FR2537723A1 - Procede et composition pour evaluer la reaction phagocytaire - Google Patents
Procede et composition pour evaluer la reaction phagocytaire Download PDFInfo
- Publication number
- FR2537723A1 FR2537723A1 FR8319657A FR8319657A FR2537723A1 FR 2537723 A1 FR2537723 A1 FR 2537723A1 FR 8319657 A FR8319657 A FR 8319657A FR 8319657 A FR8319657 A FR 8319657A FR 2537723 A1 FR2537723 A1 FR 2537723A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- particles
- cells
- process according
- protein
- chemical compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title abstract description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 17
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 claims description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 claims 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 abstract description 2
- 150000002927 oxygen compounds Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 azo compound Chemical class 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 3
- 238000001159 Fisher's combined probability test Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 2
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- SOHWLKBJOBHROR-MCDZGGTQSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SOHWLKBJOBHROR-MCDZGGTQSA-N 0.000 description 1
- LSZVFTBAMCUSBG-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-1-n,1-n'-dimethylpentane-1,1-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.N=C=NC(CC)CC(NC)NC LSZVFTBAMCUSBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100025621 Cytochrome b-245 heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000016532 chronic granulomatous disease Diseases 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000001207 effect on phagocytes Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 231100000619 immunotoxicology Toxicity 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- YSZIOXAEADAJLX-UHFFFAOYSA-N phthalazine-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N=NC(=O)C2=C1 YSZIOXAEADAJLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE ET UNE COMPOSITION POUR L'EVALUATION DE LA REACTION PHAGOCYTAIRE D'UN ORGANISME. L'ACTIVITE DES PHAGOCYTES DU SANG EST MESUREE PAR ADDITION DIRECTE DE MATIERE PARTICULAIRE COMPRENANT DES PARTICULES DE ZYMOSAN OU DE POLYACRYLAMIDE ENROBEES DE PROTEINE SUR LAQUELLE SONT FIXES DES COMPOSES CHIMIQUES LUMINESCENTS. LORSQUE LES CELLULES PHAGOCYTAIRES SONT MELANGEES AVEC CES COMPOSITIONS, LES CELLULES AVALENT LES PARTICULES, PROVOQUANT AINSI L'ACTIVATION DES MECANISMES BIOCHIMIQUES DES CELLULES. IL SE FORME DES COMPOSES INTERMEDIAIRES OXYGENES PROVOQUANT UNE REACTION AVEC LE COMPOSE CHIMIQUE LUMINESCENT, CE QUI RESULTE EN UNE PRODUCTION DE LUMIERE QUI EST MESUREE ET EN FONCTION DU TAUX DE LUMIERE PRODUITE ET DU MAXIMUM PRODUIT, L'ACTIVITE PHAGOCYTAIRE DE CES CELLULES EST MESUREE. L'INVENTION EST PAR EXEMPLE UTILISABLE POUR MESURER L'ACTIVITE PHAGOCYTAIRE DE CELLULES TELLES QUE LES NEUTROPHILES, MONOCYTES ET MACROPHAGES ALVEOLAIRES.
Description
La présente invention concerne un procédé et une composition pour évaluer
la réaction phagocytaire d'un organisme c'est-à-dire pour mesurer la capacité d'un organisme de résister à une infection et l'invention concerne également un procédé de fabrication de telles compositions. L'observation que certaines cellules phagocyta Jres que l'on trouve dans le sang et dans les organes tels que les poumons créent de la lumière à cause de l'injection physique de particules telles que des bactéries ou des compositions non-vivantesa été publiée depuis des années dans la littérature scientifique Ces observations sont basées sur des cellules spécifiques trouvées dans le sang ou les organes lesquelles cellules sont connues pour servir une fonction critique de découvrir, phagocyter (avaler) et tuer les particules teles que les bactéries par des mécanismes chimiques complexes Ces cellules peuvent également découvrir et éliminer des agents non-infectueux tels que des particules polluantes de
l'atmosphère Une partie de ce mécanisme chimique cellulai-
re comporte la production d'intermédiaires oxygénés à
énergie relativement élevée La cellule produira ces compo-
sés chimiques lorsqu'elle est stimulée pour la phagocytose.
