actinomyces viscosus, l'Aerobacter levanicum, le Bacillus amyloliquefaciens, le Bacillus licheniformis, le Bacillus mesentericus, le Bacillus subtilis, le Glucobacter oxydans, le Streptococcus mutans, le Streptococcus salivarius, le Streptomyces griseus et le Zymomonas mobilis Dans la plupart des cas, l'enzyme est extracellulaire et instable à la chaleur L'une des caractéristiques les plus importantes dans la production d'enzymes de lévane saccharase est qu'au moins 5 % de saccharose doivent être ajoutés au milieu de croissance pour induire la synthèse de l'enzyme en utilisant des micro- organismes connus produisant des enzymes de
lévane saccharase.
Par suite, il devient difficile de séparer l'enzyme de lévane saccharase du bouillon de culture du fait que la viscosité du bouillon de culture augmente au fur 2 - et à mesure que le lévane se forme au cours de la fermentation C'est pourquoi on procède toujours à des recherches de micro-organismes nécessitant des niveaux
faibles ou nuls de saccharose pour la production de lévane saccharase.
La demande de brevet japonaise JP-A-52-82781 décrit un procédé de production d'un enzyme de lévane saccharase extracellulaire en présence de faibles concentrations de saccharose ( 0,3 % en poids/volume) en utilisant la souche de Bacillus licheniformis AJ 3982 (dépôt N O 3373 à l'Institute of Microbial Engineering) Cependant, cet enzyme a toujours besoin de saccharose pour être induit et produit En outre, cet enzyme de lévane saccharase ne développe pas d'activité enzymatique à un p H de 4,0 lorsqu'il est maintenu à une température de 550 C A cette température, il ne développe que 50 % de son activité maximum pour un p H d'environ 5,2 et environ 80 % de son activité maximum à un p H d'environ 6 à environ 7,8 Cette plage de p H étroite restreint le champ d'application de cet enzyme de lévane saccharase En outre, la stabilité aux acides de l'enzyme de lévane saccharase est très importante pour de larges applications commerciales de l'enzyme. La présente invention vise à fournir un enzyme de lévane saccharase qui développe une activité enzymatique dans une gamme de p H plus large que les enzymes connus et qui est stable aux p H acides auxquels les enzymes connus ne le
sont pas.
A cet effet, la présente invention vise un enzyme de lévane saccharase stable aux acides dérivé d'un micro-organisme appartenant à l'espèce Bacillus et développant, à une température d'environ 550 C et à un p H de 4,0, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à 550 C. L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention développe par ailleurs une activité enzymatique appréciable dans une large gamme de p H en présence d'un substrat tel que la saccharose Il développe par ailleurs, à un p H compris entre environ 5,5 et environ 6,3, une activité enzymatique maximum mesurée à environ 550 C. Plus précisément, il développe encore, à une température d'environ 550 C et à un p H compris entre environ 4,0 et environ 8,4 une activité enzymatique d'au 3 - moins 50 % de l'activité maximum mesurée à 550 C Il développe, à cette température d'environ 550 C et à un p H compris entre environ 4,2 et environ 8,0, une activité enzymatique d'au moins 70 % de l'activité maximum mesurée à 550 C. Il développe, à cette température et à un p H compris entre environ 4,5 et environ 7,8, une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à C Il développe, à environ 550 C et à un p H compris entre environ 4,7 à environ 7,2, une activité enzymatique d'au moins 90 % de l'activité maximum mesurée à C. L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention a une stabilité thermique appréciable en présence d'un substrat tel que la saccharose Il développe par ailleurs, dans une gamme de température d'environ 550 C à environ 640 C, une
activité enzymatique maximum mesurée à un p H de 5,5.
Plus précisément, il développe encore, à un p H d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 35 C à environ 75 C, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à un p H de 5,5 Il développe, pour ce p H d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 450 C à environ 680 C, une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à un p H de 5,5 Il développe, à ce p H d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 50 c C à environ 670 C, une activité enzymatique d'au moins
90 % de l'activité maximum mesurée à un p H de 5,5.
L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention est un enzyme lié à la cellule Il a une activité de fructosyle transférase et est ainsi à même de produire des polymères de fructosyle à partir de saccharose constitués de fructose à
liaison bêta-D( 2 > 6) qui appartiennent à la famille des "lévanes".
