FR2659350A1

FR2659350A1 - NUCLEOTIDE SEQUENCES DERIVED FROM THE GENOMIC RNA OF VIRAL HEMORRHAGIC SEPTICEMIA VIRUS, APPLICATIONS TO THE SYNTHESIS OR DETECTION OF NUCLEIC ACIDS, PRODUCTS FOR EXPRESSING SUCH SEQUENCES AND APPLICATION OF SAID PRODUCTS TO PREVENTION AND DIIAGNOSIS OF HEMISPHERIC DISEASE VIRAL.

Info

Publication number: FR2659350A1
Application number: FR9003091A
Authority: FR
Inventors: Bernard Jacqueline; Lecoq-Xhonneux Florence; Thiry Michel; De Kinkelin Pierre
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1990-03-12
Filing date: 1990-03-12
Publication date: 1991-09-13
Also published as: WO1991013987A2; WO1991013987A3

Abstract

Nucleotidic sequences from the viral haemorrhagic septicaemia (VHS) virus, transcription products of the genomic RNA of said virus, use of said sequences as probes or triggers and for the expression of the nucleoprotein N and/or its fragments, plasmides useful for said expression and use of the expressed nucleoprotein and/or its fragments as an immunogenic agent, especially for the prevention of viral haemorrhagic septicaemia. Application of said sequences to the detection of viral haemorrhagic septicaemia and the obtaining of genetically modified animals. The nucleotidic sequence from the genomic RNA of the VHS virus comprises the coding gene for the nucleoprotein N, corresponds to the messenger RNA and comprises about 1346 nucleotides.

Description

La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques issues du virus de la septicémie hémorragique virale (virus SHV), aux produits de transcription de liARN génomique dudit virus, à l'utilisation desdites séquences comme sondes ou comme amorces et pour l'expression de la nucléoprotéine N et/ou des fragments de celle-ci, aux plasmides utiles pour ladite expression ainsi qu'à l'utilisation de la nucléoprotéine exprimée et/ou de ses fragments comme agent à pouvoir immunogène, notamment pour la prévention de la septicémie hémorragique virale. The present invention relates to nucleotide sequences derived from the viral hemorrhagic septicemia virus (VHS virus), to the genomic RNA transcripts of said virus, to the use of said sequences as probes or as primers and for the expression of the nucleoprotein N and / or fragments thereof, to the plasmids useful for said expression as well as to the use of the expressed nucleoprotein and / or of its fragments as an agent with immunogenic power, in particular for the prevention of viral haemorrhagic septicemia .

La présente invention est également relative à un test de dépistage de la septicémie hémorragique virale. Le virus de la septicémie hémorragique virale (VHS-V ou virus SHV) des salmonidés est responsable d'une perte annuelle moyenne de 15 000 tonnes pour la trutticulture européenne. Ce virus appartient à la famille des
Rhaboviridae, genre Lyssavirus.The present invention also relates to a screening test for viral haemorrhagic septicemia. The viral haemorrhagic septicemia virus (HSV-V or VHS virus) of salmonids is responsible for an average annual loss of 15,000 tonnes for European trutticulture. This virus belongs to the family of
Rhaboviridae, genus Lyssavirus.

Il est connu que ce virus n inhibe pas complètement les synthèses des cellules hôtes en dépit du fait que le rendement en particules virales est élevé. Il est également connu que l'ARN viral génomique, à polarité négative, est transcrit séquentiellement, l'ordre des gènes de 3' en 5', étant similaire à celui des autres membres de la famille, à savoir N, M1, M2, G et L (BERNARD J. et al., Ann Inst. Pasteur/virol., 1985, 136E, 213-222)
Il a également été montré que la protéine N est phosphorylée et que son poids moléculaire relatif, déterminé par SDS-Page, varie de 38 000 à 62 000 daltons, selon les Auteurs (A. DEUTER et al., J. VET. MED.,1986, 33, 36-46). It is known that this virus does not completely inhibit the synthesis of host cells despite the fact that the yield of viral particles is high. It is also known that the genomic viral RNA, with negative polarity, is transcribed sequentially, the order of the genes from 3 ′ to 5 ′, being similar to that of the other members of the family, namely N, M1, M2, G and L (BERNARD J. et al., Ann Inst. Pasteur / virol., 1985, 136E, 213-222)
It has also been shown that protein N is phosphorylated and that its relative molecular weight, determined by SDS-Page, varies from 38,000 to 62,000 daltons, according to the Authors (A. DEUTER et al., J. VET. MED. , 1986, 33, 36-46).

Au cours des dernières années, ont été isolés et étudiés essentiellement les Rh abdo virus apparentés au virus de la rage ; notamment un certain nombre de docu ment s décrivent des séquences nucléotidiques de ces différents Rhabdovirus ainsi que leurs applications (TORDO
N. et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, 1986, 83, 39143918). Cependant, en ce qui concerne les maladies à virus des poissons, peu d'études ont été réalisées, alors que l'incidence économique de ces maladies est très importante.In recent years, Rh abdo viruses related to the rabies virus have been isolated and studied mainly; in particular a certain number of documents describe the nucleotide sequences of these different Rhabdoviruses as well as their applications (TORDO
N. et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, 1986, 83, 39143918). However, with regard to fish virus diseases, few studies have been carried out, although the economic impact of these diseases is very high.

En particulier, aucune détection efficace, rapide et simple du virus, ni aucune prévention de la septicémie hémorragique virale ne permet, à l'heure actuelle, de surveiller et de protéger les Salmonidés d' Europe. In particular, no effective, rapid and simple detection of the virus, nor any prevention of viral haemorrhagic septicemia makes it possible, at present, to monitor and protect the European Salmonids.

La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une composition à pouvoir immunogène et/ou protecteur, spécifique du virus de la septicémie hémorragique virale, obtenue en exprimant un antigène viral, notamment la nucléoprotéine N et/ou un fragment de celle-ci, impliqué dans la réponse immunitaire, l'obtention par génie génétique ayant pour avantage de résoudre les problèmes de production de virus. The present invention has therefore set itself the aim of providing a composition with immunogenic and / or protective power, specific for the viral hemorrhagic septicemia virus, obtained by expressing a viral antigen, in particular nucleoprotein N and / or a fragment of the latter, involved in the immune response, obtaining by genetic engineering having the advantage of solving the problems of virus production.

C'est également un but de l'invention de pourvoir à des sondes et des amorces nucléotidiques pour la détection spécifique dudit virus. It is also an object of the invention to provide probes and nucleotide primers for the specific detection of said virus.