Ces intermédiaires oxygénés d'énergie élevée descendront vers des niveaux d'énergie plus faibles et au cours du procédé, de la lumière sera produite Bien que ces niveaux
faibles de lumière sont détectables en utilisant des instru-
ments tels que des spectromètres à cintillation à liqui-
de, ceci est une technique très encombrante qui ne permet
pas une analyse d'un grand nombre d'échantillons ou d'échan-
tillons avec un grand nombre de variables à rechercher.
Et, bien que ce phénomène soit connu depuis un certain temps, on en a peu profité du fait des limitations décrites ci-dessus ensemble avec la nondisponibilité de
réactifs relativement stables.
La présente invention concerne un procédé pour
mesurer la réaction phagocytaire de diverses cellules pha-
gocytaires Un tel procédé est basé sur le procédé de phagocytose employé par un organisme pour résister à -2 - l'infection ou pour éliminer une matière étrangère des poumons, etc Un échantillon de cellules phagocytaires provenant du sang ou d'un organe est prelevé d'un être humain ou autre animal et une matière contenant des particules est ajoutée à celui-ci et cette matière est avalée par les cellules phagocytaires Les cellules réagissent contre la matière contenant les particules et créent des intermédiaires oxygénés qui à leur tour réagissent avec un composé chimique dans la matière
contenant des particules Cette réaction crée de la lumière.
Cette lumière ainsi produite est détectée et mesurée.
Un autre aspect de l'invention comprend un tel réactif contenant les particules adaptées pour être phagocytées par les cellules et consiste en des perles
polymères enrobées de protéines auxquelles est lié un compo-
sé chimique luminescent tel que la 5-amino-2,3,dihydro-1,4-
phthalazinedione (luminol).
Un autre but de l'invention est un autre réactif contenant des particules adaptées pour être phagocytées
par les cellules et comprend des particules de poly-
saccharides provenant des parois de cellules de levure
(zymosan) absorbées avec des protéines auxquel Les est mélan-
gé un composé chimique (luminol).
Un autre but de l'invention est un procédé de fabrication de perles polymères particulières enrobées
selon la présente invention Les perles polymères d'en-
viron 2 à environ 9 pam de diamètre sont enrobées d'une protéine et d'un composé chimique luminescent Le composé chimique luminescent peut être appliqué sur la protéine ou mélangé avec la protéine et les deux sont appliqués ensemble sur les perles polymères Les particules résultantes sont lavées, remises en suspension jusqu'à
une concentration finale et lyophilisée.
Un autre but de l'invention est un procédé de fabrication de particules de zymosan enrobées utiles pour la présente invention Les particules de zymosan sont enrobées d'une protéine Le luminol est mélangé avec les particules enrobées et la matière résultante est
lyophilisée en un produit stable homogène.
-3 Pour que l'invention puisse être mieux comprise, référence est faite aux figures suivantes o: La figure 1 montre la réaction typique d'un test chimioluminescent sur du sang complet, dilué en utilisant
un réactif à base de zymosan.
La figure 2 montre une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un réactif à base
de zymosan.
La figure 3 montre une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un réactif à base
de perles polymères.
La figure 4 montre une réaction typique d'un test chimioluminescent sur du sang complet dilué en utilisant
un réactif à base-de zymosan.
La figure 5 représente une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un
réactif à base de zymosan.
La figure 6 représente une réaction typique d'un test sur des neutrophiles isolés en utilisant un
réactif à base de perles polymères.
Bien que toute matière à base de particules compatibles avec le système de cellules phagocytaires puisse être utilisée, on a trouvé qu'une matière polymère organique et en particulier des polyacrylamides (par exemple, des particules de Bio-Rad(<désignation commerciale) Richmond, Californie) et en particulier du zymosan se sont
avérés particulièrement appropriés.