L'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention n'est pas un enzyme inductible par la saccharose, c'est-à-dire qu'il n'a pas besoin de saccharose pour être
induit et produit.
La présente invention vise également un procédé de production d'un enzyme de lévane saccharase stable aux acides utilisant un micro- organisme en l'absence de
saccharose ajouté au milieu nutritif.
Le procédé selon la présente invention pour la production d'un enzyme de -4 - lévane saccharase stable aux acides comprend les étapes suivantes: (i) on cultive un micro-organisme appartenant au genre Bacillus dans un milieu nutritif approprié en formant un bouillon de fermentation comprenant une biomasse et (h) on récupère l'enzyme de lévane saccharase dudit bouillon de fermentation, le
micro-organisme étant cultivé en l'absence de saccharose.
La présente invention vise également un nouveau micro-organisme appartenant au genre Bacillus produisant un enzyme de lévane saccharase stable aux acides en
l'absence de saccharose dans le milieu nutritif.
A cet effet, la présente invention vise un nouveau micro-organisme de l'espèce Bacillus licheniformis produisant un enzyme de lévane saccharase stable aux acides en l'absence de saccharose dans le milieu nutritif Le micro-organisme préféré de l'espèce Bacillus licheniformis APMC 84 a été déposé à l'Agricultural Research
Culture Collection (NRRL) Peoria, Minois, dans le cadre du Traité de Budapest.
Le numéro de dépôt est NRRL B-18962.
Des mutants naturels et artificiels et les dérivés obtenus par des modifications naturelles ou par des modifications génétiques du microorganisme de l'espèce
Bacillus licheniformis APMC 84 sont également englobés dans la présente invention.
L'enzyme de lévane saccharase de la présente invention peut être produit non seulement par la souche de Bacillus licheniformis NRRL B-18962, mais également
par des mutants naturels ou artificiels et d'autres dérivés de ce microorganisme.
Ces mutants peuvent être obtenus par des techniques bien connues, telles que rayonnement aux rayons X et aux ultraviolets, mutagènes chimiques et génie génétique. L'enzyme de lévane saccharase produit selon le procédé de l'invention est préparé en cultivant le micro-organisme appartenant au genre Bacillus dans un milieu nutritif contenant du carbone, de l'azote et des sels minéraux dans des conditions aérobies en l'absence de saccharose, et ensuite en récupérant l'enzyme de lévane saccharase. Les conditions de culture de ces micro-organismes, notamment les composants du milieu nutritif, les paramètres, la température, le p H, l'agitation, l'aération, -
apparaîtront à l'homme de l'art.
Comme sources de carbone appropriées, on peut citer le glucose, le fructose, les maltodextrines, le glycérol, le sirop de maïs, l'amidon, l'amidon hydrolysé et des mélanges de deux ou plusieurs de ces sources de carbone Les sources de carbone préférées sont le sirop de maïs et l'amidon hydrolysé. Comme sources d'azote que l'on peut utiliser, on peut citer la farine de soja, la liqueur de trempage de maïs, la farine de pommes de terre, la farine de graines de coton, la farine de poisson, la levure, les extraits de levure ou des mélanges de deux ou plusieurs de ces sources d'azote Les sources d'azote préférées sont la farine de soja, la farine de graines de coton, les extraits de levure ou un mélange de
farine de soja et d'extrait de levure.
Comme sels appropriés, on peut citer le sulfate de potassium, le sulfate de manganèse, le sulfate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le phosphate de potassium, le phosphate de sodium mono-acide, le phosphate de sodium di-acide, le chlorure de calcium, le citrate de sodium ou des mélanges de deux ou plusieurs de ces sels Comme sels préférés, on peut citer un mélange de phosphate de sodium mono-acide, de phosphate de sodium di-acide, de chlorure de calcium et de citrate
de sodium.
Le milieu contenant les composés précités est stérilisé de manière classique et inoculé par la souche appropriée de micro-organisme, de préférence par la souche
de B licheniformis et, mieux encore, par la souche de B licheniformis APMC 84.
La culture est réalisée dans des conditions aérobies sous agitation ou sous agitation aérée, typiquement à une température comprise entre environ 25 C et 460 C
pendant environ 6 à 40 heures et à un p H compris entre environ 5,0 et environ 8,5.