La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique issue de l'ARN génomique du virus de la septicémie hémorragique virale (SHV), caractérisée en ce qu'elle comprend le gène codant pour la nucléoprotéine N et en ce qu'elle comporte environ 1346 nucléotides ; cette séquence correspond à 1'ARN messager. The subject of the present invention is a nucleotide sequence derived from the genomic RNA of the viral hemorrhagic septicemia virus (VHS), characterized in that it comprises the gene coding for nucleoprotein N and in that it comprises approximately 1346 nucleotides ; this sequence corresponds to messenger RNA.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence, celle-ci comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en amino-acides de formule I ci-après
C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46
Met 1
CAG AGT CAT ATC TCA TAA TCG TTG AAC AAA AGA ACT CAG TCG AAG ATG 94
Glu Gly Gly lie Arg Ala Ala Phe Ser Gly Leu Asn Asp Val Arg lie 17
GAA GGA GGA ATT CGT GCA GCG TTT TCA GGC CTG AAT GAT GTT AGG ATT 142
Asp Pro Thr Gly Gly Glu Gly Arg Val Leu Val Pro Gly Glu Val Glu 33
GAC CCC ACC GGT GGA GAG GGA CGG GTA CTT GTA CCT GGT GAA GTG GAG 190
Leu lie Val Tyr Val Gly Glu Phe Gly Glu Glu Asp Arg Lys Val lie 49
CTC ATC GTG TAT GTT GGT GAA TTT GGT GAG GAA GAT AGG AAG GTG ATT 238
Val Asp Ala Leu Ser Ala Leu Gly Gly Pro Gln Thr Val Gln Ala Leu 65
GTG GAT GCA CTC TCC GCA CTC GGG GGA CCC CAG ACT GTA CAG GCG TTG 286
Ser Val Leu Leu Ser Tyr Val Leu Gln Gly Asn Thr Gln Glu Asp Leu 81
TCC GTG CTT CTC TCC TAT GTA CTC CAA GGG AAC ACA CAG GAG GAC CTA 334
Glu Thr Lys Cys Lys Val Leu Thr Asp Met Gly Phe Lys Val Thr Gln 97
GAA ACA AAG TGC AAG GTC CTC ACA GAC ATG GGC TTC AAG GTG ACA CAG 382
Ala Val Arg Ala Thr Ser Ile Glu Ala Gly Ile Met Met Pro Met Arg 113
GCA GTC AGG GCC ACG AGC ATC GAG GCG GGA ATC ATG ATG CCC ATG AGA 430
Glu Leu Ala Leu Thr Val Asn Asp Asp Asn Leu Met Glu lie Val Lys 129
GAA CTG GCC CTG ACT GTC AAT GAC GAC AAC CTC ATG GAA ATC GTC AAG 478
Gly Thr Leu Met Thr Cys Ser Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Val Asp Lys 145
GGG ACC TTG ATG ACA TGC TCC CTT CTT ACC AAG TAC TCG GTG GAC AAG 526
Met Ile Lys Tyr lie Thr Lys Lys Leu Gly Glu Leu Ala Asp Thr Gln 161
ATG ATC AAG TAC ATC ACC AAG AAA CTC GGG GAG CTG GCA GAC ACC CAG 574
Gly Val Gly Glu Leu Gln His Phe Thr Ala Asp Lys Ala Ala Ile Arg 177
GGA GTT GGG GAA CTG CAG CAC TTC ACC GCT GAC AAG GCA GCC ATC AGG 622
Lys Leu Ala Gly Cys Val Arg Pro Gly Gln Lys lie Thr Lys Ala Leu 193
AAA CTC GCA GGG TGT GTG CGT CCC GGG CAG AAG ATC ACC AAG GCC CTC 670
Tyr Ala Phe lie Leu Thr Glu lie Ala Asp Pro Thr Thr Gln Ser Arg 209
TAT GCG TTC ATC CTG ACT GAG ATC GCA GAC CCC ACC ACC CAG TCG AGG 718
Val Pro Ser Met Gly Ala Leu Arg Leu Asn Gly Thr Gly Met Thr Met 225
GTC CCG AGC ATG GGG GCG TTG AGA CTC AAC GGG ACA GGA ATG ACC ATG 766
Ile Gly Leu Phe Thr Gln Ala Ala Asn Asn Leu Gly Ile Ala Pro Ala 241
ATT GGG TTG TTC ACC CAG GCC GCC AAC AAC TTG GGC ATT GCC CCG GCA 814
Lys Leu Leu Glu Asp Leu Cys Met Glu Ser Leu Val Glu Ser Ala Arg 257
AAG CTG CTG GAG GAC CTC TGC ATG GAG TCC CTG GTT GAG TCA GCC AGA 862
Arg lie lie Gln Leu Met Arg Gln Val Ser Glu Ala Lys Ser Ile Gln 273
CGG ATC ATC CAG TTG ATG AGA CAG GTG TCA GAG GCG AAG TCC ATC CAA 910
Glu Arg Tyr Ala lie Met Met Ser Arg Met Leu Gly Glu Ser Tyr Tyr 289
GAG CGC TAC GCC ATC ATG ATG AGT CGG ATG CTG GGA GAG TCC TAC TAC 958
Lys Ser Tyr Gly Leu Asn Asp Asn Ser Lys lie Ser Tyr lie Leu Ser 305
AAG TCG TAT GGA CTC AAT GAC AAC TCC AAG ATC TCT TAC ATT CTG TCA 1006
Gln Ile Ser Gly Lys Tyr Ala Val Asp Ser Leu Glu Gly Leu Glu Gly 321
CAG ATC AGT GGG AAG TAC GCA GTG GAC TCC CTG GAA GGC CTG GAG GGG 1054
Ile Lys Val Thr Glu Lys Phe Arg Glu Phe Ala Glu Leu Val Ala Glu 337
ATC AAG GTG ACA GAG AAG TTC CGC GAG TTC GCT GAG CTT GTT GCA GAA 1102
Val Leu Val Asp Lys Tyr Glu Arg lie Gly Glu Asp Ser Thr Glu Val 353
GTC CTG GTG GAC AAG TAC GAG AGG ATT GGA GAG GAC AGC ACG GAG GTC 1150
Ser Asp Val Ile Arg Glu Ala Ala Arg Gln His Ala Arg Arg Thr Ser 369
TCA GAT GTC ATC AGG GAG GCG GCC AGA CAG CAC GCG CGC AGG ACA TCT 1198
Ala Lys Pro Glu Pro Lys Ala Arg Asn Phe Arg Ser Ser Thr Gly Arg 385
GCC AAG CCA GAG CCA AAG GCC CGC AAC TTC AGG AGC TCC ACC GGA AGG 1246
Gly Arg Glu Gln Glu Thr Gly Glu Ser Asp Asp Asp Asp Tyr Pro Glu 401
GGA AGG GAG CAG GAG ACG GGG GAG TCC GAT GAT GAC GAC TAC CCC GAG 1294
Asp Ser Asp ***
GAC TCT GAC TAA AAG GCA CTC CCG TCT CAT AAC CAA CAT AGA TAG AAA 1342
AAA A ainsi que les séquences dérivées de celle-ci et les fragments de ladite séquence et des séquences dérivées. According to an advantageous embodiment of said sequence, it comprises the sequence in nucleotides and the deduced sequence in amino acids of formula I below
C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46
Puts 1
CAG AGT CAT ATC TCA TAA TCG TTG AAC AAA AGA ACT CAG TCG AAG ATG 94
Glu Gly Gly lie Arg Ala Ala Phe Ser Gly Leu Asn Asp Val Arg lie 17
GAA GGA GGA ATT CGT GCA GCG TTT TCA GGC CTG AAT GAT GTT AGG ATT 142
Asp Pro Thr Gly Gly Glu Gly Arg Val Leu Val Pro Gly Glu Val Glu 33
GAC CCC ACC GGT GGA GAG GGA CGG GTA CTT GTA CCT GGT GAA GTG GAG 190
Leu lie Val Tyr Val Gly Glu Phe Gly Glu Glu Asp Arg Lys Val lie 49
CTC ATC GTG TAT GTT GGT GAA TTT GGT GAG GAA GAT AGG AAG GTG ATT 238
Val Asp Ala Leu Ser Ala Leu Gly Gly Pro Gln Thr Val Gln Ala Leu 65
GTG GAT GCA CTC TCC GCA CTC GGG GGA CCC CAG ACT GTA CAG GCG TTG 286
Ser Val Leu Leu Ser Tyr Val Leu Gln Gly Asn Thr Gln Glu Asp Leu 81
TCC GTG CTT CTC TCC TAT GTA CTC CAA GGG AAC ACA CAG GAG GAC CTA 334
Glu Thr Lys Cys Lys Val Leu Thr Asp Met Gly Phe Lys Val Thr Gln 97
GAA ACA AAG TGC AAG GTC CTC ACA GAC ATG GGC TTC AAG GTG ACA CAG 382
Ala Val Arg Ala Thr Ser Ile Glu Ala Gly Ile Met Met Pro Met Arg 113
GCA GTC AGG GCC ACG AGC ATC GAG GCG GGA ATC ATG ATG CCC ATG AGA 430
Glu Leu Ala Leu Thr Val Asn Asp Asp Asn Leu Met Glu lie Val Lys 129
GAA CTG GCC CTG ACT GTC AAT GAC GAC AAC CTC ATG GAA ATC GTC AAG 478
Gly Thr Leu Met Thr Cys Ser Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Val Asp Lys 145
GGG ACC TTG ATG ACA TGC TCC CTT CTT ACC AAG TAC TCG GTG GAC AAG 526
Met Ile Lys Tyr lie Thr Lys Lys Leu Gly Glu Leu Ala Asp Thr Gln 161
ATG ATC AAG TAC ATC ACC AAG AAA CTC GGG GAG CTG GCA GAC ACC CAG 574
Gly Val Gly Glu Leu Gln His Phe Thr Ala Asp Lys Ala Ala Ile Arg 177
GGA GTT GGG GAA CTG CAG CAC TTC ACC GCT GAC AAG GCA GCC ATC AGG 622
Lys Leu Ala Gly Cys Val Arg Pro Gly Gln Lys lie Thr Lys Ala Leu 193
AAA CTC GCA GGG TGT GTG CGT CCC GGG CAG AAG ATC ACC AAG GCC CTC 670
Tyr Ala Phe lie Leu Thr Glu lie Ala Asp Pro Thr Thr Gln Ser Arg 209
TAT GCG TTC ATC CTG ACT GAG ATC GCA GAC CCC ACC ACC CAG TCG AGG 718
Val Pro Ser Met Gly Ala Leu Arg Leu Asn Gly Thr Gly Met Thr Met 225
GTC CCG AGC ATG GGG GCG TTG AGA CTC AAC GGG ACA GGA ATG ACC ATG 766
Ile Gly Leu Phe Thr Gln Ala Ala Asn Asn Leu Gly Ile Ala Pro Ala 241
ATT GGG TTG TTC ACC CAG GCC GCC AAC AAC TTG GGC ATT GCC CCG GCA 814
Lys Leu Leu Glu Asp Leu Cys Met Glu Ser Leu Val Glu Ser Ala Arg 257
AAG CTG CTG GAG GAC CTC TGC ATG GAG TCC CTG GTT GAG TCA GCC AGA 862
Arg lie lie Gln Leu Met Arg Gln Val Ser Glu Ala Lys Ser Ile Gln 273
CGG ATC ATC CAG TTG ATG AGA CAG GTG TCA GAG GCG AAG TCC ATC CAA 910
Glu Arg Tyr Ala lie Met Met Ser Arg Met Leu Gly Glu Ser Tyr Tyr 289
GAG CGC TAC GCC ATC ATG ATG AGT CGG ATG CTG GGA GAG TCC TAC TAC 958
Lys Ser Tyr Gly Leu Asn Asp Asn Ser Lys lie Ser Tyr lie Leu Ser 305
AAG TCG TAT GGA CTC AAT GAC AAC TCC AAG ATC TCT TAC ATT CTG TCA 1006
Gln Ile Ser Gly Lys Tyr Ala Val Asp Ser Leu Glu Gly Leu Glu Gly 321
CAG ATC AGT GGG AAG TAC GCA GTG GAC TCC CTG GAA GGC CTG GAG GGG 1054
Ile Lys Val Thr Glu Lys Phe Arg Glu Phe Ala Glu Leu Val Ala Glu 337
ATC AAG GTG ACA GAG AAG TTC CGC GAG TTC GCT GAG CTT GTT GCA GAA 1102
Val Leu Val Asp Lys Tyr Glu Arg lie Gly Glu Asp Ser Thr Glu Val 353
GTC CTG GTG GAC AAG TAC GAG AGG ATT GGA GAG GAC AGC ACG GAG GTC 1150
Ser Asp Val Ile Arg Glu Ala Ala Arg Gln His Ala Arg Arg Thr Ser 369
TCA GAT GTC ATC AGG GAG GCG GCC AGA CAG CAC GCG CGC AGG ACA TCT 1198
Ala Lys Pro Glu Pro Lys Ala Arg Asn Phe Arg Ser Ser Thr Gly Arg 385
GCC AAG CCA GAG CCA AAG GCC CGC AAC TTC AGG AGC TCC ACC GGA AGG 1246
Gly Arg Glu Gln Glu Thr Gly Glu Ser Asp Asp Asp Asp Tyr Pro Glu 401
GGA AGG GAG CAG GAG ACG GGG GAG TCC GAT GAT GAC GAC TAC CCC GAG 1294
Asp Ser Asp ***
GAC TCT GAC TAA AAG GCA CTC CCG TCT CAT AAC CAA CAT AGA TAG AAA 1342
AAA A as well as the sequences derived therefrom and the fragments of said sequence and derived sequences.

Une telle séquence correspond à l'ADNc de l'ARNm de la protéine N du virus SHV. Such a sequence corresponds to the cDNA of the mRNA of the protein N of the SHV virus.

On entend, au sens de la présente invention, par séquence dérivée, aussi bien une séquence d'acide nucléique simple brin que double brin, l'acide nucléique représentant aussi bien un ADN qu'un ARN. For the purposes of the present invention, the term “derived sequence” means both a single-stranded and double-stranded nucleic acid sequence, the nucleic acid representing both DNA and RNA.

La présente invention a également pour objet un produit de transcription du virus SHV, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment monocistronique correspondant aux nucléotides 1-1346 de la séquence de formule (I) ci-dessus, associé à un poly A et en ce qu'il code pour la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci. The present invention also relates to a transcription product of the SHV virus, characterized in that it consists of a monocistronic fragment corresponding to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula (I) above, associated with a poly A and in that it codes for nucleoprotein N or a fragment thereof.

La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention, codant pour un peptide ou un fragment de peptide du virus SHV, éventuellement associé à un segment poly A. The subject of the present invention is also fragments or combinations of fragments of a nucleotide sequence in accordance with the invention, coding for a peptide or a fragment of peptide of the SHV virus, optionally associated with a poly A segment.

Parmi lesdits fragments, elle englobe entre autres
- un fragment de 105 paires de bases qui correspond aux nucléotides 1-105 de la séquence de formule I ci-dessus ;
- un fragment de 1235 paires de bases, dénommé ci-après SHV-N1, qui correspond aux nucléotides 101-1336 de la séquence de formule I ci-dessus ;
- un fragment de 1346 paires de bases, dénommé
SHV-N2, qui correspond aux nucléotides 1-1346 de la séquence de formule I ci-dessus ;
- un fragment de 1214 paires de bases qui code pour la nucléoprotéine N du virus SHV, comprend 404 amino-acides et qui correspond aux nucléotides 92-1306 de ladite séquence de formule I.Among the said fragments, it includes inter alia
- A fragment of 105 base pairs which corresponds to nucleotides 1-105 of the sequence of formula I above;
- A fragment of 1235 base pairs, hereinafter called SHV-N1, which corresponds to nucleotides 101-1336 of the sequence of formula I above;
- a fragment of 1346 base pairs, called
SHV-N2, which corresponds to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula I above;
a fragment of 1214 base pairs which codes for the nucleoprotein N of the SHV virus, comprises 404 amino acids and which corresponds to nucleotides 92-1306 of said sequence of formula I.

La présente invention a également pour objet des oligonucléotides, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par un fragment d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention et en ce qu'ils répondent à l'une quelconque des formules 1 à 10 ci-après
(1) 5'TGCTTCTCTCCTATGTAC, correspondant au fragment 291 à 308 de la séquence de formule I,
(2) 5'GTGTGCGTCCCGGGCAGAAGATCACC, correspondant au fragment 636 à 661 de la séquence de formule I,
(3) 5'CCCCACCACCCAGTCGA, correspondant au fragment 700 à 716 de la séquence de formule I,
(4) 5'GGACCTCTGCATGGAGTCCC, correspondant au fragment 826 à 845 de la séquence de formule I,
(5) 5'GCCAAGCCAGAGCCAAAG, correspondant au fragment 1199 à 1216 de la séquence de formule I,
(6) 5'TCTTCGACTGAGTTC, correspondant au fragment 92 à 78 de la séquence de formule I,
(7) 5'AACATACACGATGAGCTC, correspondant au fragment 205 à 188 de la séquence de formule I,
(8) 5'GGTGATCTTCTGCCCGGGACGCACAC, correspondant au fragment 661 à 636 de la séquence de formule I,
(9) 5'TCCTGTCCCGTTGAGTCT, correspondant au fragment 757 à 740 de la séquence de formule I,
(10) 5' GTCAGAGTCCTCGGGGTAGTC, correspondant au fragment 1306 à 1283 de la séquence de formule I.The present invention also relates to oligonucleotides, characterized in that they consist of a fragment of a nucleotide sequence according to the invention and in that they correspond to any one of the formulas 1 to 10 below. after
(1) 5'TGCTTCTCTCCTATGTAC, corresponding to fragment 291 to 308 of the sequence of formula I,
(2) 5'GTGTGCGTCCCGGGCAGAAGATCACC, corresponding to fragment 636 to 661 of the sequence of formula I,
(3) 5'CCCCACCACCCAGTCGA, corresponding to fragment 700 to 716 of the sequence of formula I,
(4) 5'GGACCTCTGCATGGAGTCCC, corresponding to fragment 826 to 845 of the sequence of formula I,
(5) 5'GCCAAGCCAGAGCCAAAG, corresponding to fragment 1199 to 1216 of the sequence of formula I,
(6) 5'TCTTCGACTGAGTTC, corresponding to fragment 92 to 78 of the sequence of formula I,
(7) 5 ′ AACATACACGATGAGCTC, corresponding to fragment 205 to 188 of the sequence of formula I,
(8) 5'GGTGATCTTCTGCCCGGGACGCACAC, corresponding to fragment 661 to 636 of the sequence of formula I,
(9) 5'TCCTGTCCCGTTGAGTCT, corresponding to fragment 757 to 740 of the sequence of formula I,
(10) 5 'GTCAGAGTCCTCGGGGTAGTC, corresponding to fragment 1306 to 1283 of the sequence of formula I.

