FR2673952A1 - Moyens pour le diagnostic in vitro de constituants de granules cytoplasmiques et applications biologiques. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des moyens pour la détection de constituants de granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques en particulier pour la détection de granzyme ou de perforine caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement un épitope de ces constituants en donnant lieu à une réaction immunologique de type antigène-anticorps.

Description

MOYENS POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO DE CONSTITUANTS DE
GRANULES CYTOPLASMIQUES
ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention concerne des moyens pour le diagnostic invitro de constituants des cellules cytotoxiques et des cellules T "helper" jouant un rôle dans la réponse immunitaire d'un organisme.

Le système immunitaire est capable de répondre spécifiquement ou non à l'introduction dans l'organisme d'antigènes viraux, bactériens ou allogéniques. Deux types de cellules sont responsables de la neutralisation et de l'élimination de ces différents antigènes : les lymphocytes
B et les lymphocytes T. Ces cellules assurent les deux formes de la réponse immunitaire : la réponse humorale, médiée par les cellules B, et la réponse cellulaire, médiée par au moins deux populations cellulaires, à savoir les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs), et les cellules "natural killer" (NK).

Dans la cytotoxicité à médiation cellulaire, deux processus de lyse ont été décrits. L'un comporte la sécrétion par les cellules effectrices (CTLs et cellules
NK) de protéines cytolytiques en l'absence de seconds messagers intracellulaires. Le deuxième processus, appelé lyse régulée, comprend le stockage des protéines lytiques ou associées à la lyse dans les granules cytoplasmiques, en grande quantité, et leur sécrétion seulement après activation des récepteurs de surface des cellules effectrices et production de seconds messagers intracellulaires.

Dans ces granules, différentes protéines ont été identifiées, parmi lesquelles, la perforine ou protéine qui forme des pores, une famille de protéases que l'on appelle les granzymes, et les protéoglycanes, protéines de haut poids moléculaire, chargées du transport soit de la perforine, soit des granzymes, vers la membrane cellulaire.

Au cours de l'interaction de l'effecteur avec sa cible et de son activation, il se produit une exocytose des vésicules intracytoplasmiques granulaires qui sécrètent leur contenu dans l'espace intercellulaire formé par le contact effecteur/cible, provoquant la lyse de la cellule cible.

La perforine a été isolée à partir d'une lignée cytotoxique chez le rat et chez l'homme.

Les travaux effectués ont permis d'observer qu'en présence de Ca2+, les molécules de perforine polymérisent, s insèrent au niveau de la membrane plasmique de la cellule cible et forment des pores entraînant la destruction des cellules cibles.

Des clones d'ADNc murin et humain ont été isolés,
On a rapporté récemment les séquences génomiques de la perforine chez la souris et l'homme.

Quant aux granzymes, de nombreuses équipes ont décrit leur purification à partir de granules de CTLs ou de cellules à activité NK/LAK (lymphokine activated killer).

Ils représentent la majorité des protéines des granules intracytoplasmiques (85 n versus 10 % pour la perforine).

Differents granzymes ont été isolés et caractérisés chez la souris ainsi que chez l'homme. Plus particulièrement, six granzymes nommés granzymes A à F ont été décrits dans les granules cytoplasmiques de CTLs murins. Un septième granzyme appelé granzyme G a été récemment caractérisé dans les CTLs de souris. Chez l'homme, on a isolé deux granzymes correspondant aux granzymes A et B, et un troisième appelé
H ne correspondant à aucun granzyme murin déjà isolé.

Les granzymes sont synthétisés sous forme de prémolécules contenant un peptide signal caractéristique des protéines sécrétées ou ayant une localisation granulaire. Cette séquence signal est suivie d'un dipeptide acide d'activation qui est en général Gly-Glu ou Glu-Glu (propeptide) et doit être clivé par une dipepditylpeptidase pour libérer la protéine mature.

Il existe une grande homologie entre les différents granzymes, ce qui suggère qu'ils appartiennent à une famille de sérines protéases granulaires.

Ils contiennent tous les résidus His57, Aspe02 et
Ser195 qui forment la triade catalytique des sérines estérases. Tous les granzymes matures commencent par la séquence N-terminale Ile-Ile-Gly-Gly (résidus 16-19), puis une séquence variable (résidus 20-23), suivie d'une séquence conservée (résidus 24-30). Ce sont des protéines plus ou moins glycolysées. Six résidus Cys conservés forment trois ponts disulfures intra-chaîne.

L'approche par la biologie moléculaire a permis d'isoler des gènes codant pour des granzymes exprimés specifiquement dans les CTLs.

Plusieurs rôles ont été attribués aux granzymes.

On a rapporté notamment une action indirecte sur la perforine en augmentant son activité lytique, favorisant la fragmentation de l'ADN de la cellule cible.

Ils pourraient également intervenir dans le mecanisme du détachement du CTL de sa cible après la délivrance du coup létal par clivage du complexe TcR/ antigène (TcR = récepteur T à l'antigène) et des autres complexes récepteur/ligands impliqués dans les phénomènes d'adhésion cellulaire.

Enfin les granzymes, par protéolyse, pourraient cliver des constituants de la matrice extracellulaire ou des composants du milieu interstitiel et être ainsi impliqués dans les phénomènes de migration et d'infiltration des lymphocytes dans les tissus au cours de processus inflammatoires.

D'autres protéines ont été caractérisées dans les granules de CTLs et de cellules "NK" : il s'agit des proteoglycanes. Ces molecules joueraient notamment un rôle dans le "packaging" de la perforine et des granzymes. Elles peuvent également constituer une sorte de barrière protectrice de la face interne des granules sécrétoires, protégeant ainsi la cellule cytotoxique des effets de ses propres molécules lytiques.

La perforine et les granzymes ont été très étudiés au niveau de leur expression génique par les techniques de
Northern Blot et de Dot Blot et plus récemment par la technique d'hybridation in site utilisant des ribosondes spécifiques.

Les études réalisées invitro et, in vive en situation pathologique chez la souris et chez l'homme, montrent que ces gènes sont inductibles au cours de l'activation cellulaire de lymphocytes T, de cellules présentant une activité NK/LAK et ce, de façon précoce.

Chez l'homme, l'expression des gènes des granzymes et de la perforine a pu être observée dans différentes situations pathologiques comme les désordres hématologiques, les maladies auto-immunes, les maladies dermatologiques et les maladies infectieuses parasitaires, bactériennes ou virales. Enfin, les ARNm des granzymes et ou de la perforine ont pu être détectés par hybridation in site au site de plusieurs types d'allogreffes.

L'expression du gène du granzyme B a été observée au niveau des cellules infiltrant des allogreffes de reins.

L'expression des gènes du granzyme B et/ou de la perforine a pu être détectée dans les cellules préférentiellement
CD8+ dans les infiltrats lymphocytaires de biopsies endomyocardiques réalisées chez des patients présentant un rejet. Une étude similaire a été réalisée au niveau de biopsies de peaux de patients atteints de GVH (Graft versus host reaction) après greffe de moelle allogénique HLA génoou phéno-identique.

