FR2531714A1 - S-adenosyl-L-methionine solutions purification - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne un procédé de puri fication de S-adénosyl-L-méthionine (qu'on désignera ci-après de façon abrégée.par SAM), et plus particulièrement, un procédé pour isoler efficacement une SAM de grande pureté. d'un liquide contenant SAM brute. The present invention relates to a method for purifying S-adenosyl-L-methionine (which will be abbreviated hereinafter by SAM), and more particularly, to a method for effectively isolating SAM of high purity. liquid containing raw SAM.
SAM est une substance importante qui participe, in vivo au métabolisme des graisses, des protéines et des glucides. Récemment, on a trouvé que SAM avait un effetthéra- peutique sur l'adipose jecur, la lipémie, l'artériosclérose, la dépression et l'insomnie, et il est souhaitable de produire SAM en grandes quantités. SAM is an important substance which participates, in vivo, in the metabolism of fats, proteins and carbohydrates. Recently, SAM has been found to have a therapeutic effect on heart fat, lipemia, arteriosclerosis, depression and insomnia, and it is desirable to produce SAM in large quantities.
De nombreux procédés étaient connus jusqu'à-pré- sent pour la purification de SAM. Des exemples particuliers comprennent : (1) un procédé consistant à combiner une étape de traitement d'un liquide contenant SAM avec une résine d'échange de cations fortement acide et une étape de traitement de ce liquide avec du carbone activé (brevet japonais publié sous le N" 13680/1971)-, (2) un procédé qui consiste à traiter un liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide (Enzymologia, Vol. 29, page 283), (3) un procédé consistant à combiner une étape de traitement d'un liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide du type H+ et une étape de traitement de ce liquide avec du carbone activé (demande de brevet japonais mise à l'inspection Publique N" 14299/1981), (4) un procédé qui consiste à traiter un liquide contenant SAM brut avec une résine du type chélate (brevet japonais publié sous le N" 20998/1978), et (5) un procédé passant par un sel de SAM avec l'acide picrique ou l'acide picrolonique (brevets -des Etats-Unis d'Amérigue N" 3 707 536 et N" 3 954 726). Many methods have hitherto been known for the purification of SAM. Particular examples include: (1) a method of combining a step of treating a liquid containing SAM with a strongly acidic cation exchange resin and a step of treating this liquid with activated carbon (Japanese patent published under No. 13680/1971) -, (2) a process which consists in treating a liquid containing raw SAM with a weakly acidic cation exchange resin (Enzymologia, Vol. 29, page 283), (3) a process consisting to combine a step of treating a liquid containing raw SAM with a weakly acidic cation exchange resin of the H + type and a step of treating this liquid with activated carbon (Japanese patent application subject to public inspection N "14299/1981), (4) a process which consists in treating a liquid containing raw SAM with a resin of the chelate type (Japanese patent published under N" 20998/1978), and (5) a process passing through a salt of SAM with picric acid or picrolonic acid (patents and United States of America Nos. 3,707,536 and Nos. 3,954,726).
Le procédé (2) est plus simple du point de vue des étapes de traitement et plus économique que le procédé tel), (4) ou (5), mais il présente comme inconvénient une séparation incomplète de SAM des impuretés et matières étrangères et il ne permet pas d'obtenir SAM avec une pureté suffisam ment grande pour une utilisation comme médicament. En ce qui concerne le procédé (3), qui est une amélioration du procédé (1), la pureté de SAM est accrue mais1 étant donné que l'adsorption de SAM sur le carbone activé est forte, le pourcentage de récupération en SAM est réduit. Si l'on cherche à accroître le pourcentage de récupération en aug-mentant la quantité de solvant organique dans un éluant, il en résulte malheureusement une séparation insuffisante de SAM des impuretés et des matières étrangères. Method (2) is simpler from the point of view of the processing steps and more economical than the method as), (4) or (5), but it has the disadvantage of an incomplete separation of SAM from impurities and foreign matter and it does not allow SAM to be obtained with sufficiently high purity for use as a medicament. Regarding process (3), which is an improvement of process (1), the purity of SAM is increased but1 since the adsorption of SAM on the activated carbon is high, the percentage of recovery in SAM is reduced . If one seeks to increase the recovery percentage by increasing the amount of organic solvent in an eluent, unfortunately this results in an insufficient separation of SAM from impurities and foreign matter.
La présente invention se propose donc de fournir un procédé grâce auquel on peut isoler efficacepent SAM à un degré de pureté élevé. The present invention therefore proposes to provide a process by which one can effectively isolate SAM to a high degree of purity.
La Demanderesse a effectué des recherches intensives pour atteindre cet objectif, et elle a constaté que
SAM pouvait être isolé et purifié efficacement à partir d'un liquide'contenant SAM brut en combinant une étape de traitement de ce liquide avec une résine d'échange de cations faiblement acide-du type H+ avec une étape de traitement de ce liquide avec une résine synthétique poreuse adsorbante.The Applicant has carried out intensive research to achieve this objective, and has found that
SAM could be effectively isolated and purified from a liquid containing raw SAM by combining a step of treatment of this liquid with a weakly acidic cation exchange resin-of the H + type with a step of treatment of this liquid with a porous adsorbent synthetic resin.