De préférence, la culture sera réalisée à une température comprise entre environ 'C et 420 C pendant environ 12 à 30 heures et à un p H d'environ 6,0 à 8,0 De bons résultats sont obtenus lorsque la culture est réalisée à une température comprise
entre environ 36 WC et 40 'C à un p H compris entre environ 6,5 et 8,5.
Après la culture, un bouillon de fermentation comprenant une biomasse est obtenu Cette biomasse, comprenant les cellules des micro- organismes et l'enzyme de lévane saccharase à liaison cellulaire, est séparée et récupérée du filtrat de culture 6 - en utilisant des procédés classiques tels que centrifugation, désalinisation, précipitation, filtration, ultrafiltration, microfiltration, centrifugation suivie d'une
ultrafiltration ou filtration suivie d'une microfiltration.
La biomasse séparée et récupérée est ensuite lavée de préférence à plusieurs reprises à l'aide d'eau et, mieux encore, à l'aide d'eau distillée désionisée, et homogénéisée Le lavage répété de la biomasse n'a aucun effet sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase à liaison cellulaire, ce qui mène à la conclusion que
l'enzyme est étroitement lié à la cellule.
L'enzyme de lévane saccharase peut encore être purifié si nécessaire et selon les emplois planifiés La solubilisation de l'enzyme à liaison cellulaire peut être obtenue en présence de détergents ioniques tels que le cholate de sodium ou le dodécylsulfate de sodium ( 0,25 % à 2,5 %) ou des solutions de sels telles qu'une
solution de Mg".
L'enzyme peut également être précipité par du sulfate d'ammonium dans la plage de 65 à 95 % de saturation à une température d'environ 00 C Une technique de sonication peut également être utilisée pour séparer l'enzyme de lévane saccharase
et les cellules, si nécessaire.
L'enzyme de lévane saccharase peut être formulé en compositions contenant l'enzyme de lévane saccharase utilisables dans diverses industries, notamment et tout
particulièrement dans les industries alimentaire, pharmaceutique et chimique.
L'enzyme de lévane saccharase est formulé selon les applications que l'on envisage Habituellement, des stabilisants et des conservateurs sont également ajoutés aux compositions enzymatiques Par exemple, l'enzyme peut être stabilisé en ajoutant du glycérol ( 50 % en volume), du sulfate d'ammonium ( 3,2 moles/l) ou
du chlorure de sodium ( 3 moles/l) à la solution aqueuse de l'enzyme.
Pour les applications médicales, l'enzyme peut être utilisé de préférence sous
forme lyophilisée.
Pour les applications alimentaires, l'enzyme peut être utilisé immobilisé par couplage physique ou chimique de l'enzyme avec des supports inertes sensiblement
insolubles qui facilitent leur emploi dans des réacteurs à écoulement.
Habituellement, l'enzyme est attaché au support Les matières utilisées pour le -7 - support comprennent des matières organiques et minérales telles de la terre de diatomées granulaire poreuse traitée par une solution de polyamine et de glutaraldéhyde, du charbon granulaire activé, une matière tensio-active telle que l'alumine, le charbon, l'argile, la zircone, le bioxyde de titane, des résines échangeuses d'ions, de la cellulose ou du verre, des supports chimiquement activés tels que la cellulose, l'agarose, des polymères synthétiques, des gels par exemple de polyacrylamides, la silice et l'amidon, l'enzyme étant inclus dans le réseau polymérique De préference, l'enzyme de lévane saccharase comprenant des cellules entières de Bacillus peut être directement utilisé dans le procédé d'immobilisation
sans isolement ni purification de l'enzyme.
Les compositions contenant l'enzyme de lévane saccharase de la présente invention peuvent être utilisées sous forme solide ou liquide Ces compositions peuvent être transformées en un produit final qui peut être une solution liquide, un
solide, des granulés, une poudre ou une suspension.
Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées pour la production de lévanes à partir de sucres contenant des résidus de fructosyle tels que le saccharose, le raffinose ou le stachyose Ces sucres peuvent être dérivés de matières brutes, telles que les betteraves sucrières brutes, le jus purifié provenant de betteraves sucrières broyées ou déchiquetées, les mélasses, les sucres de canne, les
sucres de betterave, les sucres de plantes.
Les lévanes obtenus peuvent être des lévanes de haut poids moléculaire, des lévanes de bas poids moléculaire (fructooligosaccharides) et des polymères de fructosyle.