Les études réalisées ont permis d'observer lors de la suspicion d'un rejet au cours d'une greffe d'organe (coeur, rein) ou d'une GVH après greffe de moelle osseuse, la présence d'infiltrats lymphocytaires "silencieux" détectés par l'histologie, caractérisés phénotypiquement par l'immunohistochimie et qui sont néanmoins dépourvus de l'expression des messagers des granzymes et de la perforine. L'interprétation de tels résultats demeure une interrogation et soulève de nombreuses questions en relation avec l'état d'immunisation des cellules de ces infiltrats, l'effet du traitement immunosuppresseur et la fonction réelle de ces cellules. Seul le suivi des patients dans le temps devrait permettre d'étudier l'évolution de ces infiltrats cellulaires, leur devenir et leur relation à l'évolution du processus de rejet ou de GVH en fonction du traitement administré.

On mesure donc l'intérêt de la recherche de l'expression génique des granzymes et de la perforine au cours de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique invivo.

La plupart des études effectuées ont été réalisées par Northern Blot, Dot Blot, hybridation insitu. Bien qu'informatives, ces techniques sont lourdes et ne permettent en aucun cas d'étudier un grand nombre de patients avec le suivi nécessaire à la connaissance de l'évolution de leur pathologie.

Les infiltrats lymphocytaires détectés par l'histologie restent en fait le seul critère opérationnel sur lequel s'appuient les cliniciens pour confirmer le diagnostic clinique, qu'il s'agisse de rejet ou de GVH dans le cas des allogreffes.

Il est clair que dans toutes ces applications à la clinique, au lieu de détecter des messagers des granzymes et de la perforine, il serait plus aisé de détecter les protéines à l'aide d'anticorps.

L'aspect fondamental qui implique la compréhension du rôle biologique des granzymes et de la perforine requiert également une analyse fine et efficace à l'aide d'anticorps.

Mettant à profit leur avance technique dans ce domaine et leur grande maîtrise des techniques d'isolement et de purification des granzymes et de la perforine, les inventeurs ont développé de nouveaux outils permettant de diagnostiquer la présence de constituants des granules cytoplasmiques dans des échantillons biologiques à étudier.

Utilisant l'approche immunologique pour résoudre les problèmes posés à ce jour, les inventeurs ont produit des anticorps de haute spécificité vis-à-vis des protéines précitées.

L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens très spécifiques de diagnostic invitro de la présence des constituants des granules évoqués ci-dessus.

Elle vise également une méthode de diagnostic permettant de simplifier la détection de ces produits en recherche clinique et fondamentale.

Les anticorps de l'invention, qui sont dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules "natural killer", sont caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement un épitope d'un constituant donné de ces granules, en particulier un épitope de granzyme ou de la perforine, en donnant lieu à une réaction du type antigène /anticorps.

L'expression "constituant des granules" telle qu'utilisée dans la description et les revendications recouvre aussi bien la forme native du constituant, qu'une forme recombinante active telle qu'obtenue par les techniques classiques de génie génétique. Ainsi les granzymes ou la perforine auxquels il est fait référence sont soit sous leur forme native, soit sous une forme recombinante.

L'expression "capable de reconnaître spécifiquement un épitope" telle qu'utilisée dans la description et les revendications signifie que les anticorps monoclonaux reagissent avec l'épitope en question en utilisant les techniques immunologiques ELISA, Western
Blot ou Immunoprécipitation décrites dans les exemples.

Dans une disposition préférée de 1 invention, ces anticorps sont des anticorps monoclonaux anti-granzymes ou anti-perforine humains.

Les anticorps monoclonaux anti-granzymes sont en particulier des anticorps anti-granzyme A ou anti-granzyme
B ou encore anti-granzyme H humains.

Les anticorps monoclonaux de l'invention sont encore caractérisés par le fait qu'ils appartiennent à la classe des IgG et qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (Granzyme B), 60 kDa (Granzyme A) ou 66 à 75 kDa environ (Perforine).

L'invention vise également tout fragment des anticorps monoclonaux ci-dessus dès lors qu'il est capable d'interagir spécifiquement avec un constituant donné desdits granules, en particulier avec un granzyme ou de la perforine.

Les anticorps monoclonaux de l'invention sont également caractérisés par le fait qu'ils sont tels qu'obtenus par sécrétion à partir de souches d'hybridomes résultant de la fusion d'une cellule immortelle de myélome non secréteur avec une cellule productrice d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules de cellules cytotoxiques.

L'étape de fusion des deux types cellulaires est notamment réalisée selon la technique la plus couramment utilisée à savoir celle de Köhler et Milstein, Nature, vol 256, p. 495, 1975.

Les cellules productrices d'anticorps sont des splénocytes. Ces cellules sont récupérées apres immunisation in vive de l'animal avec l'antigène approprié.

Pour l'étape d'immunisation, on utilise des protéines purifiées, injectées avec un adjuvant. Des résultats particulièrement satisfaisants sont obtenus en purifiant les constituants des granules cytoplasmiques selon la technique de Krahenbühl et al. dans J. Immunol, 141, 3471-77, 1988.

Les cellules immortelles sont des cellules de myélome non sécréteur, ce qui permet d'obtenir des hybridomes ne sécrétant que l'immunoglobuline de la spécificité de la cellule productrice.

Conformément à la technique classique, les hybridomes obtenus sont mis en culture et clonés selon le procédé de dilution limite. On sélectionne avantageusement les hybridomes dont les surnageants de culture présentent les titres les plus élevés d'anticorps en ELISA. Pour accroître la production d'anticorps, on les injecte à des animaux, par raison de commodité, à des souris, à des rats ou à des lapins et des ascites sont ainsi produites en grande quantité. En variante, les souches d'hybridomes sont maintenues en culture dans des incubateurs à CO2.

Les anticorps monoclonaux récupérés peuvent être utilisés tels quels ou sont purifiés, par exemple par colonne d'affinité et conservés par congélation, ou éventuellement lyophilisés.

L'invention vise tout spécialement les anticorps monoclonaux produits par les clones appelés GRB 51D, GRA 66D, CE 2.10, déposés à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM), respectivement sous les numéros I-1060, I-1059, et I-1058, le 12 mars 1991.

L'invention vise également les souches d' hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux définis ci-dessus et plus spécialement les clones produisant des titres élevés d'anticorps mesurés par test ELISA.

Les souches d'hybridomes de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules immortelles avec une cellule produisant des anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques, notamment des anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine.

Le procédé d'obtention de ces hybridomes entre également dans le cadre de l'invention. Ce procédé comprend des étapes de fusion et de sélection définies plus haut en rapport avec les anticorps monoclonaux.

Comme indiqué ci-dessus, les protéines contre lesquelles sont dirigés les anticorps monoclonaux de l'invention sont soit des protéines natives, soit des protéines recombinantes. Ces protéines recombinantes sont des produits nouveaux et, en tant que tels, entrent dans le cadre de l'invention.

Il s'agit plus spécialement de séquences d'acides aminés renfermant au moins la partie C-terminale active de la protéine mature
En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, ces protéines sont produites dans des hôtes cellulaires, notamment dans des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant les fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.

Ces fragments sont excisés à partir de clones d'ADN codant pour les protéines matures et sont introduits par ligaturation dans un site approprié du vecteur choisi.

Les protéines exprimées sont récupérées du milieu de culture, après lyse des bactéries, et purifiées.

La mise en oeuvre de ces techniques conduit à l'élaboration d'outils qui constituent des produits nouveaux. Ainsi, les hôtes cellulaires transformés, les vecteurs d'expression tels que plasmides, et fragments d'ADN tels qu'évoqués ci-dessus entrent dans le cadre de l'invention. Celle-ci vise plus spécialement les protéines recombinantes de perforine et de granzyme et les outils mis en oeuvre pour leur expression.