La présente invention a également pour- objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci conforme à l'invention, éventuellement marqué à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou tout autre substance non radioactive appropriée. The present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they comprise a nucleotide sequence or a fragment thereof in accordance with the invention, optionally labeled with the aid of a marker such as an isotope radioactive, an appropriate enzyme or any other suitable non-radioactive substance.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites sondes, elles sont choisies dans le groupe qui comprend les oligonucléotides de formule (1) à (5), qui s'hybrident spécifiquement avec 1'ARN génomique du virus
SHV. According to an advantageous embodiment of said probes, they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (1) to (5), which specifically hybridize with the genomic RNA of the virus
SHV.

Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites sondes, elles sont choisies dans le groupe qui comprend les oligonucléotides de formule (6) à (10), qui s'hybrident spécifiquement avec l'ARNm du virus SHV. According to another advantageous embodiment of said probes, they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (6) to (10), which specifically hybridize with the mRNA of the SHV virus.

La présente invention a également pour objet des paires d'amorces pour la synthèse d'un ADNc ou d'un
ARN de virus SHV, caractérisé en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique conforme à l'invention.The present invention also relates to pairs of primers for the synthesis of a cDNA or of a
SHV virus RNA, characterized in that each primer comprises a sequence or a fragment of nucleotide sequence in accordance with the invention.

De telles amorces permettent notamment la synthèse d'une séquence d'ADN ou d'ARN ou d'un fragment de celle-ci conforme à l'invention et/ou de son brin complémentaire. Such primers allow in particular the synthesis of a DNA or RNA sequence or a fragment thereof according to the invention and / or its complementary strand.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites paires d'amorces, elles sont constituées par un oligonucléotide de formule (1) apparié à un oligonucléotide de formule (10). According to an advantageous embodiment of said pairs of primers, they consist of an oligonucleotide of formula (1) paired with an oligonucleotide of formula (10).

Ces deux amorces permettent la synthèse d'au moins un fragment de la séquence de formule I conforme à 1 tinvention. These two primers allow the synthesis of at least one fragment of the sequence of formula I in accordance with the invention.

La présente invention a également pour objet un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique ou une combinaison de plusieurs fragments nucléotidiques tels que définis ci-dessus. The present invention also relates to a peptide and / or a peptide fragment, characterized in that it is encoded by a nucleotide sequence or a combination of several nucleotide fragments as defined above.

Selon un mode de réalisation avantageux, ledit peptide est codé par le gène de la nucléoprotéine N, comporte 404 amino-acides et présente un poids moléculaire de 44590 Da. According to an advantageous embodiment, said peptide is encoded by the nucleoprotein N gene, contains 404 amino acids and has a molecular weight of 44,590 Da.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite nucléoprotéine présente une séquence en acides aminés qui répond à la formule II ci après
Mét-Glu-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Phé-Ser-Gly-Leu-Asn-Asp-
Val-Arg-Ile-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Glu-Gly-Arg-Val-Leu-Val
Pro-Gly-Glu-Val-Glu-Leu-Ile-Val-Tyr-Val-Gly-Glu-Phé-Gly
Glu-Glu-Asp-Arg-Lys-Val-Ile-Val-Asp-Ala-Leu-Ser-Ala-Leu
Gly-Gly-Pro-Gln-Thr-Val-Gln-Ala-Leu-Ser-Val-Leu-Leu-Ser-
Tyr-Val-Leu-Gln-Gly-Asn-Thr-Gln-Glu-Asp-Leu-Glu-Thr-Lys
Cys-Lys-Val-Leu-Thr-Asp-Mét-Gly-Phé-Lys-Val-Thr-Gln-Ala-
Val-Arg-Ala-Thr-Ser-Ile-Glu-Ala-Gly-Ile-Mét-Mét-Pro-Mét-
Arg-Glu-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Asp-Asp-Asn-Leu-Mét-Glu-
Ile-Val-Lys-Glyl30-Thr-Leu-Mét-Thr-Cys-Ser-Leu-Leu-Thr
Lys-Tyr-Ser-Val-Asp-Lys-Met-Ile-Lys-Tyr-Ile-Thr-Lys-Lys-
Leu-Gly-Glu-Leu-Ala-Asp-Thr-Glnl61-Gly-Val-Gly-Glu-Leu
Cln-His-Phe-Thr-Ala-Asp-Lys-Ala-Ala-Ile-Arg-Lys-Leu-Ala-
Gly-Cys-Val-Arg-Pro-Gly-Gln-Lys-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Tyr
Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Glu-Ile-Ala-Asp-Pro-Thr-Thr-Gln-Ser-
Arg-Val-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Arg-Leu-Asn-Gly-Thr-Gly-
Met-Thr-Met-Ile-Gly-Leu-Phe-Thr-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-
Gly-Ile-Ala-Pro-Ala-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Leu-Cys-Met-Glu-
Ser-Leu-Val-Glu-Ser-Ala-Arg-Arg-Ile-Ile-Gln-Leu-Met-Arg-
Gln-Val-Ser-Glu-Ala-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Arg-Tyr-Ala-Ile-
Met-Met-Ser-Arg-Met-Leu-Gly-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Lys-Ser-Tyr-
Gly-Leu-Asn-Asp-Asn-Ser-Lys-Ile-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ser-Gln-
Ile-Ser-Gly-Lys-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Leu-Glu-Gly-Leu-Glu-
Gly-Ile-Lys-Val-Thr-Glu-Lys-Phe-Arg-Glu-Phe-Ala-Glu-Leu-
Val-Ala-Glu-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Tyr-Glu-Ar rg-Ile-Gly-Glu-
Asp-Ser-Thr-Clu-Val-Ser-Asp-Val-Ile-Arg-Clu-Ala-Ala-Arg-
Gln-His-Ala-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Lys-Pro-Glu-Pro-Lys-Ala-
Arg-Asn-Phe-Arg-Ser-Ser-Thr-Cly-Arg-Gly-Arg-Glu-Gln-Glu-
Thr-Gly-Glu-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Tyr-Pro-Glu-Asp-Ser-Asp (Il)
Parmi les 27 résidus sérine du peptide de formule II, lesquels sont des sites de phosphorylation potentielle, 17 sont localisés sur le fragment COOH terminal comportant 154 amino-acides.According to an advantageous arrangement of this embodiment, said nucleoprotein has an amino acid sequence which corresponds to formula II below
Mét-Glu-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Phe-Ser-Gly-Leu-Asn-Asp-
Val-Arg-Ile-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Glu-Gly-Arg-Val-Leu-Val
Pro-Gly-Glu-Val-Glu-Leu-Ile-Val-Tyr-Val-Gly-Glu-Phe-Gly
Glu-Glu-Asp-Arg-Lys-Val-Ile-Val-Asp-Ala-Leu-Ser-Ala-Leu
Gly-Gly-Pro-Gln-Thr-Val-Gln-Ala-Leu-Ser-Val-Leu-Leu-Ser-
Tyr-Val-Leu-Gln-Gly-Asn-Thr-Gln-Glu-Asp-Leu-Glu-Thr-Lys
Cys-Lys-Val-Leu-Thr-Asp-Mét-Gly-Phe-Lys-Val-Thr-Gln-Ala-
Val-Arg-Ala-Thr-Ser-Ile-Glu-Ala-Gly-Ile-Mét-Mét-Pro-Mét-
Arg-Glu-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Asp-Asp-Asn-Leu-Mét-Glu-
Ile-Val-Lys-Glyl30-Thr-Leu-Mét-Thr-Cys-Ser-Leu-Leu-Thr
Lys-Tyr-Ser-Val-Asp-Lys-Met-Ile-Lys-Tyr-Ile-Thr-Lys-Lys-
Leu-Gly-Glu-Leu-Ala-Asp-Thr-Glnl61-Gly-Val-Gly-Glu-Leu
Cln-His-Phe-Thr-Ala-Asp-Lys-Ala-Ala-Ile-Arg-Lys-Leu-Ala-
Gly-Cys-Val-Arg-Pro-Gly-Gln-Lys-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Tyr
Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Glu-Ile-Ala-Asp-Pro-Thr-Thr-Gln-Ser-
Arg-Val-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Arg-Leu-Asn-Gly-Thr-Gly-
Met-Thr-Met-Ile-Gly-Leu-Phe-Thr-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-
Gly-Ile-Ala-Pro-Ala-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Leu-Cys-Met-Glu-
Ser-Leu-Val-Glu-Ser-Ala-Arg-Arg-Ile-Ile-Gln-Leu-Met-Arg-
Gln-Val-Ser-Glu-Ala-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Arg-Tyr-Ala-Ile-
Met-Met-Ser-Arg-Met-Leu-Gly-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Lys-Ser-Tyr-
Gly-Leu-Asn-Asp-Asn-Ser-Lys-Ile-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ser-Gln-
Ile-Ser-Gly-Lys-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Leu-Glu-Gly-Leu-Glu-
Gly-Ile-Lys-Val-Thr-Glu-Lys-Phe-Arg-Glu-Phe-Ala-Glu-Leu-
Val-Ala-Glu-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Tyr-Glu-Ar rg-Ile-Gly-Glu-
Asp-Ser-Thr-Clu-Val-Ser-Asp-Val-Ile-Arg-Clu-Ala-Ala-Arg-
Gln-His-Ala-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Lys-Pro-Glu-Pro-Lys-Ala-
Arg-Asn-Phe-Arg-Ser-Ser-Thr-Cly-Arg-Gly-Arg-Glu-Gln-Glu-
Thr-Gly-Glu-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Tyr-Pro-Glu-Asp-Ser-Asp (Il)
Among the 27 serine residues of the peptide of formula II, which are potential phosphorylation sites, 17 are located on the terminal COOH fragment comprising 154 amino acids.

La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments du peptide conforme à l'invention et notamment un fragment de 154 amino-acides, correspondant au fragment COOH terminal de la séquence de formule II. The present invention also relates to fragments or combinations of fragments of the peptide in accordance with the invention and in particular a fragment of 154 amino acids, corresponding to the terminal COOH fragment of the sequence of formula II.

Lesdits peptides sont avantageusement obtenus par synthèse, notamment par synthèse de Merrifield. Said peptides are advantageously obtained by synthesis, in particular by synthesis of Merrifield.

La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention. The present invention also relates to a recombinant cloning and / or expression vector, characterized in that it comprises a nucleotide sequence in accordance with the invention.

On entend, au sens de la présente invention par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cosmide qu'un phage. For the purposes of the present invention, the term “recombinant vector” means both a plasmid, a cosmid and a phage.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un plasmide approprié comprenant une origine de réplication, au moins un marqueur de sélection et une séquence nucléotidique conforme à l'invention, lequel vecteur est un vecteur de clonage. According to an advantageous embodiment of said vector, it consists of an appropriate plasmid comprising an origin of replication, at least one selection marker and a nucleotide sequence according to the invention, which vector is a cloning vector.

Un premier marqueur de sélection est notamment un gène dont l'expression permet la sélection de bactéries ayant incorporé ledit plasmide. Toutefois, cette technique ne permet que de sélectionner les bactéries qui ont incorporé un plasmide, elle ne permet pas de distinguer celles qui ont incorporé un plasmide recombinant de celles qui ont incorporé un plasmide vide. Pour y -parvenir, il faut utiliser, directement ou dans un second temps, un second marqueur de sélection. A first selection marker is in particular a gene whose expression allows the selection of bacteria which have incorporated said plasmid. However, this technique only makes it possible to select the bacteria which have incorporated a plasmid, it does not make it possible to distinguish those which have incorporated a recombinant plasmid from those which have incorporated an empty plasmid. To achieve this, you must use, directly or in a second step, a second selection marker.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur de clonage est constitué par un plasmide pUC13 dans lequel est insérée la séquence
SHV-N2 de 1346 paires de bases, telle que définie cidessus, ledit plasmide étant dénommé pSHV-N2.According to an advantageous arrangement of this embodiment, said cloning vector consists of a plasmid pUC13 into which the sequence is inserted
SHV-N2 of 1346 base pairs, as defined above, said plasmid being called pSHV-N2.

