FR2666812A1 - Enzymes immobilisees, leur preparation et leur utilisation. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des enzymes immobilisées par adsorption sur des supports d'enzymes solides, les enzymes étant immobilisées par adsorption sur des particules de substances naturelles non modifiées présentant essentiellement un caractère cellulosique.

Description

L'invention concerne des enzymes immobilisées sur des particules de

substances naturelles présentant essentiellement un caractère de type cellulose, et qui conviennent en particulier à une utilisation dans des milieux organiques.

On s'était déjà rapidement rendu compte des avanta-

ges qu'apportait, en utilisation technique, la fixation d'enzymes sur un support Il convient ici de citer en premier lieu la réutilisabilité, qui le plus souvent ne

présente aucun problème, pour une perte d'activité habi-

tuellement plus faible; l'obtention de produits de réaction sans enzymes; et la possibilité d'une mise en

oeuvre continue du procédé Présente un caractère parti-

culièrement actuel l'immobilisation, quand des enzymes doivent être utilisées dans des milieux organiques (cf. A.M Klibanow et al dans Proc Nat Acad Sci USA 82,

3192 ( 1985); Kazandjian et al Biotechnology and Bio-

engineering vol XXVIII, pp 417-421 ( 1986).

Il s'agit alors, dans tous les cas, d'enzymes chè-

res (par exemple des lipases à haute spécificité, des

estérases, des phospholipases, etc), dont la réutilisa-

bilité représente une nécessité économique Le fait que,

dans les réactions en milieu organique, il soit néces-

saire d'avoir une faible quantité d'eau dans la zone de

réaction, joue alors aussi un rôle Grâce à son absorp-

tion d'eau, le plus souvent parfaitement définie (et que l'on peut déterminer essentiellement sous forme d'un

"gonflement"), un immobilisat permet d'ajuster avec pré-

cision la quantité nécessaire d'eau.

En règle générale, les réactions en milieu organi-

que exigent une surface interfaciale d'aire aussi élevée que possible entre l'enzyme et le milieu organique dans lequel se trouve le substrat Pour des conditions de réaction hétérogènes de ce genre, c'est un support sélectionné, ayant une aire géométrique aussi élevée que possible, qui représente le site réactionnel idéal En

revanche, dans la plupart des cas, les supports enzyma-

tiques pour réactions homogènes dans lesquels on tâche d'avoir une aire intérieure élevée (volume des pores) ne conviennent pas à ce mode de réaction. Comme il a déjà été dit, toute une gamme d'enzymes,

en particulier du type hydrolase, se sont révélées effi-

caces en milieu organique Eventuellement, on peut encore utiliser avec succès, en milieu organique, d'autres enzymes ou groupes d'enzymes A titre de représentants des conditions techniques préalables de la présente invention et de la problématique qui s'y rattache, il convient d'indiquer ci-après la classe des lipases (hydrolases des esters du glycérol, E C 3 1 1 3) (cf P. Gramatica dans -"Chimia oggi" 1989, p 9; M Schneider,

E.H Reimerdes dans Forum Mikrobiologie 9/87, p 302).

A l'aide de lipases immobilisées,on peut mettre en oeuvre dans un milieu organique, dans des conditions

appropriées, des transestérifications, des estérifica-

tions, des alcoolyses, des acidolyses et des hydrolyses.

Les réactions de ce genre jouent un rôle important dans l'industrie des matières grasses Il s'agit ici d'un procédé technique qui a fait ses preuves, et qui se fonde sur des processus chimiques étudiés d'une manière

approfondie.

Il n'existe essentiellement (encore) aucun besoin portant sur des processus biologiques correspondants, à moins que des spécifications très sévères (par exemple portant sur la pureté, la couleur, la stéréospécificité, etc) ne soient exigées du produit Il convient de citer deux produits, représentatifs d'enzymes spéciales de ce genre une Mucor mihei-Lipase adsorbée sur échangeurs d'ions (LIPOZYME(R) de la Société Novo), une lipase précipitée, par précipitation à l'acétone

sur une terre de diatomées (cf GB-C 1 577 933).