La présente invention sera illustrée par ailleurs par les exemples suivants.
Exemple 1 Un milieu d'ensemencement utilisé pour le développement de l'inoculum est préparé avec les composants suivants: chlorure de calcium 0,02 % en poids/volume, citrate de sodium 0,3 %, amidon hydrolysé 2,6 % vendu sous la marque déposée MALTRlN 100 (GPC), farine de coton 4,6 % vendue sous la marque déposée PIIARMAMEDIA (TRADERS PROTElN), phosphate de sodium mono-acide 0,21 % et phosphate de sodium di- acide 0,54 % Ce milieu d'ensemencement est 8 - stérilisé à 1250 C pendant 30 minutes dans des flacons d'ensemencement qui sont des flacons d'Erlenmeyer à triple chicane de 250 ml contenant 50 ml de milieu d'ensemencement Ensuite, ces flacons sont inoculés à partir d'une culture de la
souche de B licheniformis APMC 84.
Cette souche est mise en culture sur un agitateur giratoire à 370 C pendant 24 heures avant son emploi comme source d'inoculum pour les flacons de production. Le milieu utilisé pour la production de l'enzyme de lévane saccharase est préparé avec les composants suivants: sirop de maïs 10,3 % en poids/volume vendu sous la marque déposée STALEY 200 (A E STALEY), farine de soja 5,5 % vendue sous la marque déposée PROMOSOY 100 (CENTRAL SOJA), extrait de levure (vendue par UNIVERSAL FOODS CORP) 0,32 %, phosphate de sodium
mono-acide 0,7 % et phosphate de sodium di-acide 0,7 %.
Ce milieu de production est stérilisé à 1250 C pendant 30 minutes dans des flacons de production qui sont des flacons d'Erlenmeyer à triple chicane de 250 ml
contenant 50 ml de milieu de production.
La quantité d'inoculum est de 2 % en volume/volume Les flacons de production inoculés sont incubés sur un agitateur giratoire à une température de
370 C pendant 16 à 20 heures.
On n'observe pas d'augmentation de la viscosité lorsque le lévane est produit
dans un bouillon de fermentation.
L'enzyme produit peut être isolé aisément presque sans poisser.
La biomasse est séparée du bouillon de fermentation par centrifugation, ensuite les cellules sont lavées à l'aide d'eau distillée désionisée à deux reprises et
homogénéisées.
L'enzyme de lévane saccharose selon la présente invention est récupéré.
L'unité d'enzyme de lévane saccharose (LSU) est définie comme la quantité d'activité enzymatique requise pour produire une micromole de glucose par minute
dans les conditions de l'essai.
L'activité enzymatique a été mesurée en utilisant du saccharose à titre de substrat A un millilitre d'une quantité aliquote d'enzyme, on a ajouté 7,5 ml de -9-
tampon de citrate 0,01 M, p H 5,5, contenant 60 % de saccharose (poids/poids).
Ensuite, le volume du mélange réactionnel a été ajusté à 10 ml en utilisant de l'eau distillée et le mélange a été incubé à 55 C pendant une heure Après le temps spécifié, la réaction enzymatique a été achevée par application de chaleur à 95 C pendant 10 minutes La teneur en glucose des produits réactionnels a été déterminée par analyse chromatographique en phase liquide de haute performance (HPLC)
(Brobst, K M, et H D Schobell, 1982 Starch/l Starke, 34, 117-121).
L'évaluation de l'effet du p H sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase a été déterminée en effectuant la réaction de transfructosylation enzymatique après incubation à 55 C pendant une heure à différents niveaux de p H, c'est-à-dire 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 et 8,0 en utilisant un tampon de phosphate approprié ( 0, 01 M) La quantité de glucose formée a été déterminée en utilisant le HPLC (analyse chromatographique en phase liquide de haute performance) L'activité a été calculée.
A 55 C, l'activité maximum s'est développée à p H d'environ 5,5-6,0.
La figure 1 illustre l'effet du p H sur l'activité de l'enzyme à une température de 55 C Sur cette figure, le p H est en abscisses et l'activité exprimée en pourcentage de l'activité maximum développée à p H 5,5 et à une température de C en ordonnées Le symbole O représente les données correspondant à l'enzyme selon l'invention et, à titre de comparaison, le symbole # représente les données de
la demande de brevet japonaise JP-A-52-82781.
