FR2640641A1 - Procede microbien pour la production du complexe antibiotique de cyclosporines - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à un procédé microbien de production du complexe antibiotique de cyclosporines et/ou de ses composants, la cyclosporine A, la cyclosporine B et la cyclosporine C, par la fermentation aérobie d'une souche de champignon filamenteux biosynthétisant le ou les nouveaux antibiotiques ci-dessus dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote utilisables ainsi que des sels minéraux, et l'isolement des produits formés, qui comprend la culture d'une souche de la nouvelle espèce de champignon Tolypocladium varium produisant le complexe antibiotique de cyclosporines, de préférence la souche Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, déposée à la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hongrie, sous le numéro NCAIM(P)F 001005. sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et des sources d'azote organiques et inorganiques ainsi que des sels minéraux, dans des conditions aérobies, de 25 à 30 degre(s)C et si cela est désiré, l'isolement et la purification du complexe antibiotique de cyclosporines ou de ses composants.

Description

La présente invention est relative à un procédé microbien pour la

production du complexe de cyclosporines ou de ses composants, la cyclosporine A, la cyclosporine B et la cyclosporine C

par fermentation aérobie.

Les cyclosporines sont des oligopeptides cycliques, neutres, apolaires à onze éléments, dans lesquels certains des amino-acides sont différents. La cYclosporine A et la cyclosporine B ont été d'abord isolées par A RPuegger et coll. [Helv. Chim. Acta 59, 1075 (1 976)11 tandis que les cyclosporines B, D, E et 6 ont été isolées par PQ. Traber et coll. (Helv. Chim. Acta 80, 1568 (1977)] à partir de la culture d'un champignon (NRRL 80441, identifié antéreurement en tant que Trichoderma polysporum (Ling ex Pers.) Rifai. Le taxonomie de la souche mentionnée a été ensuite revue et celle-ci a été ensuite

décrite en tant que Tolypocladium inflatum Gams dans la littérature.

On connait actuellement 25 antibiotiques différents de

type cyclosporine, sous les noms de cyclosporines A à Z ([Helv.

Chim. Acta 70, 13 (1987)]. Parmi ces composants, la cyclosporine A est la substance la plus intéressante en ce qu'elle a un effet immunosuppresseur. La cyclosporine A e été d'abord connue comme

antibiotique antifongique doux, son important effet immuno-

suppressQur n'a été reconnu que plus tard [J. F. Borel et coll.:

immunology 32, 1017 (1977)].

Il a été confirmé dans des séries d'essais in vitro et in vivo que les cyclosporines A, C et 6 sont des agents

immunosuppresseurs très spécifiques.

La cyclosporine A inhibait une réponse immune médiatisée a la fois humorale et cellulaire. L'étude de son mode d'action a montré quelle inhibait la prolifération des cellules T ainsi

que la synthèse de l'interleukine-2.

L'utilisation thérapeutique de la cyclosporine A dans des transplantation d'organes humains a été décrite en 1978. Elle a d'abord été appliquée dans des transplantations du rein (P. J. Caine et coll.: Lancet 1978/2, 1323] et de la moelle osseuse (P. L. Powles et

coll.: Lancet 1978/2, 13271.

Au cours des transplantations d'organes (rein, pancréas, foie, coeur, poumon) et des transplantations de moelle osseuse, le rejet des organes ou de la moelle osseuse a été supprimé par l'application de la cyclosporine A De plus, la cyclosporine A a été appliquée avec succès - pour le traitement de certaines maladies auto-immunes (uvéite,

rnumatisme articulaire, psoriasis et myasthenla grave/.

Dans la littérature des brevets, les microorganismes suivants ont été utilisés pour produire le complexe de cyclosporines: Cylindrocarpon lucidum Booth, NPPRL 5760 (spécification de brevet suisse No. 589.715); TolypocIadium inflatum Gams, NRPPL 8044 (selon la taxonomie antérieure: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Pifai (spécification de brevet suisse No. 603.7903 selon Bisett (1983): tol. inrflatum W. Gams, 1971 est synonyme de T-l. niveum (Rostru?) Bisett cor.. mcv. et Fusarium solani

MrIL,- I b4Y, MCI- 1550 [demande de brevet japonais pubilee rAu.