Pour que ce système puisse fonctionner convena-
blement, il est nécessaire d'enduire une protéine sur la matière particulaire Ce revêtement peut être appliqué par
réticulation chimique réelle de la protéine sur la parti-
cule ou par simple adsorbtion électrostatique Toute protéine ou mélange de protéines convenable peut être utilisé pour ainsi sensibiliser les perles Les protéines convenables comprennent l'immunoglobuline G humaine,
purifiée ou du serum animal.
Ensuite un composé chimique luminescent est enduit soit chimiquement soit par adsorption sur les
particules enrobées de protéine ou est mélangé avec celles-
4 - ci Bien que tout composé chimique luminescent qui réagisse avec les intermédiaires oxygénés en créant directement ou
indirectement de la lumière puisse être utilisé, on a trou-
vé que le luminol (disponible chez Eastman Organics, Rochester, New York) convenait particulièrement Si la perle de polymère est utilisée, le luminol est dissous dans une solution tampon aqueuse et on le fait réagir, de préférence, pour former un azo-composé intermédiaire réactif L'azocomposé intermédiaire réagit ensuite avec
les particules polymères enrobées de protéine Ceci résul-
te en un produit d'addition azoluminol-protéine et également en du luminol-polyacrybmide liés électrostatiquement On lave les particules résultantes, on les remet en suspension jusqu'à une concentration finale, on les introduit dans des fioles et on les lyophilise La matière obtenue par ce procédé donne un produit stable homogène o Le luminol peut également être simplement mélangé avec une suspension de particules de zymosan au préalable enduites d'une protéine convenable Le mélange
résultant est introduit dans des fioles et lyophilisé.
La matière obtenue par ce procédé donne un produit stable homogène. Le produit lyophilisé décrit ci-dessus, est après reconstitution avec de l'eau, prêt pour être utilisé
dans le test.
Pour le test utilisant des particules polymères, on mélange 1 000 000 à environ 2 000 000 de particules de polyacrylamide dans 50 microlitres de tampon avec environ 200 000 cellules phagocytaires purifiées dans 100 microlitres de tampon Deux exemples de procédé pour le
test en utilisant simultanément des particules des zymo-
san sont: ( 1) on dilue du sang complet en proportions 1: 3
(une partie de sang anticoagulé plus deux parties de tam-
pon) On mélange cinquante microlitres de cette dilution
avec 200 microlitres de zymosan enrobé contenant du lumi-
nol Chaque millilitre de m Iélange de zymosan contient
environ 50 000 000 de particules et ( 2) on mélange cinquan-
te microlitres de suspension de zymosan avec 100 micro-
litres de tampon contenant environ 200 000 cellules phago-
cytaires purifiées La lumière créée à partir de ces mélanges est mesurée périodiquement en fonction du temps et reflète i'activité phagocytaire et biochimique de la préparation de cellules phagocytaires Les cellules qui peuvent être évaluées par cette technique comprennent
les neutrophiles, les monocytes et les macrophages alvéo-
laires Les deux premiers de ces types de cellules sont obtenus à partir du sang complet disposé sur un gradient de densité tel que Ficoll-Hypaque (désignation commerciale) et centrifugés Ces cellules se groupent dans le gradient et sont donc purifiées Les macrophages sont obtenues à
partir de lavages de poumons et n'exigent pas de purifica-
tion Dans les exemples suivants, on utilise des neutro-
philes.
Exemple 1
On suspend 200 mg de perles de polyacrylamide décrites ci-dessus ayant un diamètre de 2-9 pm dans 20 ml d'eau A cette suspension, on ajoute 10 mg d'immunoglobine G (Ig G) humaine On mélange modérément la suspension
de perles enrobées de protéine et on la refroidit à 2 C-
8 C On ajoute 40 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3,3-diméthyl aminopropyl carbodiimide Six heures plus tard, on ajoute mg de glycine On agite le mélange durant une nuit à 2 C 8 C Le jour suivant, on lave la suspension par centrifugation avec une solution saline tamponnée au phosphate, du chlorure de sodium 1,4 M dans une solution saline tamponnée au phosphate et finalement 0,005 M de tampon phosphate On centrifuge de nouveau les perles et on les remet en suspension dans 8,5 ml de tampon borate
p H 8,5.