Jusqu'à maintenant, on n'a pas réussi à utiliser à l'échelle industrielle des enzymes de grande valeur (une

fois de plus, il conviendra de citer ici à titre d'exem-

ples les lipases), par lesquelles on aurait pu remplacer les procédés chimiques déjà bien établis; les raisons

en sont de deux ordres: tout d'abord, les données éco-

nomiques (les lipases sont trop chères, même après immo-

bilisation); ensuite, les difficiles conditions de

réaction (le plus souvent, il s'agit de systèmes hétéro-

gènes) Il ne faut donc pas être surpris du fait qu'au-

cun procédé industriel n'a émergé à ce jour des nombreu-

ses propositions de synthèses enzymatiques; de plus, le problème de la réutilisation de l'enzyme est pour une

grande part non résolu Il existait donc, comme tou-

jours, un besoin portant sur une lipase bon marché,

immobilisée sur un matériau support.

On a maintenant trouvé que des enzymes immobilisées

selon l'invention se rapprochent dans une mesure parti-

culière des exigences de la technique.

L'invention concerne des enzymes E, immobilisées par adsorption, appliquées sur des supports d'enzymes SE constitués de particules de substances naturelles non

modifiées, ayant essentiellement un caractère cellulosi-

que, comme la farine de bois, les fibres de cellulose et

les linters de coton.

Les particules de substances naturelles qui doivent être utilisées selon l'invention ont en règle générale une granulométrie de 0,01 à 1 mm Dans l'état actuel de la technique, on utilise d'autres moyens pour assurer la fixation. La cellulose et la lignine ont été décrites comme

étant des supports enzymatiques réactifs après une modi-

fication onéreuse, par exemple par oxydation au perio-

date et amination par voie de réduction (cf la demande

internationale PCT 81 02 860; Fengxie et ai, Biotech-

nol Letters vol 10, 221 ( 1988)) On trouve aussi, sous une forme très générale, une proposition d'utiliser une

liaison enzymatique covalente à de la cellulose dans GB-

A 1 407 488 Par exemple H Maeda et al, dans Biotech- nol Bioeng 20, 383 ( 1978), décrivent de la P-maltase

liée par liaison covalente à des perles de cellulose.

Pour ce qui est des supports enzymatiques SE selon l'invention, il s'agit, au contraire de l'état actuel de la technique, de particules de substances naturelles n'ayant pas subi de modification chimique Les fibres formant les particules de substances naturelles ne sont

donc chimiquement pas réactives.

Les enzymes (voir le paragraphe "Les Enzymes" ci-

après) sont de préférence appliquées sur le support

enzymatique SE à partir d'un milieu aqueux Avantageuse-

ment, on utilise alors la technique connue d'après DE-A 15 252, c'est-àdire le couplage en présence d'une concentration de sel relativement élevée, éventuellement aussi à des températures faiblement élevées Dans ce but, conviennent le mieux les sulfates et phosphates,

mais aussi d'autres sels relargables.

Cependant, l'utilisation des enzymes immobilisées

selon l'invention a lieu avantageusement en milieu orga-

nique (MO), de préférence en présence de traces d'eau.

On peut donner à titre indicatif une concentration de

0,0004 à 1 % en poids d'eau par rapport au milieu orga-

nique. Les enzymes (E)

On peut utiliser en tant qu'enzymes (E) à immobili-

ser les enzymes servant à une utilisation industrielle, notamment quand leur utilisation peut être effectuée en

milieu organique.

Il convient de citer en particulier les classes

suivantes: les hydrolases (par exemple E C 3, en parti-

culier E C 3 1; E C 3 2 1; E C 3 4), les isomérases

(par exemple E C 5, en particulier E C 5 3 1), les oxy-

doréductases (E C 1, en particulier E C 1 1; E C l 10;

E.C l ll; E C 1 13) et les transférases (E C 2, en par-

ticulier E C 2 1; E C 2 4) (Enzyme Nomenclature, Else- vier Scientific Publishing Company 1973; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3 ème éd, vol 9, 148-240, p 175-178 et suivantes, 1980) I 1 convient de citer tout spécialement par exemple les estérases (E C.

3 1 1), les protéases (E C 3 4 12; E C 3 4 21; E C 3.