Ainsi, selon la présente invention, on dispose d'un procédé pour purifier SAM qui consiste à soumettre un liquide contenant SAM brut à un procédé de purification en serie qui comprend, dans un ordre désiré quelconque, (A) au moins une étape de traitement du liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide du type H+ et (B) au moins une étape de traitement de ce liquide avec une résine synthétique poreuse adsorbante. Thus, according to the present invention, there is a method for purifying SAM which consists in subjecting a liquid containing raw SAM to a purification process in series which comprises, in any desired order, (A) at least one treatment step liquid containing raw SAM with a weakly acidic cation exchange resin of the H + type and (B) at least one step of treatment of this liquid with a porous synthetic adsorbent resin.
I1 n'y a pas de limitations particulières en ce qui concerne le procédé de production du liquide contenant
SAM brut utilisé dans la présente invention. Par exemple, ce liquide est produit par la culture d'un microorganisme appartenant au genre Saccharomyces, Candida 'ou Mucor capable de produire SAM, dans un milieu de culture contenant de la méthionine pour produire et accumuler SAM à l'intérieur et/ ou à l'extérieur des cellules microbiennes, et à extraire le bouillon de culture avec un agent d'extraction tel que l'acide perchlorique, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide formique ; ou par réaction, par voie enzymatique, d'adénosine-triphosphate et de méthionine en présence de méthionine-adénosyl-transférase.There are no particular limitations with regard to the process for producing the liquid containing
Raw SAM used in the present invention. For example, this liquid is produced by the culture of a microorganism belonging to the genus Saccharomyces, Candida 'or Mucor capable of producing SAM, in a culture medium containing methionine to produce and accumulate SAM inside and / or outside the microbial cells, and extracting the culture broth with an extraction agent such as perchloric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid or formic acid; or by enzymatic reaction of adenosine triphosphate and methionine in the presence of methionine adenosyl transferase.
L'essentiel du procédé de la présente invention consiste à purifier un tel liquide contenant SAM brut en le soumettant à un procédé de purification en série qui comprend, dans un ordre désiré quelconque, (A) au moins une étape de traitement du liquide contenant SAM brut avec une résine d'échange de cations faiblement acide du type H et (B) au moins une étape de traitement de ce liquide avec une résine synthétique poreuse adsorbante. The essence of the process of the present invention is to purify such a crude SAM-containing liquid by subjecting it to a serial purification process which comprises, in any desired order, (A) at least one step of processing the SAM-containing liquid crude with a weakly acidic cation exchange resin of type H and (B) at least one step of treatment of this liquid with a porous synthetic adsorbent resin.
L'étape de traitement (A) est conduite de la maniere suivante. The processing step (A) is carried out in the following manner.
Tout d'abord, le pH du liquide contenant SAM brut est ajusté en général à 3, 5--6 , 5, de préférence à 4-6,5. First of all, the pH of the liquid containing raw SAM is generally adjusted to 3, 5--6, 5, preferably to 4-6.5.
Lorsque le pH du liquide contenant SAN brut est trop bas,
SAM est difficilement adsorbé sur la résine d'échange d'ions. When the pH of the liquid containing raw SAN is too low,
SAM is hardly adsorbed on the ion exchange resin.
S'il est trop élevé, SAM est susceptible d'une décomposition.If it is too high, SAM is susceptible to decomposition.
Le procédé d'ajuStement du -pH n'est pas particulièrement limité. De préférence, l'ajustement du pH s'effectue en utilisant une combinaison d'un acide et d'une substance alcaline capable de former un précipité diffilement soluble ou insoluble dans l'eau, ou une résine d'échange d'anions (du type OH ). The process for increasing -pH is not particularly limited. Preferably, the adjustment of the pH is carried out using a combination of an acid and an alkaline substance capable of forming a readily soluble or insoluble precipitate in water, or an anion exchange resin (of the OH type).
Par mise en contact du liquide contenant SAM brut, dont le pH a été ajusté de la manière susmentionnée, avec la résine d'échange de cations faiblemen-t acide du type H+
SAM de charge positive est sélectivement adsorbé sur la résine d'échange de cations. Les impuretés ayant des charges neutres et négatives dans liquide ne sont pas adsorbes sur la résine.By bringing the liquid containing raw SAM, the pH of which has been adjusted in the above-mentioned manner, into contact with the weakly acidic cation exchange resin of the H + type
SAM of positive charge is selectively adsorbed on the cation exchange resin. Impurities with neutral and negative charges in the liquid are not adsorbed on the resin.
La résine d'échange de cations faiblement acide utilisée peut être toute résine d'échange de cations comportant des groupes acide carboxylique comme groupes d'échange d'ions. Des exemples particuliers en sont Amberlite IRC-50 et IRC-80 (des produits de Rohm & Haas Co.) et Diaion WK20 (un produit de Mitsubishi-Chemical Co., Ltd.). La mise en contact peut s'effectuer par un procédé discontinu ou un procédé à colonne. Ce dernier procédé est préféré en raison de son fonctionnement satisfaisant et de sa facilité d'élimination des impuretés. The weakly acidic cation exchange resin used can be any cation exchange resin having carboxylic acid groups as ion exchange groups. Particular examples are Amberlite IRC-50 and IRC-80 (products of Rohm & Haas Co.) and Diaion WK20 (a product of Mitsubishi-Chemical Co., Ltd.). The contacting can be carried out by a batch process or a column process. The latter method is preferred because of its satisfactory operation and its ease of removing impurities.
