FR2492386A1 - Nouveaux composes tetracycliques, leur preparation et les preparations pharmaceutiques les contenant - Google Patents

Abstract

LES COMPOSES DE L'INVENTION SONT DES ANTHROCYCLINES DE FORMULE GENERALE I: (CF DESSIN DANS BOPI) OU R REPRESENTE UN GROUPE METHYLE OU ACETONYLE ET R REPRESENTE NOTAMMENT UN GROUPE DE FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI)

Description

La présente invention concerne de nouveaux composés tétracycliques, un

procédé pour leur préparation et les préparations pharmaceutiques contenant ces composés qui sont efficaces contre les tumeurs et les bactéries. Plus particulièrement, l'invention concerne.de nouvelles anthracyclines qui sont des composés de formule générale

-, 0 COOCH3

I Ii ll | R1 i 2 n OH I

3 >\

o R représente un groupe méthyle ou acétonyle et R2 représente un groupe de formule I, I O

O 0

CH 3 CH3

O $ CHOH 3 CHN

CH3 iT- H C D

249?7386

I E Ho OH XCH:3 F Q 0. 0[[ 4CH,3 OH1 G I OH H

Dans cette description et dans les revendica-

tions jointes les composés spécifiques compris dans la formule I sont désignés comme suit: Rl R2 Composé C Auramycine C D Auramycine D -E. Auramycine E -CH3 F Auramycine F G Auramycine G H Auramycine H C Sulfurmycine C D Sulfurmycine D E Sulfurmycine E -CHz 2-CO-CH3 F Sulfurmycine F G Sulfurmycine G H Sulfurmycine H La nouve auz[ umposês Zsurnis v""!:invention se caracterî_sent par les donnees phvsicochimilues suivantes. (Les solvants utilisés dans la chromatographie en couche mince (CCM) sont le chloroforme/méthanol, 7:1, v/v (solvant A); le benzène/méthanol, 5:1, v/v(solvant B) et le chloroforme/méthanol, 5:1, v/v (solvant C)): Auramycine C (C35H43013N)

PM: 685,3

Point de fusion: 151,0 C (avec décomposition) Rotation spécifique: [o(]20 + 78,80 (c = 0,1 dans le

D chloroforme).

Col (gel de silice): Rf 0,20 (solvant A) Rf 0,30 (solvant B) Auramycine D (C29H33010N)

PM: 555,2

Point de fusion: 139,5 C (avec décomposition)

Rotation spécifique: + 189,3 (c 0,1 dans le chloro-

forme) CCM (gel de silice): Rf 0,08 (solvant A) Rf 0,14 (solvant B) Auramycine E (C41H53015N)

PM: 799,9

Point de fusion: 157,0 C (avec décomposition)

Rotation spécifique: + 32,3 (c = 0,1 dans le chloro-

forme) CCM (Gel de silice): Rf 0,44 (solvant A) Rf 0,41 (solvant B)

_, . 1 -

--j_,- li Auramycine F (C41H53015N)

PM: 799,9

Point de fusion: 160,0 C (avec décomposition) rotation spécifique: +26,7 (c = O,1 dans le chloroforme) CCM (gel de silice): Rf 0,39 (solvant A) 0, 38 (solvant B) Auramycine G (C41H53014N)

PM: 783,9

Point de fusion: 148,50C (avec décomposition)

rotation spécifique: + 38,5 (c = O,1 dans le chloro-

forme) CCM (gel de silice):Rf 0,38 (solvant A) 0,40 (solvant B) Auramycine H (C35H43012N)

PM: 669,3

Point de fusion: 119,5 C (avec décomposition) rotation spécifique: -- (non déterminée) CCM (gel de silice): Rf 0,33 (solvant C) Sulfurmycine C (C37H45014N)

PM: 727,3

Point de fusion: 146,0 C (avec décomposition)

rotation spécifique: + 55,8 (c = O,1 dans le chloro-

forme) CCM (gel de silice): Rf 0,20 (solvant A) 0,30 (solvant B) Sulfurmycine-D (C H O N)

31PM:597,2

PM 597,2

2492386 i Point de fusion: rotation spécifique: CCM (gel de silice): 128, 0 C (avec décomposition)

+ 167,6 (c = 0,1 dans le chloro-

forme) Rf 0,08 (solvant A) 0,14 (solvant B) Sulfurmycine E (C43H55016N)

PM:

Point de fusion: rotation spécifique: CCM (gel de silice): 841,9 151,0 C (avec décomposition)

+ 19,60 (c = 0,1 dans le chloro-

forme) Rf 0,38 (solvant A) 0,37 (solvant B) Sulfurmycine F (C43H55016N)

PM:

Point de fusion: rotation spécifique: CCM (gel de silice): 841,9 151,5 C (avec décomposition)

+ 7,9 (c = 0,1 dans le chloro-

forme) Rf 0,34 (solvant A) 0,36 (solvant B) Sulfurmycine G (C43H55015N)

PM:

Point de fusion: rotation spécifique: CCM (gel de silice): Sulfurmycine H (C37H45013N)

PM: 711,3

825,9 139,0 C (avec décomposition)

+ 25,6 (c = 0,1 dans le chloro-

forme)

Rf. 0,33 (solvant A) -

0,36 (solvant B) o''s Qu fuio n: E;8 5 'avec {]Ocomposition) rtatiol spécifi que + 59,0 (c O,1 dans le chloroforme) CCM (gel de silice): Rf 0, 28 (solvant C) Selon le procédé fourni par l'invention, on prépare les nouveaux composés de formule I ci-dessus (a) en cultivant un mutant dérivé de Streptomyces galilaeus OBB-111, capable de produire les composés de formule I dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies et en recueillant lesdits composés à partir du bouillon de fermentation, (b) en hydrolysant dans.des conditions acides un composé de formule générale

0 COOCH3

- RI

OH I -P1

i 2R'

o R1 a la signification donnée ci-dessus et R repré-

sente un groupe de formule E ou F ci-dessus ou de formule t, -, 8 6 4 2492386'q CH3 OH A pour transformer le groupe R2 en le groupe de formule C, (c) en hydrolysant dans des conditions acides un composé de formule générale

i 2" -

o R1 a la signification donnée ci-dessus et R repre-

sente un groupe de formule A, C, E, F ou G ci-dessus ou de formule

2492386 4

B Cil 3 R2" pour transformer le groupe R en le groupe de formule D, (d) en hydrolysant dans des conditions acides un composé de formule générale

O COOCH3

I I OH I - 2

1 2 su' o R a la signification donnée ci-dessus et o R représente le groupe de formule G ci-dessus, pour transformer le groupe R en le groupe de formule H, (e) en réduisant un composé de formule générale I

2492386 1

O COOCH3

Rl

> < ^O H I

OH OH R t'''' o R1 a la signification donnée ci-dessus et o R2" représente le groupe de formule A ci-dessus, 2" pour transformer le groupe R2 en un groupe de formule E ou F. Le microorganisme utilisé dans le mode de réalisation du procédé ci-dessus comprend tous les mutants dérivés de Streptomyces galilaeus OBB-111 capables de produire les composés de formule I. La souche Streptomyces galilaeus OBB-111 a été isolée à partir de sols de Neuschwanstein en Haute-Bavière, en Allemagne de l'Ouest, et a été déposée à l'Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute du Japon, sous le n FERM-P 4780 (29 janvier 1979), et à l'American Type Culture Collection Rockville, Maryland, U.S.A., sous le n ATCC 31533. Ces mutants dérivés de Streptomyces galilaeus OBB-111 (FERM-P 4780, ATCC 31533) peuvent être obtenus par des procédés classiques de mutation; par exemple par irradiation avec la lumière UV, les rayons X ou les rayons gamma, ou par

traitement avec des agents mutagènes appropriés.

La souche préférée utilisée dans le mode de réalisation (a) du procédé précédent est Streptomyces galilaeus OBB-111-610 obtenue en traitant Streptomyces

2492386'4

1I

alilaeus OBB-111 avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-

guanidine. La souche Streptomyces galilaeus OBB-111-610 a été déposée à l'Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute du Japon, sous le n FERM-P 4883 (22 mars 1979), et à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A.,

sous le n ATCC 31534.

Les caractères mycologiques de Streptomyces galilaeus OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC 31534) sont les suivants: 1. Propriétésmycologiques La souche OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC 31534) forme un mycélium aérien de longueur modérée à partir du mycélium substrat.'On observe des crochets ou des spirales qui se développent au sommet du mycélium aérien, mais il ne

se forme pas de tourbillons.

On observe habituellement la production de

chaînes de spores mûrs ayant plus de 10 spores par chaîne.

Les spores sont cylindriques et mesurent 0,5 à 0,6 >i x 0,8

à 1,O u, et leur surface est lisse.

2. Caractères culturaux sur divers milieux Le tableau 1 ci-dessous donne les caractères culturaux de la souche OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC

31534).

-25 La couleur de la croissance de la souche OBB-111-

610 (FERM-P 4883, ATCC 31534) sur gélose saccharose-

nitrate, gélose glucose-asparagine, gélose glycérol-

asparagine, gélose amidon-sels inorganiques et gélose de farine d'avoine passe au rose violet avec l'addition goutte à goutte d'une solution d'hydroxyde de sodium

0,05 N.

2492386 i

Tableau 1

Caractères culturaux de la souche OBB-111-610 (FERM-P 4883,

ATCC 31534)

Milieu - Souche OBB-111-610 Gélose saccharose-nitrate Croissance jaune pâle-,brun jaunâtre pale (3 gc, jaune clair) Mycélium aérien. gris brunâtre (3cb, sable) _ orange pale (5 cb) Pigment diffusable jaunâtre Gélose glucose-asparagine Croissance orange terne (3 pe, topaze-% 3ne, topaze)

Mycélium aérien gris brunâtre clair (3dc, natu-

rel)- gris clair (2fe, gris voilé) Pigment diffusable brunâtre Gélose glycérol-asparagine (milieu ISP n 5)

Croissance jaune pale (3gc, fauve clair)-

brun jaunâtre pale (31c, ambre) Mycélium aérien gris clair (2fe, gris voilé) Pigment diffusable jaune

Gélose amidon-sels inorga-

niques (milieu ISP n 4)

Croissance jaune pâle (2pc, or brillant)-

jaune terne (2pe, or moutarde) Mycélium aérien gris brunâtre clair (2dc, naturel) -gris clair (2fe, gris voilé) Pigment diffusable jaune Gélose à la tyrosone (milieu ISP n 7) Croissance gris brunâtre foncé (3ni, brun girofle) Mycélium aérien aucun P'igment diffusable noir Gélose nutritive Croissance brun pâle incolore Mycélium aérien aucun Pigment diffusable brun

Gélose extrait de levure-

extrait de malt (milieu ISP n 2) Croissance brun jaunâtre (3ng, érable jaune) Mycélium aérien gris clair (2fe, gris voilé) Pigment diffusable aucun Gélose de farine d'avoine (milieu ISP n 3) Croissance brun jaunâtre pâle (2gc, bambou), brun pale (3ie, chameau) Mycélium aérien gris clair (2fe, gris voiléez 3fe, gris argenté) Pigment diffusable brun Laitécrémé (37 C) Croissance brunr brun foncé Mycélium aérien blanc ' gris brunâtre Pigment diffusable brun foncé

Gélose glucose-peptone-

gélatine r Croissance Mycélium aérien Pigment diffusable jaune pâle aucun brun 3. Caractères physiologiques Les tableaux 2 et 3 ci-dessous montrent

respectivement les caractères physiologiques et l'utili-

sation des hydrates de carbone de la souche OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC 31534). On examine la température de croissance sur gélose extrait de levure- extrait de

malt (milieu ISP n 2) à 20, 27, 32, 37, 40 et 45 C.