4.22; E C 3 4 23; E C 3 4 24), les déhydrogénases (E.C 1 1 1, E C 1 1 3), les peroxydases (E C l 11 1), les glycosyltransférases (E C 2 4) et notamment les lipases (E C 3 1 1 3), les phospholipases de type A 2 (E C 3 1 1 4), de type B (E C 3 1 1 5), de type C (E C. 3.1 4 3) et de type D (E C 3 1 4 4), la glucose-oxydase

(E.C 1 1 3 4), la peroxydase (E C 1 11 1 6), la lipoxy-

dase (E C 1 13 11 12), les hexosyltransférases (E C 2.

4.1) et les pentoxytransférases (E C 2 4 2).

On peut dire en détail ce qui suit à propos des enzymes: A) Lipases (E C 3 1 1 3) Comme il est généralement d'usage, on appellera

lipases les carboxylestérases, qui normalement disso-

cient les esters du glycérol en émulsion aqueuse Elles se distinguent sur ce point d'autres carboxylestérases

qui dissocient le substrat en solution aqueuse.

a) Lipases pancréatiques Le complexe enzymatique du pancréas contient, outre

des lipases, surtout des estérases ainsi que des protéa-

ses et des amylases, constituants enzymatiques techni-

quement importants qui accompagnent les lipases L'opti-

mum de p H (par rapport à l'huile d'olive) est de 7-8,5;

l'intervalle d'activité correspond à p H 6,5-9,5.

Les lipases sont entre autres très instables, notamment vis-à-vis d'une dégradation protéolytique par

des protéases secondaires.

P) Lipases microbiologiques

Provenant par exemple de Pseudomonas fragi, Asper-

gillus sp (par exemple A luchuensis), Candida cyclin- dracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Penicillium sp (par exemple P chrysogenum,

P oxalicum), Rhizopus sp (R nigricans, R oryzae).

Ces lipases présentent en règle générale au moins

un optimum de p H à p H > 7,0 Dans la mesure o leur ins-

tabilité le permet, les lipases peuvent être utilisées

entre autres pour l'élimination des déchets, dans l'in-

dustrie du cuir et dans le secteur de l'alimentation.

Traditionnellement, on détermine l'activité des lipases avec de l'huile d'olive servant de substrat, ou

encore avec de la triacétine et de la tributyrine lcf.

M Sémériva et al, Biochemistry 10, 2143 ( 1971); Phar-

maceutical Enzymes, sous la direction de R Ruyssen et

A Lauwers 1978 (FIP)l.

Si l'activité lipolytique est exprimée en unités kilo-lipase (unité = KLCA), on travaillera, dans les

conditions standard ( 40 C, p H 5,5) avec de la tributy-

rine servant de substrat (cf M Sémériva, référence ci-dessus). B) Catalases/hydroperoxydases (E C 1 11 1 6)

a) Provenant de tissus animaux,par exemple le foie.

p) Provenant de plantes, par exemple du raifort.

) Provenant de microorganismes, par exemple de

Micrococcus lysodeicticus.

Les catalases sont habituellement utilisées pour le

blanchiment aux peroxydes et dans l'industrie laitière.

C) Protéases (E C 3 4; Kirk-Othmer, loc cit vol. 9, K Aunstrup dans B Spencer éd, Industrial Aspects of Biochemistry, vol 30 (I), pp 23-46, North Holland

1974).

a) D'origine animale, comme par exemple a) la rennine (E C 3 4 23 4), 3) les protéases pancréatiques: pancréatine, notamment trypsine, chymotrypsine (intervalle actif de p H environ 7-10) pepsine (E C 3 4 23 1) (intervalle d'activité p H environ 1,5-4,0) cathepsine (E C 3 4 23 5) (intervalle d'activité

p H environ 4,0-5,0).

b) D'origine végétale a) Papaïne (E C 3 4 22 1), intervalle d'activité p H environ 5,0-8,0 3) Ficine (E C 3 4 22 3), intervalle d'activité p H environ 4,0-9,0 Y) Bromélaine (E C 3 4 22 4 et 3 4 22 5),

intervalle d'activité p H environ 5,0-7,0.

c) D'origine microbienne (cf L Keay dans "Process Biochemistry", 1971, 17-21) a) provenant d'espèces de type Bacillus, comme B. subtilis, B licheniformis, B alkalophilus, B cereus,

B natto, B vulgatus, B mycoides.

p) provenant d'espèces de type Streptococcus Y) provenant d'espèces de type Streptomyces, comme Streptomyces fradiae, S griseus, S rectus d) provenant d'espèces de type Aspergillus, comme

Aspergillus flavus-oryzae, A niger, A saitoi, A usa-

mii ú) provenant d'espèces de type Mucor et Rhizopus, comme Mucor pusillus, M miehei ) provenant d'espèces de type Endothia, comme Endothia parasitica 1) provenant d'espèces de type Trametes, comme

Trametes sanguinea.