SAM adsorbé sur la résine d'échange d'ions est ensuite séparé par élution fractionnée de la résine avec une solution aqueuse d'un acide inorganique ou organique ayant un pH ne dépassant généralement pas 3,0, de préférence compris entre 0,2 et 2,0. L'acide 'utilisé n'est pas particulièrement limité et l'on peut utiliser, par exemple, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide acétique et l'acide p-toluànesulfonique. Si nécessairev avant l'élution fractionnée de SAM, on peut laver la résine d'échange d'ions à l'eau ou avec une solution aqueuse diluée d'un acide (par exemple à un pH de 3,5 ou plus) pour éliminér les traces, d'impuretés présentes. SAM adsorbed on the ion exchange resin is then separated by fractional elution of the resin with an aqueous solution of an inorganic or organic acid having a pH generally not exceeding 3.0, preferably between 0.2 and 2.0. The acid used is not particularly limited and it is possible to use, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid and p-toluenesulfonic acid. If necessary before fractional elution of SAM, the ion exchange resin can be washed with water or with a dilute aqueous solution of an acid (e.g. pH 3.5 or higher) to remove traces, impurities present.
L'étape de traitement (B) s'effectue de la maniere suivante. The processing step (B) is carried out in the following manner.
Tout d'abord, le liquide contenant SAM brut est ajusté à pH 6,5 ou moins, puis amené au contact de la résine synthétique poreuse adsorbante. L'ajustement du pH et la mise en contact peuvent s'effectuer de la même manière que dans l'étape de traitement (A). La mise en contact avec l'adsorbant a pour résultat une adsorption sélective des amines, de la méthylthioadénosine (le produit de décomposition de SAM) et des matières colorées qui sont les matières étrangères contenues dans le liquide. Par un choix des con disions F comme décrit ci-dessus, SAN et les matières étrangères peuvent être adsorbées ensemble sur l'adsorbant. Dans ce cas, SAM peut être séparé sélectivement par une élution fractionnée de l'adsorbant avec une solution aqueuse d'un acide inorganique ou organique ayant un pH ne dépassant pas 3,5, de préférence compris entre 0,2 et 2,0. First, the raw SAM-containing liquid is adjusted to pH 6.5 or less, and then brought into contact with the porous adsorbent synthetic resin. The adjustment of the pH and the contacting can be carried out in the same way as in the treatment step (A). Contact with the adsorbent results in selective adsorption of amines, methylthioadenosine (the decomposition product of SAM) and colored matter which is the foreign matter contained in the liquid. By a choice of conditions F as described above, SAN and the foreign matter can be adsorbed together on the adsorbent. In this case, SAM can be selectively separated by fractional elution of the adsorbent with an aqueous solution of an inorganic or organic acid having a pH not exceeding 3.5, preferably between 0.2 and 2.0.
Les acides inorganiques et organiques que l'on peut utiliser peuvent être tous ceux entrant dans la caté gorie.utilisée dans l'étape de traitement (A). On peut utiliser un solvant organique conjointement à l'acide inorganique ou organique à condition que sa proportion puisse assurer une solutionniforne. Des exemples de solvant organique sont le méthanol, méthanol; le n-propanol, l'iso propanol, l'acétone, la méthyl-éthyl-cétone, le formiate de méthyle, l'acétate d'éthyle, le dioxanne et le toluène. The inorganic and organic acids which can be used can be all those which fall into the category used in the treatment stage (A). An organic solvent can be used in conjunction with inorganic or organic acid provided that its proportion can provide a uniform solution. Examples of organic solvent are methanol, methanol; n-propanol, iso propanol, acetone, methyl ethyl ketone, methyl formate, ethyl acetate, dioxane and toluene.
Si on le désire, de la même manière que dans l'étape de traitement (A), l'adsorbant peut être lavé à l'eau ou avec une solution aqueuse diluée d'un acide avant l'élution fractionnée afin d'éliminer les traces d'impuretés présentes.If desired, in the same manner as in treatment step (A), the adsorbent can be washed with water or with a dilute aqueous solution of an acid before fractional elution in order to remove the traces of impurities present.
La résine synthétique poreuse adsorbante utilisée dans la présente invention est insoluble dans l'eau et pré- sente une structure de réseau géant. Des exemples particuliers comprennent les adsorbants non polaires à base d'un copolymère styrène/divinylbenzène en tant que matrice tel que Amberlite XAD-2 et XAD-4 (produits de Rohm & Haas Co.) et Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 et HP-50 (produits de
Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), et des adsorbants moyennement polaires à base d'un polymère d'un ester d'acide acrylique et/ou d'un ester d'acide méthacrylique ou d'un copolymère d'un tel monomère avec un monomère non polaire tel que le styrène et le divinylbenzène comme matrice, par exemple Amberlite XAD-7 et XAD-8 (produits de Rohm & Haas
Co.) et Diaion HP-ZMG (produit de Mitsubishi Chemical Co.,
Ltd.). Si on le désire, ces adsorbants peuvent être utìli- sés en combinaisons.The porous adsorbent synthetic resin used in the present invention is insoluble in water and has a giant network structure. Particular examples include non-polar adsorbents based on a styrene / divinylbenzene copolymer as a matrix such as Amberlite XAD-2 and XAD-4 (products of Rohm & Haas Co.) and Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 and HP-50 (products of
Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), and medium polar adsorbents based on a polymer of an acrylic acid ester and / or a methacrylic acid ester or a copolymer of such a monomer with a non-polar monomer such as styrene and divinylbenzene as matrix, for example Amberlite XAD-7 and XAD-8 (products of Rohm & Haas
Co.) and Diaion HP-ZMG (product of Mitsubishi Chemical Co.,
Ltd.). If desired, these adsorbents can be used in combinations.
Ces adsorbants présentent en commun une adsorption sélective des matières étrangères présentes dans le liquide contenant SAM brut, par exemple des amines et des matières colorées. Ils présentent cependant une adsorbabilité sélective vis-à-vis de SAM selon leur type.. En particulier, les adsorbants non polaires adsorbent les matières étrangères mais non SAM, et les adsorbants moyennement polaires adsorbent SAM ainsi que les matières étrangères dans des donditions d'acidité relativement faible, mais adsorbent uniquement les matières étrangères et non SAM dans des conditions d'acidité relativement forte. These adsorbents have in common a selective adsorption of foreign materials present in the liquid containing raw SAM, for example amines and colored materials. However, they have a selective adsorbability with respect to SAM according to their type. In particular, non-polar adsorbents adsorb foreign matters but not SAM, and moderately polar adsorbents adsorb SAM as well as foreign matters in conditions of relatively low acidity, but adsorb only foreign matter and not SAM under relatively high acidity conditions.
Dans le procédé de la présente invention, le traitement de 11étape (Aj et le traitement de l'étape (B) sont conduits chacun au moins une fois. La séquence des étapes de traitement est facultative. Des exemples préférés de séquence sont (1) (A) puis (B) ; (2) (B) puis (A) ; (3) (A), (B) puis (A) ; et (4) (B), (A) puis (B). Selon les besoins, l'étape de traitement (A) et/ou l'étape de traitement (B) peuvent être encore enchaînées à ces exemples. A mesure que le nombre des étapes de traitement augmente, les frais entraînés par le procédé de purification sont naturellement légèrement augmentés. In the method of the present invention, the processing of step (Aj and the processing of step (B) are each carried out at least once. The sequence of processing steps is optional. Preferred examples of sequence are (1) (A) then (B); (2) (B) then (A); (3) (A), (B) then (A); and (4) (B), (A) then (B). Depending on the needs, the treatment step (A) and / or the treatment step (B) can be further linked to these examples. As the number of treatment steps increases, the costs involved in the purification process are naturally slightly increased.
Lorsque l'étape de traitement (B) doit être conduite avant l'étape de traitement (A), il est plus opérationnel de se placer dans des conditions dans lesquelles seules les impuretés sont sélectivement adsorbées sur la résine synthétique adsorbante sans adsorption de SAM. Une technique particulière permettant d'établir de telles conditions consiste par exemple à utiliser un adsorbant non polaire ou un adsorbant modérément polaire et à le mettre en contact dans des conditions acides à un pH ne dépassant pas 3,5, de préférence de 0,2 à 3,0. When the treatment step (B) must be carried out before the treatment step (A), it is more operational to place oneself in conditions in which only the impurities are selectively adsorbed on the synthetic adsorbent resin without adsorption of SAM. A particular technique for establishing such conditions consists, for example, of using a non-polar adsorbent or a moderately polar adsorbent and bringing it into contact under acidic conditions at a pH not exceeding 3.5, preferably 0.2 to 3.0.
Lorsque l'étape finale du procédé de purification en série est l'étape (B), il est possible d'utiliser un procédé consistant à adsorber tout d'abord SAM sur la résine synthétique adsorbante, puis à le séparer, ou un procédé qui consiste à faire passer SAM à travers la résine synthétique adsorbante sans adsorption. When the final step of the serial purification process is step (B), it is possible to use a process consisting in first adsorbing SAM on the synthetic adsorbent resin, then in separating it, or a process which consists in passing SAM through the synthetic adsorbent resin without adsorption.
La solution é-luée de SAM provenant de l'étape de purification en série décrite ci-dessus est concentrée sous pression réduite, selon les besoins. Ensuite, elle est amenée au contact d'un solvant organique tel que le méthanol, l'éthanol, le n-pr-opanol, I'isopropanol, le n-butanol, l'isobutanol, le méthoxyéthanol, acétone, la méthyl-éthylcétone, le formiate de méthyle, le formiate d'éthyle, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et le dioxanne. On peut ainsi obtenir un précipité d'un sel formé entre SAM et un acide inorganique ou organique. The SAM solution eluted from the serial purification step described above is concentrated under reduced pressure, as required. Then, it is brought into contact with an organic solvent such as methanol, ethanol, n-pr-opanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, methoxyethanol, acetone, methyl ethyl ketone , methyl formate, ethyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate and dioxane. It is thus possible to obtain a precipitate of a salt formed between SAM and an inorganic or organic acid.