La température optimale pour la croissance est comprise entre.27 et 32 C et aucune croissance ne se produit à

45 C. -

Tableau 2

Caractères physiologiques de la souche OBB-111-610 (FERM-P n 4883, ATCC 31534) Test Réaction Procédés et matières Liquéfaction de gélatine Hydrolyse de l'amidon Peptonisation et coagulation du lait écrémé Réduction des nitrates Formation de mélanine Liquéfaction faible à modérée Hydrolyse faible à modérée Peptonisation modérée à forte

et pas de coagula-

tion Positive Positive

Milieu glucose-peptone-

gélatine 27 C Gélose amidon-sels inorganiques Lait écrémé à 10 % 37 C Milieu ISP n 8 27 C Milieu Milieu Milieu ISP n 1 ISP n 6 ISP n 7

Tableau 3

Utilisation des hydrates de carbone par la souche OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC 31534) L-Arabinose positive D-Xylose positive Glucose positive D-Fructose positive Saccharose positive Inositol positive L-Rhamnose positive Raffinose positive D-Mannitol négative

Milieu basal: milieu de Pridham-Gottlieb (ISP no 9).

Température: 27 C.

Les caractères mycologiques de Streptomyces galilaeus OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC 31534)sont presque identiques à ceux de la souche parente, c'est-à-dire

Streptomyces galilaeus OBB-111 (FERM-P 4780, ATCC 31533).

Selon un aspect préféré du mode de réalisation (a) du procédé ci-dessus, on peut produire les composés

de formule I en cultivant Streptomyces galilaeus OBB-111-

610 (FERM-P 4883, ATCC 31534) dans un milieu nutritif

aqueux dans des conditions aérobies.

On peut procéder à la culture dans un milieu de

culture contenant les substances nutritives habituelles.

Les sources de carbone, par exemple, sont le glucose, le saccharose, l'amidon, le lactose, le maltose, le fructose, le glycérol, la dextrine ou leurs mélanges et les sources d'azote sont, par exemple, la farine de soja,la farine de graine de coton, l'extrait de viande, la farine de poisson,

2492386 4

la peptone, la levure séchée, la liqueur de mais macérée, de préférence les germes de blé ou leurs mélanges. En outre, si nécessaire, le milieu de culture peut contenir des substances inorganiques appropriées comme les phosphates, sulfates, chlorures, bromures, nitrates et carbonates de sodium, de potassium, d'ammonium, de calcium, etc. La culture peut s'effectuer dans un milieu aqueux dans des conditions aérobies, en particulier par un procédé de fermentation en immersion. La température préférée pour la culture est dans un intervalle de 200 à 370C, en particulier 25 à 30C. Le pH du milieu peut varier, mais il se situe généralement -dans un intervalle

de 5 à 8.

Après qu'on ait procédé à la culture pendant

environ 2 à 10 jours dans les conditions mentionnées ci-

dessus, on peut obtenir les composés de formule I dans le bouillon de fermentation. Les composés de formule I ainsi obtenus, c'est-à-dire les auramycines C, D, E, F et G, et les sulfurmycines C, D, E, F et G peuvent être récupérées à partir du bouillon de fermentation; par exemple, par extraction avec un solvant organique non

miscible à l'eau comme l'acétate d'éthyle, le chloro-

forme, le chlorure de méthylène, la méthylisobutyl-

cétone ou un mélange de chloroforme et de méthanol, de préférence avec du chloroforme/méthanol (1:1, v/v). On sépare la phase organique et on la sèche pour donner une matière huileuse. On ajoute à cette matière huileuse un solvant organique non polaire comme le n-hexane, les

composés bruts étant ainsi obtenus sous forme de poudres.

Les composés obtenus peuvent être séparés les uns des autres par chromatographie sur des colonnes remplies d'un absorbant comme le gel de silice, ou d'un gel de dextranecomme le Sephadex LH-20, etc. On analyse les fractions par chromatographie en couche mince et/ou chromatographie en phase liquide à haute pression et on combine et on fait évaporer les fractions appropriées pour donner le composant sous forme plus ou moins pure. On

peut procéder à une purification plus poussée par chroma-

tographie sur colonne répétée et/ou par chromatographie

en phase liquide à haute pression.

L'hydrolyse acide de l'auramycine A, B, C, E, F ou G, ou de la sulfurmycine A, B, C, E, F ou G selon

le mode de réalisation (b), (c) ou (d) du procédé précédent.

peut s'effectuer de façon classique en utilisant un acide comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide chlorhydrique-méthanol, etc (de

0,1 à 3 N). L'hydrolyse peut s'effectuer à une tempéra-

ture comprise entre O C et la température de reflux du mélange d'hydrolyse, de préférence à une température

élevée. On prépare l'auramycine C, D et H et la sulfur-

mycine C, D et H par cette hydrolyse acide.

La réduction du groupe carbonyle de la fraction sucrée de' l'auramycine A ou de la sulfurmycine A selon le mode de réalisation (e) du procédé précédent peut également s'effectuer de façon classique en utilisant un agent réducteur comme le borohydrure de sodium, l'hydrure de lithiumaluminium, etc., ou une enzyme préparée, par exemple, à partir d'homogénats de foie de rat ou de cellules de microorganismes produisant l'antibiotique anthracycline. L'auramycine E et F et la sulfurmycine E

et F se préparent par ce procédé de réduction.

Les antibiotiques anthracyclines préparés selon le procédé fourni par l'invention présentent une

activité antibactérienne et antitumorale.

L'invention concerne donc également les agents antibactériens et antitumoraux qui contiennent comme ingrédient actif un composé d'anthracycline de formule I. Dans un aspect préféré, les agents antibactériens de l'invention contiennent l'auramycine ou la sulfurmycine C, D, E, F et/ou G et les agents antitumoraux contiennent l'auramycine ou la sulfurmycine C, D, E et/ou G' Les activités biologiques des composés d'anthracycline de l'invention s'observent d'après les données suivantes:

1. Le Tableau 4 ci-dessous montre la concentration mini-

male inhibitrice (CMI) des auramycines C, D, E, F et G et des sulfurmycines C, D, E, F et G par rapport à divers micro-organismes, par détermination utilisant le procédé

d'ensemencement sur gélose.

Tableau 4

Souche C M I (<g/ml) Auramycine Auramycine Sulfurmycine Sulfurmycine

C D C D

.,, Staphylococcus aureus 209P IAM-1011 (1) 6,25 12,5 6,25 2.5,0 Staphylococcus aureus 209P Stf (1) 6,25 12,5 6,25 25,0 Sarcina lutea IAM1009 '(1) 6,25 6,25 6,25 25,0 Micrococcus flavus ATCC-10240 (1) 6,25 12,5 6,25 25,0 Bacillus subtilis IAM-1027 (1) 6,25 12,5. 12,5 12,5 Mycobacterium smegmatis IFO-13167 (1) 6,25 3,13 3,13 6,25 Pseudomonas aeruginosa IFO-12689 (1) > 50 > 50 * 50 050 Escherichia coli K-12 IAM1264 (1) 50 50 50;50 Escherichia coli NIHJ IFO-12734 (1) '50 '50 =>50 -50 Candida albicans ATCC-10231 (2) > 50 > 50, 50,50 Candida tropicalis ATCC13803 (2) > 50 >50 7 50 >50 (1): gélose d'infusion cardiaque (2): gélose au dextrose de sabouraud ru CO Co ON Tableau 4 (suite) Souche C M I (yg/ml)

Aura- Aura- Aura- Sulfur- Sulfur- Sulfur-

mycine mycine mycine mycine mycine mycine

E F G E F G

Staphylococcus aureus 209P IAM-1011 (1) 1,56 3,12 6,25 3,12 3,12 6,25 Staphylococcus epidermidis IF0-12993 (1) 3,12 3,12 6,25 1,56 12,5 12,5 Sarcina lutea IAM-1009 (1) 3,12 3,12 6,25 3,12 1,56 12,5 Micrococcus flavus ATCC-10240 (1) 3,12 3,12 6,25 3,12 1,56 12,5 Bacillus subtilis IAM1027 (1) 3,12 3,12 12,5 3,12 3,12 6,25 Bacillus cereus Ro179B (1) 0,39 0, 39 0,78 0,39 0,39 0,39 Escherichia coli K-12 IAM-1264 (1) 50 50 50 550, 50 5 50 Escherichia coli NIHJ IFO-12734 (1) m 50 >50 550.50 >50 50 Candida albicans ATCC-10231 (2) =50 -50 0 50.50: 50 50 Candida tropicalis ATCC-13803 (2) 50. 50 >50 >.50 50 50 (1): gélose d'infusion cardiaque (2) : gélose au dextrose de sabouraud o CD %O co Mi

2492386 4

2. Toxicité aiguë La DL50 intrapéritonéale aiguë chez les souris,

évaluée 72 heures après une seule injection des anti-

biotiques, est d'environ 90 mg/kg pour l'auramycine C, l'auramycine D, la sulfurmycine C et la sulfurmycine D, de 40 à 80 mg/kg pour l'auramycine G et la sulfurmycine G

et de 20 à 40 mg/kg pour l'auramycine E et la sulfur-

mycine E. 3. Effet antitumoral On teste les glycosides anthracyclines fournis par l'invention vis-à-vis de la leucémie P388 chez la souris. Lorsqu'on inocule à des souris CDFi 1. x 106

cellules de P388 par voie intrapéritonéale et qu'on admi-

nistre chacun des antibiotiques par voie intrapéritonéale les le, 5e et 9e jours, la durée de survie des souris

traitées est prolongée conmre le montre le Tableau 5 ci-

dessous.

Tableau 5

Antibiotique Dose Survie moyenne Antibiotiquem/gDu)*tJ,% (mg/kg/jour) (T/C, %) Auramycine C 10 128

7,5 141

3,75 130

1,88 135

,0 141

Auramycine D 7,5 149

3,75 103

1,88

12,0 165

Auramycine E 6,0 158

3,0 139

1,5 131

2492386 4

Tableau 5 (suite) Conme il a été mentionné ci-dessus, les composés d'anthracycline de formule I peuvent être utilisés comme

médicaments sous forme de- préparations pharmaceutiques.

Les présents agents antitumoraux comprennent également les sels pharmaceutiquement acceptables de ces composés, en particulier les sels d'addition acides de sels inorganiques et organiques classiques; par exemple des acides inorganiques comme l'acide chlorhydrique et l'acide phosphorique; et

des acides organiques comme l'acide acétique, l'acide pro-

pionique et l'acide succinique.

Antibiotique Dose Survie moyenne (mg/kg/jour) (T/C, %)

12,0 119

6,0 105

Auramycine G 3,0 105

3,0 109

1,5 102

,0 141

Sulfurmycine C.7,5 138

3,75 141

1,88 131

,0 152

Sulfurmycine D 7,5 128

3,75 135

1,88 106

12,0 165

Sulfurmycine E 6,0 150

3,0 140

1,5 133

24,0 144

Sulfurmycine G 12,0 123

6,0 113

3,0 112

1,5 104

2492386 '

Les présentes préparations pharmaceutiques contiennent l'ingrédient actif en association avec un support pharmaceutique compatible. Ce support peut être un support inerte organique ou inorganique approprié à l'administration entérale, percutanée ou parentérale comme, par exemple, l'eau, la gélatine, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, les polyalcoylèneglycols, la vaseline, etc. Les préparations pharmaceutiques peuvent également contenir des matières thérapeutiquement intéressantes autres que les antibiotiques anthracyclines de l'invention. Les préparations pharmaceutiques peuvent être formulées sous forme solide (par exemple sous forme de comprimés, de dragées ou de capsules) ou sous forme liquide (par exemple sous forme de solutions, de

suspensions ou d'émulsions). Les préparations pharma-

ceutiques peuvent être stérilisées et/ou peuvent contenir des adjuvants comme des agents de conservation, des stabilisateurs, des agents mouillants, des émulsifiants, des sels pour faire varier la pression osmotique ou des tampons. La posologie de l'ingrédient actif dépend du mode d'administration, de l'âge, du poids et de l'état du

malade ainsi que de la maladie particulière à traiter.

-25 Cependant, la-posologie typique pour les adultes varie entre 20 et 30 mg/jour dans le cas de l'administration

orale ou parentérale, de préférence par injection intra-

veineuse. Les exemples suivants précisent le procédé

fourni par l'invention.

Exemple 1

On transfère les spores raclées à partir d'une

culture gélosée en biseau de Streptomyces galilaeus OBB-

111-610 (FERM-P 4883, ATCC 31534) dans un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérilisé composé de ,0 g de D-glucose, 20,0 g d'amidon soluble, 5,0 g de viande S-3 (Ajinomoto Co., levure (Daigo Eiyo-Kagaku Co. acide dipotassique, 1,0 g de hydraté, 3,0 g de chlorure de de calcium complété à 1 litre On fait incuber cette culture agitateur rotatif réglé à 180 de 72 h, on transfère 2 ml de de 500 ml contenant 100 ml de Ltd.), 2,5 g d'extrait de Ltd.), 1,0 g de phosphate

sulfate de magnésium hepta-

sodium et 3,0 g de carbonate

*avec de l'eau du robinet.

végétative à 27 C sur un tourspar minute. Au bout culture dans un erlenmeyer milieu de production stérile composé de 20,0 g de D-glucose, 20,0 g d'amidon soluble, ,0 g de pharmamedia (Traders Oil Mill Co., U.S.A. ), 1,0 g

de sulfate acide dipotassique, 1,0 g de sulfate de magné-

sium heptahydraté, 3,0 g de chlorure de sodium et 3,0 g de carbonate de calcium complété à 1 litre avec de l'eau du robinet. On fait incuber la culture à 27 C pendant 72 à 96 heures sur un agitateur rotatif réglé à 180 tours par minute. A ce moment, l'activité antibiotique du filtrat de culture et de l'extrait de mycélium, mesurée-par le procédé de diffusion en gélose sur disque de papier en utilisant Sarcina lutea IAM-1009 comme microorganisme

expérimental, est de 22 mm et 20 mm de diamètre, respective--

ment.

On obtient le Streptomyces galilaeus OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC 31534) mentionné ci-dessus par le

procédé suivant.

On met en suspension les spores d'une culture sur gélose en biseau de Streptomyces galilaeus OBB-111 (FERMI-P 4780, ATCC 31533) dans 10.ml de solution stérile de sel physiologique et on filtre à travers un filtre en verre n 3. On dilue deux fois la suspension de spores avec un

tampon tris 0,2 M (pH 9,0) contenant 2 mg/m2 de N-méthyl-

N'-nitro-N-nitrosoguanidine et on fait incuber à 270C pendant 60 minutes. On recueille alors les spores sur le filtre Nucléopore (taille des pores 0,2 micromètre), on lave avec 30 ml de solution stérile de sel physiologique et on remet en suspension dans 10 ml de solution stérile de sel.physiologique. On étend la suspension de spores ainsi obtenue sur le milieu ISP no 2 dans une boîte de Pétri et on fait incuber à 270C pendant 4 à 6 jours. On prélève les colonies, on les transfère dans un milieu gélosé en biseau et on fait incuber pendant 10 à 14 jours.

Exemple 2

On transfère 600 ml de la culture végétative obtenue de manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 1 dans un flacon de 50 1 contenant 30 litres de milieu de production stérile contenant les mêmes composants que ceux qui sont mentionnés dans l'exemple 1 et comprenant 0,1 % de Nissan Disfoam (Nippon Yushi Co., Ltd). La culture s'effectue à 270C en agitant à 350 tours

par minute et en aérant le milieu à 1 v/v. Au bout d'envi-

ron 90 h, la production d'antibiotiques atteint son maximum.

Exemple 3

(a) On obtient 240 litres de la culture de manière ana-

logue à ce qui est décrit dans l'exemple 2 en utilisant 8 flacons de 50 litres. On centrifuge la culture. On

extrait séparément le filtrat et le tourteau ainsi obtenus.

On met le tourteau en suspension dans 60 litres de méthanol, on agite pendant 3 h et on filtre, et on extrait encore une fois le tourteau avec du méthanol. A l'extrait ainsi obtenu, on ajoute 120 litres de chloroforme et litres d'eau et on mélange, puis on sépare la couche de chloroforme. D'un autre côté, on extrait le filtrat

de culture avec 480 1 d'un mélange de solvants chlQro-

forme: méthanol (1:1) et on sépare la couche de chloroforme. On combine les extraits de chloroforme provenant du tourteau cellulaire et du filtrat de culture

et on fait évaporer à un faible volume (300 à 400 ml).

On dilue le concentré avec du n-hexane pour précipiter un solide jaune que l'on sèche sous vide pour donner 37,0 g d'un mélange d'auramycine C, d'auramycine D, d'auramycine E, d'auramycine F, d'auramycine G, de sulfurmycine C, de.sulfurmycine D, de sulfurmycine E, de sulfurmycine F et de sulfurmycine G. (b) On procède au fractionnement du mélange précédent. On introduit du Sephadex LH-20 ayant trempé pendant 15 h dans un mélange de solvants chloroforme/méthanol (2:1) dans une colonne de 80, 0 cm de longueur et de 8,0 cm de

diamètre. On dissout le mélange obtenu selon le para-

graphe précédent (37,0 g) dans 50 ml d'un mélange de chloroforme et de méthanol (2:1) et on introduit dans la

colonne. On élue la colonne avec un mélange de chloro-

forme et de méthanol (2:1). On concentre les fractions qui contiennent les glycosides anthracyclines, analysés par chromatographie en couche mince sur gel de silice (chloroforme/méthanol; 10:1), jusqu'à siccité sous vide ce qui donne 16,8 g d'un solide jaune. Ce solide jaune contient les auramycines C, G et les sulfurmycines D, G et de faibles quantités des auramycines D, E et F et des sulfurmycines D, E et F. (c) On dissout le solide jaune (16,8 g) dans 20 ml de chloroforme et on l'introduit dans une colonne de 50,0 cm de longueur et de 5,0 cm de diamètre remplie de gel de silice. Après avoir lavé la colonne avec un mélange de solvants chloroforme/méthanol (97:3), on élue les auramycines C et G et les sulfurmycines C et G avec un

mélange de chloroforme et de méthanol (95:5 à 92:8).

On concentre cet éluat jusqu'à siccité sous vide pour

obtenir 3,8 g de solide jaune.

(d) On dissout le solide jaune obtenu dans l'étape (c) dans 10 ml de dichlorométhane et on l'introduit dans une colonne de 40,0 cm de longueur et de 3,0 cm de diamètre remplie de gel de silice. On développe la colonneavec un mélange solvant de dichloro-méthane et de méthanol (92:8). On élue tout d'abord la sulfurmycine G suivie par l'auramycine G, l'auramycine E, l'auramycine F, la sulfurmycine E, la sulfurmycine F, la sulfurmycine C, l'auramycine C, l'auramycine D et la sulfurmycine D dans cet ordre. On sépare les éluats en cinq fractions: fractions I, II, III, IV et V. On concentre chacune des fractions jusqu'à siccité sous vide, et l'on obtient 595 mg de fraction I, 890 mg de fraction II, 914 mg de fraction III, 448 mg de fraction IV et 200 mg de fraction V sous forme de poudres

jaunes.

(e) On purifie plus avant la fraction I ( 595 mg) obtenue dans l'étape (d) par chromatographie préparative en phase Fraction n . Principaux composants inclus

.. .......................DTD: Fraction I Sulfurmycine G

Fraction II Sulfurmycine G, auramycine G, aura-

mycine E, auramycine F, sulfurmycine E, sulfurmycine F, sulfurmycine C Fraction III Sulfurmycine C, auramycine C Fraction IV auramycine C Fraction V auramycine D, sulfurmycine D liquide. On dissout l'échantillon dans 10 ml d'un mélange solvant de dichlorométhanp et de méthanol (96:4) et on chromatographie sur Prep PAK-500/SILICA (Waters Associates, Inc.). La phase mobile est un mélange 96:4 de dichlorométhane et de méthanol à un faible débit de

ml/minute. On contrôle l'élution au moyen d'un contrô-

leur d'indice de réfraction. On recueille les fractions ne contenant que la sulfurmycine G et on les concentre sous vide à un faible volume. L'addition d'une certaine quantité de n-hexane provoque la précipitation de

123 mg de sulfurmycine G pure.

(f) On purifie la fraction II (890 mg) obtenue dans l'étape (d) par le procédé décrit dans l'étape (e). La phase mobile est un mélange dichlorométhane/méthanol (96:4) à un débit de 50 ml/min. La sulfurmycine G est

éluée en premier et l'auramycine G, E et F et la sulfur-

mycine E, F et C ensuite. On concentre sous vide à un faible volume les fractions contenant la sulfurmycine G pure, l'auramycine G, E et F et la sulfurmycine E, F et C. L'addition de n-hexane aux concentrés donne 44 mg de sulfurmycine G pure, 25 mg d'auramycine G pure, 12 mg d'auramycine E pure, 13 mg d'auramycine F pure, 13 mg de sulfurmycine-E pure, 18 mg de sulfurmycine F pure

et 95 mg de sulfurmycine C pure.

(g) On purifie la fraction III (914 mg) obtenue dans l'étape (d) par le procédé décrit dans l'étape (e). La phase mobile est le dichlorométhane/méthanol (95:5) à

un débit de 50 ml/min. On élue les fractions de sulfur-

mycine C en premier et les fractions d'auramycine C ensuite. On concentre sous vide à de faibles volumes les fractions contenant la sulfurmycine C pure et l'auramycine C. L'addition de n-hexane aux concentrés donne 95 mg de sulfurmycine C pure et 15 mg d'auramycine

C pure.

(h) On purifie plus avant la fraction IV (448 mg) obtenue dans l'étape (d) par chromatographie en couche mince (chloroforme/méthanol, 7:1). On gratte la bande contenant l'auramycine C et on l'extrait avec un mélange solvant de chloroforme et de méthanol (10:1) et on concentre sous vide à de faibles volumes. L'addition de

n-hexane au concentré donne 57 mg d1auramycine C pure.

(i) On purifie plus avant la fraction V (200 mg) obtenue dans l'étape (d) par chromatographie en couche mince (chloroforme/méthanol, 4:1). On gratte les bandes ne contenant que l'auramycine D ou la sulfurmycine D et on extrait avec un mélange solvant chloroforme/méthanol

(8:1) et on concentre sous vide à de faibles volumes.

L'addition de n-hexane aux concentrés donne 7 mg d'aura-

mycine D et 11 mg de sulfurmycine D.

Exemple 4

On hydrolyse à la température ambiante pendant minutes une solution de 100 mg d'auramycine E dans ml d'acide chlorhydrique à 0,5 %. On neutralise le mélange réactionnel par une solution diluée d'hydroxyde

de sodium et on extrait 2 fois avec 50 ml de chloroforme.

On concentre les extraits réunis à un faible volume sous

vide et on chromatographie avec des plaques de chromato-

graphie en couche mince (chloroforme/méthanol, 5:1).

-25 On gratte la bande contenant llauramycine C et on extrait avec un mélange solvant de chloroforme et de méthanol

(4:1) et on concentre sous vide à un faible volume. L'addi-

tion d'une certaine quantité de n-hexane provoque la

précipitation de 54 mg d'auramycine C pure.

Exemple 5

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 4, en utilisant 100 mg d'auramycine F, on obtient 48 mg d'auramycine C.

Exemple 6

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 4, en utilisant 100 mg de sulfurmycine E, on obtient 51 mg de sulfurmycine C.

Exemple 7

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 4, en utilisant 100 mg de sulfurmycine F, on obtient 45 mg de sulfurmycine C.

Exemple 8

On hydrolyse à la température ambiante pendant minutes une solution de 100 mg d'auramycine A dans ml d'acide chlorhydrique à 0,5 %. On neutralise le mélange réactionnel par une solution diluée d'hydroxyde

de sodium et on extrait 2 fois avec 100 ml de chloroforme.

On rassemble les extraits de chloroforme et on les con-

centre sous vide à un faible volume. On chromatographie le concentré avec des plaques chromatographiques en couche mince (chloroforme/méthanol, 5:1) . On gratte les bandes contenant l'auramycine C et D, on extrait avec un mélange

solvant de chloroforme et de méthanol (4:1) et on con-

centre sous vide jusqu'à siccité pour donner 12 mg d'aura-

mycine C pure et 35 mg d'auramycine D.

Exemple 9

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 8, en utilisant 100 mg de sulfurmycine A, on obtient 13 mg de sulfurmycine C et 33 mg de sulfurmycine D.

Exemple 10

A une solution de 100 mg d'auramycine A dans ml d'acétone et 1 ml de méthanol on ajoute 1 ml d'acide chlorhydrique-méthanol 0,2 N tout en agitant et on fait réagir.à la température ambiante pendant 40 minutes. On neutralise le mélange réactionnel par une solution diluée d'hydroxyde de sodium et on ajoute 20 ml d'eau puis on extrait deux fois avec 20 ml de chloroforme. On combine les extraits et on concentre à un faible volume sous vide. On chromatographie le concentré dans une colonne remplie de gel de silice (chloroforme/méthanol, 95:5). On concentre les fractions contenant l'auramycine D sous vide pour donner 43 mg d'auramycine D.

Exemple 11

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 10, en utilisant 100 mg d'auramycine E, on obtient 41mg d'auramycine D.

Exemple 12

A une solution de 100 mg d'auramycine B dans ml d'acétone on ajoute 0,3 ml d'acide chlorhydrique concentré et on hydrolyse à la température ambiante pendant 120 minutes. On neutralise le mélange réactionnel par une solution diluée d'hydroxyde de sodium et on ajoute 20 ml d'eau, puis on extrait deux fois avec 20 ml de chloroforme. On combine les extraits et on concentre à

un faible volume sous vide. On chromatographie le concen-

tré avec une colonne remplie de gel de silice (chloro-

forme/méthanol, 95:5). On concentre les fractions conte-

nant l'auramycine D sous vide pour donner 38 mg d'aura-

mycine D.

Exemple 13

On hydrolyse à la température ambiante pendant minutes une solution de 100 mg d'auramycine C dans ml d'acide chlorhydrique à 0,5 %. On neutralise le mélange réactionnel par une solution diluée d'hydroxyde de sodium, on extrait deux fois avec 100 ml de chloroforme et on concentre sous vide à un faible volume. On

chromatographie le concentré avec des plaques de chroma-

tographie en couche mince (chloroforme/méthanol, 5:1).

On gratte la bande contenant l'auramycine D et on extrait avec un mélange solvant de chloroforme et de méthanol (4:1) et on concentre sous vide jusqu'à siccité, ce qui donne 72 mg d'auramycine D.

Exemple 14

On hydrolyse à la température ambiante pendant minutes une solution de 80 mg d'auramycine G dans 4 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N. On neutralise ie mélange réactionnel par une solution diluée d'hydroxyde de sodium, on extrait deux fois avec 4 ml d'acétate d'éthyle et on concentre sous vide à un faible volume. On chromatographie le concentré avec des plaques de chromatographie en couche mince (chloroforme/méthanol, 5:1). On gratte les bandes contenant l'auramycine H et l'auramycine D et on extrait avec un mélange solvant de chloroforme et de méthanol (10:1). On concentre, chacun des extraits à un faible volume et l'addition d'une certaine quantité de n-hexane provoque la précipitation de 16 mg d'auramycine H et de 12 mg d'auramycine D.

Exemple 15

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 10, en utilisant 100 mg de sulfurmycine A, on obtient 47 mg de sulfurmycine D.

Exemple 16

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 11, en utilisant 100 mg de sulfurmycine F, on obtient 44 mg de sulfurmycine D.

Exemple 17

De manière analogue à ce qui est décrit dans

l'exemple 12, en utilisant 100 mg de sulfurmycine B, on.

obtient 39 mg de sulfurmycine D.

Exemple 18

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 13, en utilisant i00 mg de suifurmycine C, on obtient 68 mg de sulfurmycine D.

Exemple 19

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple I4, en utilisant 80 mg de sulfurmycine G, on obtient 19 mg de sulfurmycine H et 13 mg de sulfurmycine D.

Exemple 20

A une solution de 500 mg d'auramycine A dans ml d'acétate d'éthyle, on ajoute 50 mg de borohydrure de sodium dans 20 ml d'eau tout en agitant. La réaction s'effectue à la température ambiante pendant 20 minutes tout en agitant. On lave le mélange réactionnel deux fois avec 20 ml d'eau, on le déshydrate sur sulfate de sodium

et on concentre sous vide à un faible volume. On chroma-

tographie le concentré avec des plaques chroematographiquesH en couche mince (chloroforme/méthanol/hydroxyde d'ammonium, 400:30:3). On gratte les bandes contenant l'auramycine E et l'auramycine F et on extrait avec un mélange solvant de chloroforme et de méthanol (5:1). On concentre chacun des extraits à un faible volume et l'addition d'une certaine quantité de n-hexane provoque la précipitation de 200 mg

d'auramycine E et de 50 mg d'auramycine F. -

Exemple 21

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 20, en utilisant 500 mg de sulfurmycine A, on

obtient 162,5 mg de sulfurmycine E et 30,5 mg de sulfur-

mycine F.

Exemple 22

On hydrolyse à la température ambiante pendant 60 minutes une solution de 200 mg d'un mélange d'auramycine A et de sulfurmycine A dans 50 ml d'acide chlorhydrique à 0,5 %. On neutralise le mélange réactionnel avec de l'hydroxyde de sodium dilué et on extrait deux fois avec ml de chloroforme. On concentre les extraits réunis sous vide à un faible volume et on chromatographie avec

des plaques de chromatographie en couche mince (chloro-

forme/méthanol, 5:1). On gratte les bandes contenant l'auramycine C, l'auramycine D, la sulfurmycine C et la sulfurmycine-D et on extrait avec un mélange solvant de chloroforme et de méthanol (4:1), respectivement. On concentre chacun des extraits sous vide à un faible volume et l'addition d'une certaine quantité de n-hexane -10 provoque la précipitation de 10 mg d'auramycine C, 25 mg

d'auramycine D, 11 mg de sulfurmycine C et 27 mg de sul-

furmycine D.

Exemple 23

De manière analogue à ce qui est décrit dans

l'exemple 22, en utilisant un mélange de 200 mg d'auramy-

cine B et de sulfurmycine B, on obtient 25 mg d'auramycine D et 35 mg de sulfurmycine D.

Exemple 24

On sacrifie des rats Wistar mâles en les décapi-

tant. On excise les foies et on homogénéise avec un homogénéiseur Telfon en verre dans une solution 9,15 M de chlorure de potassium et on centrifuge à 9000 g pendant minutes. On utilise le liquide surnageant pour une préparation enzymatique. On fait incuber à 37 C pendant 60 minutes de façon aérobie un mélange composé de 40 ml

de préparation enzymatique, 2 ml d'une solution d'aura-

mycine A (10 mg/ml), 30 mg de NADP et 5 ml de tampon Tris-HC1 0,1 M (pH 7, 8). On termine la réaction en ajoutant un mélange solvant de chloroforme et de méthanol (1:1). On sépare la couche de chloroforme, on concentre

sous vide à un faible volume. On chromatographie le con-

centré avec des plaques de chromatographie en couche mince (chloroforme/méthanol/hydroxyde d'ammonium, 400:30:3), on compare avec des échantillons authentiques d'auranycine E et d'auramycine F. La formation d'auramycine E et d'auramycine F à partir de l'auramycine A par l'enzyme du foie de rat est confirmée.

Exemple 25

De manière analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 24, en utilisant la sulfurmycine A comme

substrat, la formation de sulfurmycine E et de sulfur-

mycine F à partir de sulfurmycine A par l'enzyme de

foie de rat est confirmée.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Composé de formule générale I o R1 représente un groupe méthyle ou acétonyle et R2 représente un groupe de formule I O O CH3 CH3 C OH D O OH E H c O HO HO 98úz6tZ

2. Composé selon la revendication 1 aux fins

d'utilisation comme antibiotique.

3. Procédé de préparation d'un composé de formule I selon la revendication 1 qui implique de procéder (a) en cultivant un mutant dérivé de Streptomyces galilaeus OBB-111 capable de produire les composés de

formule I dans un milieu nutritif aqueux dans des condi-

tions aérobies et en recueillant lesdits composés à partir du bouillon de fermentation, (b) en hydrolysant dans des conditions acides un composé de formule générale

O COOCH3

iR

H 0 H 2 Y

o R a la signification donnée dans la revendication 1 2' et o R représente un groupe de formule E ou F donnée dans la revendication 1 ou de formule O l

0. 1

O- CH.. O

pour transformer le groupe R2' en donnée dans la revendication 1, (c) en hydrolysant dans un composé de formule générale le groupe de formule C des conditions acides )CH3 Rl OH II OH o R1 a la signification donnée dans la revendication 1 R2" et ou R représente un groupe de formule A, C, E, F ou G donnée dans la revendication 1, ou de formule I B i'CH)<j o R2" pour transformer le groupe R en donnée dans la revendication 1, (d) en hydrolysant dans un composé de formule générale o le groupe de formule D des conditions acides OOCH3 Y R1

W OH I - 2

o R1 a la signification donnée dans la revendication 1 et I1!

R2 représente le groupe de formule G donnédans la reven-

dication 1, pour transformer le groupe R2" -en le groupe de formule H donnée dans la revendication 1, (e) en réduisant un composé de formule générale -I

0O CCOCH3

!IR

OH 0O OH R2'''

ou R1 a la signification donnée dans la revendication 1 et R représente le groupe de formule A donnéedans la revendication 1, pour transformer le groupe R2"" en un

groupe de formule E ou F donnée dans la revendication 1.

4. Procédé selon la revendication 3 o le mutant dérivé de Streptomyces galilaeus OBB-111 est Streptomyces galilaeus OBB-111-610 (FERM-P 4883, ATCC

31534)

5. Procédé selon la revendication 3, o le catalyseur utilisé dans le mode de réalisation (e) est le

borohydrure de sodium, ou l'hydrure de lithium-aluminium.

6. Procédé selon la revendication 3, o l'enzyme utilisé dans le mode de réalisation E est préparé à partir d'homogénats de foie animal ou à partir de cellules de microorganismes produisant l'antibiotique anthracycline.

7. Préparation pharmaceutique ayant une activité antibactérienne ou antitumorale contenant comme ingrédient actif un composé de formule I donnéedans la

revendication 1.

8. Composé de formule I donnéedans la reven-

dication 1, qu'il soit préparé selon le procédé de l'une

quelconque des revendications 3 à 6 ou par un de ses équi-

valents chimiques évidents.

9. Application d'un composé de formule I

donnéedans la revendication 1 comme antibiotique.