FR2651327A1 - Procede de dosage d'un analyte, faisant appel a des ligands couples a des marqueurs et appareil pour la mise en óoeuvre de ce procede. - Google Patents

Abstract

Procédé et appareil pour doser un analyte d'un échantillon par liaison spécifique de l'analyte à un ligand ayant un marqueur détectable pour former un complexe, dont la présence peut être déterminée quantitativement par la mesure de la quantité de marqueur. L'échantillon est mis en contact dans l'appareil avec un corps d'essai de ligands pour effectuer la liaison spécifique. Le corps a au moins deux ligands différents, marqués différemment, dans un rapport prédéterminé, au moins un premier étant celui qui se liera spécifiquement à l'analyte, le second étant celui qui se liera non-spécifiquement à l'analyte ou à d'autres fractions. La mesure quantitative de ces marqueurs couplés à des quantités liées des ligands est ensuite réalisée sensiblement simultanément. La proportion connue de ligand dans le corps d'essai, le rapport connu ou prédéterminé entre les caractéristiques de liaison non-spécifique des ligands à l'appareil, et la mesure quantitative des marqueurs liés, permet de déterminer la liaison spécifique du premier ligand à l'analyte.

Description

La présente invention porte sur des dosages chimiques et biochimiques

mettant en jeu un ou plusieurs ligands qui se lieront de façon spécifique à des fractions réactives respectives intéressantes, et, plus particuli-

èrement, sur des dosages multiples de ce type.

Les immunoréactions mettant en jeu la formation de complexes anticorpsantigène sont des exemples de réaction chimiques ou biochimiques connues analyte/ligand, dans lesquelles un complexe est formé par la réaction de fractions qui se lieront de façon très spécifique l'une à l'autre. Un certain nombre d'autres réactions de ce type sont connues, par exemple, les hybridations d'acide

nucléique, les réactions enzyme-inhibiteur, enzyme-

coenzyme, hormone-récepteur, enzyme-récepteur, et les réactions spécifiques de substrats analogues. Les termes "fraction" et "ligand", tels qu'ils sont utilisés ici, désignent de façon généralement interchangeable, les parties réactives d'un tel complexe, et, en ce qui concerne un complexe antigène-anticorps, par exemple, ces termes

sont destinés à comprendre toutes les parties immunologi-

quement réactives, telles qu'haptènes, antigènes complets, fragments réactifs antigène-anticorps, et anticorps complets. Le terme "analyte" est destiné à désigner la fraction ou le ligand qui est dosé soit qualitativement, soit quantitativement, soit les deux, et le terme "capteur" est destiné à désigner le ligand ou la fraction qui se

liera de façon spécifique à l'analyte intéressant.

Les dosages basés sur ces immunoréactions bien connues et autres réactions de liaison spécifique mettent en jeu une grande diversité de techniques. Certains procédés de dosage emploient des marqueurs radioactifs, luminescents ou fluorescents, qui sont couplés, soit au ligand, soit à l'analyte, et peuvent être détectés par la mesure de rayonnement provenant du produit ou du complexe de réaction. De façon typique, si un capteur, tel qu'un anticorps immobilisé sur un substrat, est mis à réagir dans une solution contenant une quantité inconnue d'une fraction ou d'un analyte réactif, tel qu'un antigène destiné à se

lier au capteur, le titre de l'antigène peut être facile-

ment obtenu. Par exemple, dans la technique bien connue du dosage par compétition, un mélange de l'analyte et une quantité connue d'analyte marqué sont appliqués sur la phase immobilisée et entreront en compétition entre eux pour le site de liaison. Plus la quantité de l'analyte d'échantillon présent est grande, moindre sera la mesure dans laquelle l'analyte marqué se liera au capteur. En utilisant des courbes d'étalonnage prédéterminées et en mesurant l'intensité du rayonnement provenant de l'antigène marqué complexé avec le capteur lié, on peut déterminer ou

doser la quantité d'analyte non-marqué ou d'échantillon.

Dans une autre technique courante, on peut ajouter la solution d'essai contenant l'analyte à un capteur en solution. En supposant que le complexe formé s'agrégera suffisamment pour précipiter ou s'agglutiner,

l'observation d'une telle réaction résultante d'aggluti-

nation ou de précipitation indiquerait si ou non la solution d'essai contenait l'analyte duquel le capteur est spécifique. Dans ce dernier cas, l'observation serait celle d'un rayonnement, soit réfléchi, soit dispersé, par

le produit d'agglutination ou le précipité, ou un rayon-

nement dont la transmission est atténuée par le produit

d'agglutination ou le précipité.

Dans les dosages immunologiques dans lesquels un rayonnement (par exemple, rayonnement alpha, rayonnement luminescent ou rayonnement fluorescent) provient du produit de réaction, on peut détecter et/ou mesurer le rayonnement de façon typique par compteurs Geiger ou de scintillations,

autoradiographie, fluorimètres et similaires.

Il est considéré comme admis que les forces de liaison mises en jeu dans des réactions anticorps-antigène sont l'interaction combinée de forces électrostatiques, de liaisons hydrogènes et de van de Waals, de nombreuses manières analogues à une autre liaison spécifique telle que, par exemple, celle qui se produit dans enzyme-substrat

et dans la formation de complexes enzyme-coenzyme, fournis-

sant ainsi une liaison spécifique, très forte. La spécifi-

cité de telles réactions de liaison n'est cependant pas absolue. En raison du fait que des fractions, en parti- culier un anticorps marqué, mises en jeu dans de telles réactions spécifiques, peuvent souvent se lier à d'autres

matières, dans des dosages, tels que des dosages immuno-

logiques et des dosages par capteurs, qui dépendent de la spécificité de la liaison, l'apparition d'une telle liaison non-spécifique peut présenter des effets défavorables sur la sensibilité et la reproductibilité du dosage. Il sera évident que le terme "lié", tel qu'il est utilisé ici, est ainsi destiné à désigner des ligands qui sont liés par l'intermédiaire de n'importe quel type de liaison,

spécifique ou non-spécifique.