Selon une modalité avantageuse de cette disposition, la séquence SHV-N2 est insérée au niveau du site
Sma I dudit plasmide.According to an advantageous modality of this arrangement, the SHV-N2 sequence is inserted at the site
Sma I of said plasmid.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur de clonage est consti tué par un plasmide pBS dans lequel est insérée la séquence SHV-N1 de 1235 paires de bases, telle que définie ci-dessus, ledit plasmide étant dénommé pSHV-N1. According to another advantageous arrangement of this embodiment, said cloning vector is constituted by a pBS plasmid into which is inserted the SHV-N1 sequence of 1235 base pairs, as defined above, said plasmid being called pSHV- N1.

Selon une modalité avantageuse de cette disposition, la séquence SHV-N1 est insérée au niveau du site
EcoR I dudit plasmide.According to an advantageous modality of this arrangement, the SHV-N1 sequence is inserted at the site
EcoR I of said plasmid.

Selon un autre mode de réalisation dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant approprié comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçu ledit vecteur, un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence tels que définis ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptides du virus SHV. According to another embodiment of said vector, it consists of an appropriate recombinant vector comprising in particular an origin of replication in an appropriate host microorganism, in particular a bacterium or a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection either bacteria, ie eukaryotic cells having received said vector, a promoter allowing the expression of genes in said bacteria or eukaryotic cells, and into which is inserted a nucleotide sequence or a sequence fragment as defined above, which vector is an expression vector for a peptide, a fragment of a peptide or a combination of fragments of peptides from the SHV virus.

Dans la suite, on entend par peptide aussi bien la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci que les protéines de fusion (produit d'expression) contenant la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci. In the following, the term “peptide” is intended to mean both the nucleoprotein N or a fragment thereof and the fusion proteins (expression product) containing the nucleoprotein N or a fragment thereof.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur d'expression est constitué par un plasmide pATHl dans lequel est inséré, en phase au niveau de son site Eco RI, le fragment Eco RI du plasmide pSHV-N2 conforme à l'invention. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said expression vector consists of a plasmid pATH1 into which is inserted, in phase at its Eco RI site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-N2 according to the invention .

Ledit vecteur exprime une protéine de fusion trpE-protéine N. Said vector expresses a trpE-protein N fusion protein.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur d'expression est constitué par un plasmide pUEX2 dans lequel est inséré, en phase au niveau de son site Sma I, le fragment Eco RI du plasmide pSHV-N1 conforme à l'invention. According to another advantageous arrangement of this embodiment, said expression vector consists of a plasmid pUEX2 into which is inserted, in phase at its Sma I site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-N1 in accordance with invention.

Ledit vecteur exprime une protéine de fusion ss-galactosidase-protéine N. Said vector expresses an ss-galactosidase-protein N fusion protein.

La présente invention a également pour objet un produit d'expression de la nucléoprotéine N, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans un vecteur d'expression recombinant tel que défini ci-dessus. The present invention also relates to an expression product of nucleoprotein N, characterized in that it is expressed in a recombinant expression vector as defined above.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit produit d'expression, il comprend la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci et la ss-galactosidase ou un fragment de celle-ci et est reconnu par des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine N. According to an advantageous embodiment of said expression product, it comprises nucleoprotein N or a fragment thereof and ss-galactosidase or a fragment thereof and is recognized by monoclonal antibodies specific for protein N.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit produit d'expression, il comprend la nucléoprotéine
N du virus SHV ou un fragment de celle-ci et le trpE ou un fragment de celui-ci et est reconnu par des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine N.According to another advantageous embodiment of said expression product, it comprises the nucleoprotein
N of SHV virus or a fragment thereof and trpE or a fragment thereof and is recognized by monoclonal antibodies specific for protein N.

La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention. Une telle cellule est capable d'exprimer un produit d'expression tel que défini ci-dessus. The present invention also relates to an appropriate host cell obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by an expression vector in accordance with the invention. Such a cell is capable of expressing an expression product as defined above.

Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment Saccharomyces cerevisiae transformée par un vecteur d'expression conforme à 1 'invention. According to an advantageous embodiment, the host cell is in particular Saccharomyces cerevisiae transformed with an expression vector in accordance with the invention.

La présente invention a également pour objet un processus d'expression d'un peptide conforme à 1 invention, caractérisé en ce que la cellule hôte résultant de la transformation avec un vecteur contenant une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci codant pour une protéine comprenant la nucléoprotéine N ou un fragment de celle-ci, est cultivée de manière à produire et accumuler ledit peptide, qui est ensuite collecté. The present invention also relates to a process for expression of a peptide in accordance with the invention, characterized in that the host cell resulting from the transformation with a vector containing a nucleotide sequence or a fragment thereof coding for a protein comprising nucleoprotein N or a fragment thereof, is cultured so as to produce and accumulate said peptide, which is then collected.

Selon la cellule hôte, ledit peptide est soit secrété dans l'espace périplasmique, soit excrété dans le milieu de culture. Depending on the host cell, said peptide is either secreted in the periplasmic space, or excreted in the culture medium.

La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogène et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide conforme à 1 'invention, éventuellement associé à au moins une autre substance immunogène ou immunostimulante et/ou à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The present invention also relates to a composition with immunogenic and / or protective power, characterized in that it comprises a peptide in accordance with the invention, optionally associated with at least one other immunogenic or immunostimulatory substance and / or with a pharmaceutical vehicle acceptable.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend un peptide conforme à 1 invention associé à la protéine G du virus de la SHV ou à un fragment de celle-ci. According to an advantageous embodiment of said composition, it comprises a peptide in accordance with the invention associated with protein G of the VHS virus or with a fragment thereof.

La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogène et/ou protecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule hôte transformée conforme à l'invention, inactivée de manière appropriée. The present invention also relates to a composition with immunogenic and / or protective power, characterized in that it comprises a transformed host cell according to the invention, suitably inactivated.

Selon un mode de réalisation préféré de ladite composition, elle comprend du Saccharomyces cerevisiae transformé par un vecteur d'expression conforme à l'invention. According to a preferred embodiment of the said composition, it comprises Saccharomyces cerevisiae transformed with an expression vector in accordance with the invention.

L'inactivation comprend notamment une inactivation chimique (formol, acide peracétique en particulier) associée à une inactivation physique (notamment UV.). The inactivation notably comprises a chemical inactivation (formalin, peracetic acid in particular) associated with a physical inactivation (in particular UV.).

La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de détection du virus SHV, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter un virus 51w à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique ou un fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention, en mettant en présence l'échantillon à analyser avec ladite/lesdites sondes nucléotidiques, à laquelle/auxquelles se lie L'ART génomique ou les produits de transcription du virus SHV, si de tels produits sont présents dans l'échantillon, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EA, RA, fluorescence. The present invention further relates to a method for detecting the SHV virus, characterized in that it consists in detecting a 51w virus using at least one nucleotide probe or a fragment of nucleotide probe conforming to the invention. invention, by bringing together the sample to be analyzed with said nucleotide probe (s), to which genomic ART or the transcripts of the SHV virus binds, if such products are present in the sample, the reading of the result being revealed by an appropriate means, in particular EA, RA, fluorescence.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, préalablement à l'hybridation avec lesdites sondes, on amplifie la séquence nucléique à détecter (ARN génomique ou ARN messager du virus 51w notamment) par la méthode d'amplification dite PCR (réaction de polymérisation en chaîne à l'aide d'une polymérase appropriée, notamment la Taq polymérase) en utilisant une paires d'amorces conforme à l'invention. According to a preferred embodiment of this process, prior to hybridization with said probes, the nucleic sequence to be detected is amplified (genomic RNA or messenger RNA of virus 51w in particular) by the amplification method called PCR (reaction of chain polymerization using an appropriate polymerase, in particular Taq polymerase) using a pair of primers according to the invention.

La méthode PCR est notamment décrite par SAIKI et al. dans Science, 1988, 239, 487 ainsi que dans les
Demandes de Brevet Européen CETUS n 200 362 et n 201 184.The PCR method is notably described by SAIKI et al. in Science, 1988, 239, 487 as well as in
CETUS European Patent Applications n 200,262 and n 201,184.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la paire d'amorces est de préférence l'oligonucléotide de formule (1) apparié à l'oligonucléotide de formule (10). According to an advantageous arrangement of this embodiment, the pair of primers is preferably the oligonucleotide of formula (1) paired with the oligonucleotide of formula (10).

La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de détection d'anticorps anti-virus SHV, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter les ant-icorps anti-virus 51w éventuellement présents dans un échantillon biologique à l'aide d'un peptide ou fragment de peptides conforme à l'invention, éventuellement fixé sur un support solide approprié, en mettant en présence ledit échantillon biologique avec ledit/lesdits peptides ou fragment(s) de peptides, auxquels se lient les anticorps anti-virus S1w si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon à analyser, la lecture du résultat étant révélée par un moyen approprié, notamment EIA, RIA, fluorescence. The present invention further relates to a method for detecting anti-SHV virus antibodies, characterized in that it consists in detecting the anti-virus antibodies 51w optionally present in a biological sample using '' a peptide or fragment of peptides in accordance with the invention, optionally attached to an appropriate solid support, by bringing said biological sample into contact with said peptide (s) or fragment (s), to which the anti-S1w anti-virus antibodies bind if such antibodies are present in the sample to be analyzed, the reading of the result being revealed by an appropriate means, in particular EIA, RIA, fluorescence.

Ce procédé permet notamment de vérifier la séroconversion des animaux vaccinés ou de procéder à des enquêtes sérologiques à visée épidémiologique. This process makes it possible in particular to verify the seroconversion of vaccinated animals or to carry out serological surveys for epidemiological purposes.

La présente invention a, de plus, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection du virus SHV, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins une sonde et/ou fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention et éventuellement des doses appropriées d'au moins deux amorces conformes à 1 'invention. The present invention further relates to a kit, ready for use, for the implementation of the method for detecting the SHV virus, characterized in that it comprises, in addition to useful quantities of buffers suitable for the implementation work of said detection, appropriate doses of at least one probe and / or fragment of nucleotide probe according to the invention and optionally appropriate doses of at least two primers according to one invention.

La présente invention a, en outre, pour objet un kit, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'anticorps anti-virus SHV, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées d'au moins un peptide et/ou un fragment peptidique conforme à l'invention. The present invention further relates to a kit, ready to use, for implementing the method for detecting anti-SHV antibodies, characterized in that it comprises, in addition to useful quantities of buffers suitable for carrying out said detection, appropriate doses of at least one peptide and / or a peptide fragment in accordance with the invention.

La présente invention a, de plus, pour objet, l'application des séquences nucléotidiques conformes à l'invention ou des fragments de celles-ci, à l'obtention d'animaux génétiquement modifiés. The present invention further relates to the application of the nucleotide sequences according to the invention or fragments thereof, to the production of genetically modified animals.

Les séquences conformes à l'invention permettent notamment d'obtenir des cellules de poisson et des poissons devenus résistants au virus SHV. The sequences in accordance with the invention make it possible in particular to obtain fish cells and fish that have become resistant to the SHV virus.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. In addition to the foregoing arrangements, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.

I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.

Exemple 1 : Clonage de l'ARNm du virus SEV dans le vecteur pUC13 et M13. Example 1: Cloning of the SEV virus mRNA into the vector pUC13 and M13.

Des cellules (Epithelioma papulosum cyprini,
EPC) sont infectées par des virus SHV.Cells (Epithelioma papulosum cyprini,
EPC) are infected with SHV viruses.

On récolte les virus au bout de 20 h. The viruses are harvested after 20 h.

L'ARN total est préparé comme décrit dans
CHOMCZYNSKI et al.(Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159) et l'ARN-poly A+ est purifié sur une colonne de cellulose oligo-dT (Pharmacia).Total RNA is prepared as described in
CHOMCZYNSKI et al. (Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159) and the RNA-poly A + is purified on an oligo-dT cellulose column (Pharmacia).