On prépare un sel de diazonium de luminol par mise en suspension de 200 mg de luminol dans 20 ml d'H Cl 2,4 N On refroidit le mélange sur de la glace On ajoute 2,0 ml de solution de 100 mg par ml de nitrite de sodium,
on mélange,suivi rapidement par addition de tampon refroi-
di, 50 ml, 0,5 M, p H 8,5 On observe le p H et on l'ajuste
avec de l'hydroxyde de sodium 10 N à p H 7,1 * 0,1 On ajou-
te alors 14 ml de sel de diazonium de luminol à 8,5 ml des perles remises en suspension décrites ci-dessus et le p H
37723
est ajusté à p H 8,5 On mélange la suspension durant 3 heures
dans le noir à 20 C-8 C.
La suspension de perles diazotées est alors dialysée contre plusieurs changements de 0,2 M de tampon de borate p H 8,0 à 2 OC-80 C La dialyse a lieu durant
au moins 24 heures.
On lave alors les perles par centrifugation en utilisant un tampon de borate 0,2 M, p H 8,0 jusqu'à ce que le surnageant comprenne moins de 1, Q% de la lumière initiale de la suspension totale, c'est-à-dire que plus de 99 % de
luminol est associé avec les perles.
On centrifuge alors les perles encore une fois.
On remet les perles en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate La concentration de perles est
ajustée jusqu'à environ 50 millions de perles par ml, déter-
minée par un hémocytomètre On introduit alors la suspen-
sion dans des fioles en portions de 1,0 ml et on la lyophi-
lise jusqu'à moins de 5,0 % d'humidité résiduelle, déterminée
par titrage selon la méthode de Karl Fisher.
Pour réaliser le test phagocytaire, une fiole
est reconstitue par addition de 1,0 ml d'eau purifiée.
Exemple 2
On met en suspension du zymosan A (Sigma Chemical Co St Louis, Missouri) dans une solution saline tamponnée
au phosphaté jusqu'à une concentration de 24 mg par ml.
A cette suspension on ajoute un volume égal de sérum de lapin 50 % normal dilué dans la solution saline tamponnée au phosphate On incube la suspension durant une heure à 37 C dans un bain d'eau agité On centrifuge alors la suspension, on rejette le liquide surnageant et le zymosan A (pellet) ainsi traité Et remis en suspension dans un petit volume de solution tamponnée au phosphate On aspire alors la suspension au travers d'une aiguille de seringue (ouverture 18-26) pour homogénéiser la suspension Finalement on ajoute suffisamment de solution saline tamponnée au
phosphate pour quadrupler le volume original de la suspen-
sion ce qui donne une suspension d'environ 6 mg par ml.
On passe alors cette suspension au travers d'un bouchon
de laine de verre pour piéger tout grumeau de zymosan.
7- On prépare une solution mère de luminol en le dissolvant dans de l'hydroxyde de sodium 0,01 N Une partie aliquote de cette solution mère est alors ajoutée à une solution contenant 20 % de sérum de veau foetal
dans une solution saline tamponnée au phosphate ce qui.
résulte en une concentration de luminol de 14,4 pg par ml.
A un volume de suspension de zymosan, -on ajoute un volume de solution de sérum de veau foetal -luminol On mélange la suspension résultante, on l'introduit dans des fioles en des portions de 2,0 ml et on la lyophilise jusqu'à moins de 5 % d'humidité résiduelle déterminée par
titrage selon la méthode de Karl Fisher.
Pour une utilisation dans le test de phagocytose,
un flacon est reconstitué avec 2,0 ml d',eau purifiée.
Exemple 3
Plusieurs enfants sur lesquels on a préalablement diagnostiqué une maladie granulomateuse chronique (MGC),, ont été examinés en utilisant les réactifs et le procédé du test décrits di-dessus Cette maladie a été choisie parce que la dysfonction est comprise MGC est provoquée par l'absence de certains enzymes que l'on trouve dans les cellules phagocytaires du sang Bien que les cellules
phagocytaires sont capables dbavaler les bactéries (parti-
cules), ces cellules sont incapables d'inactiver ou tuer les bactéries étant donné que les cellules phagocytaires n'ont pas la capacité de créer des composés intermédiaires oxygénés de haute énergie Comme tels, ils ne peuvent provoquer une oxydation du'luminol ainsi avalé par les cellules, de sorte qu'aucune réaction lumineuse détectable n'est observée Cliniquement, ces enfants présentent ou manifestent typiquement cette diminution sous forme d'une
sévère réduction de leur capacité à résister aux infectbns.