L'invention vise ainsi un fragment de la séquence de la perforine comportant la partie active C-terminale de la perforine mature de souris, plus spécialement le fragment tel qu'exprimé par le fragment d'ADN SmaI-EcoRV de 1400 pb. L'invention vise en particulier la séquence d'acides aminés s'étendant de la position 98 à 534 sur la figure. Elle vise également le fragment d'ADN capable de coder pour cette séquence d'acides aminés, les vecteurs renfermant un tel fragment d'ADN, en particulier un vecteur plasmidique, ainsi que les bactéries transformées par incorporation de tels vecteurs, en particulier les bactéries transformées mPerf-PL 40 déposées à la C.N.C.M.

le 12 mars 1991 sous le n" I-1057.

Comme indiqué ci-dessus, les gènes des granzymes et de la perforine sont inductibles invitro et in vive au cours de l'activation cellulaire en situation normale ou pathologique. Les granzymes apparaissent comme des marqueurs précoces de l'activation cellulaire ; la perforine semble être préférentiellement un marqueur de l'activité cytotoxique d'une cellule. Ces protéines apparaissent donc comme des marqueurs fonctionnels de l'activation cellulaire et/ou cytotoxique.

La spécificité élevée des anticorps monoclonaux de l'invention les rend particulièrement précieux pour mettre en évidence la présence de tels marqueurs dans un fluide ou un échantillon biologique.

L'invention vise donc également l'application de ces anticorps monoclonaux en tant que bioréactifs pour le diagnostic in vitro dans un fluide ou échantillon biologique de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques plus spécialement de granzymes ou de perforine ou encore, par exemple, de protéoglycanes ou de molécules de type lymphotoxine.

Dans cette application, les anticorps monoclonaux sont libres. En variante, ils sont fixés sur un support solide non immunogène.

La méthode selon l'invention de diagnostic in vitro de la présence de granzymes ou de perforine ou autre constituant desdits granules cytoplasmiques est caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes
- on met en contact l'échantillon à tester avec une préparation d'anticorps monoclonaux, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus, immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec lesdits constituants, en particulier respectivement avec un granzyme ou la perforine lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon, puis on met en évidence la formation d'un tel complexe de type antigèneanticorps.

Pour révéler la réaction immunologique, ledit constituant, plus spécialement le granzyme ou la perforine comporte un groupe marqueur. Il s'agit le plus généralement d'un groupe radioactif. En variante, on utilise un deuxième anticorps couplé à un groupement dont l'activité peut être mesurée telle une enzyme, comme la phosphatase alcaline ou un groupe fluorescent.

Cette méthode de détection permet de révéler avec une grande sensibilité et rapidement la présence desdits constituants, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, notamment de les localiser et de les quantifier par exemple au niveau de biopsies de tissu pathologique, ou de cellules du sang périphérique.

Ainsi elle est particulièrement appropriée pour diagnostiquer un rejet dans le cas de transplantation d'organes, (rein, coeur, / poumon, foie, pancréas) et à des fins de diagnostic précoce de GVH Copeau, foie, intestins) dans le cas de greffe de moelle osseuse.

Outre ces applications immunohistologiques, les anticorps monoclonaux de l'invention et leurs fragments, libres ou immobilisés, sont utilisés pour réaliser des diagnostics dans des pathologies où l'évolution de la maladie modifie le taux de granzyme ou de perforine.

Ils pourraient permettre par exemple de suivre le devenir d'une greffe chez un patient, et en particulier les implications du traitement immunosuppresseur qui pourrait être éventuellement modulé. Cette surveillance pourrait être éffectuée par l'étude cinétique des "infiltrats lymphocytaires" présents au niveau de biopsies prélevées au site de la greffe. Ils revêtent également un grand intérêt dans le cas de maladies auto-immunes, dermatologiques, infectieuses (microbiennes, parasitaires ou virales (HIV)).

L'apport des anticorps monoclonaux de l'invention est donc important pour diagnostiquer la présence de cellules activées et/ou cytotoxiques en nombre anormalement élevé au niveau de l'organe atteint, ou au niveau du sang périphérique.

Ils sont également utilisables pour effectuer des études de différenciation cellulaire, les granzymes étant des marqueurs de la différentiation cellulaire T ou B.

On notera que dans le cas de maladies auto-immunes les protéases impliquées constituent des auto-antigènes.

Elles peuvent donc être utilisées pour reconnaître les auto-anticorps formés. A cet égard, les protéines recombinantes, plus particulièrement de granzyme B et de granzyme H de l'invention, présentent un grand intérêt dans une utilisation comme auto-antigènes en vue d'une reconnaissance par des auto-anticorps présents dans des sérums auto-immuns. Pour effectuer cette réaction, on opère avantageusement selon les techniques habituelles.

L invention vise également un kit pour le diagnostic invitro de la présence desdits constituants des granules cytoplasmiques plus spécialement de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique.

Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend
- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titration,
- une préparation d'anticorps monoclonal ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini ci-dessus,
- une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un groupe marqueur,
- un système de détection spécifique du marqueur,
- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.

Les anticorps monoclonaux sont susceptibles également de constituer des agents thérapeutiques de grand intérêt et peuvent jouer le rôle de vecteurs d'enzymes ou de médicaments.

On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. La figure unique comporte la séquence d'acides aminés de la perforine recombinante dont la préparation est rapportée dans les exemples.

I - Matériel
1-1 Matériel
- Les granzymes A et B sont séparés des autres protéines des granules cytoplasmiques des LGL (lymphocytes à larges granules) sur une colonne Mono S échangeuse de cations (HR/5, PHARMACIA) connectée à un système FPLC (PHARMACIA) selon la technique décrite par (Krähenbül et al., dans J. Immunol, indiqué ci-dessus).

- Les souris utilisées sont des souris BALB/C d'haplotype H-2d.

- Le myélome NS-1, non sécréteur dthaplotype H-2d, apporte dans la fusion son pouvoir de prolifération. Il est contre-sélectionné en milieu HAT (Hypoxanthine,
Aminoptérine, Thymidine) car il porte la mutation HPRT (Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6,292-295, 1976).

- L'anticorps polyclonal dirigé contre le granzyme
B est tel qu'obtenu selon la technique décrite par Krähenbühl (voir référence ci-dessus).

- La lignée REX est une lignée T immortalisée par le virus d'Epstein Barr.

- L'anticorps monoclonal PAb419 est dirigé contre l'antigène T de SV40 (Harlow et al., J of Virology, 861869, 1981).

I-2 Solutions
MILLIEU 1 : RPMI 1640 (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO).

MILIEU 2 : RPMI 1640 (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 250 u/ml interleukine 2 (Roussel Uclaf, 0,7 106 u
BRMP / échantillon).

MILIEU 3 : RPMI (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 0,36 %. glucose (A.P.).

MILIEU 4 : Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 10 % sérum de cheval inactivé (GIBCO), 10 % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo).

MILIEU 5 : Dubecco's MOD Eagle Medium (GIBCO), 100 u/ml pénicilline, 100 u/ml streptomycine (GIBCO), 2 mM glutamine (GIBCO), 1 mM pyruvate de Sodium (GIBCO), 10 % sérum de veau foetal inactivé (GIBCO), 10 % sérum de cheval inactivé (GIBCO), 10 % NCTC 135 (GIBCO), 2 mM NaOH (Prolabo), 2 % Hypoxanthine (GIBCO), 2 % Thymidine (GIBCO), 2 % Aminoptérine (GIBCO).