L'enzyme de la présente invention est plus stable dans la gamme de p H acides
que l'enzyme décrit dans la demande de brevet japonaise mentionnée cidessus.
L'enzyme de la présente invention présente à 55 C et à un p H de 4,0 plus de 50 % de son activité maximum mesurée à 55 C, tandis que l'enzyme de la technique
antérieure ne présentait pas d'activité à p H 4,0 et à cette température.
La figure 1 montre que l'enzyme de lévane saccharase selon la présente invention développe une activité enzymatique appréciable dans une large gamme de p H en présence de saccharose Il développe dans une gamme de p H d'environ 5,5 à environ 6,3 une activité enzymatique maximum mesurée à 55 C Plus précisément, il développe, à une température d'environ 55 C et dans une gamme de - p H d'environ 4,0 à environ 8,4, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à 550 C Il développe, à cette température d'environ 550 C et dans une gamme de p H d'environ 4,2 à environ 8,0, une activité enzymatique d'au moins 70 % de l'activité maximum mesurée à 550 C Il développe, à cette température et dans une gamme de p H d'environ 4,5 à environ 7,8, une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à 55 C Il développe, à environ 550 C et dans une gamme de p H d'environ 4,7 à environ 7,2,
une activité enzymatique d'au moins 90 % de l'activité maximum mesurée à 55 C.
L'évaluation de l'effet de la température sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase a été déterminée en réalisant la réaction enzymatique à un p H de 5,5 après incubation pendant une heure à différentes températures, c'est-à-dire à 4 00 C,
500 C, 55-C, 600 C, 70 c et 80 'C.
Le mélange réactionnel était constitué de 7,5 ml d'une solution de saccharose à 60 % (poids/volume) dans un tampon de citrate-phosphate 0, 01 M à un p H de 5,5
et de 1,0 ml de biomasse lavée contenant 30 LSU/ml d'activité enzymatique.
Ap H de 5,5, l'activité maximum s'est développée à une température d'environ c C. L'effet de la température sur l'activité de l'enzyme de lévane saccharase est représentée dans la figure 2 Dans cette figure, les abscisses représentent la température réactionnelle en C et les ordonnées l'activité exprimée en pourcentage de l'activité maximum développée à 600 C et à un p H de 5,5 Le symbole O représente les données de l'enzyme selon l'invention et, à titre de comparaison, le
symbole # représente les données de la demande de brevet japonaise JP-A52-82781.
La figure 2 montre que l'enzyme de lévane saccharase selon la présente
invention a une stabilité thermique appréciable en présence de saccharose.
Il développe dans une gamme de température d'environ 55 C à environ 64 C
une activité enzymatique maximum mesurée à un p H d'environ 5,5.
Plus précisément, il développe, à un p H d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 350 C à environ 75 C, une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à un p H de 5,5 Il développe, à ce p H d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 450 C à environ 680 C, il - une activité enzymatique d'au moins 80 % de l'activité maximum mesurée à un p H de 5,5 Il développe à ce p H d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 50 'C à environ 670 C une activité enzymatique d'au moins 90 % de
l'activité maximum mesurée à un p H de 5,5.
Exemple 2 L'effet de la concentration de l'enzyme de lévane saccharase (LSU/g de saccharose) sur la composition des produits réactionnels à différents intervalles de
temps a été mesuré à une température de 550 C et à p H de 5,5.
Dans un essai typique, 4,5 g de saccharose dans 9,5 ml d'eau ont été incubés avec une quantité aliquote de 0,5 ml de biomasse contenant différentes quantités d'enzyme de lévane saccharase, c'est-à-dire 4,5, 9, 0 et 22,5 LSU à une température de 50 'C Des échantillons ont été prélevés à différents intervalles de temps et la
réaction a été terminée en chauffant à 90 'C pendant 10 minutes.
La composition des produits a été déterminée par chromatographie en phase
liquide de haute performance (Tableau 1).