Les tentatives de la technique antérieure pour surmonter les effets de la liaison non-spécifique sur les dosages ont été principalement chimiques, et elles sont orientées vers l'utilisation de réactifs contenant des protéines qui sont destinées à supprimer ou à bloquer la liaison nonspécifique. Cependant, de tels réactifs ne sont pas universellement efficaces, comme reflété par le fait que de nombreuses différentes sortes de bloqueurs (par exemple, sérum de veau foetal, gélatine, caséine, etc.) ont

été utilisées dans des dosages anticorps-antigène.

Dans la discussion ci-après, pour plus de commodité, les dosages mettant en jeu des réactions de liaison spécifique seront exemplifiés par référence à des dosage immunologiques, étant cependant entendu que les principes mis en jeu, sauf indication spécifique, peuvent s'appliquer à d'autres types de dosage mettant en jeu des

réactions de liaison spécifique.

Obtenir la sensibilité maximale de mesure mettant en jeu une réaction de liaison spécifique n'est pas

une question d'avoir le signal le plus puissant et l'équi-

pement d'instruments le plus sensible. Une certaine

sensibilité ne peut pas être améliorée par des améliora-

tions du marqueur et des instruments par suite des limites

imposées par l'affinité de l'anticorps.

Par exemple, considérons un dosage immuno-

logique par capture ou non-compétitif. En principe, ce dernier a un potentiel de plus grande sensibilité qu'un dosage immunologique par compétition parce que les effets de faible affinité de l'anticorps peuvent être surmontés par une augmentation de la concentration de l'anticorps marqué. L'avantage de la sensibilité potentielle d'un procédé non-compétitif sur un procédé par compétition, en utilisant le même anticorps dans chacun, augmente avec la diminution de l'affinité de l'anticorps. En utilisant une affinité d'anticorps de 10 12M, si, par exemple, l'effet de liaison non-spécifique peut être réduit de 1% à 0,01%, la sensibilité potentielle du dosage devrait aller jusqu'à 105 à 103 molécules/ml. Cependant, l'augmentation de la quantité d'anticorps marqué devrait être accompagnée par

une augmentation de la quantité absolue de liaison non-

spécifique de l'anticorps marqué, réduisant l'aptitude à distinguer les plus petites quantités d'antigène, et peut éliminer ou réduire l'avantage de la sensibilité réelle

d'un procédé non-compétitif.

Dans une approche classique des mesures de liaison à un ligand, on évalue habituellement une liaison non-spécifique en réalisant tout d'abord une série de mesures externes (c'est-à-dire indépendamment de ou préalablement à la mesure réelle de la liaison) pour la réponse au zéro du système d'instruments qui est utilisé, c'est-à-dire, une mesure de liaison non-spécifique en dehors du dosage à effectuer, obtenue par dosage d'un

échantillon connu pour ne pas contenir l'analyte intéres-

sant. En règle générale, de telles mesures ne sont pas constantes, mais varient autour d'une certaine valeur moyenne. A partir d'une telle série de mesures, on peut définir une réponse de liaison non-spécifique (LNS) moyenne et un niveau de bruit de fond LNS o le bruit de fond moyen quadratique (MQ) des mesures LNS est égal à l'écart-type

des réponses LNS. Dans des dosages ultérieurs de concen-

tration d'analyte inconnue, la réponse spécifique peut alors être prise en tant que réponse du système moins la réponse LNS moyenne. Il va de soi que pour être certain qu'un échantillon donné contient de l'analyte, il est nécessaire que la réponse spécifique soit supérieure au bruit de fond. A des niveaux d'analyte très faibles, le bruit de fond est habituellement dominé par le bruit de

fond LNS.

En conséquence, un principal objectif de la présente invention est de proposer un système de mesure par liaison à un ligand qui emploie un étalon "interne" qui peut être utilisé pour s'ajouter aux mesures de témoin

"externe", afin d'améliorer la sensibilité du système.

Encore un autre objectif important de la présente invention est de proposer un système dans lequel les effets de

liaison non-spécifiques de ligand marqué, tel qu'un anti-

corps, sont supprimés ou minimisés, augmentant ainsi la sensibilité du dosage au delà de celle que l'on peut

obtenir présentement par des systèmes de dosage immuno-

logique de la technique antérieure.

D'autres objectifs de la présente invention

seront en partie évidents et apparaîtront en partie ci-

après.

L'invention comprend en conséquence l'appareil

possédant les structure, combinaison d'éléments et dispo-

sition de parties, et le procédé comprenant les différentes étapes et la relation d'une ou plusieurs de ces étapes par rapport à chacune des autres, dont tous sont exemplifiés

dans la description détaillée suivante, et dont le domaine

d'application sera indiqué dans les revendications.

Pour une meilleure compréhension de la nature et des objectifs de la présente invention, référence devra

être faite à la description détaillée suivante prise en

liaison avec le dessin annexé, dans lequel est représentée une vue idéalisée, partiellement schématique, partiellement en coupe, d'un appareil illustrant les principes de la

présente invention.

Le système de la présente invention comprend, de façon générale, un système de dosage multiple dans lequel des signaux proportionnels à l'importance de la liaison de deux ligands différents dans le système sont produits et

évalués en temps réel, typiquement simultanément, c'est-à-

dire, soit sensiblement simultanément, soit dans une séquence d'observations ou de mesures prises à l'intérieur d'un laps de temps relativement court par rapport au même échantillon soumis au dosage. On préfère, dans la plupart des cas, faire les observations de façon aussi simultanée que possible pour réduire tous effets de changements

rapides du bruit de fond.