RIPA : 10 mM Tris pH 8,1 mM EDTA, 150 mM NaC1, 1 %
NP40, 1 % desoxycholate de Na, 0,1 % SDS.

Tampon de lavage des immunoprécipitations : 100 mM
Tris pH 9, 0,5 M LiCl, 1 % mercaptoéthanol.

Tampon Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970) : 62,5 mM Tris pH 6,8, 2 % SDS, 15 % glycérol, 5 % pmercaptoéthanol, 0,01 % bleu de bromophénol.

II - Méthodes
II-1 Isolement des LGL du sang périphérique
On opère comme décrit par Chouaib et al., dans
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6875-6879, 1988.

Les lymphocytes sont isolés du sang périphérique par gradient de ficoll (PHARMACIA). Après 2 lavages en milieu 5, les cellules sont numérées en solution de Hayem et incubées à raison de 3 x 108 cellules dans des flacons de culture (COSTAR) prétraités avec du SHN inactivé pendant 1 heure à 37"C. Les cellules non adhérentes sont alors collectées, lavées en RPMI SHN 10 * et fractionnées par centrifugation sur un gradient discontinu de percoll (PHARMACIA). 4 solutions de concentration différente de percoll sont préparées (31 %, 34 %, 37 % et 41 %). Une solution sur deux est préparée dans du milieu RPMI (rouge), ou dans une solution de chlorure de Na isotonique (incolore), permettant ainsi une bonne visualisation des interfaces.Après avoir coulé 4 ml de la solution à 41 g puis déposé délicatement sur celle-ci 2 ml de chaque solution par concentration décroissante dans des tubes coniques de 15 ml (NUNCLON DELTA, PAUL BLOCK), 3 x 108 lymphocytes contenus dans 2 ml de RPMI sont déposés à la surface du gradient. Les tubes sont centrifugés 30 min à 1400 t/min sans frein à température ambiante. Les anneaux de LGL situés à l'interface 37 - 41 % sont récupérés à la pipette Pasteur, lavés 3 fois en RPMI, puis regroupés. Les cellules sont numérées et mises en culture dans du milieu 2 à raison de 5 x 105 cellules par ml. Les LGL représentent 2 à 5 % de la population totale des lymphocytes.

II-2 Immunisation de souris avec les granzymes A et B purifiés à partir de LGL du sang périphérique ou de cellules NK.

10 pg de protéines purifiées (granzyme A et B) dissoutes dans 200 pg de VaccicoxR (109 unités), adjuvant, sont injectées par voie intra-péritonéale à une souris
BALB/C. 21 jours après, on effectue un rappel grâce à une 2ème injection par voie intra-veineuse (10 ug de protéines dissoutes dans 200 pg de sérum physiologique).

II-3 Fusion cellulaire
On opère comme décrit par Oi et Herzenberg, dans
Selected methods in cellular immunology. Freeman and co.

Mishell, Shiigi, eds. 1980)
Trois jours après le rappel, la souris est sacrifiée et sa rate est prélevée en milieu stérile. Elle est dilacérée avec un piston de seringue de 5 ml dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de RPMI. La solution de splénocytes est ensuite lavée avec 50 ml de RPMI. Après centrifugation, les culots cellulaires sont conservés à température ambiante.

Les cellules de myélome NS-1 mis en culture dans du milieu 2 sont centrifugés pendant 7 min à 1500 t/min, puis lavés dans 50 ml de RPMI. Les culots cellulaires sont resuspendus dans 10 ml de RPMI, et transférés dans le tube contenant les splénocytes selon le rapport de 1 cellule de myélome pour 2 splénocytes. Ce mélange est ajusté à 40 ml avec du RPMI, puis centrifugé pendant 7 min à 1500 t/min à 200C.

Le culot cellulaire mixte est resuspendu avec 1 ml de PEG (polyéthylène glycol 1500, BOEHRINGER), (agent fusionnant), en tournant doucement la pipette dans le tube pendant 1 min. Le PEG est dilué en ajoutant en 1 min 1 ml de RPMI 1640 préchauffé à 37"C puis 7 ml du même milieu en 2 min pour atténuer la toxicité de ce produit. Après centrifugation à 1800 t/min pendant 4 min sans frein, le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de milieu (4) préchauffé à 37"C. Les cellules sont distribuées dans des plaques stériles de 96 puits à fond plat à raison de 105 cellules du myélome dans 100 p1 par puits (temps 0).

24 heures après la fusion (jour 1), 100 p1 de milieu 5 (sélection HAT) préchauffé à 37"C sont ajoutés dans chaque puits. Ce milieu sélectionne les hybridomes et tue les cellules de myélome qui n'ont pas fusionné.

Au jour 7, 100 pl de milieu sont aspirés et remplacés par 100 pl de milieu 4 neuf. Au jour 10, le contenu des puits positifs (test ELISA ; kit AMERSHAM), est transféré sur plaque à fond plat de 24 puits dans lesquels on ajoute 1 ml de milieu de culture 4. Au jour 13, les hybridomes sécréteurs peuvent être conservés par congélation en azote liquide dans du SVF/10 DMSO.

II-4 Recherche des hybridomes secrétant des anticorps anti-granzymes A et B humains par test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).

(kit Anti-IG de souris, anticorps entier lié à de la peroxydase de raifort, AMERSHAM)
La préparation des plaques de 96 puits à fond plat est réalisée 24 heures avant le test. A cet effet, 100 p1 d'antigène (granzymes A ou B purifiés), à 1 pg/ml (dans du
PBS) sont distribués dans les puits. Les plaques sont mises à 4"C pendant 24 heures.

2 à 5 lavages avec 200 pl par puits de PBS, 0,1 %
Tween 20 sont effectués avant de tester les surnageants de culture des hybridomes. Les plaques sont incubées 1 heure à 37 "C avec 50 pl par puits de surnageant de culture de l'hybridome à tester.

Après 3 lavages avec du PBS, 0,1 % Tween 20, 50 pl d'anticorps secondaire (conjugué à la peroxydase et dilué au 1/500e dans du PBS, 0,2 % Tween 20) sont ajoutés dans chaque puits. L'incubation se fait à 37"C pendant 30 min.

Les plaques sont de nouveau lavées 3 fois avec du
PBS, 0,1 % Tween 20. La révélation est effectuée en ajoutant 100 p1 d'une solution contenant le substrat (10 pl
PBS, 3 % H202 dans 12,5 ml d'ABTS 180 mg/l).

Les plaques sont lues par mesure de la DO à 405 nm 15 à 25 min après l'addition du substrat.

Après fusion des cellules du myélome NS1 avec les splénocytes provenant de la souris immunisée avec le granzyme B, en opérant comme indiqué ci-dessus, les surnageants de 28 hybridomes désignés GRB se sont avérés être spécifiques du granzyme B en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée).

La même démarche suivie avec le granzyme A, a conduit à isoler 15 hybridomes appelés GRA secrétant des anticorps spécifiques du granzyme A, en test ELISA (test réalisé avec de la protéine purifiée).