En variante, sans mise en contact de la solution de SAM avec un solvant organique, on peut obtenir une poudre d'un sel formé entre SAM et un acide inorganique ou organique en éliminant l'excès d'acide de la solution de SAM en utilisant une résine d'échange d'anions (du type OH) ou une substance alcaline capable de former un sel insoluble dans l'eau par réaction avec l'acide utilisédans l'élut ion fractionnée de SAM, puis évaporation du solvant de la solution sous pression réduite jusqu siccités
La résine d'échange d'ions faiblement acide du type H+ est régénérée à un stade où SB en a été éiué. Il n'est donc pas toujours néces-saire de la soumettre à un traitement de régénération particulier.On peut l'utiliser de façon répétée après seulement un lavage à l'eau Par ailleurs, la résine synthétique adsorbante peut être faci-lement régénérée, par exemple par lavage avec une solution aqueuse à 50 % de méthanol, puis à l'eau. Alternatively, without contacting the SAM solution with an organic solvent, a powder of a salt formed between SAM and an inorganic or organic acid can be obtained by removing excess acid from the SAM solution using an anion exchange resin (of the OH type) or an alkaline substance capable of forming a salt insoluble in water by reaction with the acid used in the fractionated elution of SAM, then evaporation of the solvent from the solution under reduced pressure to dryness
The weakly acidic ion exchange resin of the H + type is regenerated at a stage when SB has been eliminated therefrom. It is therefore not always necessary to subject it to a particular regeneration treatment. It can be used repeatedly after only washing with water. Furthermore, the synthetic adsorbent resin can be easily regenerated, for example by washing with a 50% aqueous solution of methanol, then with water.
Ainsi, selon la présente invention on peut obtenir efficacement SAM d'un très haut degré de pureté par des opérations simples en utilisant des substances faciles à régénérer. Thus, according to the present invention, SAM can be efficiently obtained with a very high degree of purity by simple operations using substances which are easy to regenerate.
Les exemples suivants illustrent la présente invention plus en détail. The following examples illustrate the present invention in more detail.
EXEMPLE 1
On cultive Saccharomyces cerevisiae (IFO 204) dans le milieu de culture de F. Schlenk et coll. Journal of Biological Chemistry, Vol. 229, page 1037 (1957)] pour former des cellules microbiennes dans lesquelles est accumulé SAM. On met en suspension- 210 g des cellules résultantes dans 1000 ml d'acide perchlorique 1,5N et on les extrait par agitation à la température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, on élimine les résidus cellulaires en les séparant par centrifugation, On ajoute de l'hydrogénocarbonate de potassium à l'extrait pour ajuster son pH à 5,0.EXAMPLE 1
Saccharomyces cerevisiae (IFO 204) is cultivated in the culture medium of F. Schlenk et al. Journal of Biological Chemistry, Vol. 229, page 1037 (1957)] to form microbial cells in which SAM is accumulated. 210 g of the resulting cells are suspended in 1000 ml of 1.5N perchloric acid and extracted by stirring at room temperature for 1 hour. Then, the cell residues are removed by separating them by centrifugation. Potassium hydrogen carbonate is added to the extract to adjust its pH to 5.0.
On élimine en filtrant par aspiration à la trompe le précipité résultant de perchlorate de potassium pour obtenir 1080 ml d'un extrait contenant 1,15 g de SAM.The resulting precipitate of potassium perchlorate is removed by suction filter filtration to obtain 1080 ml of an extract containing 1.15 g of SAM.
On fait passer l'extrait à travers une colonne garnie de 200 ml de résine d'échange de cations faiblement acide, Amberlite IRC-50 (type H+) (marque de fabrique d'un produit de Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide acétique 0,0001N et la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 630 ml d'une solution de SAM. The extract is passed through a column packed with 200 ml of weakly acidic cation exchange resin, Amberlite IRC-50 (type H +) (trademark of a product of Rohm & Haas Co.) to adsorb SAM . The column is washed with 400 ml of 0.0001N acetic acid and subjected to fractional elution with 0.1N sulfuric acid to obtain 630 ml of a SAM solution.
On ajuste le pH de la solution de SAM résultante à 4,5 avec une résine d'échange d'anions faiblement basique,
Amberlite IRA-45 (type OH ) (marque de fabrique d'un produit de Rohm & Haas Co.), puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 1,5 litre de Amberlite XAD-7 (marque de fabrique d'une résine synthétique adsorbante du type acrylate fabriquée par Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM.The pH of the resulting SAM solution is adjusted to 4.5 with a weakly basic anion exchange resin,
Amberlite IRA-45 (type OH) (trademark of a product of Rohm & Haas Co.), then passed through a column packed with 1.5 liters of Amberlite XAD-7 (trademark of a synthetic adsorbent resin of the acrylate type manufactured by Rohm & Haas Co.) to adsorb SAM.
On lave la colonne avec 2 litres d'acide acétique 0,0001N -puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 1440 ml d'une solution de SAM.The column is washed with 2 liters of 0.0001N acetic acid - then it is subjected to a fractional elution with 0.1N sulfuric acid to obtain 1440 ml of a SAM solution.
On concentre la solution de SAM sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200 ml. The SAM solution is concentrated under reduced pressure until its total volume is 200 ml.
On ajoute ensuite 800 ml d'acétone pour obtenir un précipité de sulfate de SAM. On recueille le précipité par séparation par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau puis on le lyophilise pour obtenir 1,74 g de sulfate de SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.800 ml of acetone are then added to obtain a precipitate of SAM sulfate. The precipitate is collected by separation by centrifugation, dissolved in a small amount of water and then lyophilized to obtain 1.74 g of SAM sulfate in the form of a white powder. This product has a single stain in paper chromatography and thin layer chromatography on silica gel.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1. The SAM yield and its degree of purity are shown in Table 1.