L'ADNc est synthétisé en utilisant le kit d'ADNc Boehringer (numéro de catalogue 1013882), et inséré au niveau du site Sma I du vecteur pUC13 (Pharmacia). The cDNA is synthesized using the Boehringer cDNA kit (catalog number 1013882), and inserted at the Sma I site of the vector pUC13 (Pharmacia).

Une souche E. Coli D1210 est transformée et les colonies sont transférées sur des filtres de réplication et criblées par hybridation avec des fragments d'ADNc simple brin marqués, préparés à partir de 1'ARN total de cellules infectées ou non infectées par du virus
SHV, par transcription réverse amorcée au hasard.An E. Coli D1210 strain is transformed and the colonies are transferred to replication filters and screened by hybridization with labeled single-stranded cDNA fragments prepared from the total RNA of cells infected or not infected with the virus.
SHV, by reverse transcription initiated randomly.

Les clones qui hybrident uniquement avec 1'ARN de cellules infectées sont purifiés et leurs plasmides utilisés comme sondes pour le Northern blot d'ARN provenant de cellules infectées. Clones which hybridize only with RNA from infected cells are purified and their plasmids used as probes for the Northern blot of RNA from infected cells.

Les colonies contenant un plasmide qui hybride avec un ARN ayant la mobilité évaluée pour l'ARNm du gène
N sont sélectionnées.Colonies containing a plasmid which hybridizes with an RNA having the mobility evaluated for the gene mRNA
N are selected.

Un insert de 1346 nucléotides (clone SHV-N2), est coupé à l'aide des enzymes de restriction Hind III et
EcoRI (digestion partielle) et transféré dans les vecteurs de séquençage M13mpl8 et M13mpl9.An insert of 1346 nucleotides (clone SHV-N2) is cut using the restriction enzymes Hind III and
EcoRI (partial digestion) and transferred to the sequencing vectors M13mpl8 and M13mpl9.

Exemple 2 : Clonage de 1 'ARNm du virus SHV dans les vecteurs XZAP ou pBS. Example 2: Cloning of the SHV virus mRNA in the XZAP or pBS vectors.

Les cellules sont récoltées 8 heures après l'infection virale. The cells are harvested 8 hours after the viral infection.

Les acides nucléiques totaux sont extraits dans un tampon à l'isothiocyanate de guanidium (Maniatis et al., Molecular cloning, 1982) et l'ARN total est précipité avec du LiCl 2M. L'ARN-poly A+ est purifié sur un papier d'affinité Hybond (mAP-Amersham). Les ADNc sont synthétisés en utilisant un kit ADNc Amersham (numéro de catalogue RPN 1256) et insérés au niveau du site EcoRI d'un vecteur hgtl0. Le fragment EcoRI-EcoRI est ensuite transféré dans un vecteur XZAP (SHORT et al., Nucleic acids Research, 1988, 16, 7583-7600) entre le site 5maI et Hind III du polylinker. Des cellules d'E. Coli XL1
Blue sont infectées et des plasmides pBS sont coupés (SHORT et al., 1988).Les plages et colonies sont criblées avec de l'IPTG-BluO-Gal (BRL) et par hybridation des plasmides purifiés avec de l'ADNc obtenu par transcription réverse au hasard à partir d'ARN génomique purifié. Les cartes de restriction des plasmides sont réalisées.The total nucleic acids are extracted in a guanidium isothiocyanate buffer (Maniatis et al., Molecular cloning, 1982) and the total RNA is precipitated with 2M LiCl. The RNA-poly A + is purified on a Hybond affinity paper (mAP-Amersham). The cDNAs are synthesized using an Amersham cDNA kit (catalog number RPN 1256) and inserted at the EcoRI site of a vector hgt10. The EcoRI-EcoRI fragment is then transferred into an XZAP vector (SHORT et al., Nucleic acids Research, 1988, 16, 7583-7600) between the 5maI and Hind III site of the polylinker. E. cells Coli XL1
Blue are infected and pBS plasmids are cut (SHORT et al., 1988). The plaques and colonies are screened with IPTG-BluO-Gal (BRL) and by hybridization of the purified plasmids with cDNA obtained by transcription. reverses randomly from purified genomic RNA. Plasmid restriction maps are produced.

Le plasmide pSHV-N1 est notamment transcrit in vitro en présence de T3 et T7 ARN polymérases et les ARN marqués sont hybridés avec des extraits d'ARN obtenus à partir du virion et à partir de cellules infectées et non infectées, de manière à déterminer l'orientation de l'insert. The plasmid pSHV-N1 is in particular transcribed in vitro in the presence of T3 and T7 RNA polymerases and the labeled RNAs are hybridized with RNA extracts obtained from the virion and from infected and uninfected cells, so as to determine the orientation of the insert.

L'ARN peut être cloné directement dans un vecteur pBS comme visible dans la figure la dans laquelle un plasmide pBS-SK (STRATAGENE) est coupé au site unique
EcoRI de son polylinker par l'enzyme de restriction EcoRI et au niveau de ce site, l'insert SHV-N1 est inséré.The RNA can be cloned directly into a pBS vector as visible in FIG. 1a in which a plasmid pBS-SK (STRATAGENE) is cut at the single site
EcoRI of its polylinker by the restriction enzyme EcoRI and at this site, the insert SHV-N1 is inserted.

Exemple 3 : Obtention d'un plasmide sous forme d'ADN simple brin sortant des cellules dans le milieu de culture, enrobé dans les protéines du phage surinfectant fl. Example 3: Obtaining a plasmid in the form of single-stranded DNA leaving cells in the culture medium, coated in the proteins of phage superinfectant fl.

Un fragment de la séquence nucléotidique de l'ADNc de 1'ARN génomique du virus 51w de 1235 paires de bases est inséré dans un plasmide pBS-SK (n de catalogue 212206 et 212207) au niveau du site Eco RI du polylinker comme visible en figure la. A fragment of the nucleotide sequence of the cDNA of the genomic RNA of the 51w virus of 1235 base pairs is inserted into a plasmid pBS-SK (catalog numbers 212206 and 212207) at the Eco RI site of the polylinker as visible in figure it.

Les bactéries en phase exponentielle de croissance sont infectées à une multiplicité de 10 phages fl par bactéries. Bacteria in the exponential growth phase are infected with a multiplicity of 10 phage fl per bacteria.

Exemple 4 : Construction du plasmide pSHV-N2
Un fragment de la séquence nucléotidique de l'ADNc de l'ARN messager du virus 51w de 1346 paires de bases a été inséré dans un plasmide pUC13 au niveau du site Sma I, entre le site BamHI, d'un côté et les sites
Sst I et Eco RI de l'autre côté.Example 4 Construction of the Plasmid pSHV-N2
A fragment of the nucleotide sequence of the messenger RNA cDNA of the 51w virus of 1346 base pairs was inserted into a plasmid pUC13 at the Sma I site, between the BamHI site, on one side and the sites
Sst I and Eco RI on the other side.

Exemple 5 : Expression de l'insert SHV-N2. Example 5: Expression of the SHV-N2 insert.

Le fragment Eco RI de pSHV-N2 est inséré en phase au site Eco RI d'un plasmide pATH1. The Eco RI fragment of pSHV-N2 is inserted in phase at the Eco RI site of a plasmid pATH1.

Chez les bactéries, la traduction du message contenu dans l'insert est réalisée sous le contrôle du promoteur de la TRPE (anthranylate synthétase). In bacteria, the translation of the message contained in the insert is carried out under the control of the promoter of TRPE (anthranylate synthetase).

La protéine de fusion correspondant à l'insert
SHV-N2 est exprimée à partir dudit plasmide pATH (DIECKMAN et al. J. Biol. Chem., 1985, 260, 1513-1520).The fusion protein corresponding to the insert
SHV-N2 is expressed from said plasmid pATH (DIECKMAN et al. J. Biol. Chem., 1985, 260, 1513-1520).

Les clones recombinants sont mis en culture une nuit dans un milieu M9 supplémenté en tryptophane à 20 mg/l et en casamino-acides à 0,5 %. La culture est diluée 10 fois dans le même milieu sans tryptophane et cultivée pendant une heure à 30"C avant l'induction avec l'acide indoleacrylique à 5 mg/l pendant 2 heures.The recombinant clones are cultured overnight in M9 medium supplemented with tryptophan at 20 mg / l and with casamino acids at 0.5%. The culture is diluted 10 times in the same medium without tryptophan and cultured for one hour at 30 ° C. before induction with indoleacrylic acid at 5 mg / l for 2 hours.

La protéine exprimée par le SHV-N2 (trpE-N) migre sur SDS-Page à la position 70 000-73 000. Comme le trpE correspond à 35 000, la protéine N a un poids moléculaire de l'ordre de 35-38 000. The protein expressed by SHV-N2 (trpE-N) migrates on SDS-Page at position 70,000-73,000. As trpE corresponds to 35,000, protein N has a molecular weight of about 35-38 000.

Cette protéine est reconnue par un anticorps monoclonal spécifique de la nucléoprotéine N. This protein is recognized by a monoclonal antibody specific for nucleoprotein N.

Exemple 6 : Expression du fragment SXV-N1. Example 6: Expression of the SXV-N1 fragment.

Le plasmide pS1w-Nl est digéré par l'enzyme
Eco RI et le fragment obtenu est inséré en phase au niveau du site Sma I d'un plasmide pUEX 2 comme visible sur la figure lb.The plasmid pS1w-Nl is digested by the enzyme
Eco RI and the fragment obtained is inserted in phase at the Sma I site of a plasmid pUEX 2 as visible in FIG. 1b.

Chez les bactéries, la traduction du message contenu dans l'insert est réalisée sous le contrôle du promoteur de la galactosidase. In bacteria, the message contained in the insert is translated under the control of the galactosidase promoter.

En système acellulaire, la traduction du message contenu dans l'insert est sous le contrôle des promoteurs T4 ou T7, dans un plasmide PBS. In the acellular system, the translation of the message contained in the insert is under the control of the T4 or T7 promoters, in a PBS plasmid.

La protéine de fusion correspondant à l'SHV-Nl est exprimée à partir dudit plasmide pUEX (AMERSHAM). Les clones recombinants sont mis en culture une nuit à 27"C dans un milieu L Broth. La culture est diluée dans le même milieu et cultivée pendant 5 heures à 27"C puis 2 heures à 42 C pour l'induction. The fusion protein corresponding to SHV-N1 is expressed from said plasmid pUEX (AMERSHAM). The recombinant clones are cultured overnight at 27 "C in L Broth medium. The culture is diluted in the same medium and cultured for 5 hours at 27" C then 2 hours at 42 C for induction.

La protéine de fusion ss-Gal-N présente un poids moléculaire de l'ordre de 160 000 et la B-Gal correspond à un poids moléculaire de 120 000. The fusion protein ss-Gal-N has a molecular weight of the order of 160,000 and B-Gal corresponds to a molecular weight of 120,000.

La figure 2a montre la migration de la protéine N et de la B-galactosidase. La protéine de fusion N-ssGal et la ss-gal sont soumises à une électrophorèse en parallèle et le gel est coloré au bleu de Comassie. Figure 2a shows the migration of protein N and B-galactosidase. The fusion protein N-ssGal and ss-gal are subjected to an electrophoresis in parallel and the gel is stained with Comassie blue.

Les marqueurs de poids moléculaire sont à droite 94, 67, 43, 30 et 20 kDa et à gauche 200, 92,5, 69, 46, 21,5 et 14,3 kDa. Entre 200 et 92,5, la distance n'est pas proportionnelle au logarithme du poids moléculaire. The molecular weight markers are on the right 94, 67, 43, 30 and 20 kDa and on the left 200, 92.5, 69, 46, 21.5 and 14.3 kDa. Between 200 and 92.5, the distance is not proportional to the logarithm of the molecular weight.