Le système multiple de la présente invention devra être distingué des dosages à canaux multiples connus, dans lesquels deux analytes, ou davantage, sont dosés de façon sensiblement simultanée à l'aide de différents ligands marqués qui se lieront respectivement uniquement de façon spécifique aux analytes correspondants. Cf. Double Dosage Radioimmunologique pour la Détection de la Morphine et de la Cocaïne dans l'Urine (A Dual Radioimmunossay for the Detection of Morphine and Cocaine in Urine), A.S. Young, F. Rubio et S.E. Wagner, Clinical Chemistry,

Vol. 34, N 6, 1988, page 1161.

Cependant, un mode de réalisation typique du système de dosage multiple de la présente invention est un système qui détermine la réaction de liaison spécifique avec un analyte spécifique intéressant présent dans un échantillon, système dans lequel deux ligands marqués différemment, ou davantage, chacun avec ses propres caractéristiques différentes de liaison, sont observés de façon simultanée par rapport à l'échantillon présent dans le système. Les réponses obtenues sont traitées pour réduire les effets de liaison non-spécifique dans un tel dosage, de sorte que la réponse de liaison spécifique

puisse être déterminée de façon plus précise.

Par conséquent, le procédé de la présente invention fournit une méthode de dosage d'un analyte intéressant présent dans un échantillon. Le procédé comprend l'étape consistant à prévoir au moins deux ligands différents, couplés chacun à un type de marqueur différent respectif, pouvant être distingué d'un autre, au moins un premier de ces ligands étant capable de se lier de façon spécifique avec cet analyte. Le ligand et l'échantillon sont mis en contact entre eux, par exemple, par mélange, pour former un corps d'essai (qui peut être un volume liquide), comprenant un complexe mettant en jeu au moins ce premier ligand et l'analyte. La mesure est ensuite effectuée simultanément, quantitativement et séparément, de chacun des marqueurs tels qu'ils sont couplés seulement aux ligands liés dans le corps d'essai, et ces mesures sont comparées. Il va de soi que les mesures peuvent être effectuées plus facilement par ségrégation préalable des ligands liés des ligands non- liés, par exemple, par

élimination par lavage des ligands non-liés.

La présente invention est illustrée par un appareil de dosage de l'analyte présent dans l'échantillon par liaison spécifique de l'analyte à un ligand immobilisé

sur une surface de réaction, afin de former un complexe.

La liaison spécifique est effectuée par la mise en contact de l'échantillon avec le ligand immobilisé et un second ligand différent et marqué différemment. Les deux ligands différents sont fournis en proportion prédéterminée l'un par rapport à l'autre, et ils ne sont pas susceptibles de réactions immunologiques croisées. De préférence, le

second ligand ne se liera pas de façon spécifique à l'ana-

lyte ou à d'autres fractions présentes dans l'échantillon.

Les différents marqueurs sur les ligands peuvent être mesurés de façon quantitative. Les caractéristiques relatives de liaison non-spécifique de ces ligands par rapport à l'appareil sont dans une fonction ou relation connue ou prédéterminée. La mesure quantitative des marqueurs couplés seulement aux quantités liées des ligands est ensuite faite sensiblement simultanément. A partir de la proportion connue de ligands dans le corps d'essai, de la relation connue entre les caractéristiques de liaison nonspécifique des ligands à l'appareil, et de la mesure quantitative des marqueurs liés, on peut déterminer de façon relativement précise la liaison spécifique du premier

ligand à l'analyte.

En particulier, les différents marqueurs sont choisis de façon qu'ils puissent fournir respectivement des signaux qui peuvent être facilement distingués les uns des autres, par exemple, être fluorescents à des longueurs d'onde différentes. Ainsi, les mesures quantitatives effectuées sont celles de l'amplitude des signaux fournis par les marqueurs excités qui sont couplés aux ligands qui

sont liés à la fois de façon spécifique et de façon non-

spécifique au cours du dosage. En raison du fait que la proportion relative de ligands l'un par rapport à l'autre dans le corps d'essai ou le réactif est connue, et également en raison du fait que la relation entre les caractéristiques de liaison non-spécifique de ces ligands par rapport à l'appareil de dosage est également connue ou prédéterminée, il devient relativement simple de déterminer ensuite en temps réel la mesure dans laquelle les signaux mesurés par rapport au seul ligand qui se lierait de façon spécifique à l'analyte sont dus à un tel ligand lié de

façon spécifique.

Par exemple, supposons que le ligand (Ls) qui se liera de façon spécifique à l'analyte et le ligand (Ln) qui se liera de façon non- spécifique à l'analyte sont présents dans un rapport (R1) de 1:1 dans le corps d'essai sous la

forme d'un réactif. Supposons en outre qu'un test préa-

lable du réactif dans l'appareil de dosage en l'absence de tout analyte intéressant a établi que les ligands se lieront de façon non-spécifique dans le rapport (R2) de 1:2 (Ls:Ln). Le dosage nécessite alors que l'échantillon comportant l'analyte intéressant, s'il est présent, soit mis en contact avec le corps de réactif. Ceci conduira à la fois à la liaison spécifique de l'analyte et de Ls, et à la liaison non-spécifique des ligands à l'appareil d'essai (lequel terme dans ce contexte doit être compris comme englobant toutes réactions de liaison qui se produisent autres que la liaison spécifique de l'analyte à Ls). Une mesure simultanée est ensuite effectuée des signaux distinctifs et séparés (c'est-à-dire, des mesures de canaux

séparés) par les marqueurs respectifs sur les ligands liés.