Le pourcentage d'hybridomes sécréteurs d'anticorps spécifiques est particulièrement satisfaisant, en effet sur 300 hybridomes issus de la fusion entre les cellules du myélome NS1 et les splénocytes de la souris immunisée avec le granzyme B purifié, 10 % secrètent des anticorps spécifiques en test ELISA. Dans le cas du granzyme A, 5 % des hybridomes de la seconde fusion sont spécifiques dans les mêmes conditions.

II-5 Clonage des hybridomes par dilution limite.

Les hybridomes dont les surnageants présentent la plus forte positivité en test ELISA sont clonés dans des plaques de 96 puits à fond plat. Plusieurs dilutions sont testées. Le clonage est effectué à 100 cellules, 10 cellules, 1 cellule et 0,25 cellules par puits à raison de 100 pl de milieu 4 par puits.

Les cellules sont nourries 3 jours après le clonage avec 100 pi de milieu 4, puis tous les 7 jours.

Lorsque la croissance cellulaire, contrôlée sur microscope inversé, semble importante, le surnageant de culture de ces puits est testé en ELISA sur les granzymes purifiés sur du granzyme A ou B et sur le lyzozyme comme contrôle négatif.

Les hybridomes positifs sont transférés dans les plaques de 24 puits puis sur des plaques de 6 puits et par la suite en flacon pour maintenir la croissance exponentielle des cellules. Ces hybridomes sont injectés dans le péritoine des souris pour produire des ascites. Ils peuvent être laissés en culture jusqu'à la mort cellulaire afin d'obtenir des surnageants très concentrés étudiés en
Western Blot ou en immunoprécipitation.

On récupère deux hybridomes secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme B, appelés respectivement GRB98C et GRB5lD et trois autres souches secrétant des anticorps reconnaissant le granzyme A, appelés GRA66D, GRA382E et GRA1OD. Les hybridomes restants seront clonés afin de constituer un panel d'anticorps dirigés contre les granzymes humains A et B.

II-6 Caractérisation de l'isotype des anticorps clonés
Le surnageant de culture de l'hybridome à tester est dilué au 1/10e en 20 mM Tris pH 7,6, 137 mM NaCl (TBS).

La bandelette du kit est incubée 15 min à température ambiante avec le surnageant dilué. Après 3 lavages en TBS, 0,1 * Tween 20 (TBS-T), la bandelette est incubée dans une solution d'anticorps anti-souris couplés à la peroxydase (dilués au 1/500e dans du TBS-T).

La révélation s'effectue par incubation de la bandelette durant 15 min à température ambiante dans 3 ml d'une solution contenant le substrat (1 pastille de chloronaphtol dissoute dans 10 ml de méthanol froid, mélangés extemporanément à 50 ml de TBS contenant une goutte de peroxyde d'hydrogène). Après 3 lavages en eau distillée, les bandelettes sont séchées et peuvent être interprétées.

La technique d'immunisation utilisée dans cette étude a permis d'obtenir des hybridomes sécrétant des anticorps d'isotype IgG. L'isotype des anticorps a été confirmé par le kit commercialisé par Amersham d'anticorps monoclonaux de souris. Les anticorps monoclonaux GRB98C,
GRA66D, GRA382E et GRA1OD présentent l'isotype IgG1. Celui sécrété par l'hybridome GRB51D présente l'isotype IgG2a. La titration des surnageants de culture des hybridomes clonés par test ELISA a permis de déterminer un titre du surnageant de culture de l'hybridome GRB98C de 1000. Ceux des surnageants de culture des hybridomes GRB51D, GRA66D et
GRA1OD sont de 10 000. Le titre du surnageant de culture de l'hybridome GRA382E est de 100 000. Il convient de noter les valeurs élevées de ces titres.

Détermination de la spécificité de ces anticorps par les techniques d' électro-transfert de protéines et d'immunorévélation (Western blot). On opère comme décrit par Towbin et al., dans Proc. Natl. Acad. Sci.

76, 4350-4354, 1979.

La protéine (antigène purifié : granzymes A ou B, ou témoin négatif) est incubée dans du tampon de Laemmli à 100"C pendant 10 min (1 pg/gel de 12 cm de largeur), migre sur un gel de polyacrylamide dénaturant, puis est électrotransférée sur filtre de nitrocellulose (BA83, CERA
LABO) dans un appareil à électrodes en graphite (CERA
LABO), dans un tampon 39 mM de glycine, 48 mM Tris pH 8,3, 0,037 % SDS, 20 % méthanol sous un courant de 1 mA/cm2 de filtre pendant 1,5 à 2 heures. Après transfert, le filtre de nitrocellulose est coloré avec du rouge ponceau 0,2 %, et de l'acide trichloracétique 0,3 % pour vérifier l'efficacité du transfert, puis découpé en bandelettes de 0,6 cm de largeur.

Les bandelettes sont préincubées dans un tampon
PBS avec 0,2 % de Tween 20 et 5 % de lait écrémé pendant 1 heure à 4"C. Un jeu de bandelettes, représentant différentes protéines à tester, sont incubées 1 nuit à 4"C avec le surnageant d'hybridome dilué au 1/10 dans le tampon
PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 5 % de lait écrémé. Les bandelettes sont ensuite lavées dans du tampon PBS contenant 0,2 % de Tween 20 sous agitation moyenne pendant 5 fois 5 min à température du laboratoire. Les bandelettes sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de souris couplé à la phosphatase alcaline (dilué au 1/1000e dans le tampon PBS ci-dessus) pendant 2 heures à température du laboratoire.Après 5 lavages de 5 min dans du PBS, les bandelettes sont équilibrées dans le tampon de réaction de la phosphatase alcaline (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaC1, 50 mM MgCl2) et mises en présence du substrat de la phosphatase (10 ml de tampon de réaction, 44 pl de chlorure de tétrazolium nitro-bleu, 33 pi de sel de (5bromo-4-chloro-3-indolylphosphatase p-toluidine) pendant 15 minutes à température ambiante. La réaction peut être stoppée en lavant les bandelettes avec H20.

Le granzyme B, réduit et dénaturé, est électrotransféré sur un filtre de nitrocellulose. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées avec les différents anticorps à tester, puis avec un anticorps antisouris conjugué à la phosphatase alcaline.

Dans ces conditions, une bande à 31 KD est observée sur la bandelette incubée avec le sérum polyclonal anti-granzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée sur les bandelettes incubées avec les anticorps anti-granzyme B GRB51D et GRB98C. Les contrôles (bandelettes incubées avec l'anticorps dirigé contre l'antigène T de SV 40, avec les anticorps anti-granzyme A
GRA66D, GRA382E et GRA1OD) sont également négatifs. Les anticorps anti-granzyme B ne reconnaissent donc pas le granzyme B dans les conditions de cette expérience de
Western blot.

II-8 Marquage des cellules in vitro et immunoprécipitation.

Les LGL sont mis en culture (milieu : RPMI dépiété en méthionine, compiémenté en 35S méthionine : 20 à 50 pCi/ml et en 1 % SHN inactivé) à raison de 3 à 5 x 105 cellules par ml. Le marquage peut être effectué dans un milieu RPMI déplété en leucine et complémenté par 20 à 50 pCi/ml de 3H leucine. Après une incubation de 4 heures à 37"C, les cellules sont lavées 2 fois en PBS. Le culot cellulaire est repris dans 500 pl de RIPA-O,O1 % BSA (B2518, SIGMA), puis soniqué pendant 15 s (micro sonicateur, puissance 40 watts, sonde 0,3-87, BIOBLOCK).