Dans un autre essai, la N-ssGal, la ss-Gal et les protéines de virus purifiées sont soumises à une électrophorèse en parallèle, puis transférées sur des membranes de nitrocellulose et traitées soit avec les an ticorps monoclonaux F5 (dilution 1/5000), spécifiques de la nucléoprotéine N ou avec les anticorps monoclonaux I10 (dilution 1/500), spécifiques de la protéine G. La figure 2b montre la reconnaissance de la protéine N par un anticorps monoclonal spécifique de la protéine N dénommé F5, ladite protéine n'étant pas reconnue par un anticorps monoclonal spécifique de la protéine G dénommé I10.Dans cette figure, Les tâches correspondent à 1 à 0,13 pLg de ss-
Gal-N ou de ssss-Gal déposées sur de la nitrocellulose et traitées avec les mêmes anticorps que ci-dessus.In another test, the N-ssGal, the ss-Gal and the purified virus proteins are subjected to an electrophoresis in parallel, then transferred to nitrocellulose membranes and treated with either the F5 monoclonal antibodies (dilution 1/5000) , specific for nucleoprotein N or with monoclonal antibodies I10 (dilution 1/500), specific for protein G. Figure 2b shows the recognition of protein N by a monoclonal antibody specific for protein N called F5, said protein n not being recognized by a monoclonal antibody specific for protein G designated I10. In this figure, the tasks correspond to 1 to 0.13 pLg of ss-
Gal-N or ssss-Gal deposited on nitrocellulose and treated with the same antibodies as above.

Exemple 7 Séquençage des inserts SEN-N1 et SHV-N2. Example 7 Sequencing of the SEN-N1 and SHV-N2 inserts.

Les oligomères conformes à l'invention sont utilisés. La séquence de nucléotides 1 à 105 est obtenue à partir de M13mpl9 (SHV-N2) et de M13mpl8 (SHV-N2) et représente les deux brins de pSHV-N2. The oligomers in accordance with the invention are used. The nucleotide sequence 1 to 105 is obtained from M13mpl9 (SHV-N2) and M13mpl8 (SHV-N2) and represents the two strands of pSHV-N2.

La séquence de nucléotides 105 à 1300 est vérifiée sur les deux brins des deux inserts (SHV-N1 et
SHV-N2) ; il y a homologie des deux inserts au niveau de ce fragment qui comprend la phase ouverte de lecture.The nucleotide sequence 105 to 1300 is verified on the two strands of the two inserts (SHV-N1 and
SHV-N2); there is homology of the two inserts at the level of this fragment which includes the open reading phase.

Le séquençage est réalisé soit en présence de séquenase (T7 ADN polymérase modifiée), selon le protocole décrit dans le kit United States Biochemicalj soit en présence d'un fragment de Klenow de 1'ADN polymérase
I, selon le protocole décrit dans le kit Boehringer.The sequencing is carried out either in the presence of sequenase (T7 modified DNA polymerase), according to the protocol described in the United States Biochemicalj kit or in the presence of a Klenow fragment of the DNA polymerase
I, according to the protocol described in the Boehringer kit.

Exemple 8 : Procédé de détection du virus SHV, conforme à l'invention, en présence d'anticorps appropriés. Example 8: Method for detecting the SHV virus, in accordance with the invention, in the presence of appropriate antibodies.

a. On prépare des anticorps polyclonaux antivirus S1w à partir d'une protéine de fusion conforme à 1' invention. at. S1w anti-virus polyclonal antibodies are prepared from a fusion protein according to the invention.

b. On applique une technique ELISA telle que celle décrite dans WAY et DIXON (J. Applied Ichtyol, 1988, 4, 182-189), notamment à des prélèvements d'organes de poissons. b. An ELISA technique such as that described in WAY and DIXON (J. Applied Ichtyol, 1988, 4, 182-189) is applied, in particular to samples of fish organs.

Exemple 9 : Procédé de détection d'anticorps antinucléoprotéine N, conforme à l'invention. Example 9: Method for detecting antinucleoprotein N antibodies, according to the invention.

30 Al de protéine de fusion en dilutions séries 1/2 (concentration de départ 5 llg) sont déposés dans les puits d'un appareil "dot blot" équipé d'une membrane de nitrocellulose, puis les puits sont lavés avec 100 1 de tampon (Tris-HCl) 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM). La feuille de nitrocellulose est ensuite découpée et saturée par immersion pendant 30 minutes à 37"C dans du PBS 3 % gélatine. Après 4 lavages en PBS 0,05 % - Tween 20, la feuille de nitrocellulose est incubée pendant 30 minutes à 37"C en PBS 3 % gélatine 0,5 % Triton X100 contenant le sérum à étudier. 30 μl of fusion protein in 1/2 series dilutions (starting concentration 5 μg) are deposited in the wells of a "dot blot" apparatus equipped with a nitrocellulose membrane, then the wells are washed with 100 l of buffer (Tris-HCl) 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM). The nitrocellulose sheet is then cut and saturated by immersion for 30 minutes at 37 "C in PBS 3% gelatin. After 4 washes in 0.05% PBS - Tween 20, the nitrocellulose sheet is incubated for 30 minutes at 37" C in PBS 3% gelatin 0.5% Triton X100 containing the serum to be studied.

L'incubation avec l'anticorps anti-immunoglobuline de truite est effectué dans les mêmes conditions. The incubation with the anti-immunoglobulin antibody for trout is carried out under the same conditions.

Exemple 1O: Procédé de détection du virus SHV par amplification. Example 10: Method for detecting the SHV virus by amplification.

Environ 1 Rg d'ARN total est hybridé avec 100 ng de l'oligonucléotide (1) conforme à l'invention de sens (+) et s'étendant entre les positions 290 et 307 du génome du virus 51w et un ADN de sens (+) complémentaire au génome est amorcé spécifiquement et synthétisé. Le milieu réactionnel est extrait au phénol, précipité à l'éthanol, lavé puis séché. Il est alors repris dans 50 Al comprenant l'amorce correspondant à un oligonucléotide de formule (10) de sens (-) et s'étendant entre les positions 740 à 757 du géne, des tampons appropriés habituellement utilisés lors de l'amplification et de la Taq
DNA polymérase.About 1 Rg of total RNA is hybridized with 100 ng of the oligonucleotide (1) according to the invention of sense (+) and extending between positions 290 and 307 of the genome of the 51w virus and a sense DNA ( +) complementary to the genome is specifically initiated and synthesized. The reaction medium is extracted with phenol, precipitated with ethanol, washed then dried. It is then taken up in 50 A1 comprising the primer corresponding to an oligonucleotide of formula (10) with direction (-) and extending between positions 740 to 757 of the gene, suitable buffers usually used during amplification and the Taq
DNA polymerase.

Le milieu réactionnel est incubé dans une "machine à PCR" lui faisant subir les étapes suivantes
+ 95"C 5 min pour dénaturer
+ 50"C 2 min pour que les amorces s'hybrident
+ 72"C 2 min pour que la Taq polymérase allonge les brins d'ADNc.The reaction medium is incubated in a "PCR machine" subjecting it to the following steps
+ 95 "C 5 min to denature
+ 50 "C 2 min so that the primers hybridize
+ 72 "C 2 min for Taq polymerase to lengthen the strands of cDNA.

Dans le cas présent, l'oligonucléotide de formule (1) s'hybride avec l'ARN génomique et sert d'amorce de transcription inverse. Le second brin est alors synthétisé en utilisant comme amorce l'oligonucléotide de formule (10). Tous les deux peuvent ensuite servir à l'amplification. Inversement, l'oligonucléotide de formule (10) peut s'hybrider avec le messager pour la réaction de transcription inverse et l'oligonucléotide de formule (1) être utilisée pour la synthèse du deuxième brin. In the present case, the oligonucleotide of formula (1) hybridizes with the genomic RNA and serves as a reverse transcription primer. The second strand is then synthesized using the oligonucleotide of formula (10) as a primer. Both can then be used for amplification. Conversely, the oligonucleotide of formula (10) can hybridize with the messenger for the reverse transcription reaction and the oligonucleotide of formula (1) can be used for the synthesis of the second strand.

Exemple 11 : Pouvoir immunogène et protection des compositions conformes à l'invention. Example 11: Immunogenic power and protection of the compositions in accordance with the invention.

Des lots comportant plus de 50 truitelles par lot reçoivent respectivement des préparations de nucléoprotéine N, de protéine G et de l'association des deux. Lots with more than 50 troutelles per lot receive preparations of nucleoprotein N, protein G and a combination of the two respectively.

Parallèlement d'autres lots reçoivent des cellules hôtes non transformées inactivées (Saccharomyces cerevisiae) (témoin négatif). In parallel, other batches receive inactivated untransformed host cells (Saccharomyces cerevisiae) (negative control).

A l'issue d'une période d'immunisation de 6 semaines, à 10"C, des réplicats de chacun des lots seront infectés soit par un virus 51w de type 1, soit par deux autres virus 51w de types 2 et 3. At the end of a 6-week immunization period, at 10 ° C., replicates of each of the batches will be infected either with a 51w type 1 virus or with two other 51w types 2 and 3 viruses.

Après une période d'épreuve d'un minimun de 30 jours à 10"C, les pourcentages de protection relative sont calculés. After a minimum 30 day trial period at 10 "C, the relative protection percentages are calculated.

Le pourcentage de survie des poissons qui ont été immunisés est significativement supérieur. The percentage of survival of fish that have been immunized is significantly higher.

Exemple 12 : Préparation de cellules de poissons devenues résistantes au virus SHV. Example 12: Preparation of fish cells that have become resistant to the SHV virus.

On prend la séquence des 100 premiers nucléotides de la séquence de formule I conforme à l'invention ; on l'insère dans un vecteur plasmidique sous contrôle d'un promoteur actif en cellules eucaryotes notamment apte à s'exprimer en cellules de poissons et chez le poisson, de telle sorte que soit synthétisé l'ARNc du fragment cité de façon à montrer si ces séquences anti-sens sont capables de protéger les cellules de poissons et les poissons contre une infection par le virus. The sequence of the first 100 nucleotides of the sequence of formula I according to the invention is taken; it is inserted into a plasmid vector under the control of a promoter active in eukaryotic cells, in particular capable of being expressed in fish cells and in fish, so that the cRNA of the fragment cited is synthesized so as to show whether these antisense sequences are able to protect fish cells and fish against infection by the virus.

Le vecteur plasmidique utilisé est par exemple un pCMV CAT dans lequel la séquence est sous contrôle d'un promoteur de la protéine immédiate précoce de CMV (cytomégalovirus) humain. The plasmid vector used is for example a pCMV CAT in which the sequence is under the control of a promoter of the immediate early protein of human CMV (cytomegalovirus).

Exemple 13 : Expression d'une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine N du virus 5EV en levure
Les caractéristiques du vecteur d'expression inductible par la levure sont les suivantes
- la réplication et le maintien dans la bactérie (E. coli) sont assurés par pBR322, résistant à l'ampicilline (AmpR),
- la réplication dans la levure est assurée par les fonctions du 2 ,u,
- le promoteur résulte de la fusion des séquences régulatrices (URS, Upstream Regulating Sequences) de 1'ADH2, le gène de l'alcool déhydrogénase 2 qui est inductible par l'alcool et le promoteur GAPDH, (glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase), qui est un des promoteurs constitutifs les plus puissants de la levure, ce promoteur hybride combine la puissance du promoteur
GAPDH avec l'inductibilité de l'ADH2,
- le terminateur du gène GAPDH.EXAMPLE 13 Expression of a Nucleic Acid Sequence Coding for the Protein N of the 5EV Yeast Virus
The characteristics of the yeast-inducible expression vector are as follows
- replication and maintenance in the bacteria (E. coli) are ensured by pBR322, resistant to ampicillin (AmpR),
- replication in yeast is ensured by the functions of 2, u,
- the promoter results from the fusion of the regulatory sequences (URS, Upstream Regulating Sequences) of ADH2, the alcohol dehydrogenase 2 gene which is inducible by alcohol and the promoter GAPDH, (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase), which is one of the most powerful constitutive promoters of yeast, this hybrid promoter combines the power of the promoter
GAPDH with the inducibility of ADH2,
- the terminator of the GAPDH gene.

La sélection dans la levure se fait par complémentation d'une auxotrophie de la souche hôte par les gènes Ura3 ou leu 2d (d pour déficient); ces deux gènes permettent d'étudier l'influence du nombre de copies sur la production de la protéine d'intérêt, car Ura3 est un allèle sauvage du gène muté, la complémentation est effi cace, le nombre de copies du vecteur est minimal, le gène leu 2d est très peu traduit, pour assurer la biosynthèse de leucine indispensable pour sa croissance la cellule n'a qu'une possibilité augmenter le nombre de copies du gène leu 2d et par conséquent le nombre de copies du vecteur. Selection in yeast is done by complementing an auxotrophy of the host strain by the Ura3 or leu 2d genes (d for deficient); these two genes make it possible to study the influence of the number of copies on the production of the protein of interest, because Ura3 is a wild allele of the mutated gene, the complementation is effective, the number of copies of the vector is minimal, the leu 2d gene is very little translated, to ensure the biosynthesis of leucine essential for its growth, the cell has only one possibility of increasing the number of copies of the leu 2d gene and consequently the number of copies of the vector.

Le gène de la protéine N a été reproduit par
PCR à partir du plasmide pSHVN2. Le premier oligonucléotide CGA CCA TGG AAG GAG GAA TTC GT place un site Ncol
Ncol sur le codon initiateur de la protéine N. Cette modification ne change pas l'enchaînement des acides aminés.The protein N gene has been reproduced by
PCR from the plasmid pSHVN2. The first oligonucleotide CGA CCA TGG AAG GAG GAA TTC GT places an Ncol site
Ncol on the initiator codon of protein N. This modification does not change the chain of amino acids.

Le second oligonucléotide CTT GTC GAC TTA GTC
Sall
AGA GTC CTC GGG place un site Sall en aval du codon terminateur.The second oligonucleotide CTT GTC GAC TTA GTC
Sall
AGA GTC CTC GGG places a Sall site downstream of the terminator codon.

Le DNA synthétisé est digéré par les enzymes Nicol et Sall, est inséré dans le vecteur intermédiaire pEGT101 ouvert par Ncol et Sall, entre le promoteur
ADH2/GAPDH, grâce au site Ncol placé sur l'ATG initiateur, et le terminateur du plasmide intermédiaire pEGT101 grâce au site Sall situé après le codon stop et introduit par transformation dans E. coli. On obtient ainsi un plasmide dénommé pEGT101-SHVN.The synthesized DNA is digested by the enzymes Nicol and Sall, is inserted into the intermediate vector pEGT101 opened by Ncol and Sall, between the promoter
ADH2 / GAPDH, thanks to the Ncol site placed on the initiating ATG, and the terminator of the intermediate plasmid pEGT101 thanks to the SalI site located after the stop codon and introduced by transformation into E. coli. A plasmid called pEGT101-SHVN is thus obtained.

Les caractéristiques de ce plasmide ont été vérifiées par la digestion par les enzymes de restriction Ncol et Sall qui libère le cDNA de la susdite séquence d'acides aminés sous la forme d'une bande de 1,2 kb. Le fragment BamH1 contenant le promoteur, le gène de la protéine N et le terminateur est à son tour introduite au site unique BamH1 du vecteur navette E. coli-levure pEGTîî0 ; les plasmides sont introduits par transformation et la présence du fragment BamHl dans le vecteur navette est vérifiée par la digestion BamH1 qui fait apparaître une bande de 3,4 kb.Le plasmide ainsi obtenu, pYSHVN est introduit par transformation au PEG dans la souche classique de levure DC04 (a adel leu2-04 cir ).La construction du vecteur pYSHVN est représentée à la figure 3. The characteristics of this plasmid were verified by digestion with the restriction enzymes Ncol and SalI which liberates the cDNA from the above-mentioned amino acid sequence in the form of a 1.2 kb band. The BamH1 fragment containing the promoter, the protein N gene and the terminator is in turn introduced into the unique BamH1 site of the E. coli-yeast shuttle vector pEGT10; the plasmids are introduced by transformation and the presence of the BamHI fragment in the shuttle vector is verified by the BamH1 digestion which reveals a 3.4 kb band. The plasmid thus obtained, pYSHVN is introduced by transformation with PEG in the conventional strain of yeast DC04 (a adel leu2-04 cir). The construction of the vector pYSHVN is represented in FIG. 3.

Le protocole de la fermentation et de l'induction est particulier car l'induction de l'ADH2 est sensible à la répression catabolique. La première phase de la fermentation vise à obtenir une biomasse en maintenant le plasmide. La sélection se fait par complémentation de la mutation leu 2, par conséquent le milieu est le YNB (Yeast nitrogen base without aminoacids Difco 0919-15), avec 3 % de glucose. Le milieu est rendu aussi riche que possible en ajoutant tous les acides aminés à l'exception de la leucine, et les bases azotées. Le temps de génération de la souche dans ce milieu est proche de 4 heures, contre 2 heures seulement dans un milieu complexe. La densité optique atteinte est de 2,5. Les cellules sont ensuite transférées dans un milieu identique, pendant une nuit, où le glucose a été remplacé par du glycérol pour lever la répression catabolique. The fermentation and induction protocol is special because the induction of ADH2 is sensitive to catabolic repression. The first phase of fermentation aims to obtain a biomass by maintaining the plasmid. The selection is made by complementing the leu 2 mutation, therefore the medium is YNB (Yeast nitrogen base without aminoacids Difco 0919-15), with 3% glucose. The medium is made as rich as possible by adding all the amino acids except leucine, and the nitrogenous bases. The generation time of the strain in this medium is close to 4 hours, against only 2 hours in a complex medium. The optical density reached is 2.5. The cells are then transferred to an identical medium, overnight, where the glucose has been replaced by glycerol to lift the catabolic repression.

L'induction se fait dans le milieu riche YM (Yeast Broth
Difco 0711-01), en présence de 3 % d'éthanol.Induction takes place in the rich medium YM (Yeast Broth
Difco 0711-01), in the presence of 3% ethanol.

La culture est poursuivie jusqu'à une densité optique de 4. A ce moment, les cellules sont récoltées par centrifugation et remises en suspension dans le Tampon Tris-HCl 20 mM EDTA, 10 mM, PMSF (fluorure de méthylphényl-sulfonyl) 1 mM, pH 8,0. Les cellules sont alors brisées par trois passages à la presse de French de manière à obtenir un extrait brut de la séquence en acides aminés. The culture is continued until an optical density of 4. At this time, the cells are harvested by centrifugation and resuspended in the Tris-HCl buffer 20 mM EDTA, 10 mM, PMSF (methylphenyl sulfonyl fluoride) 1 mM , pH 8.0. The cells are then broken by three passes with the French press so as to obtain a crude extract of the amino acid sequence.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1 invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework, or the scope, of the present invention.

Claims

RESELL ICAT IONS

1 ") Nucleotide sequence derived from the genomic RNA of the SHV virus, characterized in that it comprises the gene coding for the nucleoprotein N.

AAA A as well as the sequences derived therefrom and the fragments of said sequence and derived sequences.

GAC TCT GAC TAA AAG GCA CTC CCG TCT CAT AAC CAA CAT AGA TAG AAA 1342

Asp Ser Asp ***

GGA AGG GAG CAG GAG ACG GGG GAG TCC GAT GAT GAC GAC TAC CCC GAG 1294

Gly Arg Glu Gln Glu Thr Gly Glu Ser Asp Asp Asp Asp Tyr Pro Glu 401

GCC AAG CCA GAG CCA AAG GCC CGC AAC TTC AGG AGC TCC ACC GGA AGG 1246

Ala Lys Pro Glu Pro Lys Ala Arg Asn Phe Arg Ser Ser Thr Gly Arg 385

TCA GAT GTC ATC AGG GAG GCG GCC AGA CAG CAC GCG CGC AGG ACA TCT 1198

Ser Asp Val Ile Arg Glu Ala Ala Arg Gln His Ala Arg Arg Thr Ser 369

GTC CTG GTG GAC AAG TAC GAG AGG ATT GGA GAG GAC AGC ACG GAG GTC 1150

Val Leu Val Asp Lys Tyr Glu Arg Ile Gly Glu Asp Ser Thr Glu Val 353

ATC AAG GTG ACA GAG AAG TTC CGC GAG TTC GCT GAG CTT GTT GCA GAA 1102

Ile Lys Val Thr Glu Lys Phe Arg Glu Phe Ala Glu Leu Val Ala Glu 337

CAG ATC AGT GGG AAG TAC GCA GTG GAC TCC CTG GAA GGC CTG GAG GGG 1054

AAG TCG TAT GGA CTC AAT GAC AAC TCC AAG ATC TCT TAC ATT CTG TCA 1006 Gln Ile Ser Gly Lys Tyr Ala Val Asp Ser Leu Glu Gly Leu Glu Gly 321

Lys Ser Tyr Gly Leu Asn Asp Asn Ser Lys lie Ser Tyr lie Leu Ser 305

GAG CGC TAC GCC ATC ATG ATG AGT CGG ATG CTG GGA GAG TCC TAC TAC 958

Glu Arg Tyr Ala Ile Met Met Ser Arg Met Leu Gly Glu Ser Tyr Tyr 289

CGG ATC ATC CAG TTG ATG AGA CAG GTG TCA GAG GCG AAG TCC ATC CAA 910

Arg lie Ile Gln Leu Met Arg Gln Val Ser Glu Ala Lys Ser lie Gln 273

AAG CTG CTG GAG GAC CTC TGC ATG GAG TCC CTG GTT GAG TCA GCC AGA 862

Lys Leu Leu Glu Asp Leu Cys Met Glu Ser Leu Val Glu Ser Ala Arg 257

ATT GGG TTG TTC ACC CAG GCC GCC AAC AAC TTG GGC ATT GCC CCG GCA 814

Ile Gly Leu Phe Thr Gln Ala Ala Asn Asn Leu Gly Ile Ala Pro Ala 241

GTC CCG AGC ATG GGG GCG TTG AGA CTC AAC GGG ACA GGA ATG ACC ATG 766

Val Pro Ser Met Gly Ala Leu Arg Leu Asn Gly Thr Gly Met Thr Met 225

TAT GCG TTC ATC CTG ACT GAG ATC GCA GAC CCC ACC ACC CAG TCG AGG 718

Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Glu Ile Ala Asp Pro Thr Thr Gln Ser Arg 209

AAA CTC GCA GGG TGT GTG CGT CCC GGG CAG AAG ATC ACC AAG GCC CTC 670

Lys Leu Ala Gly Cys Val Arg Pro Gly Gln Lys Ile Thr Lys Ala Leu 193

GGA GTT GGG GAA CTG CAG CAC TTC ACC GCT GAC AAG GCA GCC ATC AGG 622

Gly Val Gly Glu Leu Gln His Phe Thr Ala Asp Lys Ala Ala Ile Arg 177

ATG ATC AAG TAC ATC ACC AAG AAA CTC GGG GAG CTG GCA GAC ACC CAG 574

Met Ile Lys Tyr Ile Thr Lys Lys Leu Gly Glu Leu Ala Asp Thr Gln 161

GGG ACC TTG ATG ACA TGC TCC CTT CTT ACC AAG TAC TCG GTG GAC AAG 526

Gly Thr Leu Met Thr Cys Ser Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Val Asp Lys 145

GAA CTG GCC CTG ACT GTC AAT GAC GAC AAC CTC ATG GAA ATC GTC AAG 478

Glu Leu Ala Leu Thr Val Asn Asp Asp Asn Leu Met Glu Ile Val Lys 129

GCA GTC AGG GCC ACG AGC ATC GAG GCG GGA ATC ATG ATG CCC ATG AGA 430

Ala Val Arg Ala Thr Ser lie Glu Ala Gly Ile Met Met Pro Met Arg 113

GAA ACA AAG TGC AAG GTC CTC ACA GAC ATG GGC TTC AAG GTG ACA CAG 382

Glu Thr Lys Cys Lys Val Leu Thr Asp Met Gly Phe Lys Val Thr Gln 97

TCC GTG CTT CTC TCC TAT GTA CTC CAA GGG AAC ACA CAG GAG GAC CTA 334

Ser Val Leu Leu Ser Tyr Val Leu Gln Gly Asn Thr Gln Glu Asp Leu 81

GTG GAT GCA CTC TCC GCA CTC GGG GGA CCC CAG ACT GTA CAG GCG TTG 286

Val Asp Ala Leu Ser Ala Leu Gly Gly Pro Gln Thr Val Gln Ala Leu 65

CTC ATC GTG TAT GTT GGT GAA TTT GGT GAG GAA GAT AGG AAG GTG ATT 238

Leu Ile Val Tyr Val Gly Glu Phe Gly Glu Glu Asp Arg Lys Val Ile 49

GAC CCC ACC GGT GGA GAG GGA CGG GTA CTT GTA CCT GGT GAA GTG GAG 190

Asp Pro Thr Gly Gly Glu Gly Arg Val Leu Val Pro Gly Glu Val Glu 33

GAA GGA GGA ATT CGT GCA GCG TTT TCA GGC CTG AAT GAT GTT AGG ATT 142

Glu Gly Gly lie Arg Ala Ala Phe Ser Gly Leu Asn Asp Val Arg lie 17

CAG AGT CAT ATC TCA TAA TCG TTG AAC AAA AGA ACT CAG TCG AAG ATG 94

Puts 1

C TTT CAA GTT TGA AAT TCC AAG AAT TTG GAA AGT GAA AGT TGA ACA 46

2 ") Nucleotide sequence according to claim 1, characterized in that it comprises the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of formula I below

3) Transcription product of the SHV virus, characterized in that it consists of a monocistronic fragment corresponding to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula (I) according to claim 2, associated with a poly A and in that 'it codes for nucleoprotein N or a fragment thereof.