82.63093). Les procédés de fermentation effectués avec les microorganismes ci-dessus ont fourni de faibles taux de production de cyclosporines après de longues périodes de fermentation et les

rendements de l'isolement étaient aussi faibles.

La Demanderesse a cherché à découvrir des souches de microorganismes capables de produire le complexe antibiotique de cuciosporines ou ses composants, à des concentrations supérieures et dans des conditions plus avantageuses que celles des souches antérieures. Le criblage d'un grand nombre de souches de champignons filamenteux isolées à partir du sol, a permis de détecter une souche de microorganisme du genre Tolypocladium genus capable de biosynthétiser le complexe antibiotique de cyclosporines. Ce microorganisme dénommé CY/93 par nos soins, n'a pas pu être identifié dans des études taxonomiques avec l'une quelconque des espèces de champignon produisant le complexe antibiotique de cyclosporines. Le Tolypocladium varium species nova CY/93 est un nouveau taxon du genre Tolypocladium qui peut être

différencié au niveau de l'espèce.

A partir des découvertes précédentes, I'invention est relative à un procédé microbien fournissant un bouillon contenant de fortes concentrations en cyclosporines, comprenant l'application

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d'un nouveau microorganisme, Tolypocladlum varium species nova CY/93, déposé à la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Collection Nationale des Microorganismes Agricoles et Industriels), Budapest, Hongrie, sous le numéro NCAJM(P)F 001005. Le bouillon de fermentation contient à côté de la cyclosporne A, le produit principal, àgalement do petites quantités de cyclosporine B et de cyclosporine C. Les caractéristiques taxonomiques de la nouvelle espèce de champignon ont été comparées aux principales propriétés diagnostiques de l'espèce Tolypocladium de la façon suivante: Le genre Tolypocladium a été décrit en premier par Gams en 1971 en tant que nouveau genre de Moniliales du sol. Ses popriétés caractéristiques sont: une croissance lente, des colonies blanches en forme d'oreiller, des phialides terminaux et latéraux développés en partie sur une courte ramification secondaire, avec une base fortement gonflée et filamenteuse, un

cou fréquemment courbé, se terminant dans une conidie unicellulaire.

6ams a différencié les 3 nouvelles espèces suivantes dans ce genre: T. geodes, T. cylindrosporum et T. inflatum. T. geodes a une odeur de sol prononcée de type Actinomyces, tandis que la nouvelle espèce T. varium sp. nov. CY/93 en est complètement dépourvue. De plus, les cellules porteuses de T. gQodes sont notablement plus étroites que celles de T. varium sp. nov. CY/93. Les conidies de T. cyclodrosporum sont longues et allongées de façon caractéristique, tandis que celles de T. varium sp. nov. CY/93 sont sphériques et seulement légèrement allongées. Les conidies de T. inflatum sont ovoïdes et plus longues que celles qui sont observées dans la culture de T.

varium sp. nov.CY/93. Les phialides de T. inflatum sont ca-

ractéristiquement produits dans des verticilels, soit di-

rectement sur les hyphes, soit sur des cellules porteuses de 2 à 3 pm de long. T.varium sp.nov.CY/93 ne présente pas un

tel modèle d'arrangement verticillé, celui-ci n'est détecta-

ble de temps-en-temps que dans des cas isolés. Les colonies de toutes les espèces Tolypocladium connues sont blanches, principalement parce que le mycélium. aérien ressemble à du

coton blanc, tandis que l'envers des colonies est gris-

jaunâtre, incolore ou jaune. Aucun pigment soluble typique n'est produit. T.varium sp.nov.CY/93 peut aussi

êere différencié à ce propos:un pigment foncé gris som-

bre et noir respectivement est produit de façon variable dans le temps sur des milieux contenant du glucose et de la peptone ainsi qu'un extrait de levure-extrait de malt. L'évaluation taxonomique des nouvelles espèces comparées aux autres espèces Tolypocladium connues, a été faite d'après les publications suivantes: W. Gams, Persoonia, B6, 185-191 [1971); G. L. Barron: Can. J. Bot. BR, 439-442 [19801). ET Bisett, J. Can. J. Bot. 61, 1311 - 1329 (1983) Les modèles diagnostiques de T. varium sp. nov. CY/93

sont résumés dans ce qui suit.