Outre une distinction selon leur origine, on trouve

aussi une distinction selon leur point d'action (exo-

enzymes contre endo-enzymes),et se fondant sur les sites

actifs des protéases (sérine;-protéases, qui sont inhi-

bées par le DFP, enzymes à sulfhydryle).

En outre, la relation entre l'activité enzymatique et le p H présente une grande importance pratique On distingue donc, surtout des points de vue pratiques, les protéases suivantes: i) Protéases alcalines, avec un optimum d'activité pour p H compris entre environ 7,5 et 13, notamment les protéases alcalines bactériennes (E C 3 4 21), qui pour

la plupart appartiennent au type sérine, et les protéa-

ses alcalines fongiques.

ii) Protéases neutres, ayant un optimum d'activité pour p H compris entre 6,0 et 9,0, en particulier les

protéases neutres bactériennes (E C 3 4 24), qui appar-

tiennent aux métallo-enzymes, et les protéases fongi-

ques, notamment les protéases de Bacillus, de Pseudomo-

nas, de Streptomyces, d'Aspergillus.

iii) Protéases acides, ayant un optimum d'activité pour p H compris entre 2,0 et 5,0 (E C 3 4 23), notamment les protéases acides fongiques, provenant par exemple de Rhizopus spp, d'Aspergillus spp, de Penicillium spp,

de Mucor spp et d'Impex lacteus et d'Endothitia parasi-

tica. Les protéases trouvent une utilisation industrielle entre autres dans les opérations suivantes: fabrication

du cuir, détergents, nettoyage, désencollage, fabrica-

tion des fromages, dégradation des viandes et stabilisa-

tion de la bière.

Il convient de citer en particulier, en tant que protéases alcalines, les subtilisines, les protéinases alcalines bactériennes du type sérine, stables à p H 9-10

et dans une certaine mesure insensibles aux perborates.

L'activité protéolytique des enzymes est habituellement déterminée par la méthode à l'hémoglobine-Anson (M L. Anson, J Gen Physiol 22, 79 ( 1939)), ou encore par la méthode Lôhlein-Volhard (die Lôhlein- Vohard'sche Methode

zur Bestimmung der proteolytischen Aktivitât Gerberei-

chem Taschenbuch Dresde-Leipzig, 1955), en unités "LVE" (unités Lôhlein-Volhard) On entend par unité

Lôhlein-Volhard la quantité d'enzyme qui, dans les con-

ditions spécifiques de la méthode, digère 1,725 mg de caséine En outre, on utilise ci-après, pour déterminer l'activité des enzymes actives à p H acide, des unités

qui dérivent de la méthode d'Anson On les appelle "uni-

tés de protéinase (hémoglobine)" U Hb Une U Hb correspond à la quantité d'enzyme qui catalyse la libération de

fragments d'hémoglobine, solubles dans l'acide trichlor-

acétique, équivalent à 1 pmole de tyrosine par minute à 37 C (la mesure étant effectuée à 280 nm) ( 1 m U Hb = 10-3

U Hb).

D) Phospholipases On entend par phospholipases, comme il est d'usage, le groupe des hydrolases qui provoquent une dissociation hydrolytique des phospholipides, et plus précisément la liaison ester d'acide carboxylique (phospholipases A et

B) ou la liaison ester d'acide phosphorique (phospholi-

pases C et D) Les phospholipases qui dissocient la

lécithine sont aussi appelées des lécithinases.