Dans un cas idéalisé, les signaux provenant de Ln sont dus

seulement au ligand Ln qui a été lié de façon non-spéci-

fique, alors que les signaux provenant de Ls proviendront du ligand qui est lié à la fois de façon spécifique et de façon non-spécifique. En raison du fait qu'il est connu que les ligands étaient présents dans un rapport R1 et que les caractéristiques relatives de liaison nonspécifique de ces ligands dans le réactif était R2, on peut alors employer ces relations pour déterminer l'importance du

signal qui provenait de Ls lié de façon spécifique.

Par exemple, supposons que les amplitudes des

signaux sont mesurées à As et An, représentant respecti-

vement le Ls lié de façon spécifique et de façon non-

spécifique et le Ln lié de façon non-spécifique, la partie S du signal As due seulement au Ls lié de façon spécifique peut être exprimée sous la forme: (1) S = As - Anf(R1, R2) o f(R1, R2) est une fonction (non nécessairement soit

linéaire, soit non-linéaire) des valeurs R1 et R2.

Une forme d'exemplification simple de la fonction sous la forme d'un produit est: (2) f = kR1k2R2 o k1 et k2 sont tout simplement des constantes de proportionnalité ou de pondération à déterminer de façon empirique. Une variante de la présente invention est

illustrée par un appareil de dosage tel que décrit ci-

dessus, mais dans lequel additionnellement, il est employé encore un autre ligand, ou troisième ligand, marqué par un marqueur qui peut être mesuré quantitativement, qui peut être différencié facilement des marqueurs sur les deux autres ligands, et qui se liera de façon spécifique soit à un site différent sur l'analyte intéressant, soit à un analyte différent. Il va de soi que les trois ligands sont tous dans une proportion prédéterminée l'un par rapport à l'autre, les ligands n'étant pas susceptibles de réactions immunologiques croisées. Les caractéristiques relatives de liaison non-spécifique de ces trois ligands par rapport à l'appareil sont dans une fonction ou relation connue ou prédéterminée. Ce système fournit alors trois canaux, deux spécifiques et un non-spécifique, canaux à partir desquels les caractéristiques de liaison spécifique des deux ligands

se liant de façon spécifique peuvent être déterminées.

Un mode de réalisation de la présente invention peut être avantageusement décrit dans un contexte d'un système de dosage immunologique par fluorescence, employant des marqueurs fluorescents, en particulier un dosage employant des cellules de réflexion totale atténuée (RTA), mais il doit être entendu que les principes de l'invention s'étendent à d'autres types de dosages mettant en jeu des réactions de liaison spécifique et employant d'autres types

de marqueurs détectables.

L'utilisation d'une cellule RTA sous la forme

d'une plaque épaisse de matière transmettant le rayon-

nement, pour observer et mesurer la fluorescence induite au niveau d'une surface de cellule par une onde évanescente et

se déplaçant à travers la cellule sensiblement perpen-

diculairement au plan de cette surface de cellule, a tout d'abord été suggérée par T. Hirschfeld dans le brevet

américain n 3 604 927. Un appareil de dosage immuno-

logique RTA plus sophistiqué est représenté et décrit en détail dans le brevet américain n 4 558 014 délivré le

décembre 1985, et la description et le fonctionnement

d'une telle cellule RTA sont incorporés ici par référence.

Un avantage distinct est obtenu par l'utilisation d'une telle cellule RTA dans la présente invention, parce que les signaux de fluorescence détectés par une telle cellule ne se produisent qu'à l'intérieur de la zone évanescente adjacente à la surface de réaction de la cellule. Ainsi, la cellule, en tant que telle, sépare automatiquement les

ligands libres des ligands qui sont liés de façon non-

spécifique à la surface de réaction et qui sont liés de façon spécifique dans des complexes formés à la surface de réaction. Si l'on se réfère au dessin, on voit qu'il est représenté une section transversale d'un fragment d'une cellule de dosage à réflexion totalement interne 10. Un mode de réalisation préféré de la cellule 10 comprend une tige ou fibre cylindrique 12, qui est un corps optiquement transparent, sensiblement cylindrique, allongé, adapté pour propager, le long de sa longueur, par des réflexions internes totales multiples, un rayonnement optique pénétrant par une extrémité de la fibre à l'intérieur d'un angle solide établi, sensiblement à symétrie de révolution autour de l'axe longitudinal de la fibre. A titre d'exemple, la fibre 12 peut être faite de n'importe laquelle parmi un certain nombre de matières optiquement transparentes, telles que le verre, le quartz, le saphir, le polypropylène, les polyoléfines, le Nylon et similaires, ayant un indice de réfraction supérieur à celui de

l'échantillon fluide à doser. Comme on le décrira ci-

après, un polymère de synthèse est préféré dans la mesure

o la fixation sur celui-ci d'un revêtement décrit ci-

après peut être effectuée plus facilement que sur un substrat minéral, tel que le verre. De préférence, la

fibre 12 est enfermée à l'intérieur d'un tube capil-

laire 14, formé d'une matière qui est relativement insoluble et nonréactive avec le fluide à doser. La fibre 12 passe à travers et est supportée coaxialement à l'intérieur [du tube capillaire 14, de façon typique par un bouchon 16, ce qui permet ainsi de disposer de la totalité de la fibre excepté de la face d'extrémité 18 à

l'intérieur du tube 14.