Des colonies de dix jours ont un diamètre de 10 à 25 mm, leur surface est couverte de mycélium aérien blanc, cotonneux et richement sporulant. L'envers des colonies est gris-jaunâtre ou gris sale. Un pigment soluble gris sombre est produit dans certains milieux complexes. Une sporulation à la fois terminale et latérale est observée sur les hyphes du mycélium aérien. Les phialides sont localisés de façon solitaire ou sporadique, parfois dans des verticilles, directement sur les hyphes ou sur de courtes cellules porteuses (2 à 3 jPm). Les phialides sont formés à partir d'une base gonflée (2 à 4 x 2 à 3 Prm) et d'un long cou filamenteux (2 à 4 x 0,5 à 0,6 Pim). Les conidies des têtes sont petites (2 à 3 x 1,3 à 2,2 Jrm), généralement sphériques et lisses. L'épithète spécifique "varium" se réfère à la variabilité des phialides. To . varium present. dans son cycle de vie une certaine similitude avec le genre Harposporium, auquel nous nous référerons plus loin. La souche dénommée CY/93 ne peut pas utiliser le raffinose, mais elle se développe bien sur les sources de carbone suivantes: mannitol, inositol, saccharose, fructose, rhamnose, galactose, dextrose, arabinose et xylose dans une culture en surface. Ses cultures se développent médiocrement sur une gélose nutritive d'extrait de malt et se développent bien sur une gélose de farine de soja, une gélose Czapek et une gélose de pomme de terre- dextrose. La gélose de farine d'avoine et la gélose

de dextrose-extrait de levure ne conviennent pas pour le stockage.

Tol. varium diffère franchement de Tol. trigo-

nosphorum, lequel produit des conidies de forme trigonale

quand elles sont vues de face, avec des bordures légère-

ment concaves. Tol. varium diffère également de Tol.

balanoides. Ce dernier produisant des phialides latérales lagéniformes. En outre, la souche holotype (CY/93) de tolypocladium

varium n.sp. est différente de la souche de type authenti-

que de tolypocladium inflatum (CBS 714.70) en ce que la

dernière souche développe un mycélium aérien blanc et abon-

dant quand elle est cultivée sur un milieu nutritif maltose-

agar, alors que tolypocladium varium sp. nov. CY/93 ne pro-

duit pas un tel mycélium aérien. La souche type de tolypo-

cladium inflatum produit un endipigment rouge-brun dans son mycélium substrat sur milieu de culture fer-peptone agar, tandis que le mycélium substrat de tolypocladium

varium sp. nov. CY/93 reste jaune pâle. La souche tolypo-

cladium varium sp. nov. CY/93 n'utilise pas l'arabinose, tandis que tolypocladium inflatum le fait. Quand le nitrite de sodium est utilisé, cette dernière souche développe un

mycélium abondant tandis que tolypoclacium varium sp. nov.

CY/93 pousse difficilement.

La comparaison entre tolypocladium varium sp. nov.

CY/93 avec des souches authentiques d'autres espèces de tolypocladium, avec trichoderma polysporum ATCC 16.641 et avec cylindrocarpon lucium NRRL 5760 est résumé dans le

Tableau I.

TABLEAU I

o|oE.. =E-

E E E E_ _

_*-o' c-c c'_- e e -s _ _ - t: X'r-: U I= V: r- ci-C Démposition de la _ _++ ++ ce.lulose _. _._ Myc-é-lium aérien vert

ou bleu-vert. -

Production de pigment rouge sur King-agar _ _ _ Production de pigment brun fur fer-peptone _ _ _ aqar Production de pigment brun foncé sur agar. _ _ - + _ glycérol synthétique Utilisation du I saccharose + +++ +* + +4+ - + Utilisation de 1' inuline. __ -_ - +

Croissance à 5 C.