La distinction se fait généralement selon le point d'attaque Les phospholipases A séparent de la lécithine (ou de la céphaline) un acide gras, avec comme résidu la lysolécithine (ou la lysocéphaline) La phospholipase dissocie les acides gras terminaux La phospholipase A 2 (E C 3 1 1 4) dissocie les acides gras centraux, le plus

souvent non saturés, qui dans le cas de l'acide arachi-

donique peuvent être métabolisés en prostaglandines.

Les sources de phospholipase A 2 sont par exemple le

pancréas,le venin des insectes et le venin des serpents.

La phospholipase B (E C 3 1 1 5) dissocie des acides gras à partir de la lysolécithine, avec formation de l'ester cholique de l'acide glycérophosphorique On la trouve par exemple dans des glucides comme le son de riz, le malt, les céréales, les pommes de terre, les pois, ainsi que dans les moisissures et dans le

venin de guêpe.

La phospholipase C (E C 3 1 4 3) attaque la léci-

thine avec formation de phosphorylcholine On la trouve par exemple dans Bacillus cereus, dans le cerveau et

dans le venin de serpent.

La phospholipase D (E C 3 1 4 4) permet d'obtenir de la choline à partir de la lécithine et, en tant que

produit supplémentaire de dissociation, de l'acide phos-

phatidique On peut l'obtenir par exemple à partir de Streptomyces chromofuscus On la trouve en outre dans les plantes foliaires, comme le choux, l'épinard, les feuilles de betterave à sucre, Hevea brasiliensis, mais aussi dans les plantules de céréales, le malt d'orge, etc. En général, l'optimum de p H est d'environ 8,0 pour les types C et D, et essentiellement de 5 à 6 pour les

autres types.

(cf E A Dennis, dans P D Boyer (Ed) The Enzy-

mes, 3 ème édition, vol 16, p 307-353, Academic Press

1984; pour l'analytique: cf Vurioka & Matsuda, Anal.

Biochem 75, 281 ( 1976)).

Les supports enzymatiques (SE)

Les supports enzymatiques selon l'invention repré-

sentent, comme il a été dit ci-dessus, des particules de

substances naturelles non modifiées ayant essentielle-

ment un caractère cellulosique On entend ici par "non modifiées" le fait qu'elles n'ont subi aucune conversion chimique, et notamment aucune activation de quelque nature que ce soit On peut citer à titre d'exemples en particulier la farine de bois, les fibres de cellulose, il les linters de coton, etc Habituellement, les supports enzymatiques destinés à être utilisés selon l'invention sont de ce fait constitués de fibres ou représentent des particules fibreuses En règle générale, les particules de substances naturelles destinées à être utilisées

selon l'invention ont une grosseur de particule de 0,01-

1 mm (o il convient de penser à chacun des axes spa-

tiaux pouvant traverser chaque particule individuelle).

Le processus d'immobilisation

Les enzymes sont avantageusement appliquées à par-

tir d'une solution aqueuse sur les supports enzymatiques SE A titre indicatif, on peut donner un rapport enzyme/ eau d'environ 1:( 10-20) La solution aqueuse peut encore contenir avantageusement des additifs connus en soi des formulations enzymatiques, comme des stabilisants, des agents de fixation tels par exemple que le sulfate de sodium On peut donner à titre indicatif pour la teneur en sel environ 1/5-1/15 de la teneur en eau Il s'est avéré avantageux de dissoudre d'abord l'enzyme dans l'eau, puis d'ajouter par exemple le sulfate de sodium et finalement les particules de substances naturelles, par exemple sous forme de farine de bois On laisse l 1 enzyme se fixer sur le support enzymatique pendant un certain temps, habituellement d'environ 20 heures, tout

en mélangeant d'une manière intime par exemple par agi-

tation, auquel cas il est souvent recommandé, selon les

enzymes utilisées, de travailler à une température supé-

rieure à la température ambiante, par exemple à 400 C. Finalement, on filtre à la trompe et on sèche le support

enzymatique SE chargé.