Est disposé sur une partie de la surface externe de la fibre 12, un revêtement 20 immobilisé ou prélié, lequel, par exemple, peut être formé de l'un des réactifs d'une réaction de type immunoréaction, c'est-à-dire une fraction d'un complexe antigène-anticorps. De façon typique, on peut appliquer le revêtement en dotant tout d'abord la surface de la fibre ou le substrat d'une pluralité de sites de couplage, puis un certain nombre des fractions désirées d'un complexe anticorps-antigène peuvent être liées à ces sites, de préférence par covalence et d'une manière connue. Les sites de couplage sur le substrat, sur lequel les fractions choisies du complexe antigène-anticorps sont initialement immobilisées, sont choisis de façon à fournir l'immobilisation requise sans affecter de façon appréciable l'affinité et l'avidité de la fraction pour la partie complémentaire du complexe. Si la fibre 12 est en verre, les sites de fixation appropriés peuvent être fournis, comme cela est bien connu, par exemple, par réaction d'un composé silylé avec la surface du verre. Le couplage d'autres composés silylés appropriés, et des procédés par lesquels des groupes carboxyle, amino et autres groupes réactifs d'anticorps ou d'antigène peuvent être liés de façon covalente à diverses matières minérales, sont décrits par Weetall dans le brevet américain n 3 652 761. La liaison à des polymères est souvent plus facile, et il existe une vaste littérature décrivant l'immobilisation d'anticorps et d'antigènes sur la surface de polymères. Le revêtement 20 peut également être appliqué par adsorption dans certains cas, par simple mouillage de la surface de la cellule par un réactif

approprié ayant une fraction choisie de façon appropriée.

Par exemple, pour le dosage bien connu en sandwich, la fraction choisie à immobiliser sur le substrat RTA devrait être un ligand qui se liera de façon spécifique à l'analyte intéressant. Un tel ligand est, de préférence, fourni en quantité suffisante pour donner un nombre de sites de réaction largement en excès du nombre de molécules ou de fractions d'analyte à doser, de sorte que les sites de réaction ne seront pas saturés ultérieurement. La cellule revêtue devrait alors être mise en contact à la fois avec l'échantillon qui peut contenir l'analyte qui est dosé et le réactif contenant les deux ligands marqués ou repérés, et on laisse les réactifs incuber pendant un laps de temps suffisant pour assurer que les réactions de liaison ont été achevées de façon substantielle. Les signaux obtenus à partir des ligands marqués qui se sont

liés à l'analyte immobilisé et se sont liés de façon non-

spécifique à d'autres parties de l'appareil de dosage sont ensuite mesurés. Le signal mesuré provenant du second ligand lié (c'est-à-dire, celui qui n'est pas capable de se lier de façon spécifique à l'analyte) peut alors être utilisé pour prédire (par l'intermédiaire d'une abaque, d'une table ou d'une formule) quelle quantité ou proportion du signal reçu provenant du premier ligand lié provenait de

la liaison spécifique de ce dernier à l'analyte.

Dans le système RTA décrit à titre d'exemple, une source 24 est adaptée pour adresser un faisceau lumineux 22 à la cellule 10. Alors que la source 24 peut être une lumière de source à large bande, telle qu'un condenseur éclairé par de la lumière provenant d'une lampe à incandescence, une diode électroluminescente, la lumière solaire et similaires, on préfère que la source 24 constitue une double source pour fournir un rayonnement d'excitation à l'intérieur d'une paire de bandes de longueurs d'onde étroites et, à cet effet, peut comprendre des filtres passe-bandes appropriés. Les longueurs d'onde centrales des deux bandes sont choisies conformément aux caractéristiques d'absorption des fluorophores utilisés comme marqueurs sur les ligands marqués, de façon à exciter ces derniers en fluorescence lorsqu'ils sont éclairés. La source lumineuse 24 comprend également des moyens appropriés de formage du faisceau, tel que cela est entendu par l'homme du métier, pour éclairer la lentille d'objectif 28 par un faisceau de vergence approprié, de façon à permettre à la lentille 28 de former l'image de l'ouverture de la source sur la face d'extrémité 18, de préférence sans aucun rayon incident sur la face 18 à un angle supérieur à celui correspondant à l'ouverture

numérique de la fibre.

Des moyens, tels qu'un système 30 de décomposi-

tion de faisceau, sont interposés entre la source 24 et la lentille 28. Dans un mode de réalisation préféré, le système 30 de décomposition de faisceau est formé de façon

à réfléchir les deux bandes de longueurs d'onde d'excita-

tion et à transmettre les émissions fluorescentes respec-

tives provenant de la face 18. Si l'échantillon contenant l'analyte est introduit dans l'espacement 32

entre la fibre 12 et le tube 14, l'analyte réagira avec le ligand immobilisé dans le revêtement 20, en supposant que le ligand ait été choisi pour se lier de façon spécifique à cet analyte, et un peu

de l'analyte est présent dans l'échantillon. Si mainte-

nant, pour effectuer un dosage en sandwich, on introduit les deux ligands différents, marqués différemment, dans l'espacement 32, le premier ligand marqué se liera de façon spécifique à la fois à l'analyte libre et à l'analyte qui a été lié au ligand immobilisé. Le second ligand marqué ne se liera pas de façon spécifique à l'analyte, mais on peut s'attendre à ce qu'il se lie de façon non-spécifique à la surface de la fibre 12, comme le fera également un peu du

premier ligand marqué.

Lors de l'introduction d'un faisceau lumineux provenant de la source 24 à un angle approprié dans la face 18 de la fibre 12, le faisceau se propagera à travers la fibre par réflexion interne totale, créant une onde évanescente dans une zone évanescente (non représentée) contiguë à la surface de la fibre. L'onde évanescente, si elle est incidente sur de tels ligands liés, amenera les marqueurs ou repères à être fluorescents à deux longueurs d'onde différentes ou dans deux canaux différents, et une grande partie de cette fluorescence sera renvoyée ou redirigée dans le milieu de la fibre 12, un peu à ou au- dessus de l'angle critique et un peu au-dessous de l'angle

critique. La lumière renvoyée dans la cellule à ou au-

dessus de l'angle critique se propagera à travers la

fibre 12, un peu émergeant de la face d'entrée 18.

La mesure des amplitudes respectives des deux longueurs d'ondes différentes de lumière fluorescente émergeant de la face 18 par des moyens de détection électro-optiques 34 indiquera la présence quantitative respective des ligands liés. A cet effet, les moyens 34 peuvent comprendre deux détecteurs électro-optiques

respectivement sensibles aux longueurs d'ondes respectives.

En variante, on peut également employer, au lieu de la source 24 et des moyens de détection 34, un fluorimètre ayant des filtres d'excitation et d'émission commutables, appropriés respectivement à l'excitation et à la détection de l'émission par les marqueurs correspondants. De telles mesures des amplitudes des signaux émis par les marqueurs, conjointement avec l'autre information prédéterminée concernant les valeurs de R1 et R2, peuvent alors être introduites dans des moyens 36, tels qu'un calculateur numérique programmé de façon appropriée ou un circuit proprement cablé, pour effectuer la détermination désirée, comme décrit ci-dessus, de l'importance de la liaison

spécifique obtenue.

L'utilité d'un système multiple pour la détermination de liaison nonspécifique en présence de liaison spécifique a été montrée dans un système d'essai exemplifié dans l'exemple détaillé suivant. Le réactif d'essai était formé d'IgG anti-bovine de chèvre (en tant que premier ligand attendu pour se lier de façon spécifique à l'IgG bovine), marquée par de la fluorescéine d'une manière connue, et de l'IgG anti-souris de chèvre (en tant que second ligand), marquée par de la rhodamine d'une manière connue. La cellule RTA, à savoir une fibre de quartz revêtue de polystyrène, a été revêtue au moins dans

une zone de réaction sur sa surface, par de l'IgG bovine.

Ces réactifs ont été obtenus auprès de Jackson Immuno-

logical Corporation, et les anticorps ont été pré-sélec-

tionnés par le fournisseur pour la réactivité croisée.

Une détermination préliminaire de la liaison non-spécifique des deux anticorps a tout d'abord été effectuée en ce qui concerne un certain nombre de fibres de quartz revêtues de polystyrène, nues, sensiblement identiques, en incubant tout d'abord ces dernières dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH: 7,4), obtenue auprès de Sigma Chemical. Après incubation, chacune des fibres a été placée dans une cellule à circulation dans un fluorimètre RTA ayant une paire de canaux détecteurs sensibles respectivement aux longueurs d'ondes majeures de respectivement la fluorescéine et la rhodamine (530 nm et 580 nm). Conformément à un mode de réalisation préféré, on emploie un fluorimètre ayant des filtres d'excitation et d'émission commutables, appropriés respectivement à l'excitation et à la détection de la fluorescence émise par la fluorescéine et par la rhodamine, c'est-à-dire des filtres d'excitation 480/20 (longueur d'onde centrale de 480 nm, passe-bande de 20 nm) pour la fluorescéine, et 530/30 pour la rhodamine; des filtres de fluorescence de 530/30 pour la fluorescéine et de 580/20

pour la rhodamine.

Chaque fibre a été lavée dans un courant de PBS pendant deux minutes. On a arrêté l'écoulement, de la

lumière d'excitation (480 et 530 nm en séquence) d'inten-

sité fixée, était introduite dans la fibre à une extrémité,

et des lectures de bruit de fond (en mV) ont été enregis-

trées pour chacun des deux canaux, l'une lisant le bruit de fond dans le canal de détection de la fluorescéine et l'une, dans le canal de détection de la rhodamine. Le PBS a ensuite été chassé de la cellule à circulation et remplacé par un courant de solution de volumes égaux de 7, 5 gg/ml d'IgG anti-souris marquée par de la rhodamine et

7,0 pg/ml d'IgG anti-bovine marquée par de la fluorescéine.

On a arrêté l'écoulement, et on a laissé la fibre incuber pendant deux minutes à la température ambiante. La solution d'anticorps a ensuite été retirée par lavage avec un courant de PBS pendant quatre minutes. La même lumière d'excitation a été à nouveau introduite dans la fibre, et des lectures (en mV), représentant la somme des bruits de fond respectifs et de la liaison non-spécifique, ont été prises pour obtenir des valeurs d'Af et Ar pour les canaux de fluorescéine et de rhodamine respectivement pour quatre

telles fibres.

Les données sont résumées dans le Tableau A suivant, dans lequel Af et Ar représentent respectivement l'amplitude en mv des signaux reçus à partir des IgG

marquées par la fluorescéine et la rhodamine, liées. Pré-

et post-inc. désignent les signaux mesurés respectivement avant l'incubation et après l'incubation et le lavage. La réponse de liaison est tout simplement la différence entre les signaux respectifs pré-inc. et post-inc., et le rapport

de liaison est le rapport des réponses de liaison.

Tableau A

Réponse de système Réponse de liaison Rapport de liaison

Pré-inc. Post-inc.

Af Ar Af Ar Af Ar Fluor./Rhod.

303 297 712 651 409 354 1,155

398 492 1170 1080 772 588 1,313

338 322 744 668 406 346 1,173

397 355 8955 764 498 409 1,215

Notons que le rapport de liaison moyen était de 1,215 avec un écart-type de 0,070 et un C.V. de 5,798%. La

réponse LNS moyenne pour Af était de 521 mv avec un écart-

type de 172,5 mv (C.V.: 33%), ce qui est en fait une

mesure du bruit au niveau d'analyte zéro.

Il va de soi que les réponses précédentes ont

été faites de surfaces qui étaient exemptes d'antigène.

Cependant, on comprendra que l'on peut réaliser une série analogue de mesures sur une fibre bloquée par une protéine ou quelque autre agent de blocage qui n'est pas lié de

façon spécifique par l'un ou l'autre des anticorps.

L'utilisation de tels bloqueurs devrait servir à réduire les effets indésirés possibles dus à des différences dans les caractéristiques de liaison non-spécifique des anticorps en ce qui concerne les fibres respectivement

bloquées et nues.

On a ensuite fait réagir le même mélange d'anticorps avec cinq des fibres identiques telles que celles utilisées au préalable. Le même mode opératoire que celui décrit a été suivi, excepté que les fibres ont été préparées par incubation pendant cinq minutes dans 0,5 gg/ml d'IgG bovine plutôt que par incubation dans du PBS. Les résultats de l'exemple sont présentés dans le

Tableau B.

Tableau B

Réponse du système Réponse de liaison

Pré-inc. Post-inc.

Af Ar Af Ar Af Ar

729 501 1650 1183 921 682

568 435 1508 987 940 552

478 457 1355 1030 877 573

420 322 722 569 302 247

542 502 1530 1161 988 659

Ces dernières données permettent de déterminer que la réponse spécifique fournie par l'IgG marquée par la fluorescéine était la réponse de liaison Af moyenne totale moins 1,215 (le rapport de liaison prédéterminé trouvé dans le Tableau A) multiplié par l'Ar moyenne. Ceci fournit une réponse de liaison moyenne de 146,2 mv, avec un écart-type

de 102 mv.

La méthode classique de la technique antérieure d'analyse des données consiste à prendre la valeur Af moyenne du Tableau B et à soustraire de celle-ci la valeur Af moyenne due seulement à la liaison non-spécifique telle que présentée en tant que l'Af moyenne dans le Tableau A. D'après cette méthode, la réponse de liaison spécifique

moyenne est de 284,6 mv, et l'écart-type est de 284,3 mv.

Une méthode commode de comparaison de la technique antérieure et de la méthode de la présente invention est de déterminer le rapport moyen signal-à-bruit de fond (S/B) au niveau d'analyte utilisé. Conformément à la méthode de la technique antérieure, le S/B est alors de 284,6/284,3 ou de 1,00, là o la méthode de la présente invention donne un S/B de 146, 2/102 ou 1,43. Ceci constitue une amélioration du S/B d'environ 1,5 au niveau d'analyte choisi et une réduction du bruit de fond d'un facteur d'environ 2,8 dans

la réponse d'analyte zéro.

Un autre exemple d'appareil multiple de la présente invention qui est utilisé pour déterminer la LNS peut être vu dans ce qui suit. Il est connu qu'un virus peut induire la formation de plus d'un type d'anticorps,

par exemple, deux anticorps différents spécifiques respec-

tivement de l'enveloppe et du noyau du virus. A des fins de diagnostic, on peut souhaiter doser un échantillon, par exemple de sang, supposé contenir les anticorps dirigés

contre un type spécifique d'un tel virus.

En conséquence, on peut immobiliser le lysat de ce virus, par exemple, sous la forme d'un revêtement sur la surface d'une fibre optique, appliqué par exemple par adsorption. Cette fibre revêtue est ensuite mise en contact avec cet échantillon, ce qui permet ainsi de former des complexes par liaison spécifique des fragments de lysat de noyau et d'enveloppe avec n'importe quels anticorps correspondants respectifs qui peuvent être présents dans l'échantillon. Un réactif est préparé, contenant un rapport connu de première et seconde protéines synthétiques ou naturelles, correspondant respectivement aux protéines d'enveloppe et de noyau du virus et marquées respectivement par des marqueurs fluorescents, tels que la fluorescéine et la rhodamine d'une manière connue. Le réactif est mélangé avec l'échantillon et la fibre revêtue, de sorte que les protéines de ce réactif puissent également se lier de façon spécifique aux anticorps liés antérieurement au revêtement de lysat, et se lier de façon non-spécifique ailleurs à la fibre. Le rapport de liaison spécifique des deux protéines est déterminé par le rapport des sites de liaison fourni par les quantités relatives des deux anticorps présents dans l'échantillon et liés au revêtement. S'il existe une connaissance a priori du rapport de tels sites de liaison, le réactif est alors préparé avec un rapport de protéines qui est différent de façon marquée du rapport des

sites de liaison.

Les protéines marquées liées à la fibre sont alors excitées en fluorescence séparément et sensiblement simultanément dans l'appareil de la présente invention, fournissant des signaux produits par une combinaison de liaison spécifique et non-spécifique des protéines marquées. Cependant, il apparaîtra à l'évidence que le rapport des signaux respectifs produits par les marqueurs sur les protéines qui sont spécifiquement liées correspond au rapport des sites de liaison, mais que le rapport des signaux produits par des protéines marquées qui sont liées de façon non-spécifique correspondra au rapport connu auquel les protéines respectives sont fournies dans le réactif. Si le rapport des sites de liaison ou des anticorps est également connu, du fait que les deux rapports diffèrent de façon très importante (étant sous le contrôle du préparateur du réactif), les amplitudes des signaux respectifs peuvent alors être ajustées de façon

correspondante pour éliminer l'effet de la liaison non-

spécifique. S'il n'y a pas de connaissance a priori du rapport des sites de liaison, c'est-à-dire du rapport des anticorps, on peut effectuer un dosage préalable en utilisant un autre réactif dans lequel les protéines sont

présentes dans un premier rapport, par exemple, l'unité.

En utilisant les résultats de ce dosage, un second dosage est ensuite effectué avec un second réactif dans lequel le rapport de protéines a été établi, par exemple, comme

l'inverse de la mesure des signaux dans le premier dosage.

La mesure de signaux dans le second dosage fournit une information suffisante à partir de laquelle on peut faire

des calculs qui sépareront les effets de la liaison non-

spécifique.

Etant donné que certaines modifications peuvent être apportées dans le procédé et l'appareil ci-dessus sans s'écarter du domaine de l'invention mise en jeu, il est

entendu que toute la matière contenue dans la description

ci-dessus ou représentée dans le dessin annexé doit être interprétée comme illustrative et non dans un sens limitatif.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de dosage d'un analyte intéressant présent dans un échantillon, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à: - prévoir au moins deux ligands différents, couplés chacun à un type de marqueur différent respectif, pouvant être distingué d'un autre, au moins un premier desdits ligands étant capable de se lier de façon spécifique avec ledit analyte;

- mettre en contact lesdits ligands et ledit échan-

tillon, pour former un corps comprenant un complexe mettant en jeu au moins ledit premier ligand et ledit analyte; - mesurer simultanément quantitativement et séparément chacun desdits marqueurs tel qu'il est couplé seulement aux ligands liés dans ledit corps; et

- comparer les mesures desdits marqueurs.

2 - Procédé selon la revendication 1, caracté-

risé par le fait qu'il comprend les étapes consistant à: - prévoir un appareil dans lequel ledit dosage doit être conduit; - prévoir les deux ligands différents, marqués de façon différente, dans une proportion prédéterminée entre

eux, chacun desdits ligands ayant des caractéristi-

ques de liaison spécifique différentes par rapport audit analyte intéressant, les caractéristiques de liaison non-spécifique desdits ligands par rapport audit appareil étant dans une corrélation connue entre elles;

- mettre en contact lesdits ligands avec ledit échan-

tillon dans ledit appareil, de façon à effectuer ladite liaison spécifique et à former ledit complexe; et - déterminer la liaison spécifique dudit premier ligand par rapport audit analyte à partir de la comparaison desdites mesures, de ladite proportion connue et de

ladite corrélation connue.

3 - Procédé selon la revendication 2, caracté-

risé par le fait qu'il comprend l'étape de séparation, après ladite étape de mise en contact, de sensiblement la totalité dudit analyte et desdits ligands à partir des ligands qui sont liés audit analyte et audit appareil. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que chacun desdits différents marqueurs, une fois excité, peut fournir respectivement un signal pouvant être distingué d'un autre, et que lesdites mesures sont celles de l'amplitude desdits signaux

provenant sensiblement seulement des ligands liés.

- Procédé selon la revendication 4, caracté- risé par le fait que chacun desdits différents marqueurs, une fois excité, fournit un rayonnement fluorescent à une

longueur d'onde qui diffère d'une autre.

6 - Procédé selon la revendication 2, caracté-

risé par le fait que le second desdits ligands se liera de façon nonspécifique audit analyte ou à d'autres fractions

dudit échantillon.

7 - Procédé selon la revendication 6, caracté-

risé par le fait que ledit premier ligand est fourni en excès de la quantité attendue pour se lier de façon

spécifique avec ledit analyte dans ledit échantillon.

8 - Procédé selon la revendication 4, caracté-

risé par le fait qu'il comprend l'étape de la détermination de ladite corrélation connue par: - le dosage préalable desdits ligands dans ledit appareil en l'absence dudit analyte, de façon à mesurer quantitativement les amplitudes des signaux respectifs émis par lesdits ligands marqués qui deviennent non-spécifiquement liés pendant le dosage préalable; et - la détermination du rapport des amplitudes des signaux mesurés provenant dudit premier ligand et du

second desdits ligands.

9 - Procédé selon la revendication 4, caracté-

risé par le fait que ladite étape de détermination est effectuée par une modification, conformément à une fonction de ladite proportion connue et dudit rapport connu, de la valeur du signal provenant du second desdits ligands, pour fournir ainsi une valeur modifiée, et une comparaison à ladite valeur modifiée de l'amplitude du signal émis par

ledit premier ligand.

- Procédé selon la revendication 4, caracté-

risé par le fait que ladite étape de détermination est effectuée en soustrayant de l'amplitude du signal émis par ledit premier ligand, le produit dudit rapport connu multiplié par ladite proportion connue multiplié par

l'amplitude du signal émis par le second desdits ligands.

11 - Appareil de dosage d'un analyte intéressant présent dans une solution, caractérisé par le fait qu'il comprend, en combinaison: - au moins deux ligands marqués différemment, chacun marqué différemment par des marqueurs respectifs, la présence desdits marqueurs pouvant être déterminée quantitativement, au moins un premier desdits ligands étant capable de se lier de façon spécifique audit analyte; - une surface de réaction sur laquelle au moins ledit premier ligand peut former un complexe lié de façon spécifique avec ledit analyte; et - des moyens pour mesurer simultanément quantitativement et séparément chacun desdits marqueurs tel qu'il peut

être lié à ladite surface.

12 - Appareil selon la revendication 11, caractérisé par le fait que ledit premier ligand est

immobilisé sur ladite surface de réaction.

13 - Appareil selon la revendication 11, caractérisé par le fait que ladite surface de réaction est

une surface d'une cellule de réflexion totale atténuée.

14 - Appareil selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu'il comprend des moyens pour introduire un rayonnement dans ladite cellule à des longueurs d'onde capables d'exciter les deux marqueurs précités pour qu'ils émettent des signaux respectifs différents. - Appareil selon la revendication 14, caractérisé par le fait que lesdits moyens de mesure simultanée, quantitative et séparée, comprennent une paire de détecteurs, chacun respectivement sensible à l'un

desdits différents signaux respectifs.

16 - Appareil selon la revendication 14, caractérisé par le fait que lesdits moyens de mesure simultanée, quantitative et séparée, comprennent un fluorimètre ayant des filtres d'excitation et d'émission commutables, appropriés respectivement à l'excitation et à

la détection de l'émission par lesdits marqueurs.