EXEMPLE 2
On fait passer un extrait contenant 1,06 g de SAM, obtenu de la même manière que dans liExemple 1, à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-84 (type H+) (marque de fabrique d'une résine d'échange de cations faiblement acide fabriquée par Rohm & Haas Co.) pour adsorber
SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide chlorhydrique 0,0001N puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide chlorhydrique pour obtenir 640 ml d'une solution de SAM.EXAMPLE 2
An extract containing 1.06 g of SAM, obtained in the same manner as in Example 1, is passed through a column packed with 200 ml of Amberlite IRC-84 (type H +) (trademark of a resin of weak acid cation exchange made by Rohm & Haas Co.) to adsorb
SAT. The column is washed with 400 ml of 0.0001N hydrochloric acid and then subjected to fractional elution with hydrochloric acid to obtain 640 ml of a SAM solution.
La solution de SAM est ajustée à pH 4,8 avec
Amberlite IRA-45 (typeçOH ), une résine d'échange dlanions faiblement basique, puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 1,5 litre de Amberlite XAD-7 (marque de fabrique d-'une résine synthétique adsorbante fabriquée par
Rohm & Haas Co.) pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 2 litres d'acide acétique 0,0001N puis on la soumet à une élution fractionnée en faisant passer un solvant mixte composé d'acide chlorhydrique 0,1N et-d'acétone (à un rapport en volume de 1:0.,1) pour obtenir 1120 ml d'une solution de SAM.The SAM solution is adjusted to pH 4.8 with
Amberlite IRA-45 (typeçOH), a weakly basic ion exchange resin, then it is passed through a column packed with 1.5 liters of Amberlite XAD-7 (trademark of a synthetic adsorbent resin manufactured by
Rohm & Haas Co.) to adsorb SAM. The column is washed with 2 liters of 0.0001N acetic acid and then subjected to fractional elution by passing a mixed solvent composed of 0.1N hydrochloric acid and acetone (at a volume ratio of 1: 0., 1) to obtain 1120 ml of a SAM solution.
La so-lution de SAM est concentrée sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200 ml, puis on ajoute Amberlite IRA-45 (type OH ), une résine d'échange d'anions faiblement basique, pour ajuster le pH de la solution à 2,0. On sépare la résine par filtration par aspiration, et on concentre le filtrat sous pression réduite. The SAM solution is concentrated under reduced pressure until its total volume is 200 ml, then Amberlite IRA-45 (OH type), a weakly basic anion exchange resin, is added to adjust the pH of the solution at 2.0. The resin is separated by suction filtration, and the filtrate is concentrated under reduced pressure.
On lyophilise le concentré pour obtenir 1,19 g de chlorhydrate de SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.The concentrate is lyophilized to obtain 1.19 g of SAM hydrochloride in the form of a white powder. This product has a single stain in paper chromatography and thin layer chromatography on silica gel.
Le rendement en SAM et son degré de-pureté sont indiqués sur le Tableau 1. The SAM yield and its degree of purity are indicated in Table 1.
EXEMPLE 3
On fait passer un extrait contenant 0,98 g de SAM, obtenu de la même manière que dans l'Exemple 1, à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite XAD-2 (marque de fabrique d'un adsorbant du type styrène/divinylbenzène fabrique par Rohm & Haas Co.) pour adsorber les matières étrangères. On ajoute de l'hydrogénocarbonate de potassium à la solution de SAM de laquelle les matières étrangères ont été éliminées comme ci-dessus, pour ajuster son- pH à 5,0.EXAMPLE 3
An extract containing 0.98 g of SAM, obtained in the same manner as in Example 1, is passed through a column packed with 200 ml of Amberlite XAD-2 (trademark of a styrene-type adsorbent / divinylbenzene manufactured by Rohm & Haas Co.) to adsorb foreign matter. Potassium hydrogen carbonate is added to the SAM solution from which foreign matter has been removed as above, to adjust its pH to 5.0.
On sépare le précipité résultant de perchlorate de potassium en filtrant par aspiration.The resulting precipitate of potassium perchlorate is separated by suction filtration.
On fait ensuite passer la solution de SAM à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite RC-50 (type
H+), une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 400 ml d'acide acétique 0,0001N et la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 630 ml d'une solution de SAM.The SAM solution is then passed through a column packed with 200 ml of Amberlite RC-50 (type
H +), a weakly acidic cation exchange resin, to adsorb SAM. The column is washed with 400 ml of 0.0001N acetic acid and subjected to fractional elution with 0.1N sulfuric acid to obtain 630 ml of a SAM solution.
On concentre la solution de SAM résultante sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200 ml, puis on ajoute 800 ml d'acétone pour obtenir un précipité de sulfate de SAM. off recueille le précipité en, le séparant par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau, et on le lyophilise pour obtenir 1,50 g de sulfate de SAM sous forme d'une poudre blanche. The resulting SAM solution is concentrated under reduced pressure until its total volume is 200 ml, then 800 ml of acetone is added to obtain a SAM sulfate precipitate. off collects the precipitate in, separating it by centrifugation, dissolving it in a small amount of water, and lyophilizing it to obtain 1.50 g of SAM sulfate in the form of a white powder.
Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.This product has a single stain in paper chromatography and thin layer chromatography on silica gel.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1. The SAM yield and its degree of purity are shown in Table 1.