TABLEAU 1
Effet de la concentration de l'enzyme de lévane saccharase (LSU/g de saccharose) sur la composition des produits réactionnels 12 Concentration Composition des produits de l'enzyme Temps réactionnels en % en LSU/g de (hr) saccharose saccharose Fructose Glucose Saccharose Lévane 1 LSU/g 2 2,48 4,93 86,82 5,77
4 4,13 9,63 76,24 10,00
6 5,50 41,06 66,74 13,70
8 6,94 18,41 58,54 16,56
12 7,49 23,60 47,30 21,61
16 8,60 28,95 37,90 24,55
24 9,79 36,35 23,14 30,71
36 10,90 41,57 13,40 34,14
44 11,24 42,91 10,55 35,29
2 LSU/g 2 3,99 10,10 76,55 9,36
4 6,41 18,59 58,28 16,72
6 7,87 26,09 43,09 22,95
8 9,03 32,33 31,59 27,08
12 10,22 39,27 17,74 32,77
16 10,93 42,93 11,11 35,02
24 11,76 45,25 6,90 36,08
LSU/g 2 7,19 23,94 48,02 20,35
4 9,76 38,61 19,23 32,39
6 10,98 44,28 8,71 36,02
8 11,41 45,65 6,48 36,46
12 12,34 45,32 6,43 35,91
16 13,01 45,46 6,06 35,47
(Hrt) représente le nombre d'heures.
13 - Le taux de formation de glucose à partir de saccharose par l'enzyme de lévane saccharase augmentait avec l'augmentation de la concentration de l'enzyme Une quantité de 35 % de lévane a été produite dans tous les cas Une quantité de 45 %
de glucose a été produite dans tous les cas.
Exemple 3 La stabilité thermique de l'enzyme en présence de substrat est très importante pour une large application commerciale de l'enzyme L'effet de la température sur la composition des produits réactionnels a été déterminée à des températures de 400 C, 50 'C et 60 C Le mélange réactionnel était constitué de 7,5 ml d'une solution de saccharose à 60 % (poids/poids) dans un tampon de citrate-phosphate
0,01 M à p H de 5,5 et de 2,5 ml d'une solution d'enzyme contenant 40 unités LSU.
Des échantillons ont été prélevés à différents intervalles de temps et la réaction a été
terminée en chauffant à 90 'C pendant 10 minutes.
La composition des produits a été déterminée par chromatographie en phase
liquide de haute performance (Tableau 2).
14-
TABLEAU 2
Effet de la température sur la composition des produits réactionnels Composition des produits Température Temps réactionnels en % réactionnelle hr Fructose Glucose Saccharose Lévane
C 4 7,50 23,31 47,33 21,86
8 9,15 35,54 24,16 31,15
14 11,28 47,30 7,27 34,15
24 11,09 43,32 10,58 35,01
C 4 7,92 24,32 45,26 22,50
8 10,63 35,58 23,39 30,41
14 13,80 46,07 9,07 30,93
24 14,43 46,77 6,20 32,61
C 4 8,65 23,66 46,35 21,34
8 11,51 32,14 29,98 26,36
14 15,11 42,87 18,09 23,93
24 14,55 40,36 14,74 30,36
Les données du tableau 2 montrent que l'enzyme de la présente invention a une bonne stabilité thermique en présence d'un substrat entre 50 et 65 C à p H de 5,5.
Exemple 4
Une concentration élevée de substrat est toujours préférée pour le succès commercial d'une transformation quelconque du fait du coût énergétique élevé dû à
l'évaporation des produits réactionnels.
L'effet de la concentration du saccharose sur la composition des produits réactionnels a été étudié à différents intervalles pendant l'incubation du saccharose
à une température de 55 C avec l'enzyme à p H de 5,5.
On a préparé un tampon d'acétate ( 0,1 M) à p H de 5,5 contenant diverses - quantités de saccharose Des quantités appropriées d'enzyme ont été ajoutées pour
obtenir une concentration fmale de 10 LSU/g de saccharose et incubées à 55 C.
Des échantillons ont été prélevés à différents intervalles de temps et la réaction
enzymatique a été terminée par chauffage à 90 C pendant 10 minutes.
La composition des produits réactionnels a été ensuite déterminée par HPLC
(Tableau 3).