L'incorporation de radioactivité est suivie par comptage d'une fraction précipitée au TCA. L'extrait cellulaire est aliquoté par 5 x 106 cpm.

- Immunoprécipitation (selon Kress et al., dans J.

Virol. 31, 472-483, 1979).

L'incubation, pendant 30 min à 4"C avec agitation sur roue, de l'extrait cellulaire avec 60 pl de protéine A
SépharoseR (PHARMACIA, CL4B SépharoseR) permet de diminuer le bruit de fond. L'échantillon est ensuite filtré sur un frité (polyéthylène poreux). 10 pi de sérum normal de souris et 30 pl de protéine A SépharoseR sont ajoutés à l'éluat et laissés 1 heure à 4"C avec agitation. Cette solution est filtrée sur le même filtre. La dernière étape de diminution du bruit de fond est réalisée grâce à l'addition de 30 pi de protéine A SépharoseR au filtrat et à une incubation de 30 min à 4"C avec agitation.Après filtration, l'éluat est incubé, 4 heures à 4"C avec agitation, en présence de 200 pi de surnageant de culture à tester ; 40 pl de protéine A SépharoseR et 20 pi de RIPA0,01 % BSA (B2518, SIGMA). Le complexe antigène-anticorpsprotéine A SépharoseR est filtré, puis lavé, élué par 45 pi de tampon de Laemmli et bouilli 10 min à 100 C.

Les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide (12,5 %) en présence de SDS. Après migration à 40 mA 200 V, le gel est fixé, traité au EN3HANCE (DUPONT de NEMOURS) lavé en eau distillée, séché 1 heure à 80"C et fluorographié sur Hyperfilm-MP (AMERSHAM) à -80 C.

On rapporte ci-après les résultats d'expériences d'immunoprécipitation suivies de séparation sur gel d'acrylamide, réalisées pour vérifier la capacité des anticorps monoclonaux anti-granzymes B d'immunoprécipiter les granzymes B contenus dans les granules des LGL. Dans cette expérience, on utilise des extraits de cellules (LGL ou REX) marquées à la 35S-méthionine. L'immunoprécipitation est réalisée à l'aide des surnageants de culture des hybridomes à tester. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %.

Le temps d'autoradiographie est de 7 jours.

On observe une bande à 31 KD correspondant à la migration de l'extrait cellulaire de LGL, immunoprécipité par les anticorps anti-granzyme B, GRB51D et GRB98C. Cette bande à 31 KD est aussi observée pour le même extrait cellulaire immunoprécipité par le sérum polyclonal antigranzyme B. En revanche, cette bande n'est pas détectée avec un contrôle négatif. La migration de l'extrait cellulaire REX (cellules n'exprimant pas les granzymes) immunoprécipité par les anticorps décrits précédemment ne révèle aucune bande à ce poids moléculaire. Ces résultats montrent que les anticorps GRB51D et GRB98C reconnaissent bien le granzyme B.

Pour la caractérisation des anticorps antigranzyme A (GRA66D, GRA382E, GRA1OD), les immunoprécipitations ont été réalisées sur des extraits de
LGL et de lignées cellulaires REX marqués à la leucine 3H en effet la séquence en acides aminés du granzyme A est très pauvre en méthionine, mais elle contient à l'inverse 26 leucines. Les protéines immunoprécipitées sont séparées sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5 %. Le temps d'autoradiographie est de 1 mois. Une bande supplémentaire de faible intensité à 32 Kd est observée uniquement avec l'extrait cellulaire de LGL immunoprécipité par l'anticorps
GRA66D, mais non par les anticorps GRA382E et GRA1OD, ni par un anticorps servant de contrôle négatif.

11-9 Production d'ascites
Une injection de 500 pl de tetra-méthyl-pentadécane (JANSSEN) est effectuée en intrapéritonéal à une souris BALB/C. On opère comme décrit par Hoogenraad et
Wraight, dans Methods Enzymol, 121, 375-381, 1986. Dix jours plus tard, 107 hybridomes lavés dans du sérum physiologique sont injectés en intra-péritonéal. Les souris sont ponctionnées chaque jour. Le liquide péritonéal est centrifugé pendant 7 min à 1500 t/min à 4"C. L'ascite récupérée à l'aide d'une pipette Pasteur est filtrée sur 0,2 pm (NALGENE), puis centrifugée à 4"C pendant 30 min à 12000 g pour éliminer les lipides et conservée à -80 C.

II-10 Purification des anticorps
(ImmunoPure IgG Purification kit, PIERCE)
La colonne de protéine A, stockée en 0,02 % azide de Na, est lavée avec 5 ml de tampon de liaison. 2 ml d'ascite, diluée au 1/2 dans le tampon de liaison, sont déposés sur la colonne. Après lavage avec 15 ml de tampon de liaison, les IgG (immunoglobulines G) sont éluées avec 5 ml de tampon d'élution. Cette colonne est régénérée avec 8 ml 0,1 M d'acide citrique pH 3 et stockée en 0,02 % azide de Na.

Les fractions éluées sont dessalées sur des colonnes d'Exocellulose avec 10 ml de PBS. Ces colonnes de dessalage sont régénérées avec 15 ml de PBS et stockées en 0,02 % azide de Na. Les fractions dessalées des IgG sont dosées par mesure de la DO à 280 nm pour déterminer la concentration des immunoglobulines dans chaque fraction selon la formule : [IgG] en mg/l = DO à 280 nm/1,4.

II-11 Détection des granzymes au niveau des LGL par immunocytochimie.

Les LGL ont été incubés avec des anticorps reconnaissant les granzymes A et B, sélectionnés par le test ELISA comme rapporté plus haut.

2 x 105 cellules par lames sont cytocentrifugées pendant 5 min à 250 t/min et fixées dans l'acétone pendant 10 min à 4"C. Après 2 lavages en PBS, 10 pi par lame de l'anticorps à tester (dilué au 1/2 dans du PBS, 1 % BSA) sont ajoutés et laissés pendant 1 heure à 37"C. Les lames sont lavées 2 fois en PBS puis 200 pl par lame de l'anticorps anti Ig de souris (dilué au 1/500e dans du PBS, 1 % BSA) sont ajoutés et laissés 30 min à 37"C. Après 2 lavages en PBS, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 200 pl d'une solution contenant le substrat, 1 pastille (10 mg) de 3,3' diaminobenzidine (SIGMA) dissoute dans 10 ml de 50 mM Tris pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 pl de H202 à 0,3 %. Les lames sont lavées et les cellules sont colorées par de l'Hémalun de Meyer (MERCK) pendant 1 min à température ambiante. Les cellules sont lavées, déshydratées dans des bains d'méthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une goutte de résine de montage (BIOLYON).

L'analyse est faite en microscopie photonique.

Dans ces conditions , une coloration marron du cytoplasme est observée, révélant la fixation de ces anticorps. Aucune coloration n'est obtenue avec un anticorps utilisé comme contrôle négatif. Lorsque les LGL sont activés une nuit en présence d'IL-2 recombinant (250
U/ml), une partie seulement de la population cellulaire est colorée. Après sept jours de culture en présence d'IL2 à la même concentration toute la population cellulaire est colorée.

II-12 Détection des granzymes A et B sur les biopsies de peau de patients présentant une GVH par immunohistochimie.