EXEMPLE 4
On produit des cellules microbiennes contenant
SAM accumulé de la même manière que dans l'Exemple 1. On met en suspension 200 g des cellules microbiennes dans 1000 ml d'acide formique 0,1N. On chauffe la suspension à 60"C pendant 10 minutes, puis on la refroidit immediatement. On se- pare les cellules par centrifugation pour obtenir 1020 ml d'un extrait contenant 0,91 g de SAM.EXAMPLE 4
We produce microbial cells containing
SAM accumulated in the same manner as in Example 1. 200 g of the microbial cells are suspended in 1000 ml of 0.1N formic acid. The suspension is heated to 60 ° C. for 10 minutes, then immediately cooled. The cells are separated by centrifugation to obtain 1020 ml of an extract containing 0.91 g of SAM.
On fait passer l'extrait à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite XAD-8 (marque de fabrique d'un acrylate adsorbant fabriqué par Rohm & Haas Co.) pour adsorber les matières étrangères. The extract is passed through a column packed with 200 ml of Amberlite XAD-8 (trademark of an adsorbent acrylate manufactured by Rohm & Haas Co.) to adsorb foreign matter.
La solution de SAM débarrassée des matières étrangères comme ci-dessus est ajustée à pu .5,0 avec Amberlite
IRA-45 (type OH-), une résine d'échange d'anions faiblement basique, puis on la fait passer à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-84 (type H+)9 une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM.The SAM solution freed of foreign matter as above is adjusted to pu .5.0 with Amberlite
IRA-45 (OH- type), a weakly basic anion exchange resin, then pass it through a column packed with 200 ml of Amberlite IRC-84 (H + type) 9 cation exchange resin weakly acid, to adsorb SAM.
On lave la colonne avec 400 ml d'acide chlorhydrique 0,0001N, puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide chlorhydrique 0,2N pour obtenir 710 ml d'une solution de-SAM.The column is washed with 400 ml of 0.0001N hydrochloric acid, then it is subjected to a fractional elution with 0.2N hydrochloric acid to obtain 710 ml of a solution of-SAM.
On ajoute Amberlite IRA-45 (type OH )v-une résine d'échange d'anions faiblement basique, à la solution de SAM pour ajuster son pH à 2,0. On sépare la résine par filtration par aspiration, et on concentre le filtrat sous pres- sion réduite, et on le lyophilise pour obtenir 1,01 g de chlorhydrate de SAM sous forme d'une poudre -blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatograph e sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice. Amberlite IRA-45 (OH type) v-a weakly basic anion exchange resin is added to the SAM solution to adjust its pH to 2.0. The resin is removed by suction filtration, and the filtrate is concentrated under reduced pressure, and lyophilized to give 1.01 g of SAM hydrochloride as a white powder. This product has a single stain in paper chromatography and thin layer chromatography on silica gel.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1. The SAM yield and its degree of purity are shown in Table 1.
EXEMPLE 5
On fait passer 630 ml d'une solution de SAM, obtenue par traitement avec l'adsorbant styrène/divinylbenzène et la résine d'échange de cations faiblement acide de type H de la même manière que dans l'Exemple 3,a travers une colonne garnie de 200 ml dgun adsorbant du type acrylate, Amberlite XAD-7, pour adsorber les matières étrangères.EXAMPLE 5
630 ml of a SAM solution, obtained by treatment with the styrene / divinylbenzene adsorbent and the weakly acidic cation exchange resin type H, is passed through a column in the same manner as in Example 3. filled with 200 ml of an adsorbent of the acrylate type, Amberlite XAD-7, to adsorb foreign matter.
La solution de SAM dont les matières étrangères ont été éliminées comme ci-dessus est concentrée sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total soit de 200m1. The SAM solution from which the foreign materials have been removed as above is concentrated under reduced pressure until its total volume is 200m1.
On ajoute ensuite 800 ml d'acétone pour former un précipité de sulfate de SAM. On recueille le précipité en le. séparant par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau, et le lyophilise pour obtenir 1,46 g de sulfate de
SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.800 ml of acetone are then added to form a precipitate of SAM sulfate. The precipitate is collected in it. separating by centrifugation, it is dissolved in a small amount of water, and lyophilized to obtain 1.46 g of
SAM in the form of a white powder. This product has a single stain in paper chromatography and thin layer chromatography on silica gel.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1. The SAM yield and its degree of purity are shown in Table 1.
Exemple Comparatif 1
On ajuste à 5,0 le pH de 950 g d'un extrait contenant Q;98 g de SAM, obtenu de la même manière que dans l'Exemple 1, avec de l'hydrogénocarbonate de potassium.Comparative Example 1
The pH of 950 g of an extract containing Q; 98 g of SAM, obtained in the same manner as in Example 1, is adjusted to 5.0 with potassium hydrogen carbonate.
On sépare le précipité résultant de perchlorate de potassium par filtration par aspiration pour obtenir un liquide contenant SAM.The resulting precipitate of potassium perchlorate is separated by suction filtration to obtain a liquid containing SAM.