Voir les figures 1 à 3 pour la réponse typique Lorsque ces enfants ont été testés ensemble avec des sujets témoins apparemment sains, il ne se produisait aucune lumière due
à l'oxydation du luminol, bien qu'elles avalaient les parti-
cules aussi efficacement que les témoins.
Exemple 4
On a testé un groupe d'enfants sur lesquels on a -8- précédemment diagnostiqué de l'asthme, en fonction de leur
réaction phagocytaire/biochimique des cellules phagocytai-
res Environ la moitié des enfants ont reçu des doses thérapeutiques de théophylline; le restant des enfants n'avaient pas été soumis à cette médication Il est admis
que la théophylline a un effet sur l'adénosine monophos-
phate cyclique (c-AMP) qui est reconnue comme exerçant un contrôle régulatoire sur certaines actions biochimiques des cellules phagocytaires Voir les figures 4-6 Les enfants ayant reçu la théophylline en général présentaient des niveaux réduits de production d'intermédiaires oxygénés
quantifiés par l'oxydation réduite du luminol et la produc-
tion réduite de lumière.
De tels procédés tels que ceux décrits ont une utilité particulière pour la quantification de la
résistance infectueuse en termes d'activité phagocytaire.
Cependant, un tel procédé a également une application
pour le diagnostique médical, l'itmmunotoxicologie de l'en-
vironnement, la pharmacologie, par exemple pour contrôler
la toxicité ou la chimiothérapie et la thérapie au rayon-
nement des patients par exemple, ils peuvent être utili-
sés pour l'évaluation de l'immuno-compétence, de certains défauts de protéines dans le sérum sanguin etc Comme outil de recherche, ils peuvent être utilisés pour tester les composés pharmaceutiques et leur effet sur les phagocytes, les effets des polluants sur les cellules phagocytaires et l'effet des composés toxiques sur les
animaux et les humains.
Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux procédés et compositions qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. -9-
Claims (13)
1 Procédé pour mesurer la capacité d'un organisme à résister à une infection caractérisé en ce qu'il consiste à prélever un échantillon de sang de l'organisme, séparer les cellules phagocytaires du sang, ajouter aux cellules phagocytaires des particules enrobées de protéine à laquelle sont liées des composés chimiques luminescents,
permettre aux cellules phagocytaires d'avaler les particu-
les activant ainsi le mécanisme biochimique des cellules qui réagissent avec le composé chimique luminescent créant
de la lumière qui est mesurée sur un luminomètre.
2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les particules sont des perles polymères ayant
des diamètres d'environ 2 um à environ 9 Fm.
3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé
en ce que les perles sont en polyacrylamide.
4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que les particules sont des particules de zymosan.
5 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en
ce que le composé chimique luminescent est le luminol.
6 Composition phagocytaire caractérisée en ce qu' elle comprend des particules de polyacrylamide ayant un
diamètre d'environ 2 pm à environ 9 pi enrobées d'une cou-
che de protéine de sérum à laquelle est liée une couche de luminol.
7 Composition phagocytaire caractérisée en ce qu'elle comprend des particules de zymosan enrobées d'une couche de protéine de sérum et de luminol I
8 Composition selon l'une quelconque des revendi-
cations 6 et 7, caractérisée en ce qu'elle est sous forme lyophilisée.
9 Procédé de fabrication d'un réactif phagocytaire
de l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé
en ce qu'il consiste à enrober une matière particulaire à particules de deux à environ neuf 1 m de diamètre, d'une couche de protéine et de composé chimique luminescent, et lyophiliser les particules enrobées pour obtenir un
produit stable, homogène.