Croissance à 37 C +

Résistance au traite-

ment à la chaleur à 'C pendant 60 min. ++.. +++ +++ Production d'acide à partir de glucose ++ + ++ + + ++

Utilisation du salici-

late de sodium. - _ + + + + Utilisation du malonat de sodium ++ ++ + _ _+ Uti:isation du tartrat de sodium + ++ ++ - + + Production d'un pigmen lilas soluble sur agar - _ +++.++. _ tyrosine et leucine d'une souche de champignon filamenteux biosynthétisant le ou les nouveaux antibiotiques ci-dessus dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote utilisables ainsi que des sels minéraux, et l'isolement des produits formés, qui comprend la culture d'une souche de la nouvelle espèce de champignon Tolypocladium varium produisant le complexe antibiotique de cyclosporines, de préférence le Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, souche déposée à la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hongrie sous le numéro NCAIMPlP)F 001005, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone, des sources d'azote organiques et inorganiques ainsi que des sels minéraux, dans des conditions aérobies, dans une gamme de température allant de 25 à 'C et si cela est désiré, I'isolement et la purification du complexe

antibiotique de cyclosporines ou de ses composants ainsi produits.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le complexe antibiotique de cyclosporines est produit avec la nouvelle souche Tolypocladium varium sp. nov. CGY/93. La souche choisie est extrômement avantageuse en raison de sa croissance rapide. Il est très avantageux que la souche puisse utiliser le saccharose, le glucose, le sorbose, le maltose, le fructose, l'amidon, le glycérol ainsi que diverses graisses et huiles en tant que sources de carbone et une variété de sources d'azote organiques et inorganiques, comme une liqueur de macération de mais, une peptone, un extrait de levure, un extrait de viande, du nitrate de sodium, du nitrate d'ammonium, du sulfate d'ammonium ainsi que divers aminoacides. En plus des sources de carbone et d'azote indiquées ci-dessus, les milieux nutritifs utilisés pour la production du complexe antibiotique de cyclosporine peuvent aussi contenir des sels minéraux tchlorure de potassium, sulfate de magnésium ou phosphate monopotassique), des oligoéléments (cuivre, manganèse,

sels de fer) et aussi des vitamines et des agents antimousse.

Selon un procédé préféré de la présente invention, un milieu liquide est inoculé avec une suspension de conidies et de mycéliums, préparée à partir de la culture sur gélose inclinée de Tolypocladium varium sp. nov. GY/93. Après trois jours de culture, la pré-culture obtenue est utilisée pour inoculer le milieu appliqué pour la production des antibiotiques, qui est Qnsuite incubé à 25-30'C, de préférence à 25'C, pendant B à 7 jours. Pendant la fermentation, le pH est maintenu dans la gamme de 6,0 à 2,5, de préférence à 5,2. La fermentation est effectuée dans des conditions aérobies, sous une agitation vigoureuse (750 à 1000 tpm) et avec une aération de 300 litres/heure. La teneur en cyclosporines du bouillon est suivie pendant la fermentation, par dosage microbien et chromatographie liquide haute pression (HPLC). Dès que la quantité maximum d'antibiotiques est produite; ceux-ci sont récupérés à partir de la liqueur de culture par des méthodes d'extraction etou d'adsorption connues. La concentration des cyclosporines dans les bouillons est mesurée à partir de l'activité fongique des cyclosporines par le test de la diffusion en plaque. On peut utiliser avantageusement Aspergillus niger, Asper'gillus japonicus et Curvularia lunata comme

organismes d'essai [M. Dreyfuss et coll.: European J. Appl. Microbiol.

3, 125-133 (t 1976)]. La détermination par HPLC de la concentration des cyclosporines dans le bouillon a été effectuée à partir des échantillons de bouillon dilués dix fois avec du méthanol selon F. Kreuzig [J. Chromat. 290, 181 (1984)]. Selon les expériences de la Demanderesse, le complexe antibiotique de cyclosporines, contenant la cyclosporine A comme principal produit et la cyclosporine B et la cyclosporine C comme composants mineurs, est produit avec un rendement élevé (950 mcg/ml) par la nouvelle souche Tolypocladium

varium sp. nov. CY/93.