Le milieu organique MO Le milieu organique MO est avantageusement adapté aux buts et aux conditions du procédé Il peut être constitué uniquement des substances participant à la

réaction, par exemple, dans le cas d'une transestérifi-

cation de matières grasses, du mélange de graisses pro-

prement dit Mais le substrat peut aussi être dilué avec des solvants organiques On a obtenu de bons résultats

avec des hydrocarbures, notamment des hydrocarbures ali-

phatiques ou cycloaliphatiques ayant 16 à 18 atomes de carbone, comme par exemple l'heptane, l'isooctane, l'hexadécane, le cyclohexane, éventuellement aussi le toluène. Quand on utilise des lipases, entrent aussi en ligne de compte des solvants du type éther, comme par exemple l'oxyde de diéthyle ou l'oxyde d'isopropyle,

notamment dans le cas des lipases pancréatiques.

En revanche, les solvants organiques fortement polaires et pratiques sont moins intéressants, ce qui semble confirmer la tendance, observée par -ailleurs, à une diminution de l'activité enzymatique quand augmente

la miscibilité à l'eau.

Effets avantageux

D'après l'expérience acquise, on obtient un charge-

ment très satisfaisant des supports enzymatiques SE par les enzymes Dans le cas du chargement par une lipase,

on a retrouvé par exemple dans le filtrat de l'immobili-

sat < 1 % de l'activité initiale, c'est-à-dire que, d'un point de vue pratique, il y a eu fixation de la totalité

des enzymes utilisées.

Comme on peut le voir directement, les enzymes fixées selon l'invention aux supports enzymatiques SE conviennent essentiellement à une utilisation dans le

milieu organique MO, avantageusement en présence de fai-

bles quantités d'eau (environ 0,004-1 % en poids) On

peut ainsi éviter d'une manière efficace la désorption.

Les supports enzymatiques selon l'invention conviennent en règle générale essentiellement à une utilisation dans des procédés discontinus, car un garnissage convenable de colonnes par les supports enzymatiques SE présente

des difficultés.

Les enzymes immobilisées selon l'invention convien-

nent parfaitement, selon l'expérience acquise, à la mise en oeuvre de réactions à catalyse enzymatique, selon leur activité connue. C'est ainsi que l'on peut par exemple mettre en

oeuvre avec des lipases immobilisées, d'une manière con-

nue en soi, des transestérifications, des estérifica-

tions, des alcoolyses, des acidolyses et des hydrolyses.

Présente entre autres un intérêt particulier la possibi-

lité d'une hydrolyse sélective, éventuellement avec con-

servation ou production de centres optiquement actifs.

Exemples

A Immobilisation d'enzymes A 1 Immobilisation de lipases On mélange 250 g de farine de bois (produit de la Sté Rettenmeier) de granulométrie environ 100 pm à 250 g d'une lipase dérivant de Pseudomonas (activité 20 000 LCA/g, produit DEGOMMA(R) 7101 de la Sté Rôhm Gmb H) dans 3750 g d'eau contenant 588 g de sulfate de sodium,

et on agite pendant 20 heures à 40 'C Lors de la prépa-

ration de la masse réactionnelle, il s'est avéré avanta-

geux de dissoudre d'abord les lipases dans l'eau, puis d'ajouter le sel et finalement la farine de bois Puis

on filtre à la trompe et on sèche Activité de 1 'immobi-

lisat: 6000 LCA/g de poids sec On retrouve dans le

filtrat de l'immobilisat < 1 % de l'activité.

B Utilisation des enzymes immobilisées B.1 Trans-estérification On agite pendant 2 h à 50 'C dans un mélange de 0,8 g de tristéarine dans 40 g de myristate d'isopropyle 1 g de lipase immobilisée (Exemple A 1) La teneur en eau est faible: 8,3 % dans l'immobilisat; le substrat a

donc été séché au préalable.

* Au bout de 2 h, la teneur en tristéarine est tombée à 5 % de la valeur initiale, ce qui correspond à un taux de conversion de 95 % Une analyse par chromatographie en phase gazeuse montre qu'environ 40 % sont constitués de produits de transestérification, tel que par exemple la trimyristine, 55 % étant constitués de produits

d'hydrolyse, comme différents mono et diglycérides.

B.2 Transestérification énantio-sélective A une solution sous faible agitation de 1,11 g de 2-O-benzylglycérol ( 6,1 mmoles) dans 20 ml d'oxyde de tert-butyle et de méthyle (= 0,3 mole/l), on ajoute à la température ambiante 2 ml d'acétate de vinyle ( 1,82 g, 18,2 mmoles) et 100 mg de lipase immobilisée (Exemple

1) On suit l'évolution de la réaction par chromatogra-

phie sur couche mince (cyclohexane/acétate d'éthyle = 1/1 sur plaques de gel de silice, rf (diol) = 0,10, rf (acétate) = 0,32) Lors de la première utilisation de l'enzyme, on atteint au bout de 6 heures une conversion totale (si on utilise l'enzyme huit fois, la durée nécessaire de réaction s'élève en continu à environ 12 heures) Quand la réaction est terminée, on isole l'enzyme par filtration, on la lave avec de l'oxyde de tert-butyle et de méthyle et on concentre les filtrats combinés, à l'aide d'un évaporateur rotatif On obtient

sous forme d'une huile le produit très pur (S)-l-acétyl-

oxy-2-benzyloxy-propanol-3.

(S)-l-acétyloxy-2-benzyloxy-propanol-3 C 12 H 1604, masse moléculaire 224,26 g/mole Pouvoir rotatoire (c = 2, T = 20 C): CH C 13 Ethanol lal lal 589 nm -17,3 + 12,2 578 nm -18,1 + 12,7 546 nm -20,3 + 14,6 436 nm -34,6 + 25,1 365 nm - 54,1 + 39,6 Il ressort d'une comparaison avec les pouvoirs rotatoires indiqués dans la littérature (Y Terao, M. Murata, K Achiwa, T Nishio, M Akamtsu, M Kamimura, Tetrahedron Lett 29 ( 1988) 5173) que le produit est présent avec un excès d'énantiomères (ee) de 86 %.

Immobilisation sur farine de bois.

A.2 Immobilisation de la phospholipase A 2 On dissout dans 4000 1 d'eau à laquelle on a ajouté

après coup 400 g de sulfate d'ammonium 17,5 g d'une phos-

pholipase A 2 (Lécitase 10 L de la Sté Novo-Nordisk, 10 000 UI/ml*) (* 1 unité internationale de phospholipase A 2 est définie par la quantité d'enzyme qui dissocie de la lécithine 1 pmole d'acide gras libre par minute) On introduit dans cette solution 250 g d'une farine de bois

"Lignocel C 120 " de la Sté Rettenmeier, ayant une gra-

nulométrie d'environ 100 pm La suspension est agitée à

la température ambiante pendant 2 heures.

Puis on filtre à la trompe (sans lavage ultérieur) et on sèche avec précaution (à 40 C jusqu'au lendemain

en étuve sèchesous vide).

On ne retrouve pratiquement aucune activité enzyma-

tique dans le filtrat de l'immobilisat Le support pro-

prement dit fait l'objet d'un contrôle d'activité par la

"méthode du jaune d'oeuf" (jaune d'oeuf servant de subs-

trat, 40 C, p H 8) Il possède 212 UI/g, ce qui correspond

à un rendement d'activité de 30,3 %.

Cette enzyme convient par exemple à la dissociation de la lécithine après addition de faibles quantités d'eau dans une huile (par exemple une huile de soja

brute).

A.3 Immobilisation de la glucose-oxydase (GOD)/ catalase On procède comme dans l'Exemple A 2, sauf que l'on

utilise en tant qu'enzyme 10 ml de glucose-oxydase/cata-

lase provenant d'Aspergillus, ayant une activité GOD de 850 Unités*/ml (* 1 unité GOD/ml est définie par la quantité d'enzyme qui libère par minute 1 pmole d'acide

gluconique ( 37 C, p H 5,5).

Dans le filtrat, après couplage de l'enzyme, on ne retrouve que des traces de l'enzyme L'activité du sup- port est de 20 unités, ce qui correspond à un rendement

d'activité de 59 %.

Grâce à sa teneur en catalase, le support peut être utilisé pour éliminer H 202 dans une solution diluée de désinfectant Dans ce but, on l'introduitdans un lit en écoulement d'une colonne (écoulement descendant) La destruction du H 202 peut être facilement reconnue par la

formation de petites bulles de gaz (oxygène).

A.4 Immobilisation de protéinase alcaline sur de la poudre de cellulose On dissout 4 g d'une protéinase alcaline provenant de B licheniformis (Alcalase 2 0 T de Novo Nordisk) dans 4 1 d'un tampon phosphate 1 M p H 8,0 Puis on ajoute 400 g d'une poudre de cellulose ayant un volume

apparent de 3 l/hg (Sté Rettenmeier), et on agite pen-

dant 1 h à 40 C Puis la suspension de poudre de cellu-

lose est filtrée à la trompe sans lavage, et séchée avec

précaution à 40 C en étuve sèche sous vide.

On retrouve dans le filtrat < 7 % de l'activité

enzymatique initiale La quantité principale est adsor-

bée par la poudre de cellulose ( 81 % de l'enzyme utili-

sée).

La mesure a été effectuée ici en unités Lôhlein-

Vollhard (ULV)*.

Alcalase 2 0 T 140 000 ULV/g Solution à 0,1 % 140 ULV/g Filtrat après couplage < 10 ULV/g (= < 7 % de l'activité initiale) Activité sur le support 113 ULV/g (= rendement d'activité de 81 %) Cette enzyme convient par exemple aux synthèses

d'esters stéréospécifiques dans un milieu organique.

A.5 Immobilisation du complexe enzymatique du pan-

créas On procède comme dans l'Exemple A 2, sauf que l'on

utilise comme enzyme 10 g d'enzyme pancréatique (Coro-

lase PP, Rôhm Enzymtechnologie, activité indicative 220

000 ULV).

Dans le filtrat, on ne retrouve après couplage de

l'enzyme que des traces de l'enzyme L'activité du sup-

port a été mesurée à 4000 ULV, ce qui correspond à un

rendement d'activité de 45 %.

Grâce à sa teneur en chymotrypsine (env 10 % des

protéinases), cette enzyme immobilisée convient parfai-

tement à la synthèse des esters en milieu organique.

Claims (9)

Revendications

1 Enzymes immobilisées par adsorption sur des sup-

ports enzymatiques solides, caractérisées en ce que les

enzymes sont immobilisées par adsorption sur des sup-

ports enzymatiques SE constitués de particules de subs- tances naturelles non modifiées ayant essentiellement un

caractère cellulosique.

2 Enzymes immobilisées par adsorption sur des sup-

ports enzymatiques solides, caractérisées en ce que les supports enzymatiques SE sont choisis dans le groupe comprenant la farine de bois, les fibres de cellulose et

les linters de coton.

3 Enzymes immobilisées par adsorption sur des sup-

ports enzymatiques solides selon la revendication 2, caractérisées en ce que les particules de substances

naturelles ont une granulométrie de 0,01-1 mm.

4 Enzymes immobilisées par adsorption sur des sup-

ports enzymatiques solides selon les revendications 1 à

3, caractérisées en ce que les enzymes sont choisies

dans la classe des hydrolases, des isomérases, des oxy-

doréductases et des transférases.

Enzymes immobilisées par adsorption sur des sup- ports enzymatiques solides selon la revendication 4, caractérisées en ce que les enzymes représentent des

lipases (E C 3 1 1 3).

6 Enzymes immobilisées par adsorption sur des sup-

ports enzymatiques solides selon la revendication 4, caractérisées en ce que les enzymes représentent des

protéases (E C 3 4).

7 Enzymes immobilisées par adsorption sur des sup-

ports enzymatiques solides selon la revendication 4, caractérisées en ce que les enzymes représentent des

catalases (E C 1 11 1 6).

8 Procédé de préparation d'enzymes immobilisées

par adsorption sur des supports enzymatiques SE, carac-

térisé en ce qu'on fait fixer les enzymes, à partir d'un milieu aqueux, sur des particules de substances naturel- les non modifiées ayant essentiellement un caractère cellulosique. 5 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le milieu aqueux contient de 1/5 à 1/15 de son

poids d'un sel de fixation.

Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on utilise comme sel de fixation du sulfate de

sodium.

11 Utilisation des enzymes immobilisées par adsorption sur des supports enzymatiques solides SE

selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on uti-

lise comme milieu réactionnel un milieu organique MO.

12 Utilisation des enzymes immobilisées par adsorption sur des supports enzymatiques solides selon

les revendications 1, 5 et 11, caractérisée en ce qu'on

met en oeuvre une transestérification énantio-sélective.