4) Fragment or combination of fragments of a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it codes for a peptide or a peptide fragment of the SHV virus, optionally associated with a poly A segment.

5) Fragment according to claim 4, characterized in that it comprises 105 base pairs and corresponds to nucleotides 1-105 of the sequence of formula I according to claim 2.

6) Fragment according to claim 4, characterized in that it comprises 1235 base pairs, is called SHV-N1 and corresponds to nucleotides 101-1336 of the sequence of formula I according to claim 2.

7) Fragment according to claim 4, characterized in that it comprises 1346 base pairs, is called SHV-N2 and corresponds to nucleotides 1-1346 of the sequence of formula I according to claim 2.

8) Fragment according to claim 4, characterized in that it comprises 1214 base pairs, code for the nucleoprotein N of the virus 51w which comprises 404 amino acids and corresponds to nucleotides 92-1306 of said sequence of formula I.

10) Nucleotide probes, characterized in that they comprise a nucleotide sequence or a fragment thereof according to any one of claims 1 to 9, optionally labeled using a marker such as a radioactive isotope, an appropriate enzyme or other suitable non-radioactive substance.

(10) 5'GTCAGAGTCCTCGGGGTAGTC

(9) 5'TCCTGTCCCGTTGAGTCT

(8) S'GGTGATCTTCTGCCCGGGACGCACAC

(7) 5'AACATACACGATGAGCTC

(6) 5'TCTTCGACTGAGTTC

(5) 5 'GCCAAGCCAGAGCCAAAG

(4) 5 'GGACCTCTGCATGGAGTCCC

(3) S'CCCCACCACCCAGTCGA

(2) 5'GTGTGCGTCCCGGGCAGAAGATCACC

(1) S 'TGCTTCTCTCCTATGTAC

9) Oligonucleotides, characterized in that they consist of a fragment of a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 8 and in that they correspond to any of the formulas 1 to 10 below

SHV.

11 ") Probes according to claim 10, characterized in that they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (1) to (5), which specifically hybridize with the genomic RNA of the virus

CDNA or of a SHV virus RNA, characterized in that each primer comprises a sequence or a fragment of nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 9.

13) Pairs of primers for the synthesis of a

12) Probes according to claim 10, characterized in that they are chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formula (6) to (10), which hybridize specifically with the mRNA of the SHV virus.

14) Pairs of primers according to claim 13, characterized in that they consist of an oligonucleotide of formula (1) paired with an oligonucleotide of formula (10).

15) Peptide and / or peptide fragment, characterized in that it is coded by a nucleotide sequence or a combination of several nucleotide fragments according to any one of claims 1 to 8.

16) Peptide according to claim 15, characterized in that said peptide is coded by the nucleoprotein N gene, contains 404 amino acids and has a molecular weight of 44590 Da.

18) Peptide, characterized in that it comprises 154 amino acids and corresponds to the terminal COOH fragment of the sequence of formula II according to claim 17.

Thr-Gly-Glu-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Tyr-Pro-Glu-Asp-Ser-Asp (Il)

Arg-Asn-Phe-Arg-Ser-Ser-Thr-Gly-Arg-Gly-Arg-Glu-Gln-Glu-

Gln-His-Ala-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Lys-Pro-Glu-Pro-Lys-Ala

Val-Ala-Glu-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Tyr-Glu-Arg-Ile-Gly-Glu Asp-Ser-Thr-Glu-Val-Ser-Asp-Val-Ile-Arg-Glu-Ala -Ala-Arg-

Gly-Ile-Lys-Val-Thr-Glu-Lys-Phe-Arg-Glu-Phe-Ala-Glu-Leu-

Ile-Ser-Gly-Lys-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Leu-Glu-Gly-Leu-Glu-

Gly-Leu-Asn-Asp-Asn-Ser-Lys-Ile-Ser-Tyr-Ile-Leu-Ser-Gln-

Met-Met-Ser-Arg-Met-Leu-Gly-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Lys-Ser-Tyr-

Gln-Val-Ser-Glu-Ala-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Arg-Tyr-Ala-Ile-

Ser-Leu-Val-Glu-Ser-Ala-Arg-Arg-Ile-Ile-Gln-Leu-Met-Arg-

Gly-Ile-Ala-Pro-Ala-Lys-Leu-Leu-Glu-Asp-Leu-Cys-Met-Glu-

Met-Thr-Met-Ile-Gly-Leu-Phe-Thr-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-

Arg-Val-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Arg-Leu-Asn-Gly-Thr-Gly-

Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Glu-Ile-Ala-Asp-Pro-Thr-Thr-Gln-Ser-

Gly-Cys-Val-Arg-Pro-Gly-Gln-Lys-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Tyr-

Gln-His-Phe-Thr-Ala-Asp-Lys-Ala-Ala-Ile-Arg-Lys-Leu-Ala-

Leu-Gly-Glu-Leu-Ala-Asp-Thr-Glnl61-Gly-Val-Gly-Glu-Leu

Lys-Tyr-Ser-Val-Asp-Lys-Met-Ile-Lys-Tyr-Ile-Thr-Lys-Lys-

Ile-Val-Lys-Glyl30-Thr-Leu-Mét-Thr-Cys-Ser-Leu-Leu-Thr

Arg-Glu-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Asn-Asp-Asp-Asn-Leu-Mét-Glu-

Val-Arg-Ala-Thr-Ser-Ile-Glu-Ala-Gly-Ile-Mét-Mét-Pro-Mét-

Cys-Lys-Val-Leu-Thr-Asp-Mét-Gly-Phe-Lys-Val-Thr-Gln-Ala-

Tyr-Val-Leu-Gln-Gly-Asn-Thr-Gln-Glu-Asp-Leu-Glu-Thr-Lys-

Gly-Gly-Pro-Gln-Thr-Val-Gln-Ala-Leu-Ser-Val-Leu-Leu-Ser-

Glu-Glu-Asp-Arg-Lys-Val-Ile-Val-Asp-Ala-Leu-Ser-Ala-Leu-

Pro-Gly-Glu-Val-Glu-Leu-Ile-Val-Tyr-Val-Gly-Glu-Phe-Gly-

Val-Arg-Ile-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Glu-Gly-Arg-Val-Leu-Val-

Mét-Glu-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Phe-Ser-Gly-Leu-Asn-Asp-

17) Peptide according to claim 16, characterized in that said nucleoprotein has an amino acid sequence which corresponds to formula II below

19) Recombinant cloning and / or expression vector, characterized in that it comprises a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 8.

20) Vector according to claim 19, characterized in that it consists of an appropriate plasmid comprising an origin of replication, at least one selection marker and a nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 8, which vector is a cloning vector.

1346 base pair SHV-N2 according to claim 7, said plasmid being named pSHV-N2.

21) Vector according to claim 20, characterized in that said cloning vector consists of a plasmid pUC13 into which the sequence is inserted

22) Vector according to claim 21, characterized in that the SHV-N2 sequence is inserted at the Sma I site of said plasmid.

1235 base pair SHV-N1 according to claim 6, said plasmid being named pSHV-N1.

23) Vector according to claim 20, characterized in that said cloning vector consists of a pBS plasmid into which the sequence is inserted

24) Vector according to claim 23, characterized in that the SHV-N1 sequence is inserted at the EcoR I site of said plasmid.

25) Vector according to claim 19, characterized in that it consists of an appropriate recombinant vector comprising in particular an origin of replication in an appropriate host microorganism, in particular a bacterium or a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection either of bacteria or of eukaryotic cells having received said vector, a promoter allowing the expression of genes in said bacteria or eukaryotic cells, and into which is inserted a nucleotide sequence or a sequence fragment according to any one of Claims 1 to 8, which vector is an expression vector for a peptide, a fragment of a peptide or a combination of fragments of peptides from the SHV virus.

26) Vector according to claim 25, characterized in that said expression vector consists of a plasmid pATH1 into which is inserted, in phase at its Eco RI site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-N2 according to claim 21 or claim 22.

27) Vector according to claim 25, characterized in that said expression vector consists of a plasmid pUEX2 into which is inserted, in phase at its Sma I site, the Eco RI fragment of the plasmid pSHV-N1 according to claim 23 or claim 24.

N, characterized in that it is expressed in a recombinant expression vector according to any one of claims 25 to 27.

28) Expression product of the nucleoprotein

29) Expression product according to claim 28, characterized in that it comprises nucleoprotein N or a fragment thereof and ss-galactosidase or a fragment thereof and is recognized by monoclonal antibodies specific for the protein N.

30) Expression product according to claim 28, characterized in that it comprises the 511V virus nucleopro tein N or a fragment thereof and the trpE or a fragment thereof and is recognized by antibodies monoclonals specific for protein N.

31) Appropriate host cell obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by an expression vector according to any one of claims 25 to 27.

32) Host cell according to claim 31, characterized in that the host cell is in particular Sac charomyces cerevisiae transformed with an expression vector according to any one of claims 25 to 27.

33) Process for the expression of a peptide according to any one of claims 15 to 18 or 28 to 30, characterized in that the host cell resulting from the transformation with a vector containing a nucleotide sequence or a fragment thereof encoding a protein comprising nucleoprotein N or a fragment thereof, is cultured so as to produce and accumulate said peptide, which is then collected.

34) Composition with immunogenic and / or protective power, characterized in that it comprises a peptide according to any one of claims 15 to -18 or 28 to 30, optionally associated with at least one other immunogenic or immunostimulatory substance and / or to a pharmaceutically acceptable vehicle.

35) Composition according to claim 34, characterized in that it comprises a peptide according to any one of claims 15 to 18 or 28 to 30, associated with protein G of the 511V virus or a fragment thereof .

36) Composition with immunogenic and / or protective power, characterized in that it comprises a transformed host cell according to claim 31 or claim 32, suitably inactivated.

37) Composition according to claim 36, characterized in that it comprises Saccharomyces cerevisiae transformed with an expression vector according to any one of claims 25 to 27.

38) Method for detecting the SHV virus, characterized in that it consists in detecting a 511V virus using at least one nucleotide probe or a nucleotide probe fragment according to any one of claims 10 to 12, bringing the sample to be analyzed into contact with said nucleotide probe (s), to which genomic RNA or the transcripts of the SHV virus binds, if such products are present in the sample, the reading of the result being revealed by an appropriate means, in particular EA, RA, fluorescence.

39) Method according to claim 38, characterized in that prior to hybridization with said probes, the nucleic sequence to be detected is amplified (genomic RNA or messenger RNA of the 511V virus in particular) by the amplification method called PCR (reaction of chain polymerization in the presence of an appropriate polymerase, in particular Taq polymerase) using a pair of primers according to claim 13 or claim 14.

40) Method according to claim 39, characterized in that the pair of primers is preferably the oligonucleotide of formula (1) paired with the oligonucleotide of formula (10).

41) Method for detecting anti-virus SHV antibodies, characterized in that it consists in detecting anti-virus antibodies 511V possibly present in a biological sample using a peptide or fragment of peptides according to any one of claims 15 to 18, optionally attached to an appropriate solid support, by bringing said biological sample into contact with said peptide (s) or peptide fragment (s), to which the anti-virus 511V antibodies bind if such antibodies are present in the sample to be analyzed, the reading of the result being revealed by an appropriate means, notably EIA, RIA, fluorescence.

42) Kit, ready to use, for implementing the process for detecting the SHV virus, characterized in that it comprises, in addition to the useful quantities of buffers suitable for the implementation of said detection, appropriate doses of 'at least one probe and / or fragment of nucleotide probe according to any one of Claims 10 to 12 and optionally suitable doses of at least two primers according to Claim 13 or Claim 14.

SHV, characterized in that it comprises, in addition to useful quantities of buffers suitable for carrying out said detection, suitable doses of at least one peptide and / or a peptide fragment according to any one of claims 15 to 18.

43) Kit, ready to use, for implementing the anti-virus antibody detection method

44) Application of the nucleotide sequences according to any one of claims 1 to 8 or fragments thereof, to obtain genetically modified animals.