Des méthodes d'extraction peuvent être - avantageusement appliquées pour isoler le complexe de cyclosporines à partir du bouillon de fermentation. Avant l'extraction, le mycélium est séparé par filtration ou par centrifugation. Des antibiotiques produits pendent la fermentation peuvent avantageusement être récupérés par lavage des cellules de microorganismes avec des alcanols inférieurs, de préférence avec du méthanol, ou avec des cétones organiques, de préférence avec l'acétone, tandis que les cyclosporines peuvent être extraites du filtrat de bouillon avec des solvants organiques immiscibles à l'eau, comme l'acétate d'éthyle, l'acétate de n-butyle, le dichlorométhane, le 1,2- dichloroéthane ou le chloroforme, de préférence avec I'acétate de n- butyle. Le produit brut obtenu par extraction est contaminé par des pigments rouges et violets produits par le champignon, qui peuvent être éliminés par adsorption sur du charbon actif ou un gel de silice. Des contaminants lipidiques possibles (c'est-à-dire un agent antimousse) peuvent être séparés par répartition dans un système d'éther de pétrole et de méthanol contenant 1 0% d'eau, les impuretés étant transférées dans la phase

d'éther de pétrole.

La phase méthanolique aqueuse est concentrée sous pression réduite, puis le résidu aqueux est extrait avec du d.chlorométhane, qui est évaporé pour fournir la cyclosporine purifiée. La cyclosporine A peut être séparée des composants cyclosporines mineurs par chromatographie sur colonne et recristallisation. La structure des produits isolés a été déterminée par spectrographie de masse, analyse ces spectres UV, IR, PMN pour

1H, PMN pour 13C et par analyse des aminoacides.

Les exemples suivants illustrent la présente invention

sans la limiter.

EXEMPLE 1

Une suspension de conidies et de mycéliums, provenant d'une culture de Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 sur une gélose inclinée contenant de l'extrait de malt-extrait de levure, est préparée avec 5 ml d'une solution de chlorure de sodium à 0,9% On utilise 1 ml de cette suspension pour inoculer 100 mi de milieu

d'inoculum IC stérile dans un flacon Erlenmeyer de &00 mi.

l0 Composition du milieu IC: Glucose 40 g Caséine-peptone 6 g Nitrate de sodium 3 g Phosphate monopotassique 2 g Chlorure de potassium 0,5 g Sulfate de magnésium, 7HLO0 0>5 g

Sulfate de Fe(il), 7H20 0,01 g.

dans 1000 ml d'eau du robinet Le pH du milieu nutritif est ajusté à 5,2 avant la

stérilisation et le mélange est stérilisé à 121 C pendant 25 minutes.

La culture est incubée à 25'C sur un appareil rotatif à secousses (340 tpml, puis des portions de 5 ml de ce milieu d'inoculum sont utilisées pour inoculer 15 flacons Erienmeyer de 500 mi contenant

chacun 100 ml de milieu FC1 stérile.

Composition du milieu FCG: Glucose 80 g Tryjptone 40 g Urée 2 g Sulfate d'ammonium 12 g Nitrate de sodium 3 g Phosphate monopotassique 2 g Chlorure de potassium 0,5 g Sulfate de magnésium, 7HDO 0,5 g Sulfate de Fe(111, 7HEO 0,01 g dans 1000 ml d'eau du robinet Le pH du milieu nutritif est ajusté à 5,2 avant la

stérilisation et le mélange est stérilisé à 121 'C pendant 25 minutes.

Les flacons sont incubés à 25'0 sur un appareil rotatif à secousses (340 tpm). Pendant la fermentation, la concentration en

antibiotiques du bouillon est suivie par le test de diffusion en plaque.

L'Aspergillus niger est appliqué comme organisme d'essai. La concentration du complexe antibiotique de cyclosporines dans le

bouillon est dosée avec la cyclosporine A comme étalon.

La fermentation est poursuivie pendant 168 heures, après lesquelles le bouillon contient 400 iJig/ml de complexe antibiotique de cyclosporines. Le complexe de cyclosporines est Isolé

de la façon suivante.

Les cellules d'un litre de bouillon sont filtrées et les antibiotiques sont récupérés par deux lavages avec 200 ml de méthanol à chaque fois. La solution méthanolique aqueuse est concentrée sous pression réduite, puis le complexe antibiotique est

extrait à partir du concentrat aqueux avec 2 x 50 ml d'acétate de n-

butyle. Le teneur en cyclosporines du filtrat de bouillon est extraite-

avec 200 mi d'acétate de n-butyle. Les extraits d'acétate de n-

butyle sont rassemblés, séchés sur du sulfate de sodium anhydre, puis évaporés sous pression réduite à 40'C. Le produit brut obtenu (3,7 g) est dissous dans 10 ml de méthanol et transféré au sommet d'une colonne de gel de Sephadex LH-20 (colonne ayant une longueur de 40 cm et un diamètre de 2,5 cm) préparée avec du méthanol. Les impuretés lipidiques sont ensuite séparées par élution avec du méthanol. Les fractions contenant le complexe de cyclosporines sont évaporées sous pression réduite à 40'G. La séparation des composants du complexe de cyclosporines obtenu (1,05 g) est effectuée par chromatographie sur une colonne de gel de silice préparée à partir de 20 g de Kieselgel 40 (Reanal, Budapest), par élution avec des mélanges solvants de chloroforme-méthanol contenant des volumes de méthanol qui augmentent graduellement L'élution commence avec 100 ml de chloroforme, puis elle est poursuivie avec des mélanges de chloroforneméthanol dans lesquels la teneur en méthanol dans chaque portion de 100 ml est augmentée de 0,5. La teneur en cyclosporines des fractions est suivie par chromatographie en couche mince (plaque: Kieselgel 60

F%4, DC AJufoil (Merck), solvant révélateur: acétate d'éthyle-

isopropanol 95:5, détection: vapeurs d'iode), Les cyclosporines A, B

et C sont éluées de la colonne par des mélanges de méthanol-

chloroformne contenant 2,0%, 2,5% et 3,0% de méthanol, respectivement. Des fractions contenant les composants purs sont évaporées sous pression réduite, fournissant 225 mg de :yclosporine A [p.f.: 137-140'C, [C]D: 1890C (méthanoll], 25 mg de

cyclosporine B [p.f.: 149-151 1C) et 52 mg de cyclbsporine C (p.f.; 150-

152'C1).

EXEMPLE 2

Cinq litres du milieu d'inoculum IC, stérilisés à 121'C pendant 45 minutes dans un fermenteur de laboratoire de 10 litres, sont inoculés avec 200 ml d'une culture secouée d'inoculum préparàe de la façon décrite dans l'exemple 1, puis incubés à 252C, agités à 750 tpm et aérés avec 300!/h d'air, La fermentation est poursuivie pendant 72 heures, puis 500 ml de ce milieu d'inoculum sont utilisés pour inoculer 5 litres de milieu FC2, la stérilisation est effectuée à 121 'C pendant 45 minutes dans un fermenteur de laboratoire de 10 litres, Composition du milieu FC2: Glucose 80 g Tryptone 40 g Urée 2 g Sulfate d'ammonium 12 g Nitrate de sodium 3 g Phosphate monopotassique 2 g Chlorure de potassium 0,5 Z Sulfate de magnésium, 7H-20 05 g Sulfate de cuivre (11), 5HeO2 0,01 g Sulfate de manganèse (11), 7H20 0,01 g Sulfate de Fet(l), 71-120 0,01 g dans 1000 ml d'eau du robinet Le pH du milieu est ajusté à 5,2 avant la stérilisation. La culture inoculée est incubée à 25'C, agitée à 750 tpm et aérée avec

300 I/h.

La fermentation est poursuivie dans ces conditions pendant 144 heures jusqu'à obtention des titres maximum de

cyclosporines, puis le bouillon est récolté.

La cyclosporine A est isolée de la façoni suivante à pertir des 4,8 litres de bouillon de fermentation, contenant 500 ig[/ml du complexe de cyclosporines. Les cellules du microorganisme sont centrifugées et le complexe de cyclosponines est éliminé par deux lavages des cellules avec 1 litre de méthanol à chaque fois. La solution méthanolique aqueuse est concentrée sous pression réduite, puis le complexe antibiotique est extrait à partir du concentrat aqueux avec 2 fois

250 mi d'acétate de n-butyle.

Le complexe de cyclosporines est extrait du filtrat du

bouillon de fermentation avec 2 fois 500 mi d'acétate de n-butyle.

Les extraits d'acétate de n-butyle sont rassemblés, séchés sur du sulfate de sodium anhydre, puis évaporés sous pression réduite à 'C. La purification préliminaire du produit brut obtenu (1 9,2g) est eFTectuée par chromatographie sur une colonne préparée à partir de 100 g de Kieseigel 60 (dimension particulaire 0,063 à 0,2 mml, avec un solvant d'élution comprenant du chloroforme, du méthanol et de I'acétone (924:44). Les fractions contenant le complexe de cyclosporines (analyse par chromatographie en couche mince (plaque: Kieselgel 60 Fe54, DC Alufoil (Merck), solvant révélateur hexane-acétone 2:1; détection: réactif chloretolidinel sont évaporées à siccité. Le résidu de l'évaporation (5,28 g) est soumis à une chromatographie sur colonne pour fournir la cyclosporine A La colonne est préparée à partir de 1 15 g de Kieselgel 60 (dimension particulaire 0,063 à 0,2 mml et elle est éluée avec des mélanges d'hexaneacétone contenant des volumes d'acétone de plus en plus grands. La cyclosporine A est éluée de fa colonne avec un mélange contenant 23% d'acétone. En évaporant les fractions contenant la cyclosporine A, on obtient 1,48 g de cyclosporine A

EXEMPLE 3

Une suspension de conidies et de mycéliums, provenant d'une culture de Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 sur une gélose inclinée contenant de l'extrait de malt-extrait de levure, est préparéQ avec 5 ml d'une solution de chlorure de sodium à 0,9%, elle est utilisée pour inoculer 800 ml du milieu d'inoculum IC décrit dans l'exemple 1 et stérilisée dans un flacon Erienmeyer de 3 I. Le flacon est incubé sur un appareil rotatif à secousses (340 tpm) à 25'C pendant 2,5 jours, puis le contenu est inoculé dans 5 litres d'un milieu FC3, stérilisé dans un fermenteur de laboratoire de 10 litres à 12 lC

pendant 45 minutes.

Composition du milieu FCS: Sorbose 60 g

Tryptone 40 g -

Urée 2 ó Sulfate d'ammonium 12 g Nitrate de sodium 3 g Phosphate monopotassique 2 g Chlorure de potassium 0,5 g Sulfate de magnésium, 7H20 0,5 g Sulfate de manganèse (11l), 7H20O 0,01 g Sulfate de Fe(lIl), 7H20 0, 01 g dans 1000 ml d'eau du robinet Le pH du milieu est ajusté à 5,2 avant la stérilisation. La culture inoculée est incubée à 25'C, agitée à 1000 tpm et aérée avec

300 I/h.

La fermentation est poursuivie pendant 168 heures, après lesquelles le bouillon de fermentation contient 600 mcg/mi de

complexe de cyclosporines selon l'essai microbien.

On recueille 310 mg de cyclosporine A à partir d'un litre

de bouillon en l'isolant selon la procédure de l'exemple 2.

EXEMPLE 4

Une suspension de conidies et de mycéliums, provenant d'une culture de 5 à 7 jours de Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 (NOAIM[P)F 001005) sur une gélose inclinée contenant de l'extrait de malt-extrait de levure, est préparée avec 5 ml d'une solution de chlorure de sodium à 0,9Z, elle est utilisée pour inoculer 500 ml du milieu d'inoculum IC décrit dans l'exemple 1 et stérilisée dans un flacon Erlenmeyer de 3 I. Le flacon est incubé sur un appareil rotatif à secousses (340 tpm) à 25'C pendant 3 jours, puis sert à inoculer 5 litres d'un milieu FC4, stérilisé dans un fermenteur de laboratoire de

litres à 121 "C pendant 45 minutes.