Lors d'une greffe de moelle allogénique réalisée en identité HLA, le syndrome clinique de la réaction du greffon contre l'hôte ou GVH est fréquemment observé. Les manifestations cliniques de la GVH se caractérisent par des atteintes de la peau, de l'intestin et du foie. Les biopsies de peaux sont considérées comme le meilleur matériel pour établir le diagnostic de GVH grâce à l'histologie et l'immunohistochimie. Les biopsies de 2 patients (RAP : leucémie myeloïde chronique (LMC) ; REN leucémie aiguë myeloïde (LAM)) présentant des lésions compatibles avec une GVH ont été étudiées.

Les biopsies de peau congelées en OCT (Tissue-Tek,
MILES), fixées en acétone pendant 10 min à 4"C, sont coupées à froid à 5 pm. Les coupes de tissus sont saturées avec du sérum de cheval (kit Vectastin, VECTOR) pendant 20 min à température ambiante. Après un lavage en PBS, 2,5 pg de l'anticorps à tester sont déposés sur la coupe pendant 30 min à température ambiante. On rapporte les résultats d'expériences réalisées avec les anticorps anti-granzymes
GRA51D et GRA66D. Les lames sont lavées 3 fois en PBS puis incubées avec 50 pi d'anticorps anti Ig de souris biotinylés (kit Vectastin) pendant 30 min à température ambiante, puis avec de l'avidine mélangée à de la peroxidase biotinylée (kit Vectastin) pendant 1 heure à température ambiante.Après 2 lavages en PBS, la révélation est effectuée en incubant pendant 10 min à température ambiante la lame recouverte par 50 pl d'une solution contenant le substrat (1 pastille (10 mg) de diaminobenzidine, dissoute dans 10 ml de Tris 50 mM pH 7,6, mélangés extemporanément à 100 pi de H202 à 0,03 %). Les lames sont lavées et les coupes de tissus sont colorées par de l'Hémalun de Meyer pendant 1 min à température ambiante.

Les coupes de tissus sont lavées, déshydratées dans des bains d'éthanol (70 %, 90 % et 100 %), passées dans du toluène et montées avec une goutte de résine de montage.

L'analyse est faite en microscopie photonique.

On observe comme précédemment invitro, dans le cas des LGL, une coloration du cytoplasme des lymphocytes infiltrant la peau. Aucune coloration n'est obtenue avec l'anticorps contrôle utilisé comme témoin négatif.

De plus, la coloration indiquant la fixation des différents anticorps anti-granzymes se trouve être localisée au niveau des infiltrats lymphocytaires qui ont été caractérisés en immunohistochimie par les marqueurs membranaires de différenciation des lymphocytes (CD3, CD4,
CD8).

III - Production de perforine recombinante de souris.

Pour produire de la perforine recombinante de souris, on utilise un vecteur d'expression procaryote pAR3039 qui exprime les protéines sous le contrôle des signaux de transcription et de traduction du phage T 7 (voir Studier et al., : J. Mol. Biol., 189, 113-130, 1986).

On excise un fragment SmaI-EcoRV de 1400 pb d'un clone d'ADNc complet de perforine de souris. Ce segment code pour la partie C-terminale de la perforine de souris mature recouvrant les résidus 98 à 534 (voir figure unique).

L'extrémité franche du segment est ligaturée dans le site BamH1 du vecteur pAR3039 à l'aide de linkers phosphorylés (5'- CCG GAT CCGG-3').

Ce plasmide est appelé pAR3039-perf.

On transforme avec ce plasmide des bactéries
E.coli DE3 qui contiennent dans leur génome le gène de la polymérase T7 sous le contrôle d'un promoteur inductible
IPTG. Des bactéries correspondantes ont été déposées à la
C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n" I-1057.

La synthèse de la perforine recombinante est induite par IPTG dans les bactéries transformées.

On purifie la perforine recombinante de 45 kDa en lysant le culot bactérien (à partir de 100 ml de culture) avec 20 ml d'une solution contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d'EDTA et 10 Wug/ml de lypozyme pendant 12 heures sur de la glace.

Après addition de 1,5 ml de NaCl 5M et de 1,5 ml de NP-40 à 10 %, on maintient les bactéries lysées 20 minutes sur de la glace.

L'ADN bactérien est ensuite fragmenté par sonication et les corps d'inclusion protéiques sont centrifugés, 15 minutes à 12 000 t/min.

Le culot est lavé à trois reprises avec une solution de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM d'EDTA et 300 mM de NaCl et dissous dans du tampon SDS-PAGE.

La protéine recombinante de 45 kDa est séparée de la majorité des protéines bactériennes par SDS-PAGE (10 g de gel de polyacrylamide) et soumise à une électroélution en utilisant le dispositif d'élution de protéines ISCO.

On obtient en routine de 1 à 2 mg de perforine recombinante à partir de 100 ml de culture bactérienne.

IV - Production de l'anticorps monoclonal antiperforine CE2.10 1) Processus d'immunisation
Des rats mâles OFA sont immunisés par voie intrapéritonéale avec 50 pg de perforine recombinante murine (ou rMup) puis par une seconde injection, par voie intrapéritonéale, 3 semaines plus tard. 3 jours avant de prélever les splénocytes (pour la production d'hybridomes), on injecte 50 pg de rMuP dans la veine de la queue sans adjuvant.

2) Production d'hybridomes et sélection
En opérant comme décrit par Harlow et Lane dans
Cold Spring Harbor Laboratory - New-York, 1988, on réalise la fusion de cellules de myélome Sp2/0-Ag86 ne produisant pas d'immunoglobulines avec des splénocytes de rats immunisés avec la rMuP. Brièvement, les splénocytes sont récupérés en introduisant avec précaution dans les tissus de la rate avec une aiguille et une seringue du milieu RPMI dépourvu de sérum. Les splénocytes sont lavés avec le milieu comme effectué avec les cellules de myélome. 108 splénocytes sont alors mélangés avec 107 cellules de myélome dans un tube FALCON de 50 ml et soumis à centrifugation pendant 10 minutes à 1 000 t/min. On élimine autant de surnageant que possible.Les cellules sont remises en suspension en tapant doucement sur les parois du tube et on ajoute goutte à goutte 0,4 ml de polyéthylène glycol 1500 chaud 50 * (p/v) (PEG, Serva, cat. N" 33123) tout en maintenant le tube dans un bain marie à 37"C. Après l'addition de tout le PEG, le tube est maintenu à 37"C pendant 3 min puis centrifugé à 800 t/min pendant 5 min.

Sans enlever le surnageant, on ajoute 5 ml de milieu RPMI dépourvu de sérum (à 37"C) en 2 min, puis à nouveau 5 ml en une fois. Les cellules sont centrifugées à 1 000 t/min pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et on ajoute 50 ml d'un milieu RPMI complet - 5 % de FCS. La suspension cellulaire est distribuée dans dix plaques de 96 puits auxquelles on a ajouté au préalable des monocytes péritonéaux/macrophages (cellules nourricières) provenant de souris Balb/c (1 à 5 jours avant). Les plaques sont incubées à 37"C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de C02 pendant 24 heures, avant de remplacer le milieu avec un milieu frais cRPMI-5* FCS supplémenté avec 1 % de HAT (Gibco). On laisse les cellules croître pendant environ 10 jours. A ce stade, environ 70 % des puits comportent des clones qui se sont développés, beaucoup d'entr'eux possédant plus d'un seul clone. Environ 20 jours après la fusion, les cellules dans la majorité des puits contenant des hybridomes ont atteint une densité pratiquement maximale et 100 pl de chaque puits sont prélevées pour effectuer un test ELISA sur de la rMuP et de la perforine de murin native. Des hybridomes fortement positifs sont sous-clonés comme décrit dans l'article de Harlow dont question ci-dessus et soumis à une autre opération de sélection.