On fait passer le liquide contenant SAM à travers une colonne garnie de 200 ml de Amberlite IRC-50 (type H) une résine d'échange de cations faiblement acide, pour adsorber SAM. On lave la colonne avec 400 mî d'acide acétique 0,0001N, puis on la soumet à une élution fractionnée avec de l'acide sulfurique 0,1N pour obtenir 610 ml d'une solution de SAM. The liquid containing SAM is passed through a column packed with 200 ml of Amberlite IRC-50 (type H), a weakly acidic cation exchange resin, to adsorb SAM. The column is washed with 400 ml of 0.0001N acetic acid, then it is subjected to a fractional elution with 0.1N sulfuric acid to obtain 610 ml of a SAM solution.
On fait passer la solution de S M à travers une colonne garnie de 200 ml de carbone actif chromatographique. The S M solution is passed through a column packed with 200 ml of chromatographic active carbon.
On lave lacolonne avec 600 ml d'acide sulfurique 0,2N, puis on la soumet à une élution fractionnée avec un solvant mixte se composant d'acide sulfurique 1,GN et de méthanol (1:1 en volume) pour obtenir une solution de SAN. The column is washed with 600 ml of 0.2N sulfuric acid, then it is subjected to a fractional elution with a mixed solvent consisting of sulfuric acid 1, GN and methanol (1: 1 by volume) to obtain a solution of SAN.
On concentre la solution de SAM sous pression réduite jusqu'à ce que son volume total -soit de 200 ml. The SAM solution is concentrated under reduced pressure until its total volume is 200 ml.
On ajoute 800 ml d'acétone pour obtenir un précipité de sulfate de SAM. On recueille le précipité par séparation par centrifugation, on le dissout dans une petite quantité d'eau, et le lyophilise pour obtenir 1,28 g de sulfate de
SAM sous forme d'une poudre blanche. Ce produit présente une seule tache dans la chromatographie sur papier et la chromatographie en couche mince sur gel de silice.800 ml of acetone are added to obtain a precipitate of SAM sulfate. The precipitate is collected by separation by centrifugation, dissolved in a small amount of water, and lyophilized to obtain 1.28 g of
SAM in the form of a white powder. This product has a single stain in paper chromatography and thin layer chromatography on silica gel.
Le rendement en SAM et son degré de pureté sont indiqués sur le Tableau 1. The SAM yield and its degree of purity are shown in Table 1.
Exemple Comparatif 2
On répète Exemple 1 à la-différence qu'on n'effectue que le traitement avec Amberlite IRC-50 (type H+) comme traitement de purification.Comparative Example 2
Example 1 is repeated except that only the treatment with Amberlite IRC-50 (type H +) is carried out as a purification treatment.
Les résultats sont indiqués sur le Tableau 1. The results are shown in Table 1.
Tableau 1
Pureté Réaction Quantité de Rendement
de SAM à la mé.thylthio- en SAM
(7) ninhydrine adénosine (%)
(*1) avec des (%) (*3)
matières
autres que
SAM (*2)
Ex. 1 98,1 - 0,08 89
Ex. 2 98,0 . - 0,1 90
Ex. 3 98,0 - 0,1 90
Ex. 4 98,1 - 0,08 90
Ex. 5 98,5 - å 0,05 88
à 0,05
Ex. Comp. 1 97,6 - 0,4 77
Ex. Comp. 2 56,7 ++ 1,8 90
"Ex." signifie Exemple, et "Ex. Comp." signifie
Exemple Comparatif.Table 1
Purity Reaction Yield Quantity
from SAM to m.thylthio- in SAM
(7) adenosine ninhydrin (%)
(* 1) with (%) (* 3)
materials
other than
SAT (* 2)
Ex. 1 98.1 - 0.08 89
Ex. 2 98.0. - 0.1 90
Ex. 3 98.0 - 0.1 90
Ex. 4 98.1 - 0.08 90
Ex. 5 98.5 - å 0.05 88
at 0.05
Ex. Comp. 1 97.6 - 0.4 77
Ex. Comp. 2 56.7 ++ 1.8 90
"Ex." means Example, and "Comp. Ex." mean
Comparative example.
(*1) : La pureté de SAM est mesurée par chromatographie bidimensionnelle sur papier. (* 1): The purity of SAM is measured by two-dimensional chromatography on paper.
(*2) : La réaction à la ninhydrine avec des matières autres que SAM est déterminée de la façon suivante
Un échantillon est développé par chromatographie bidimensionnelle en couche mince de cellulose, et la présence de taches autres qu'une tache de SAM qui sont détectées par la formation de couleur à La ninhydrine est mesurée et estimée d'après la méthode suivante à trois graduations. (* 2): The reaction to ninhydrin with materials other than SAM is determined as follows
A sample is developed by two-dimensional thin layer cellulose chromatography, and the presence of spots other than a SAM spot which are detected by the formation of ninhydrin color is measured and estimated according to the following method with three graduations.
- : Néant
+ : Présence légère
++: Présence considérable
(*3) : La quantité de méthylthioadénosine est mesurée par chromatographie bidimensionnelle sur papier.-: None
+: Mild presence
++: Considerable presence
(* 3): The quantity of methylthioadenosine is measured by two-dimensional chromatography on paper.
Les résultats ci-dessus montrent clairement que grâce au procédé de la présente invention, on peut obtenir
SAM de plus grande pureté en un rendement plus élevé que dans les procédés connus. The above results clearly show that by the process of the present invention, it is possible to obtain
SAM of greater purity in a higher yield than in known methods.
Claims (10)
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