Composition du milieu FC4' Maltose 80 g Tryptone 40g Urée 2g Sulfate d'ammonium 12 g Nitrate de sodium 3 g Phosphate monopotassique 2 g Chlorure de potassium 0,5 g Sulfate de magnésium, 71-20 0,5 g Sulfate de manganèse (11, 7H20 0,01 g Sulfate de cuivre (11), 5Hp20 0,01 g Sulfate de Fetli), 7H20 0,01 g dans 1000 ml d'eau du robinet

Le pH du milieu est ajusté à 5,2 avant la stérilisation.

Après inoculation, le bouillon de fermentation est incubé

à 25'C, agité à 1000 tpm et aéré avec 300 I/h.

La fermentation est poursuivie pendant 144 heures, après lesquelles le bouillon de fermentation contient 620 mcg/ml de

complexe de cyclosporines selon l'essai microbien.

On recueille 305 mg de cyclosporine A à partir d'un litre

de bouillon, après l'avoir isolée salon la procédure de l'exemple 1.

EXEMPLE S5

Une suspension de conidies et de mycéliums, provenant d'une culture de 5 à 7 jours de Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 tNCAIM(P)F 0010051 sur une gélose inclinée contenant de l'extrait de

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malt-extrait de levure, est préparée avec 5 ml d'une solution de chlorure de sodium à 0,9. Qt elle est utilisée pour inoculer 500 ml du milieu d'inoculum IC décrit dans l'exemple 1 et stérilisée dans un flacon Erlenmeyer de 3 I. Le flacon est incubé sur un appareil rotatif à secousses (340 tpm) à 25'C pendant 3 jours, puis sert à inoculer 5 litresd'un milieu FC1, stérilisé dans un fermenteur de laboratoire de litres à 121 'C pendant 45 minutes. Apres inoculation, le bouillon de fermentation est agité à 1000 tpm à 25'C et aéré avec 300 I/h. Apres 96 heures de culture, une solution aqueuse stérilisée de 100 g de maltose est ajoutée et la fermentation est poursuivie pendant 144 heures, après lesquelles le bouillon de fermentation contient 950 mcg/ml de complexe de cyclosporines selon l'essai microbien. On recolte 4,8 litres du bouillon. On recueille 2,75 Z de cyclosporine A

après l'avoir isolée selon la procédure de l'exemple 2.

Claims (5)

REVENDICATIONS

1. Procédé microbien pour la production du complexe antibiotique de cyclosporines et/ou de ses composants, la cyclosporine A, la cyclosporine B et la cyclosporine C, par la fermentation aérobie d'une souche de champignon filamenteux biosynthétisant le ou les nouveaux antibiotiques ci-dessus dans un milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote utilisables ainsi que des sels minéraux, et par l'isolement des produits formés, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une souche de la nouvelle espèce de champignon Tolypocladium varium produisant le complexe antibiotique de cyclosporines, sur un milieu nutritif contenant des sources de carbone et des sources d'azote organiques et inorganiques ainsi que des sels minéraux, dans des conditions aérobies, de 25 à 30'C et si cela est désiré, I'isolement et la purification du complexe antibiotique de cyclosporines ou de ses composants.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la souche Tolypocladium varium sp. nov. CY/93, déposée à la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budepest, Hongrie, sous le numéro NCAIMtP)F 001005 est utilisée

comme souche de champignon.

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée dans un milieu de culture contenant de la peptone, du sulfate d'ammonium et de la tryptone comme source d'azote et du glucose, du maltose et du sorbitol

comme source de carbone.

4. Espèce de champignon, caractérisée en ce qu'il s'agit

du Tolypocladium varium.

5. Tolypocladium varium sp. nov. CT/93, déposée à la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms,

Budapest, Hongrie sous le numéro NCAIM(P)F 001 005.