16-
TABLEAU 3
Effet des concentrations de saccharose sur la composition des produits réactionnels Concentra Pourcentage de composition Rapport tion en Temps du lévane saccharose (hr) au g/IO Oml Fructose Glucose Saccharose Lévane fructose libre5 9,75 25,69 43,88 21,57 2,21
8 12,47 32,78 30,09 24,67 1,98
12 16,14 43,04 17,75 23,08 1,43
24 17,67 45,35 6,66 30,33 1,73
5 8,99 29,44 36,84 24,72 2,75
8 10,71 36,40 22,75 30,13 2,81
12 13,66 44,31 11,03 31,00 2,27
24 13,56 42,75 10,20 33,46 2,46
5 6,93 29,47 34,12 29,49 4,26
8 8,46 39,93 20,55 34,05 4,02
12 11,12 44,98 5,37 35,62 3,16
24 14,03 44,98 5,37 35,62 2,54
5 6,25 29,15 33,34 31,27 5,00
8 7,57 37,30 19,00 36,12 4,77
12 9,45 44,26 8,93 37,34 3,95
24 10,76 43,31 4,96 41,12 3,82
Les résultats donnés dans le tableau 3 montrent que la augmentée en augmentant la concentration de saccharose. transfructosylation a été Le rapport de lévane produit au fructose libre à tout intervalle de temps était supérieur pour une concentration supérieure de substrat par comparaison au rapport obtenu pour une 17 - moindre concentration de substrat Par exemple, le rapport du lévane au fructose libre se situe entre 1,4 et 2,2 pour une concentration de la saccharose de 30 %, tandis que le rapport est de 4,5 5,0 pour une concentration de la saccharose de % Cela suggère fortement que la faible activité de l'eau favorise la production de lévane. 18 -
Claims (13)
1 Enzyme de lévane saccharase, stable aux acides, dérivé d'un microorganisme appartenant à l'espèce Bacillus, caractérisé en ce qu'il développe à une température d'environ 55 C et à un p H de 4,0 une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée à 55 C. 2 Enzyme de lévane saccharase stable aux acides selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il développe, par ailleurs, dans une gamme de p H d'environ 5,5
à environ 6,3 une activité enzymatique maximum mesurée à environ 55 C.
3 Enzyme de lévane saccharase selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il développe, par ailleurs, à environ 55 C et dans une gamme de p H d'environ 4,0 à 8,4 une activité enzymatique d'au moins 50 % de l'activité maximum mesurée
à 55 C.
4 Enzyme de lévane saccharase selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il développe par ailleurs à une température d'environ 55 C et dans une gamme de p H d'environ 4,5 à environ 7,8 une activité enzymatique d'au moins 80 % de
l'activité maximum mesurée à 55 C.
Enzyme de lévane saccharase selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il développe, par ailleurs, à un p H d'environ 5,5 et dans une gamme de température d'environ 35 C à environ 75 C une activité enzymatique d'au moins
50 % de l'activité maximum mesurée à un p H de 5,5.
6 Procédé de production d'un enzyme de lévane saccharase stable aux acides qui comprend les étapes suivantes: (i) on cultive un micro- organisme appartenant au genre Bacillus dans un milieu nutritif approprié en formant un bouillon de fermentation comprenant une biomasse, et (ii) on récupère l'enzyme de lévane saccharase dudit bouillon de fermentation,
le micro-organisme étant cultivé en l'absence de saccharose.
7 Procédé selon la revendication 6, dans lequel le micro-organisme appartient
à l'espèce du Bacillus licheniformis.
8 Procédé selon la revendication 7, dans lequel le micro-organisme est le 19 -
Bacillus licheniformis NRRL B-18962.
9 Procédé selon la revendication 6, dans lequel le stade (ii) comprend par ailleurs les opérations suivantes: (a) on sépare la biomasse comprenant les cellules de micro-organisme et l'enzyme de lévane saccharase du filtrat de culture, et
(b) on lave la biomasse séparée.
Micro-organisme appartenant au genre Bacillus produisant un enzyme de lévane sacccharase stable aux acides en l'absence de saccharose dans le milieu nutritif. 11 Micro-organisme selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il
appartient à l'espèce Bacillus licheniformis.
12 Bacillus licheniformis APMC 84 déposé sous le numéro NRRL B-18962.
13 Composition contenant l'enzyme de lévane saccharase stable aux acides
de la revendication 1.
14 Composition selon la revendication 13 préparée sous forme de solution liquide.
Composition selon la revendication 13 préparée sous la forme solide.
16 Composition selon la revendication 13, dans laquelle l'enzyme de lévane saccharase ou l'enzyme de lévane saccharase contenant des cellules entières de
Bacillus est immobilisé.
17 Composition selon la revendication 13 pour la production de lévanes.
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