10 Procédé selon la revendication 9, caractérisé - en ce que la couche de protéine est appliquée d'abord et le composé chimique luminescent est appliqué sur cette
couche de protéine.
11 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le composé chimique luminescent est mélangé
avec un protéine avant l'application à la matière parti-
culaire.
12 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en
ce que le composé chimique luminescent est le luminol.
13 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la matière particulaire est du polyacrylamide
ou du zymosan.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44970982A | 1982-12-14 | 1982-12-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2537723A1 true FR2537723A1 (fr) | 1984-06-15 |
Family
ID=23785187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8319657A Withdrawn FR2537723A1 (fr) | 1982-12-14 | 1983-12-08 | Procede et composition pour evaluer la reaction phagocytaire |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59132361A (fr) |
| AU (1) | AU2217783A (fr) |
| CA (1) | CA1210328A (fr) |
| DE (1) | DE3344607A1 (fr) |
| FI (1) | FI834603A7 (fr) |
| FR (1) | FR2537723A1 (fr) |
| GB (1) | GB2131948B (fr) |
| IT (1) | IT1169988B (fr) |
| SE (1) | SE8306808L (fr) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6036962A (ja) * | 1983-08-09 | 1985-02-26 | Toray Ind Inc | 生物学的検査用微粒子 |
| EP0175577A3 (fr) * | 1984-09-21 | 1987-11-25 | Jonathan L Kiel | Système d'essai microchimioluminescent |
| CA2097952C (fr) * | 1993-06-08 | 2006-03-14 | Alex D. Romaschin | Diagnostic precoce de la sepsie au moyen des interactions antigene-anticorps amplifiees par chimiluminescence du sang total |
| US5804370A (en) * | 1994-06-08 | 1998-09-08 | Critichem Medical Products Limited | Early diagnosis of sepsis utilizing antigen-antibody interactions amplified by whole blood chemiluminescence |
| US6203997B1 (en) | 1994-06-08 | 2001-03-20 | Sepsis, Inc. | Quantitation of analytes in whole blood |
| US6159683A (en) * | 1997-12-16 | 2000-12-12 | Spectral Diagnostics, Inc. | Method of determining stage of sepsis |
| RU2143693C1 (ru) * | 1999-04-06 | 1999-12-27 | Коган Александр Харитонович | Способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов |
| GB9910975D0 (en) | 1999-05-13 | 1999-07-14 | Univ Strathclyde | Rapid dehydration of proteins |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1428856A (fr) * | 1964-03-26 | 1966-02-18 | Ibm | Procédé et appareil de classification de cellules |
| FR2231968A1 (fr) * | 1973-05-31 | 1974-12-27 | Block Engineering | |
| FR2397634A1 (fr) * | 1977-07-16 | 1979-02-09 | Deutsches Krebsforsch | Procede et dispositif d'analyse de la fluorescence de particules colorees, en particulier de cellules biologiques |
| US4336029A (en) * | 1980-08-15 | 1982-06-22 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood |
-
1983
- 1983-11-23 CA CA000441805A patent/CA1210328A/fr not_active Expired
- 1983-12-05 GB GB08332404A patent/GB2131948B/en not_active Expired
- 1983-12-07 AU AU22177/83A patent/AU2217783A/en not_active Abandoned
- 1983-12-08 FR FR8319657A patent/FR2537723A1/fr not_active Withdrawn
- 1983-12-09 SE SE8306808A patent/SE8306808L/ not_active Application Discontinuation
- 1983-12-09 DE DE19833344607 patent/DE3344607A1/de not_active Withdrawn
- 1983-12-12 JP JP58234123A patent/JPS59132361A/ja active Pending
- 1983-12-14 IT IT24159/83A patent/IT1169988B/it active
- 1983-12-14 FI FI834603A patent/FI834603A7/fi not_active Application Discontinuation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1428856A (fr) * | 1964-03-26 | 1966-02-18 | Ibm | Procédé et appareil de classification de cellules |