Sélection par test ELISA pour obtenir un anticorps monoclonal anti-perforine.

Des plaques de microtitration de 96 puits (Dynatech, MIC 2000) sont recouverts pendant environ 14 heures à 4"C avec 100 pl de rMuP (10 pg/ml dans PBS). En variante, les puits sont recouverts de granules dérivés de
CTL B6.1 de murin (solubilisés dans 1,5 M de NaCl, ultracentrifugês et dilués à 1/10 dans l'eau) ou de granules de cellules LAK humaines (solubilisés dans du phosphate 0,5 M, ultracentrifugés et dilués à 1/5 dans l'eau). Après lavage des puits à trois reprises avec PBS 0,02 % Tween-20, on ajoute 100 pl de surnageant d'hybridomes dans chaque puits en 2 h à température ambiante. Les puits sont lavés comme indiqué plus haut et on ajoute 50 pl d'immunoglobulines de chèvre anti-rat conjuguées à de la phosphatase alcaline (Sigma) en 1 heure.

Après le lavage, on ajoute 100 pi de substrat de phosphatase (p-nitrophényl phosphate, Sigma 104 tablettes) et on mesure le A405nm dès que la couleur commence à apparaître. Les puits témoins négatifs sont incubés avec cRPMI-5 % FCS au lieu d'être incubés avec des surnageants d'hybridomes. On récupère ainsi l'anticorps monoclonal anti-perforine désigné par l'abréviation CE2.10.

Claims (21)

REVENDICATIONS

1/ Anticorps dirigés contre les constituants des granules cytoplasmiques de cellules activées T "helper" ou de cellules cytotoxiques, plus spécialement des lymphocytes

T cytotoxiques et des cellules "natural killer", caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux capables de réagir spécifiquement avec un épitope d'un constituant donné de ces granules, sous forme native ou sous forme recombinante, en particulier un épitope de granzyme ou de perforine, sous forme native ou recombinante, en donnant lieu à un composé du type antigène-anticorps.

2/ Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'anticorps monoclonaux anti-granzyme ou anti-perforine humains.

3/ Anticorps selon la revendication 2, caractérisés en ce que les anticorps monoclonaux antigranzymes sont des anticorps monoclonaux anti-granzyme A, B ou H humains.

4/ Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils appartiennent à la classe des

IgG, qu'ils sont dirigés contre des protéines de poids moléculaire d'environ 25 à 30 kDa (granzyme B), 60 kDa (granzyme A) ou 66-75 kDa environ (perforine).

5/ Anticorps selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être induits par un procédé comprenant les étapes

- de fusion de cellules de myélome non sécréteur avec des cellules productrices d'anticorps dirigés contre un constituant donné de granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques ou de cellules T "helper", en particulier d'anticorps dirigés contre les granzymes ou la perforine.

- de purification des anticorps monoclonaux tels que produits par exemple à partir de liquides d'ascites ou de milieux de culture.

- de clonage de ces hybridomes, et

- de sélection de cellules hybrides capables de produire des anticorps spécifiques vis-à-vis desdits constituants,

6/ Anticorps monoclonaux anti-granzyme tels que sécrétés par les clones GRB 51D et GRA 66D déposés à la

CNCM sous les n" I-1060 et I-1059 le 12 mars 1991.

7/ Anticorps monoclonaux anti-perforine tels que sécrétés par le clone CE 2.10 déposé à la CNCM sous le n" 1-1058 le 12 mars 1991.

8/ Souches d'hybridomes caractérisées en ce qu'elles sont capables de sécréter des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications précédentes.

9/ Souches d'hybridomes selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules hybrides résultant de la fusion de cellules de myélome avec des cellules produisant des anticorps spécifiques après immunisation avec un constituant donné des granules cytoplasmiques de cellules cytotoxiques, plus spécialement avec des granzymes ou de la perforine purifiés.

10/ Clones producteurs d'anticorps monoclonaux anti-granzyme déposés à la CNCM sous les n" I-1060 et I1059 le 12 mars 1991.

11/ Clone producteur d'anticorps monoclonaux antiperforine, déposé à la CNCM sous le n" I-1058 le 12 mars 1991.

12/ Procédé pour la préparation d'un hybridome selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de fusion et de sélection définies dans la revendication 5.

13/ Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que les cellules de myélome sont des cellules de myéline NS1 et que les cellules productrices d'anticorps monoclonaux sont des splénocytes.

14/ Méthode de détection invitro de la présence de constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques, en particulier de granzymes ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend

- la mise en contact de l'échantillon provenant d'un patient susceptible d'être atteint d'une maladie s'accompagnant de l'exocytose desdits constituants, en particulier de granzyme ou de perforine, avec une préparation d'anticorps monoclonal ou d'un fragment de ce dernier, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 7, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, et la détection de la liaison immunologique.

15/ Kit pour la détection invitro de la présence des constituants des granules cytoplasmiques de cellules T "helper" ou de cellules cytotoxiques en particulier de granzyme ou de perforine dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend

- une phase solide appropriée servant de support pour le dosage, telle qu'une plaque de micro-titrage,

- une préparation d'anticorps monoclonal spécifique ou de fragment, libre ou immobilisé, comme défini dans l'une des revendications 1 à 7.

- des solutions tampons appropriées pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.

- un système de détection spécifique du marqueur,

- une préparation desdits constituants, plus spécialement de granzyme ou de perforine avec le cas échéant un groupe marqueur, et, lorsque la préparation ne comporte pas de groupe marqueur, une préparation d'un deuxième anticorps avec un tel groupe,

16/ Application des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à la détection de la présence de constituants des granules cytoplasmiques sécrétés par des cellules cytotoxiques.

17/ Protéines des granules cytoplasmiques des cellules T "helper" ou des cellules cytotoxiques, caractérisées en ce qu'il s'agit de protéines recombinantes reconnues par un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 7, telles qu'obtenues, par génie génétique, dans des hôtes cellulaires, notamment des bactéries, transformés par introduction de vecteurs d'expression, notamment de plasmides, renfermant des fragments de gène codant pour les séquences d'acides aminés recherchées.

18/ Fragments d'ADN caractérisés en ce qu'ils sont constitués par la séquence codante vis-à-vis d'une protéine selon la revendication 17, ou qu'ils comportent une telle séquence, et qu'ils sont le cas échéant incorporés dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide.

19/ Vecteurs d'expression notamment plasmide renfermant un fragment d'ADN selon la revendication 18, et hôtes cellulaires transformés par ces vecteurs, en particulier la souche d'E.coli transformée mPerf-PL 40 déposée à la

C.N.C.M. le 12 mars 1991 sous le n" I-1057.

20/ Perforine recombinante selon la revendication 17 telle qu'exprimée par le fragment SmaI-EcoRV de 1400 paires de base environ, excisé d'un clone d'ADNc de perforine.

21/ Perforine recombinante selon la revendication 20 correspondant à la séquence d'acides aminés allant de la position 98 à 534 sur la figure unique.