| FR2231968A1 (fr) * | 1973-05-31 | 1974-12-27 | Block Engineering | |
| FR2397634A1 (fr) * | 1977-07-16 | 1979-02-09 | Deutsches Krebsforsch | Procede et dispositif d'analyse de la fluorescence de particules colorees, en particulier de cellules biologiques |
| US4336029A (en) * | 1980-08-15 | 1982-06-22 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8332404D0 (en) | 1984-01-11 |
| AU2217783A (en) | 1984-06-21 |
| IT8324159A0 (it) | 1983-12-14 |
| IT8324159A1 (it) | 1985-06-14 |
| SE8306808L (sv) | 1984-06-15 |
| JPS59132361A (ja) | 1984-07-30 |
| FI834603A0 (fi) | 1983-12-14 |
| GB2131948A (en) | 1984-06-27 |
| SE8306808D0 (sv) | 1983-12-09 |
| CA1210328A (fr) | 1986-08-26 |
| FI834603A7 (fi) | 1984-06-15 |
| IT1169988B (it) | 1987-06-03 |
| DE3344607A1 (de) | 1984-06-14 |
| GB2131948B (en) | 1986-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dikkeboom et al. | Hemocytes of the pond snail Lymnaea stagnalis generate reactive forms of oxygen | |
| AU551950B2 (en) | Immunoassay products and methods | |
| US4483921A (en) | Immunoassay with antigen or antibody labeled liposomes sequestering enzyme | |
| CH618015A5 (fr) | ||
| FR2490826A1 (fr) | Procede pour la mesure de la thyroxine libre ou de la 3,5,3'-triiodothyronine libre dans un echantillon liquide | |
| EP0001223A2 (fr) | Latex recouvert d'un composé polyhydroxy, procédé de préparation de ce latex, réactif immunologique comprenant ce latex, procédé de préparation de ce réactif, application de ce réactif, procédé d'analyse utilisant ce réactif et trousse contenant ce réactif | |
| Rabe et al. | Contraction of human bronchial smooth muscle caused by activated human eosinophils | |
| FR2537723A1 (fr) | Procede et composition pour evaluer la reaction phagocytaire | |
| JPH061275B2 (ja) | 逆潜伏特異的結合測定法 | |
| EP0406404B1 (fr) | Particules sumicroniques, preparation et utilisation dans l'immunodiagnostic | |
| EP0311492A2 (fr) | Trousse et méthode de dosage immunométrique applicables à des cellules entières | |
| FR2678387A1 (fr) | Procede de dosage immuno-enzymatique de la vitamine b12 et de preparation d'un echantillon pour ce dosage. | |
| CH646524A5 (fr) | Procede pour preparer un reactif qui s'agglutine lorsqu'on le met en contact avec des liquides de l'organisme contenant des antigenes. | |
| JPH10512672A (ja) | 心臓トロポニンｉの超高感度アッセイ法 | |
| CH644455A5 (fr) | Procede d'analyse quantitative des nucleotides cycliques et ensemble de reactifs pour la mise en oeuvre de ce procede. | |
| HU209588B (en) | Process for determination, by means of free radicals, of anti-oxidant properties of cells of a living organism or potencially agressive agent | |
| EP0063064B1 (fr) | Réactif pour le dosage radio-ou enzymo immunologique des IgE | |
| FR2577048A1 (fr) | Reactif pour le dosage par hemagglutination des anticorps contre les toxines bacteriennes, procede de preparation et son application | |
| FR2468125A1 (fr) | Conjugue destine a des dosages immunologiques par chimioluminescence | |
| FR2523311A1 (fr) | Produit de couplage entre une albumine et un ligand specifique, obtention et applications dans le domaine biologique | |
| FR2601781A1 (fr) | Reactif de dosage de mycotoxine et methode l'utilisant pour doser une mycotoxine | |
| EP0598014B1 (fr) | Utilisation d'atélocollagène comme support solide de fixation d'un capteur spécifique | |
| EP0258388A1 (fr) | Analyse immunologique de liposomes - procedes et produits | |
| FR2466020A1 (fr) | Reactif et methode pour la determination de l'aldolase du type contenu dans les muscles de l'homme | |
| CA2612621C (fr) | Revetement d'heparine sur un tissu biologique |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |