FI93278C - Diagnostinen analyysielementti ja fluoresoiva konjugaatti - Google Patents
Diagnostinen analyysielementti ja fluoresoiva konjugaatti Download PDFInfo
- Publication number
- FI93278C FI93278C FI884922A FI884922A FI93278C FI 93278 C FI93278 C FI 93278C FI 884922 A FI884922 A FI 884922A FI 884922 A FI884922 A FI 884922A FI 93278 C FI93278 C FI 93278C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- biologically active
- substituent
- active moiety
- hydrophilic group
- element according
- Prior art date
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 18
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 17
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 claims description 15
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 12
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 claims description 3
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 claims 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 2
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N phosphinic acid Chemical compound O[PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 150000003008 phosphonic acid esters Chemical class 0.000 claims 2
- LOTBYPQQWICYBB-UHFFFAOYSA-N methyl n-hexyl-n-[2-(hexylamino)ethyl]carbamate Chemical compound CCCCCCNCCN(C(=O)OC)CCCCCC LOTBYPQQWICYBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 22
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 16
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 13
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical group O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl azide Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(=O)(N=[N+]=[N-])C1=CC=CC=C1 MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)=O JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N potassium tert-butoxide Chemical compound [K+].CC(C)(C)[O-] LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- OWWAUBQOFLVUMS-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydro-1h-indol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1CCN2 OWWAUBQOFLVUMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 3
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 3
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AXDJCCTWPBKUKL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-aminophenyl)-(4-imino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]aniline;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1=CC(=N)C(C)=CC1=C(C=1C=CC(N)=CC=1)C1=CC=C(N)C=C1 AXDJCCTWPBKUKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-M 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)[O-])=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N Phthalic anhydride Natural products C1=CC=C2C(=O)OC(=O)C2=C1 LGRFSURHDFAFJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N butyl 2,2-difluorocyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CCCCOC(=O)C1CC1(F)F JHIWVOJDXOSYLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- ASMQGLCHMVWBQR-UHFFFAOYSA-M diphenyl phosphate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)([O-])OC1=CC=CC=C1 ASMQGLCHMVWBQR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 2
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- ZYECOAILUNWEAL-NUDFZHEQSA-N (4z)-4-[[2-methoxy-5-(phenylcarbamoyl)phenyl]hydrazinylidene]-n-(3-nitrophenyl)-3-oxonaphthalene-2-carboxamide Chemical compound COC1=CC=C(C(=O)NC=2C=CC=CC=2)C=C1N\N=C(C1=CC=CC=C1C=1)/C(=O)C=1C(=O)NC1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 ZYECOAILUNWEAL-NUDFZHEQSA-N 0.000 description 1
- QORVGJAHBMMXFG-UHFFFAOYSA-N 2,2,6-triaminohexanoic acid Chemical compound NCCCCC(N)(N)C(O)=O QORVGJAHBMMXFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SDTMFDGELKWGFT-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropan-2-olate Chemical compound CC(C)(C)[O-] SDTMFDGELKWGFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLMQHXUGJIAKTH-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyindole Chemical compound OC1=CC=CC2=C1C=CN2 NLMQHXUGJIAKTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- ASMQGLCHMVWBQR-UHFFFAOYSA-N Diphenyl phosphate Chemical class C=1C=CC=CC=1OP(=O)(O)OC1=CC=CC=C1 ASMQGLCHMVWBQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-LBPRGKRZSA-N L-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@H]([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical class C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 235000010338 boric acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000005619 boric acid group Chemical class 0.000 description 1
- 125000005620 boronic acid group Chemical class 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical group 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004687 hexahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N histamine Natural products NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 229950008325 levothyroxine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003009 phosphonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- BNWCETAHAJSBFG-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2-bromoacetate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)CBr BNWCETAHAJSBFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- GINSRDSEEGBTJO-UHFFFAOYSA-N thietane 1-oxide Chemical compound O=S1CCC1 GINSRDSEEGBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
- C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
- C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
- C09B11/24—Phthaleins containing amino groups ; Phthalanes; Fluoranes; Phthalides; Rhodamine dyes; Phthaleins having heterocyclic aryl rings; Lactone or lactame forms of triarylmethane dyes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
93278
Diagnostinen analyysielementti ja fluoresoiva konjugaatti
Biologisten, diagnostisten analyysien alalla on tunnettua käyttää biologisesti aktiivisten osien konju-5 gaatteja todettavissa olevan, signaalin aiheuttavan väri-aineosan kanssa, joka voi olla esimerkiksi osa, joka emittoi sähkömagneettista säteilyä, esim. fluoresoiva, kemilu-minoiva tai bioluminoiva osa. Biologisesti aktiivinen osa voi olla DNA-koetin, esim. merkitty DNA-koetin, joka on 10 komplementaaristen DNA-sekvenssien osittamisessa käytettävää tyyppiä, entsyymi, entsyymin inhibiittori, antigeeni, vasta-aine, hapteeni jne.
Viime vuosina on kiinnitetty paljon huomiota merkittyjä reagensseja hyödyntäviin immunoanalyyseihin sel-15 laisten kehon nesteiden komponenttien kuin antigeenien, hormonien, tartunta-aineiden, seerumin vasta-aineiden ja vastaavien osoittamiseksi. Niinpä patenttikirjallisuudessa on esitetty monia erilaisia analyysejä, joihin kuuluu merkittyjä reagensseja käsittävä reaktio antigeenien ja vas-20 ta-aineiden välillä, jolloin saadaan todettavissa oleva signaali, joka voi olla värin muutos, sähkömagneettisen säteilyn emissio jne. Näihin analyyseihin liittyy ligandin ja antiligandin välinen immunologinen vuorovaikutus, jolloin vähintään toinen kahdesta reagoivasta aineesta sisäl-25 tää sellaisen aineen tai aineen edeltäjän, joka kykenee aiheuttamaan todettavissa olevan signaalin immunologisen ligandi-antiligandivuorovaikutuksen funktiona. Yksi ryhmä sellaisia merkkiaineita, joita yleensä käytetään tällaisissa analyyseissä, ovat fluoresoivat väriaineet eli fluo-30 roforit. Alalla tunnetaan sekä heterogeenisiä että homogeenisiä spesifistä sitoutumista hyödyntäviä analyysejä, joissa käytetään fluoresoivalla aineella merkittyjä konju-gaatteja. Yleensä on toivottavaa, että tällaisissa analyyseissä käytettävillä fluoresoivilla merkkiaineilla on 35 suhteellisen pitkä emissioaallonpituus, esim. yli 500 nm.
2 93278
Lisäksi on toivottavaa, että merkkiaineilla on suuri Stokes -siirtymä, että ne ovat stabiileja koeolosuhteissa, ovat suhteellisen riippumattomia epäspesifisestä häirinnästä sekä liuoksessa olevien aineiden taholta että sen 5 osan taholta, johon merkkiaine on yhdistetty, ja antavat korkeita kvanttituloksia.
Tämä keksintö koskee uusia fluoresoivia konjugaat-teja, jotka sisältävät rodamiiniväriaineosan liitettynä biologisesti aktiiviseen osaan, ja niiden käyttöä biolo-10 gisten diagnostisten määritysten analyysielementeissä ja menetelmissä.
Tämän keksinnön tarkoituksena on siten tarjota uusia fluoresoivia konjugaatteja, jotka sisältävät biologisesti aktiivisen osan ja fluoresoivan väriaineosan.
15 Lisätarkoituksena on tarjota diagnostisia ana- lyysielementtejä ja menetelmiä.
Nämä ja muita tarkoituksia ja etuja saavutetaan keksinnön mukaisesti tarjoamalla käyttöön uusia fluoresoivia konjugaatteja sekä näitä uusia fluoresoivia kon-20 jugaatteja sisältäviä diagnostisia analyysielementtejä, joilla fluoresoivilla konjugaatteilla on kaava x " Xm - “ Wp x ' Λ ^ \ 25 -ίι ί r n—f—Ri (A)*
30 L
jossa W, X, Y ja Z ovat kukin toisistaan riippumatta ~(CH2 )a( CHR4) (CH2); R, R2, R3 ja R4 ovat kukin toisistaan riippumatta 35 vety, hydrofiilinen ryhmä tai substituentti, joka käsittää
II
3 93278 biologisesti aktiivisen osan, joka on antigeeni, vasta-aine, hapteeni, Fab-fragmentti tai DNA-koetin; R2 on -C02~, -S03~ tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, 5 sillä ehdolla, että vähintään yksi joukosta R, Rx, R2, R3 ja R4 on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, ja vähintään yksi jäljellä olevista ryhmistä R, Rj, R3 ja R4 on hydrofiilinen ryhmä; a ja b ovat kumpikin toisistaan riippumatta jokin 10 kokonaisluvuista 0-4, sillä ehdolla, että summa a+b on jokin kokonaisluvuista 1-4; m ja n ovat kumpikin 0 tai 1, sillä ehdolla, että toinen luvuista mjanonOja toinen on 1; p ja q ovat kumpikin 0 tai 1, sillä ehdolla, että 15 toinen luvuista pjaqonOja toinen on 1; A on vastaioni tai vastaioneja konjugaattiosassa olevien kokonaisvarausten tasapainottamiseksi; ja x on 0 tai 1.
On selvää, että kun konjugaattiosa on kokonaisuu-20 dessaan neutraali, vastaionia ei tarvita. Vastaioni A voi olla mikä tahansa biologisesti hyväksyttävä anioni tai kationi, kuten esimerkiksi kloridi, sulfaatti, difenyyli-fosfaatti, trifluoriasetaatti, trimetyyliammonium, natrium, kalium, kalsium ja vastaavat. On myös selvää, että kun 25 konjugaattiosan nettokokonaisvaraus on suurempi kuin yksi, varaukset voidaan tasapainottaa yhden tai useamman vastai-onin avulla. Esimerkiksi kun konjugaattiosan nettokokonaisvaraus on +2, -nämä varaukset voidaan tasapainottaa kahden kloridi-ionin tai yhden sulfaatti-ionin avulla.
30 Huomattakoon, että "hydrofiilisellä ryhmällä" tarkoitetaan tässä selitysosassa ja patenttivaatimuksissa käytettynä ryhmää, joka parantaa molekyylin liukenevuutta veteen. Tyypillisiä, sopivia hydrofiilisiä ryhmiä, joita voi sisältyä keksinnön mukaisiin uusiin fluoresoiviin yhdistei-35 siin ovat karboksyylihapot (-C00H); polyeetterit, kuten 4 93278 esimerkiksi sellaiset, joilla on kaava —(OCH2CH245-0Et, jossa c on jokin kokonaisluvuista 1-20, kuten esimerkiksi polyetyleenioksidi; polyalkoholit, joilla on kaava -CH2—(— CHOH—)— CH20H, jossa d on jokin kokonaisluvuista 1 -5 20; primääriset, sekundääriset tai tertiääriset amiinit, joilla on kaava -NR5R6, jossa R5 ja R6 ovat kumpikin toisistaan riippumatta vety, alkyyli, jossa edullisesti on 1 - 6 hiiliatomia, aryyli kuten esimerkiksi fenyyli, tai poly-amiinit, kuten esimerkiksi 10 /—\ - ( CH2 } 2-N^ (CH2 } 2NH2 ; sulfonihapot (-S03H); fosfonihapot tai niiden esterit, 15 joilla on kaava —fCHy^j-POtOR,) (ORe), jossa e on jokin kokonaisluvuista 1 - 8 ja R7 ja Re ovat kumpikin toisistaan riippumatta vety, alkyyli, jossa edullisesti on 1 - 6 hiiliatomia, tai aryyli, kuten esimerkiksi fenyyli; fosfaatit, joilla on kaava —fcCH2-)^-OPO(OH)2; fosfaattiesterit, 20 joilla on kaava —^CH2-)^-0P0(OH)(0R9), jossa R, on alkyyli, jossa edullisesti on 1 - 6 hiiliatomia, tai aryyli, kuten esimerkiksi fenyyli; fosfiinihapot, joilla on kaava —fCHj-^r-POiOHjR^, jossa R10 on alkyyli, jossa edullisesti on 1-6 hiiliatomia; boronihapot, joilla on kaava -Rn-B(0H)2, 25 jossa Ru on—tai aryyli, kuten esimerkiksi fenyyli; ja boriinihapot, joilla on kaava -R:1-B(OH)R10. Kuten jäljempänä esitetään yksityiskohtaisemmin, keksinnön mukaiset yhdisteet voivat sisältää yhden tai useamman samanlaisen hydrofiilisen ryhmän tai ne voivat sisältää useam-30 man kuin yhden tyypiltään erilaisen hydrofiilisen ryhmän.
Kaavan I mukaisten uusien fluoresoivien konjugaat-tien emissiomaksimit ovat yli 500 nm, tyypillisesti alueella noin 500 nm - noin 650 nm.
Yleensä keksinnön mukaiset uudet konjugaatit sisäl-35 tävät vähintään yhden biologisesti aktiivisen osan, joka 5 93278 voi olla kiinnitetty suoraan väriainekromoforiin tai joka voi olla kiinnitetty väriainekromoforiin kaksiarvoisen akromoforisen kytkentäryhmän avulla. Termillä "akromofori-nen kytkentäryhmä" tarkoitetaan ryhmää, joka ei aiheuta 5 mitään arvioitavissa olevaa muutosta väriaineosan kirjo-absorptio-ominaispiirteissä. Siten kaavassa I, jossa mikä tahansa ryhmistä R, Rx, R2, R3 tai R4 on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sellainen substituentti voi sisältää kaksiarvoisen akromoforisen kytkentä-10 ryhmän väriaineosan sitomiseksi biologisesti aktiiviseen osaan. Tällaisen sidoksen tulisi olla ei-konjugoitunut.
Tyypillisiä funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat käyttökelpoisia kytkentäryhminä, joita voidaan kiinnittää väriainemolekyyliin, ja biologisesti aktiivisen osan subs-15 tituentteja, joiden kanssa tällaiset kytkentäryhmät voivat reagoida muodostaakseen merkittyjen konjugaattien sisältämän akromoforisen kytkentäryhmän, ovat:
Kytkentäryhmä Biologisesti aktiivisen ryhmän 20 _substituentti_ N-hydroksisukkin- aminoryhmät (α-amino, lysiini) imidiesterit imidoesteri aminoryhmät 25 aldehydit aminoryhmät seka-anhydridit nukleofiiliset ryhmät isotiosyanaatit nukleofiiliset ryhmät 2,4-dikloori-5-tri- nukleofiiliset ryhmät atsiini 30 diatsoniumsuolat tryptamiini, histamiini
bromiasetyyli histamiini, SH
maleimido SH
aktivoidut disulfidi- SH
sidokset (esim.
35 2-pyridyylidisulfidit) 6 93278
Monet muut kytkentäryhmät voivat sisältyä keksinnön mukaisiin konjugaatteihin. Esimerkiksi yllä mainitut hyd-rofiiliset ryhmät ovat suurin piirtein akromoforisia, ja eräistä näistä voidaan tehdä johdannaisia ja käyttää sopi-5 vina kytkentäryhminä. Esimerkiksi ryhmä -NH2 voidaan muuttaa amidiksi seurauksena biologisesti aktiivisen osan (BIO) kiinnittämisestä siihen, so -NHCO-BIO. Lisäksi eräässä toisessa toteutusmuodossa voi hydrofiilinen ryhmä olla kiinnitetty kytkentäryhmään. Esimerkiksi primäärisen 10 amiinin tapauksessa yksi vetyatomeista on korvattu siihen yhdistetyllä biologisesti aktiivisella osalla, kuten yllä on kuvattu, ja toinen vetyatomi voi olla korvattu hydro-fiilisellä ryhmällä, kuten esimerkiksi ryhmällä (CH2)2P03H2. Tarkoituksena on siten, että kytkentäryhmässä sen toimies-15 sa keinona väriaineosan kiinnittämiseksi biologisesti aktiiviseen osaan, voi myös olla siihen kiinnittynyt hydrofiilinen ryhmä. Lisäksi kytkentäryhmä voi myös toimia hyd-rofiilisenä ryhmänä, kuten esimerkiksi tapauksissa -NH-BIO ja -P02(0H)BI0.
20 Keksinnön mukaiset merkityt fluoresoivat konjugaa- tit ovat hyödyllisiä monissa eri sovellutuksissa, mukaan lukien diagnostiset analyysit, jotka perustuvat energian-siirtomekanismiin fluoresoivan merkkiaineen aktivoimiseksi. Fluoresoivien väriaineosien maksimiabsorption aallon-25 pituus λ max on tyypillisesti noin 500 nm - noin 650 nm, niillä ilmenee noin 15 - 20 nm:n Stokes-siirtymiä ja niillä on korkeat kvanttitulokset, noin 0,7 - 0,8. Näissä vä-riaineosissa on edullisesti muutamia kiinnittymisasemia biologisesti aktiivisia osia ja/tai liuottavia ryhmiä var-30 ten. Sellaisten liuottavien ryhmien läsnäolo voi auttaa välttämään konjugaattien epäsuotavaa epäspesifistä sitoutumista biologisissa nesteissä läsnäoleviin aineosiin, kuten esimerkiksi plasman proteiineihin.
Erään erityisen edullisen keksinnön mukaisten kon-35 jugaattien ryhmän muodostavat konjugaatit, joilla on kaava 7 93278 R12 R13
I I
N 0 N\ 5 (A)v 14 R15 x r3 10 jossa R2, R3, A ja x ovat edellä määriteltyjä ja R12, R13, R14 ja R15 ovat kukin toisistaan riippumatta vety, hydrofiili- 15 nen ryhmä tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sillä ehdolla, että vähintään yksi joukosta R2, R3, R12, R13, R14 ja R1S on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, ja vähintään yksi jäljellä olevista ryhmistä R3, R12, R13, R14 ja R15 on hydro 20 fiilinen ryhmä.
Erään toisen erityisen edullisen keksinnön mukaisten konjugaattien ryhmän muodostavat yhdisteet, joilla on kaava 25 - i4 r-x"*15 B/*Yy0YV"'l,1! 30 (A)
I X
V-R2 35 _ — 8 93278 jossa R2, R3, R12, R13, R14, R 15, A ja x ovat edellä määritelty j ä.
Kuten on todettu aikaisemmin, voi keksinnön mukaisissa konjugaateissa biologisesti aktiivinen osa olla 5 kiinnittynyt fluoresoivaan väriaineosaan erilaisisiin ase miin. Erityisen edullisessa toteutuksessa biologisesti aktiivinen osa sisältyy substituenttiin R2 (kaava I). Biologisesti aktiivinen osa on edullisimmin kiinnittynyt sidoksen avulla, joka on karboksiamidopiperatsinyylijohdannai-10 nen, jolla on kaava /-0 _^N-C-(CH2t3- (IV) 15 Tässä erityisen edullisessa toteutuksessa R2:ta edustaa siten 0 /-v 0 il / 'ii -C-N N-C-iCH^-)-BIO (V) 20 \_/ 3 25 o ,-> p ii / \ li -S-N N-C-(CH2ir—BIO (VI) % w 3
Biologisesti aktiivinen osa voi olla kiinnittynyt 30 sidokseen minkä tahansa tuon osan sopivan aseman välityksellä. Esimerkiksi kun biologisesti aktiivinen osa on teo-fylliini, se voi olla kiinnittynyt sidokseen asemien 3 tai 8 välityksellä.
Keksinnön mukaisia merkittyjä konjugaatteja voidaan 35 käyttää missä tahansa monista käyttömuodoista, kuten esi- 9 93278 merkiksi diagnostisissa analyyseissä, kuten kilpailevissa sitoutumisanalyyseissä tai immunoanalyyseissä, tai immuunivasteen reaktioissa, joissa käytetään merkittyjä rea-gensseja. Eräässä erityisen hyvänä pidetyssä sovellutuk-5 sessa konjugaatteja käytetään lääkkeentarkkailukäytössä, esimerkiksi lääkkeiden kuten teofylliinin, fenytoiinin jne yhteydessä, tai hormonientarkkailukäytössä, kuten esimerkiksi tyroksiinin (T4) yhteydessä. Erityiset analyysit, joissa keksinnön mukaiset konjugaatit ovat hyödyllisiä, 10 ovat tunnettuja, esim. immunometriset analyysit, kilpailevat sitoutumisanalyysit jne, eikä sen vuoksi sellaisten analyysien laaja tarkastelu tässä ole tarpeen. Sellaisissa tunnetuissa diagnostisissa testeissä tai analyyseissä biologisesta reaktiosta tai vuorovaikutuksesta on seurauksena 15 todettavissa olevan signaalin syntyminen. Esimerkiksi tyypillisessä immunoanalyysissä, joka suoritetaan monikerroksisessa koe-elementissä, analysoitavaa ainetta sisältävä näyte, joka käsittää kehon nestettä, kuten esimerkiksi seerumia tai kokoverta, lisätään elementin pinnalle. Neste 20 johdetaan tyypillisesti suodattavan aineen lävitse häiritsevien aineiden ja/tai solujen poistamiseksi, ja se dif-fundoituu sitten merkittyä biologisesti aktiivista konju-gaattia sisältävään kerrokseen, jolloin aiheutuu immunologinen reaktio tai vuorovaikutus koe-elementin nimenomaisen 25 systeemin mukaan, ja tämä reaktio tai vuorovaikutus vuorostaan aiheuttaa todettavissa olevan signaalin, joka on näytenesteessä olevan analysoitavan aineen funktio. Näin syntyneen signaalin avulla voidaan vähemmän monimutkaisissa systeemeissä ainoastaan kvalitatiivisesti ratkaista 30 analysoitavan aineen läsnäolo, tai pitemmälle kehitetyissä systeemeissä sen avulla voidaan puolikvantitatiivisesti mitata analysoitava aine. Tällaisessa systeemissä voi todettavissa olevan signaalin synnyttävän osan sisältävä biologisesti aktiivinen konjugaatti olla niin kutsuttu 35 merkkiaine-proteiini-konjugaatti, so sellainen proteiini 10 93278 kuin esimerkiksi antigeeni, vasta-aine tai Fab-fragmentti, joka on "merkitty" väriaineosalla eli sisältää sellaisen.
Tyypillinen monikerroksinen koe-elementti käsittää kantaja-ainekerroksen, joka voi olla läpinäkyvä ja johon 5 kuuluu vähintään yksi reagenssikerros, jossa on keksinnön mukaista merkittyä konjugaattia. Reagenssikerroksessa (kerroksissa) on myös mikä tahansa muu reagenssi, joka on tarpeellinen kysymyksessä olevassa analyysissä hyväksi käytettyä nimenomaista signaalin tuottavaa järjestelmää 10 varten. Nämä elementit voivat myös sisältää muita kerroksia erilaisia toimintoja varten, jotka ovat alalla tunnettuja, kuten esimerkiksi: kerroksen ottamaan vastaan näytteen ja aikaansaamaan näytteen aineosien tasainen jakautumisen alla olevaan reagenssikerrokseen (-kerroksiin); va-15 loa estävän eli suojakerroksen avustamaan signaalin toteamisessa erottamalla kerros, jossa signaalin tuottava laji sijaitsee, muista elementin kerroksista ja siten ehkäisemällä signaalin toteamisen epäsuotavan häirinnän; jne.
Keksinnön mukaisia konjugaatteja voidaan myös käyt-20 tää solujen värjäämiseen fluoresoivalla aineella. Soluja voidaan sitten tarkkailla mikroskoopin avulla, jolloin fluoresoivan konjugaatin läsnäolo ilmaisee määrätyn determinant tikohdan läsnäolon. Lisäksi konjugaatteja voidaan käyttää poistamiseen, erottamiseen tai muuta käyttösovel-25 lutusta varten fluoresenssin aktivoimassa solujen lajittelijassa.
Keksinnön mukaiset konjugaatit voidaan valmistaa reaktioiden avulla, jotka ovat alan asiantuntijoiden tuntemia, ja nämä käyvät ilmi tässä jäljempänä esitetyistä 30 erityisistä esimerkeistä. Niinpä tässä ei tarvita sellaisten menetelmien laajaa tarkastelua.
Keksintöä kuvataan nyt lisäksi yksityiskohtaisesti määrättyjen, erityisen edullisten toteutusmuotojen osalta esimerkkien avulla, jolloin on selvää, että nämä on tar-35 koitettu ainoastaan valaiseviksi, eikä keksintö rajoitu
II
11 93278 niissä kuvattuihin erityisiin materiaaleihin, koostumuksiin tai menetelmiin.
Esimerkki I
Seosta, jossa oli 1,9 g (13,0 mmol) 7-hydroksikino-5 liinia ja 100 mg yhdistettä Pt20 75 ml:ssa 95-%:ista etanolia, hydrattiin yön ajan. Seos imusuodatettiin piimään lävitse, ja suodos haihdutettiin alennetussa paineessa. Saatu punertavan ruskea öljy kiteytyi hitaasti, jolloin saatiin kvantitatiivinen saanto yhdistettä
10 I
(VII) 15 jota säilytettiin pimeässä typpikaasun alla.
^-NMR (CDC13): 6 1,85 (kvint., 2H, J=6 Hz), 2,65 (t, 2H, J=6 Hz); 3,23 (t, 2H, 6 Hz); 4,65 (leveä s, 2H), 5,95 (d, 1H, J=3 Hz); 6,1 (dd, 1H, J1=90 Hz, J2=3 Hz), 6,75 20 (d, 1H, J=9 Hz). M.S. (M+149).
20 Raakatuote (VII) (28 mmol) yhdistettiin puhtaana kuivassa kolvissa 4,16 g:n (28 mmol) kanssa ftaalihappoan-hydridiä ja 1,9 g:n (14 mmol) kanssa sulatettua ZnCl2 ja saatua seosta kuumennettiin öljyhauteessa 150 °C:ssa typpikaasun alla kahden tunnin ajan. Kiinteä massa jäähdytet- 25 tiin huoneen lämpötilaan, jauhennettiin, ja sitä uutettiin lämpimällä vedellä ja imusuodatettiin. Saatu punainen kiinteä aine otettiin 250 ml:aan 18-%lista HCl:n vesi-liuosta, ainetta lämmitettiin höyryhauteella ja siihen lisättiin useita millilitroja väkevää HCl:a liukenemisen 30 aikaansaamiseksi. Liuos jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan ja säilytettiin sitten pakastimessa kahden päivän ajan. Muodostunut kiteinen tuote imusuodatettiin, pestiin runsaalla määrällä 1 N HCl:a ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 2,65 g (42 % saanto) yhdistettä: 12 93278 cccco w 0 Axo* 10 ^ purppuranpunaisena jauheena. Titraus kalium-t-butoksidilla viittasi siihen että tuote oli bis-HCl-suola (M+ 410 vapaa 15 emäs).
Kalium-t-butoksidia (1,56 g, 13,9 mmol) lisättiin yhtenä annoksena sekoitettuun liuokseen, jossa oli 2,0 g edellistä tuotetta (Vili) 200 ml:ssa kuivaa DMF:a 0-5 °C:ssa typpikaasun alla. Muodostui tummansininen väri ja 20 se hävisi myöhemmin. (Huom: myöhemmin huomattiin sopivammaksi lisätä kalium-t-butoksidia siihen pisteeseen asti, jolloin tummansininen väri pysyi, ja sitten lisätä vielä yksi ekvivalentti). Lisättiin vielä 0,5 g (4,5 mmol) kalium-t-butoksidia, ja saatua tummansinistä liuosta sekoi-25 tettiin 45 minuutin ajan. Tähän liuokseen lisättiin ti-poittain 5 minuutin aikana liuos, jossa oli 2,2 ml (13,4 mmol) t-butyylibromiasetaattia 10 mlrssa DMF:a, ja saatu seos lämmitettiin huoneen lämpötilaan. Sitten liuotin poistettiin suurtyhjössä, minkä jälkeen jäännös otettiin 30 CH2Cl2:in, suodatettiin piimään lävitse ja suodosta haihdutettiin. Tuote puhdistettiin kromatografiän avulla käyttäen silikageeliä ja eluenttina liuosta 10 % CH30H/CH2C12, jolloin saatiin 2,0 g (70 %:n saanto) yhdistettä: 13 93278 CH/»*», CHiCOiCM.,
i .. 0 -N
ΓΤΤΥΎΊ
Jyco2 ~ 10 ani1iininpunaisena jauheena.
^-NMR (CDC13): 1,5 (s, 18H), 1,9 (m, 4H), 2,55 (t, 4H, J=6 Hz), 3,4 (t, 4H, J-6 Hz), 3,4 (t, 4H, J=6 Hz), 3,9 (leveä s, 4H), 6,23 (s, 2H), 6,34 (s, 2H), 7,1-7,2 (m, 1H), 7,5-15 7,75 (m, 2H), 8,0-8,2 (m, 1H).
Seos, jossa oli 370 mg (0,58 mmol) yhdistettä (IX) ja 193 mg (0,58 mmol) yhdistettä: 20 ^n^nA S ^ ,x) I I >—ΡΗΛ- C-N—^\m
Me 25 (joka oli valmistettu vastaavasta 8-karboksipropyyli-teofylliinistä ja piperatsiinista trimetyyliasetyyliseka-anhydridikytkennän avulla) 10 ml:ssa DMF:a, jäähdytettiin -30 eC:seen. Lisättiin difenyylifosforyyliatsidia (160 μΐ, 0,75 mmol) sekoitettuun liuokseen typpikaasun alla, ja 30 hauteen annettiin lämmetä hitaasti huoneen lämpötilaan. Neljän päivän kuluttua liuos kaadettiin ylimäärään etyyli-eetteriä, neste dekantoitiin erilleen öljystä, ja öljy kromatografoitiin käyttäen silikageeliä ja 10 - 15 % CH30H/CH2Cl2:a, jolloin saatiin 421 mg (61 %:n saanto) yh-35 distettä: 14 93278 (XI) CH2C02CMe3 CH2C02CMe3 kjkk^k^kk h o χΛτ“\ /\ » /S\ai f f XN ^-C - (CH2)3—/ I f 10 CH3 difenyylifosfaattisuolana (X = (Pho)2P02-); (m/e*956 FAB+). 15 1H-NMR (CDC13) oli kompleksinen mutta vastasi tuotteen rakennetta .
Liuos, jossa oli 421 mg (0,35 mmol) yhdistettä (XI) 10 ml:ssa CH2CL2:a, jäähdytettiin noin 5 eC:seen ja sitä käsiteltiin 2 ml:11a trifluorietikkahappoa. Saatua seosta 20 sekoitettiin typpikaasun alla 30 minuutin ajan ja sitten huoneen lämpötilassa yön ajan. Tuote eristettiin haihduttamalla liuotin ja puhdistettiin kromatografian avulla käyttäen silikageeliä ja eluenttina 15 - 30 % CH3OH/10 % AcOH/CH2C12, jolloin saatiin haluttu konjugaatti: 25 CH2coR' CH2C0R" I I (XII) /Ννγ°γγ% 30 V. JL n H 9 0 I il
/V\ /V II
\ I XN---N -C- (CHjb -/ I ! 35 ch3 15 93278 jossa R' on -OH ja R" on -0", hygroskooppisena, kiinteänä aineena 63 %:n saantona: (M+ 843); 1H-NMR (CD30D, CDC13) kompleksinen mutta vastasi tilannetta, jossa vastaionia kompensoi sisäinen karboksylaatti; λ max (pH:n 7 omaava 5 puskuriliuos) 568 nm (6 = 107 073). C45H46N809. (H20)4 edellyttää 59,07 % C:tä, 5,95 %, H:ä ja 12,25 % N:ä. Alkuaine-analyysissä todettiin 59,26 % C:tä, 5,71 % H:ä ja 12,25 % N:ä.
Esimerkki II
10 Konjugaatit XIII (XII, jossa R' on -NH(CH2)2S03H) ja R" on -NH(CH2)2S03") ja XIV (XII, jossa R’ = R" ja kumpikin on -N(CH3)CH2(CHOH)4CH2OH) syntetisoitiin XII:sta yhdistämällä tauriinin ja vastaavasti N-metyyli-d-glukamiinin kanssa difenyylifosforyyliatsidi (DPPA)-kytkennän avulla. 15 Siten yhdistettiin yksi mmol XII:ta 3 mmol:n kanssa tau-riinia (tai 3 mmol:n kanssa N-metyyli-d-glukamiinia) ja 5 mmol:n kanssa trietyyliamiinia tauriinin tapauksessa (tai 2 nunol:n kanssa N-metyyli-d-glukamiinin tapauksessa) 1/2 ml:ssa kuivaa DMF:a. Jäähdytettyihin liuoksiin (-30 eC) 20 lisättiin 3 mmol DPPA:a yhtenä annoksena, haude lämmitettiin hitaasti huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin yön ajan. Tuotteet eristettiin haihduttamalla tyhjössä ja puhdistettiin käänteisfaasikromatografian avulla.
Konjugaatilla XIII esiintyi λ max (pH:n 7 omaava 25 puskuriliuos) 558 nm (e - 74 900). Konjugaatilla XIV
esiintyi λ max (pH:n 7 omaava puskuriliuos) 555 nm (e = 60 300).
Esimerkki III
Liekitettyyn/N2-jäähdytettyyn, 100 ml:n pyöreäpoh- 30 jäiseen pulloon, joka oli varustettu N2-ilmakehän syöttöau- kolla, lisättiin 2,0 g (4,1 x 10 ^ mol) bis-rodamiini-HCl- suolaa (VIII) yhdessä 50 ml:n kanssa kuivaa DMS0:a (48 tuntia 3A:n seulojen päällä). Pullo upotettiin huoneen lämpötilassa olevaan vesihauteeseen ja sitten lisättiin _2 35 1,89 g (1,68 x 10 mol) t-butoksidin kaliumsuolaa yhtenä 16 93278 annoksena sekoittaen. Väriltään punaviolettia reaktioseos- ta sekoitettiin 2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa.
_2
Lisättiin propaanisulfonia (2,54 g, 2,08 x 10 mol) yhtenä annoksena, ja reaktioseosta sekoitettiin vielä 14 tun-5 tia ympäristön lämpötilassa. Raaka reaktioseos haihdutettiin suurtyhjössä, ja saatua kiinteää ainetta hierrettiin CH3CN:n ja sitten etyylieetterin kanssa ennen puhdistamista kromatografian avulla käyttäen käänteisfaasin kantajaa (C18-piidioksidi, joka oli valmistettu julkaisun Journal of 10 Organic Chemistry, 48, 1983, sivu 3589 mukaan) ja eluent-tina liuosta 30 % CH30H/H20, jolloin saatiin 2,3 g (72 %:n saanto) aniliininpunaista jauhetta, tris-(3-sulfopropyy-li)rodamiinia, jolla on kaava: 15 ICHjIjSOjH (CHjIjSOjH <xv> 20 rVco2(CHj)3SOj0
Tuotteen rakenne varmistettiin 300 MHz:n NMR-spek-trin avulla.
Tris-(3-sulfopropyyli)rodamiinia (2,3 g) sekoitet-25 tiin 30 ml:ssa 1 N Na0H:n vesiliuosta yhden tunnin ajan typpikaasun alla. Tähän liuokseen lisättiin 30 ml 1 N HCl:a, ja liuotin haihdutettiin sitten kuiviin suurtyhjössä. Saatu kiinteä aine liuotettiin pieneen tilavuuteen vettä ja lisättiin kerrokseen C18-piidioksidia. Suolat 30 poistettiin pesemällä vedellä. Haluttu bis-(3-sulfopropyy-li)rodamiinikarboksyylihappo poistettiin kerroksesta eluoimalla CH30H:lla, liuotin poistettiin haihduttamalla tyhjössä, ja kiinteää tuotetta hierrettiin CH3CN:n kanssa, minkä jälkeen kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,67 g 35 (86 %:n saanto) bis-(3-sulfopropyyli)rodamiinikarboksyyli- 17 93278 happoa*, purppuranpunaista jauhetta, jolla on kaava: iCH2]3S03H (CH2]3S03H (XVI)
iA_c°2G
10 *Yhdiste on hygroskooppinen ja tulisi säilyttää typpikaasun alla.
Lisättiin bis-(3-sulfopropyyli)rodamiinikarboksyy-lihappoa (50 mg, 7,67 x 10”^ mol) liekitettyyn/N2-jäähdytettyyn, pyöreäpohjäiseen pulloon yhdessä 2,3 ml:n kanssa 15 kuivaa DMF:a ja sekoitettiin ympäristön lämpötilassa typpikaasun alla. Lisättiin trietyyliamiinia (64 μΐ, 46,4 mg, 4,6 x 10-4 mol) ja sen jälkeen pivaloyylikloridia (28,2 -4 μΐ, 27,6 mg, 2,3 x 10 mol), ja seosta sekoitettiin kahden tunnin ajan. Reaktiota tarkkailtiin ohutkerroskromato-20 grafian (TLC) avulla pysäyttäen näytteet piperidiinillä. Muodostuneen seka-anhydridin joukkoon lisättiin piperat-siinia (66 mg, 7,67 x 10-4 mol), ja reaktioseosta sekoitettiin vielä 14 tunnin ajan. Sitten poistettiin liuotin suurtyhjössä, ja raakaseos puhdistettiin silikageelipyl-25 väässä käyttäen Cie-piidioksidia ja eluenttina liuosta 30 % CH30H/H20, jolloin saatiin bis-(3-sulfopropyyli)rodamii-nipiperatsiiniamidi, jolla on kaava: 30 [CH2|3S03H [CH2]3S03O (XVII) rWrV'i } 0 35 ___-
^ — NH
18 93278
Tuotteen rakenne varmistettiin NMR-spektritietojen avulla (300 MHz). Kvantitatiivinen analyysi vastasi heksa-hydraattia. Tuote liukenee helposti absorboituun kosteuteen ja tulisi säilyttää suurtyhjössä tai typpikaasun al-5 la.
3-(karboksyylipropyyli)teofylliinin (joka oli valmistettu noudattaen menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Jour. of Org. Chem., 45 (9) 1980, sivu 1711) seka-an-hydridi muodostettiin liekitetyssä/N2-jäähdytetyssä, pyö-10 reäpohjaisessa pullossa typpikaasun alla lisäämällä piva- loyylikloridia (14,5 μΐ, 14,5 mg, 1,20 x 10~4 mol) ja tri- etyyliamiinia (16,7 μΐ, 12,1 mg, 1,20 x 10-^ mol) 3-(kar- -4 boksipropyyli)teofylliinin (28,6 mg, 1,20 x 10 mol) joukkoon, joka oli 6 ml:ssa kuivaa DMF:a 0 °C:ssa. Seosta 15 sekoitettiin 1 1/2 tunnin ajan 0 °C:ssa, ja se siirrettiin sitten toiseen liekitettyyn/N2-jäähdytettyyn, pyöreäpohjai- seen pulloon, joka sisälsi bis-(3-sulfopropyyli)-rodamii- -5 nipiperatsiiniamidia (43,4 mg, 6,01 x 10 mol) typpikaasun alla. Reaktioseosta sekoitettiin 12 tunnin ajan ympä-20 ristön lämpötilassa. Ohutkerroskromatografia osoitti reaktion tapahtuneen epätäydellisestä joten reaktioseokseen lisättiin vielä 2 ekvivalenttia seka-anhydridiä. Liuotin poistettiin suurtyhjössä, ja raakatuote puhdistettiin kro-matografian avulla aiemmin kuvatun menettelyn mukaisesti 25 käyttäen eluenttina liuosta 40 % CH30H/H20, jolloin saatiin 40 mg (68,7 %:n saanto) rodamiini/3-(karboksipropyyli)teo-fylliini-konjugaattia, jolla on kaava (CH2)3S03H [CH2]3S03© (XVIII)
30 N 0 N
_-λ 0 oc H \ _ ^ I*
35 V---N-C-(CHj)38IO
li 19 93278 jossa BIO on "Yr> 5 0^Ν^ν
Tuotteen rakenne varmistettiin 300 MHz:n NMR-spekt-rin avulla, m/e = 958 FAB+.
10 Esimerkki IV
L-tyroksiinin natriumsuolaa, joka oli hankittu toi-minimeltä Cal Biochem, (200 mg, 0,25 mmol), lisättiin sekoitettuun liuokseen, jossa oli etikkahappoanhydridiä (24 μΐ, 0,25 mmol) 2 ml:ssa DMF:a huoneen lämpötilassa typpi-15 kaasun alla. Sitten lisättiin trietyyliaraiinia (35 μΐ, 0,25 mmol), ja saatua seosta sekoitettiin yön ajan. Liuotin poistettiin suurtyhjössä, jäännös otettiin 2 ml:aan CH30H:a, ja sitten lisättiin tipoittain 1 N HCl:a sekoittaen, jolloin muodostui valkea saostuma. Sakan yllä oleva 20 neste dekantoitiin, ja kiinteä aine kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 180 mg (88 %:n saanto) yhdistettä: 25 ,XIX’ )-' /-' NHAc Γ Γ XH NMR (CD3OD - CDCI3): 2,02 (s, 3H), 2,8 - 3,2 (m, 2H), 4,70 (b.t., 1H, J=7 Hz), 7,1 (s, 2H), 7,7 (s, 2H): M.S. 30 (M+ 819).
Lisättiin trimetyyliasetyylikloridia (30 μΐ, 0,24 mmol) tipoittain sekoitettuun liuokseen, jossa oli 180 mg (0,22 mmol) yhdistettä XIX ja trietyyliamiinia (34 μΐ, 0,24 mmol) 2 ml:ssa DMF:a 0-5 °C:ssa. Saatua seosta se-35 koitettiin typpikaasun alla yhden tunnin ajan, ja se lisättiin sitten tipoittain kylmään liuokseen, jossa oli 95 20 93278 mg (1,10 mmol) piperatsiinia 1 ml:ssa DMF:a. Seos lämmitettiin huoneen lämpötilaan, sitä sekoitettiin kahden tunnin ajan, ja se haihdutettiin sitten kuiviin. Jäännöstä hierrettiin CH30H:n kanssa, suodatettiin, hierrettiin H20:n 5 kanssa, suodatettiin ja kuivattiin, jolloin saatiin 41 mg (21 %:n saanto) yhdistettä: V=\ l (XX) 10 y~°\) n ^ \ v y—y nhac M.S. (M+ 887).
Seosta, jossa oli yhdistettä IX (41 mg, 0,064 mmol) 15 ja 57 mg yhdistettä XX (0,064 mmol) 1 ml:ssa DMF:a -30 °C:ssa typpikaasun alla, käsiteltiin 18 pl:lla (0,083 mmol) difenyylifosforyyliatsidia yhtenä annoksena. Saadun seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan, ja sitä sekoitettiin yön ajan. Haihtuva aines poistettiin suurtyh-20 jössä, ja jäännös kromatografoitiin käyttäen silikageeliä ja liuosta 10 % AcOH/20 % CH30H/CH2C12, jolloin saatiin 12 mg (13 %:n saanto) konjugaattia CH,C0R’ CH-COR"
I I
25 (XXI) 1 Ί XXII (XXI, jossa R' - R" ja kumpikin on -0C(CH3)3 ja X on difenyylifosfaatti).
Konjugaatti XXIII (XXI, jossa R' on -OH ja R" on 35 O-) valmistettiin XXII:sta noudattaen samaa menetelmää, li 21 93278 jota käytettiin XII:ta varten.
Esimerkki V
Liuotettiin 1-(karboksietyyli)fenobarbitaalia ( 50 -4 mg, 1,64 x 10 mol) 2 ml:aan kuivaa DMF:a sekoitettiin 5 N2:n alla. Liuos jäähdytettiin jäävesihauteessa ja lisät- -4 tiin trietyyliamiinia (25 μΐ, 1,75 x 10 mol) yhtenä annoksena. Seokseen lisättiin pivaloyylikloridia (22 μΐ, -4 1,75 x 10 mol) yhtenä annoksena. Useiden minuuttien kuluessa havaittiin saostuma, ja seosta sekoitettiin 5 10 °C:ssa yhden tunnin ajan. Seos lisättiin sitten hitaasti tipoittain liuokseen, jossa oli piperatsiinia (70,6 mg, -4 8,20 x 10 mol) 5 ml:ssa kuivaa DMF:a, sekoittaen N2:n alla. Reaktioseosta sekoitettiin jäähdyttäen jäävesihauteessa yhden tunnin ajan ja sitten huoneen lämpötilassa 15 yhden tunnin ajan, minkä jälkeen liuotin konsentroitiin suurtyhjössä huoneen lämpötilassa. Puolijähmeä jäännös lisättiin silikageelipylvääseen ja eluoitiin liuoksella 10 % CH3OH/I % NH40H/CH2C12. Halutun tuotteen fraktiot konsentroitiin tyhjössä, jolloin saatiin 45,1 mg (74 %:n saanto) 20 yhdistettä: Λ »
HN/XN(CH2)2 C-hL
II
. 25 NH (XXIV)
CjC2Hs
Lisättiin trietyyliamiinia (19 μΐ, 1,33 x 10~4 mol) 30 yhtenä annoksena jäähdytettyyn liuokseen (n. 3 eC), jossa oli 78 mg (1,21 x 10 ^ mol) yhdistettä IX 2ml:ssa kuivaa DMF:a. Liuokseen lisättiin pivaloyylikloridia (17 μΐ, 1,33 -4 x 10 mol) yhtenä annoksena jäähdyttäen.
Havaittiin saostuma melkein välittömästi, ja seosta 35 sekoitettiin yhden tunnin ajan alennetussa lämpötilassa.
22 93278
Seos lisättiin sitten nopeasti tipoittain liuokseen, jossa oli 45 mg (1,21 x 10 ^ mol) yhdistettä XXIV ja trietyyli- -4 amiinia (19 μΐ, 1,33 x 10 mol) 2 mlrssa kuivaa DMF:a. Saatua liuosta sekoitettiin yhden tunnin ajan alennetussa 5 lämpötilassa ja yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liuos konsentroitiin sitten kiinteäksi aineeksi suurtyh-jössä. Kiinteä aine puhdistettiin silikageelipylvään avulla eluoiden 1:1 etyyliasetaatti/asetonilla, jolloin saatiin reagoimaton väriaine (24 mg, 31 %). Eluoimalla liuok-10 sella 10 % CH30H/CH2C12 saatiin 65,3 mg (54,3 %) yhdistettä: CHoCOR' CH2COR"
I I
/ΝγΧ/°γ/\/Ν\ 15 n
Jk 11 n ? (XXV) r >c-n_____ V-----ShC-(CH2]2 J Γ 0
FsSgg\\-Kt.
20 / jj 2 5 XXVI (XXV, jossa R' = R" ja kumpikin on -OC(CH3)3 ja X on kloridi).
Yhdistettä XXVI (65,3 mg, 6,57 x 10-5 mol) sekoi-25 tettiin 1,5 ml:ssa trifluorietikkahappoa huoneen lämpötilassa typpikaasun alla 1 1/2 tunnin ajan ja sitten liuotin konsentroitiin tyhjössä. Jäännös lisättiin käänteisfaasi-silikageelille ja eluoitiin liuoksella 40 % CH30H/H20 ja siten liuoksella 60 % CH30H/H20, jolloin saatiin lukuisia 30 fraktioita, joissa oli tuotteiden seoksia. Fraktiot, joilla esiintyi Rf = 0,79 käänteisfaasisilikageelillä, konsentroitiin tyhjössä ja kuivattiin, jolloin saatiin 6,1 mg yhdistettä XXVII (XXV, jossa R’ on -OH ja R" on -0"). Myöhemmät synteesit osoittivat, että eluoitaessa normaali-35 faasisilikageelistä liuoksella 10 % CH3OH/10 % HOAc/CH2C12 on takaisinsaaminen parempi.
23 93278
Esimerkki VI
Pullo, joka sisälsi 40 ml jääetikkaa, jäähdytettiin kylmässä vesihauteessa ja 1,9 g (0,03 mol) natriumsyaani-boorihydridiä lisättiin annoksittain sekoittaen ja jääh-5 dyttäen jatkuvasti. Sen jälkeen kun H2:n kehitys oli lakannut, lisättiin 1,0 g (0,0075 mol) 4-hydroksi-indolia, ja saatua liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa kolmen tunnin ajan.
Reaktioseos kaadettiin sitten hitaasti sekoitettuun 10 liuokseen, jossa oli 50 g natriumkarbonaattia 400 ml:ssa vettä. Raakatuote uutettiin pois etyyliasetaatilla. Liuottimet poistettiin kiertohaihduttimen avulla, ja jäännös kromatografoitiin käyttäen silikageeliä (10 % EtOAc/- CHjClj), jolloin saatiin 723 mg (71 %) yhdistettä:
15 OH
(XXVIII)
H
20 4-hydroksi-indoliini (XXVIII) valkeana jauheena.
*H NMR (CDC13): 6 283 (t, 2H), 3,43 (t, 2H), 5,13 (leveä s, 1H), 5,9 - 6,1 (m, 2H), 6,77 (t, 1H), 8,80 (s, 1H); m/e = 135.
Suspensiota, jossa oli 1,6 g (12,1 mmol) monometyy-.25 lisukkinaattia 20 ml:ssa kuivaa tolueenia, sekoitettiin huoneen lämpötilassa ja lisättiin 140 mg (3,7 mmol) nat-riumboorihydridiä. Ei havaittu kaasun kehittymistä. Suspensiota käsiteltiin 100 mg:11a (0,74 mmol) yhdistettä XXVIII, ja reaktioseoksen lämpötila kohotettiin hitaasti 30 60 °C:seen, jona aikana kaasun kehitys alkoi ja saatiin aikaan täydellinen liukeneminen.
Kun oli kulunut kaksi tuntia 60 eC:ssa, reaktio-liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, sammutettiin sitten lisäämällä 200 ml:aan suolaliuosta, ja tuote uutettiin 35 erilleen EtOAc:lla. Liuottimet poistettiin kiertohaihdut- 24 93278 timen avulla, jolloin saatiin raakatuote, joka kromatogra-foitiin käyttäen silikageeliä (5 % EtOAc/CH2Cl2). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin jäljelle jäi valkea kiinteä aine. Tämä kiinteä aine liuo-5 tettiin liuottimeen CH2C12 ja pestiin 5-%:isella natriumbi-karbonaattiliuoksella. Kerros kuivattiin natriumsulfaatin avulla ja sitten haihdutettiin, jolloin saatiin 35 mg (20 %) yhdistettä XXIX vaaleana öljynä.
OH
10 (XXIX) (ch2)3co2ch3 15 *H NMR (CDClj): 6 1,89 (q, 2H), 2,39 (t, 2H), 2,75 - 3,2 (m, 4H), 3,37 (t, 2H), 3,63 (s, 3H) 5,95 - 6,15 (m, 2H), 6,88 (t, 1H); m/e = 236 (FAB+).
Yhdiste XXIX (32 mg, 0,14 mmol) yhdistettiin puhtaana kuivassa pullossa ftaalihappoanhydridin (20,1 mg, 20 0,14 mmol) ja sulatetun ZnCl2:n (9 mg, 0,07 mmol) kanssa, ja saatua seosta kuumennettiin öljyhauteessa 150 °C:ssa typpikaasun alla kahden tunnin ajan. Saatu punainen massa jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, kromatografoitiin sitten käyttäen silikageelia ja eluenttina 3 % MeOH - 5 % 25 MeOH/CH2Cl2:a. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 18 mg (45 %) yhdistettä XXX purppuranpunaisena kiinteänä aineena.
CH302C-(CH2)3-N \ o Ji N“ (CH_) -C0_CH_
so Vt' 'rV
KA®XJ
C02“ (XXX)
35 kJ
II
25 93278 XH NMR (CDC13 + CDjOD): 6 1,97 (m, 4H), 2,40 (t, 4H), 3,3 - 3,7 (m, 8H), 3,63 (s, 6H), 4,03 (t, 4H), 6,57 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,02 (d, 2H, J = 9 Hz), 7,3 (m, 1H), 7,75 (m, 2H), 8,3 (m, 1H); m/e = 583
5 Seos, jossa oli 18 mg (0,031 mmol) yhdistettä XXX
ja 10,3 mg (0,031 mmol) yhdistettä X 1,5 ml:ssa DMF:a, jäähdytettiin -30 °C:seen. Lisättiin difenyylifosforyyli-atsidia (10 mg, 0,036 mmol) sekoitettuun liuokseen typpikaasun alla, ja reaktioseoksen annettiin hitaasti lämmetä 10 ympäristön lämpötilaan ja sitä sekoitettiin sitten 60 tunnin ajan. Liuottimet poistettiin suurtyhjössä, ja purppuranpunainen jäännös kromatografoitiin käyttäen silikagee-liä (5 % MeOH - 15 % MeOH/CH2Cl2), jolloin saatiin 32 mg (91 %) yhdistettä XXXI purppuranpunaisena kiinteänä ainee-15 na.
«AO-IOU,- H~\ 0 JT)H -(ch2> 3C02“3
Il 11 1 (xxxi) H o (Ph02)P02© T | Ϊ
CH.J
25 1H-NMR (CDCI3 + CD3OD) oli kompleksinen mutta vasta si tuotteen rakennetta.
Liuosta, jossa oli 30 mg (0,026 mmol) yhdistettä XXXI 2 mltssa etanolia, käsiteltiin tipoittain 1,0 ml:11a 0,1 N NaOH-liuosta, ja saatua liuosta lämmitettiin 30 30 eC:ssa typpikaasun alla, kunnes TLC osoitti hydrolyysin tapahtuneen täydellisesti (noin kaksi tuntia). Ylimäärä liuottimia poistettiin suurtyhjössä. Jäännöstä sekoitettiin 5-%:isen HOAc-liuoksen kanssa, ja ylimäärä liuottimia poistettiin taas tyhjössä. Raakatuote puhdistettiin kroma-35 tografian avulla käyttäen silikageeliä ja eluenttina 10 - 26 93278 20 % MeOH/5 % HOAc/CH2Cl2:a, jolloin saatiin 14 mg (62 %) konjugaattia XXXII purppuranpunaisena jauheena.
H020-«Ji2) - '(CH2> 3C02® 5 Y y yf (xxxii) ' 1 rvco\ /-t^n-ch3
| XN—^__^N-C0-(CH2J3y H
10 «3 m/e = 872 (FAB ).
Näkyvä spektri: λ max (pH:n 7 omaava puskuriliuos): 600 nm, ε = 58 000.
15 1H-NMR (CD30D + CDCI3) oli kompleksinen mutta vasta si tilannetta, jossa vastaionia kompensoi sisäinen karbok-sylaatti.
Esimerkki VII
Tarkoituksena valaista lisää keksinnön mukaisten 20 biologisten fluoresoivien konjugaattien hyödyllisyyttä suoritettiin tyroksiinin (T4) immunoanalyysi. Analyysissä käytettiin seuraavia reagensseja:
Reagenssi A -liuos: 50 mmol HEPES-puskuriliuosta (pH 7,2); 10 mmol Na2-25 EDTA:a; 0,02 % 8-anilinonaftaleenisulfonaattia (ANS); 0,1 % naudan seerumin albumiinia (BSA); ja 0,05 % NAN3:a. Reagenssi B -liuos:
Reagenssi A ja 5 % polyetyleeniglykolia (PEG; mol.p. 6000). Valmistettiin kalibrointiliuoksia, joissa 30 oli kulloinkin vastaavasti 1, 25, 50, 100, 200 ja 400 ng T4:ä/pl reagenssia A. Kukin kalibrointiliuoksista (200 μΐ) yhdistettiin 200 μ1:η kanssa liuosta, jossa oli hiiren monoklonaalista anti-T4-vasta-ainetta (Behringwerke AG 49/7), 0,15 mmol IgG:tä, reagenssissa A, ja 200 μ1:η kans-35 sa liuosta, jossa oli 0,17 mmol konjugaattia reagenssissa 27 93278 A. Seosta inkuboitiin 60 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen lisättiin 200 μΐ liuosta, jossa oli 2 % hiiren normaalia seerumia reagenssissa B, ja 200 μΐ vuohen anti-hiiren IgG-vasta-ainetta (tuotteen Calbiochem Cat No 5 401210 laimennosta 1/16) reagenssissa B, ja seosta inku boitiin vielä 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa.
Seoksia sentrifugoitiin sitten 15 minuutin ajan nopeudella 3000 g, ja supernatanttineste dekantoitiin. Supernatanttinesteessä olevan vapaan konjugaatin fluo-10 resenssi mitattiin käyttäen Perkin Elmer MPF 44 -fluorofo-tometriä ja viritysaallonpituutta 565 nm ja emissioaallon-pituutta 590 mm. Taulukossa I on esitetty saadut tulokset:
Taulukko I
15 Tyroksiinia Vapaata konjugaattia (nq/ul)_(%J_ 1 19,0 25 25,4 20 50 39,8 100 71,8 200 84,2 400 87,0 25 Standardikäyrä osoitti hyvää herkkyyttä annoksen suhteen kiinnostavalla alueella 70 - 110 ng T4:ä/ml.
Vaikka keksintö on kuvattu kiinnittäen huomiota määrättyihin, erityisen edullisiin toteutusmuotoihin, ei sen tarkoiteta rajoittuvan niihin, vaan pikemminkin alan 30 asiantuntijat ymmärtävät, että siinä voidaan tehdä vaihdoksia ja muunnoksia, jotka ovat keksinnön hengen mukaisia ja sisältyvät liitteenä olevien patenttivaatimusten suoja-piiriin. Esimerkiksi voivat konjugaattien rodamiinimerkki-aineosan renkaat olla lisäksi sopivasti substituoituja 35 esimerkiksi sellaisilla substituenteilla kuin esitetyillä 28 93278 liuottavilla ryhmillä. Analogeja, jotka omaavat tämän keksinnön mukaisten konjugaattien edulliset tunnusomaiset piirteet, pidetään siten niiden vastikkeina tässä esitettyjen patenttivaatimusten tarkoituksia varten.
Claims (18)
1. Diagnostinen analyysielementti, joka soveltuu vastaanottamaan biologisesta nesteestä otetun näytteen ja 5 antamaan todettavissa olevan signaalin mainitussa nesteessä mahdollisesti läsnäolevan analysoitavan aineen funktiona, tunnettu siitä, että se sisältää fluoresoivaa konjugaattia, jolla on kaava 10 ^' Xra - — / ' 0 JL \ r — n--rr n-,N-Ri (A)x \ ^ 1 fff*2 15 r3 j jossa W, X, Y ja Z ovat kukin toisistaan riippumatta 20 -(CH2)a(CHR4)(CH2)b; R, Rlf R3 ja R, ovat kukin toisistaan riippumatta vety, hydrofiilinen ryhmä tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osa, joka on antigeeni, vasta-aine, hapteeni, Fab-fragmentti tai DNA-koetin, jolloin bio-25 logisesti aktiivisen osa on mitattava analysoitava aine, sen analogi tai analysoitavan aineen sitoutumispari; R2 on -C02 , -S03 tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sillä ehdolla, että vähintään yksi joukosta R, R:, 30 R2, R3 ja R4 on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, ja vähintään yksi jäljellä olevista ryhmistä R, Rx, R3 ja R4 on hydrofiilinen ryhmä; a ja b ovat kumpikin toisistaan riippumatta jokin kokonaisluvuista 0-4, sillä ehdolla, että summa a+b on 35 jokin kokonaisluvuista 1-4; 93278 m ja n ovat kumpikin 0 tai 1, sillä ehdolla, että toinen luvuista m ja n on 0 ja toinen on 1; p ja q ovat kumpikin 0 tai 1, sillä ehdolla, että toinen luvuista pjaqonOja toinen on 1; 5. on vastaioni tai vastaioneja konjugaattiosassa olevien kokonaisvarausten tasapainottamiseksi; ja x on 0 tai 1.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analyysielement-ti, tunnettu siitä, että se käsittää kantajan, 10 johon kuuluu vähintään yksi reagenssikerros.
3. Patenttivaatimuksen 2 diagnostinen analyysiele-mentti, tunnettu siitä, että se sisältää konju-gaatissa läsnä olevan biologisesti aktiivisen osan sitou-tumisparia.
4. Patenttivatimuksen 1 mukainen analyysielementti, tunnettu siitä, että konjugaatilla on kaava ?12 F13 CT"· jossa R2, R3, A ja x ovat patenttivaatimuksessa 1 määritel-30 tyjä ja R12, R13, R14 ja R15 ovat kukin toisistaan riippumatta vety, hydrofiilinen ryhmä tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sillä ehdolla, että vähintään yksi joukosta R2, R3, R12, R13, R14 ja R15 on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, ja 35 vähintään yksi jäljellä olevista ryhmistä R3, R12, R13, R14 ja Rl5 on hydrofiilinen ryhmä. Il 93278
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen analyysielement-ti, tunnettu siitä, että R2 on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen analyysielement-5 ti, tunnettu siitä, että R12 on hydrof iilinen ryhmä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analyysielement-ti, tunnettu siitä, että R13 on hydrof iilinen ryhmä.
8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen analyysi- elementti, tunnettu siitä, että hydrofiilinen ryhmä on karboksyylihappo, polyeetteri, polyalkoholi, amiini, sulfonihappo, fosfonihappo, fosfonihapon esteri, fosfaatti, fosfaattiesteri, fosfiinihappo, boraanihappo 15 tai boriinihappo.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen analyysielement-ti, tunnettu siitä, että konjugaatilla on kaava 20 /—yR14 /—X''15 -N x n JL N—o V γΛγ'°γΛγ 13 T (A) I x 25 fiT' 30 jossa R2, R3, A ja x ovat patenttivaatimuksessa 1 määriteltyjä ja R12, R13, R14 ja R15 ovat kukin toisistaan riippumatta vety, hydrofiilinen ryhmä tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sillä ehdolla, että vähintään yksi joukosta R2, R3, R12, R14 ja R15 on substituentti, 35 joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, ja vähintään 93278 yksi jäljellä olevista ryhmistä R3, R12, R13, R14 ja R15 on hydrofiilinen ryhmä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen analyysielement-ti, tunnettu siitä, että R2 on substituentti, joka 5 käsittää biologisesti aktiivisen osan.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen analyysiele-mentti, tunnettu siitä, että R12 on hydrof iilinen ryhmä.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen analyysiele- 10 mentti, tunnettu siitä, että R13 on hydrof iilinen ryhmä.
13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen analyy-sielementti, tunnettu siitä, että hydrofiilinen ryhmä on karboksyylihappo, polyeetteri, polyalkoholi, 15 amiini, sulfonihappo, fosfonihappo, fosfonihapon esteri, fosfaatti, fosfaattiesteri, fosfiinihappo, boraanihappo tai boriinihappo.
14. Fluoresoiva konjugaatti, tunnettu siitä, että sillä on kaava 20 --- x WpN / \ o / \ ' -N-(A)v -----Π T II > 25 .A. R ^r3 30 jossa W, X, Y ja Z ovat kukin toisistaan riippumatta -(CH2).(CHR4)(CH2)b; R, R1# R3 ja R4 ovat kukin toisistaan riippumatta vety, hydrofiilinen ryhmä tai substituentti, joka käsittää 35 biologisesti aktiivisen osan, joka on antigeeni, vasta- aine, hapteeni, Fab-fragmentti tai DNA-koetin; 93278 R2 on -C02", -S03‘ tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sillä ehdolla, että vähintään yksi joukosta R, Rx, R2, R3 ja R4 on substituentti, joka käsittää biologisesti 5 aktiivisen osan, ja vähintään yksi jäljellä olevista ryhmistä R, R3, R3 ja R4 on hydrofiilinen ryhmä; a ja b ovat kumpikin toisistaan riippumatta jokin kokonaisluvuista 0-4, sillä ehdolla, että summa a+b on jokin kokonaisluvuista 1-4; 10. ja n ovat kumpikin 0 tai 1, sillä ehdolla, että toinen luvuista mjanonOja toinen on 1; p ja q ovat kumpikin 0 tai 1, sillä ehdolla, että toinen luvuista pjaqonOja toinen on 1; A on vastaioni tai vastaioneja konjugaattiosassa 15 olevien kokonaisvarausten tasapainottamiseksi; ja x on 0 tai 1.
15 I <ai* Ra 20 jossa R2, R3, A ja x ovat patenttivaatimuksessa 14 määriteltyjä ja R12, R13, R14 ja R15 ovat kukin toisistaan riippumatta vety, hydrofiilinen ryhmä tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sillä ehdolla, että 25 vähintään yksi joukosta R2, R3, R12, R14 ja R15 on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, ja vähintään yksi jäljellä olevista ryhmistä R3, R12, R13, R14 ja R15 on hydrofiilinen ryhmä.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen fluoresoiva konjugaatti, tunnettu siitä, että sillä on kaava 20 „ ?12 C"OaCÖ <A)x
25 JL Ä15 30 jossa R2, R3, A ja x ovat patenttivaatimuksessa 14 määriteltyjä ja R12, R13, R14 ja R15 ovat kukin toisistaan riippumatta vety, hydrofiilinen ryhmä tai substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, sillä ehdolla, että 35 vähintään yksi joukosta R2, R3, R12, r13, r14 ja R15 on sub- 93278 stituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan, ja vähintään yksi jäljellä olevista ryhmistä R3, R12, R13, R14 ja R15 on hydrofiilinen ryhmä.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen fluoresoiva 5 konjugaatti, tunnettu siitä, että R2 on substi- tuentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan.
17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen fluoresoiva konjugaatti, tunnettu siitä, että sillä on kaava 10 r~y*14 Rl5 R -nv3n/°^Vn~Ri3 XXXJ
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen fluoresoiva 30 konjugaatti, tunnettu siitä, että R2 on substituentti, joka käsittää biologisesti aktiivisen osan. 93278
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/034,225 US4900686A (en) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay |
| US3422587 | 1987-04-02 | ||
| PCT/US1988/000641 WO1988007682A1 (en) | 1987-04-02 | 1988-02-23 | Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay |
| US8800641 | 1988-02-23 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI884922A0 FI884922A0 (fi) | 1988-10-25 |
| FI884922L FI884922L (fi) | 1988-10-25 |
| FI93278B FI93278B (fi) | 1994-11-30 |
| FI93278C true FI93278C (fi) | 1995-03-10 |
Family
ID=21875075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI884922A FI93278C (fi) | 1987-04-02 | 1988-10-25 | Diagnostinen analyysielementti ja fluoresoiva konjugaatti |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4900686A (fi) |
| EP (1) | EP0285179B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0718874B2 (fi) |
| AT (1) | ATE90789T1 (fi) |
| AU (1) | AU602090B2 (fi) |
| CA (1) | CA1339782C (fi) |
| DE (1) | DE3881735T2 (fi) |
| ES (1) | ES2058164T3 (fi) |
| FI (1) | FI93278C (fi) |
| GR (1) | GR3008515T3 (fi) |
| NZ (1) | NZ223998A (fi) |
| WO (1) | WO1988007682A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA881640B (fi) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989012232A1 (en) * | 1988-06-08 | 1989-12-14 | London Diagnostics, Inc. | Assays utilizing sensitizer-induced production of detectable signals |
| US5364796A (en) * | 1989-07-11 | 1994-11-15 | Pb Diagnostics Systems, Inc. | Diagnostic assay system |
| US5290682A (en) * | 1991-05-31 | 1994-03-01 | Polaroid Corporation | Enzyme controlled processes and products |
| US5750409A (en) * | 1991-11-18 | 1998-05-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pentacyclic compounds and their use as absorption or fluorescent dyes |
| DE4137934A1 (de) * | 1991-11-18 | 1993-05-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue pentacyklische verbindungen und ihre verwendung als absorptions- oder fluoreszenzfarbstoffe |
| EP0573762A2 (de) * | 1992-05-11 | 1993-12-15 | BASF Aktiengesellschaft | Rhodaminderivate |
| CA2158782C (en) * | 1994-09-23 | 2010-01-12 | Pierrette Gaudreau | Marker for growth hormone-releasing factor receptors |
| CA2164167A1 (en) * | 1994-12-20 | 1996-06-21 | Izak Bahar | Assay normalization method |
| US5650512A (en) * | 1995-06-07 | 1997-07-22 | Systemix | Fluorescent labeling reagents |
| US6008373A (en) | 1995-06-07 | 1999-12-28 | Carnegie Mellon University | Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer |
| FR2742047B1 (fr) * | 1995-12-06 | 1998-01-16 | Oreal | Compositions de teinture des fibres keratiniques contenant des derives n-substitues de la 4-hydroxy indoline, nouveaux derives, leur procede de synthese, leur utilisation pour la teinture, et procede de teinture |
| US5847162A (en) * | 1996-06-27 | 1998-12-08 | The Perkin Elmer Corporation | 4, 7-Dichlororhodamine dyes |
| US6017712A (en) * | 1996-06-27 | 2000-01-25 | Lee; Linda | 4,7-dichlororhodamine dyes |
| US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
| US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
| US6130101A (en) * | 1997-09-23 | 2000-10-10 | Molecular Probes, Inc. | Sulfonated xanthene derivatives |
| US6342611B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-01-29 | Cytovia, Inc. | Fluorogenic or fluorescent reporter molecules and their applications for whole-cell fluorescence screening assays for capsases and other enzymes and the use thereof |
| DE19824535A1 (de) * | 1998-06-03 | 1999-12-09 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Rhodamin-Derivate und deren Verwendung |
| ATE276754T1 (de) | 1998-07-21 | 2004-10-15 | Cytovia Inc | Neue fluoreszensfarbstoffe und ihre anwendung in fluoreszensnachweisverfahren ganzer zellen für kaspasen, peptidasen, proteasen und andere enzyme sowie deren verwendung |
| US6750357B1 (en) * | 1999-06-25 | 2004-06-15 | Syngen, Inc. | Rhodamine-based fluorophores useful as labeling reagents |
| AU2001278135A1 (en) | 2000-08-03 | 2002-02-18 | Cytovia, Inc. | Method of identifying immunosuppressive agents |
| US11008359B2 (en) | 2002-08-23 | 2021-05-18 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
| US7344701B2 (en) * | 2004-02-03 | 2008-03-18 | Biosearch Technologies, Inc. | Xanthene dyes |
| WO2007135368A2 (en) * | 2006-05-18 | 2007-11-29 | Solexa Limited | Dye compounds and the use of their labelled conjugates |
| US9056885B2 (en) * | 2011-11-21 | 2015-06-16 | Promega Corporation | Carboxy X rhodamine analogs |
| EP2847165A2 (en) | 2012-04-02 | 2015-03-18 | Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. | Indole, indoline derivatives, compositions comprising them and uses thereof |
| CA2903095C (en) | 2013-03-15 | 2018-02-13 | Xiaohai Liu | Modified nucleosides or nucleotides |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3822270A (en) * | 1971-08-09 | 1974-07-02 | Eastman Kodak Co | Pyrylium dyes having a fused,rigidized nitrogen-containing ring |
| US3932415A (en) * | 1972-04-17 | 1976-01-13 | Eastman Kodak Company | Pyrylium dyes having a fused rigidized nitrogen-containing ring |
| US4005092A (en) * | 1973-08-20 | 1977-01-25 | Eastman Kodak Company | Pyrylium dyes having a fused, rigidized nitrogen-containing ring |
| US4588697A (en) * | 1979-09-07 | 1986-05-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for performing fluorescent protein binding assay employing novel alkyl substituted fluorescent compounds and conjugates |
| US4481136A (en) * | 1979-09-07 | 1984-11-06 | Syva Company | Alkyl substituted fluorescent compounds and conjugates |
| US4351760A (en) * | 1979-09-07 | 1982-09-28 | Syva Company | Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates |
| DE3071373D1 (en) * | 1980-10-27 | 1986-03-06 | Syva Co | Novel ether substituted fluorescein compounds as fluorescers and quenchers |
| IT1140209B (it) * | 1981-09-25 | 1986-09-24 | Anic Spa | Reagenti per immunoluorescenza e metodo per la loro preparazione |
| US4622400A (en) * | 1983-12-29 | 1986-11-11 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Preparation of certain m-aminophenols and the use thereof for preparation of laser dyes |
-
1987
- 1987-04-02 US US07/034,225 patent/US4900686A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-02-23 JP JP63504346A patent/JPH0718874B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-23 WO PCT/US1988/000641 patent/WO1988007682A1/en not_active Ceased
- 1988-02-23 AU AU17281/88A patent/AU602090B2/en not_active Ceased
- 1988-03-08 ZA ZA881640A patent/ZA881640B/xx unknown
- 1988-03-14 CA CA000561395A patent/CA1339782C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-24 NZ NZ223998A patent/NZ223998A/xx unknown
- 1988-04-01 DE DE88105319T patent/DE3881735T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-01 AT AT88105319T patent/ATE90789T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-01 EP EP88105319A patent/EP0285179B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-01 ES ES88105319T patent/ES2058164T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-25 FI FI884922A patent/FI93278C/fi not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-07-16 GR GR920403057T patent/GR3008515T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI884922A0 (fi) | 1988-10-25 |
| JPH0718874B2 (ja) | 1995-03-06 |
| GR3008515T3 (fi) | 1993-10-29 |
| ZA881640B (en) | 1989-01-25 |
| EP0285179A2 (en) | 1988-10-05 |
| JPH01503488A (ja) | 1989-11-22 |
| ATE90789T1 (de) | 1993-07-15 |
| AU1728188A (en) | 1988-11-02 |
| US4900686A (en) | 1990-02-13 |
| FI884922L (fi) | 1988-10-25 |
| WO1988007682A1 (en) | 1988-10-06 |
| DE3881735T2 (de) | 1993-10-07 |
| EP0285179A3 (en) | 1988-11-23 |
| FI93278B (fi) | 1994-11-30 |
| CA1339782C (en) | 1998-03-31 |
| DE3881735D1 (de) | 1993-07-22 |
| EP0285179B1 (en) | 1993-06-16 |
| ES2058164T3 (es) | 1994-11-01 |
| NZ223998A (en) | 1989-11-28 |
| AU602090B2 (en) | 1990-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI93278C (fi) | Diagnostinen analyysielementti ja fluoresoiva konjugaatti | |
| EP0273115B1 (en) | Chemiluminescent acridinium and phenanthridinium salts | |
| EP0203047B1 (en) | Fluorescent lanthanide chelates | |
| US4886744A (en) | Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay system | |
| JP4195200B2 (ja) | ポルフィリン化合物、それらの結合体および前記結合体の使用に基づく検定方法 | |
| EP0988551B1 (en) | Chemiluminescent energy transfer conjugates and their uses as labels in binding assays | |
| US20040106806A1 (en) | Novel green and orange fluorescent labels and their uses | |
| CS273617B2 (en) | Method of resorufine's derivatives production | |
| JP3172522B2 (ja) | 改良された化学ルミネセントエステル，チオエステルおよびアミドを用いるアッセイ法 | |
| JP2002529466A5 (fi) | ||
| GB2111476A (en) | Substituted carboxy- fluoresceins and their use in fluorescence polarization immunoassay | |
| US6277984B1 (en) | Monomethine cyanines rigidized by a two-carbon chain | |
| US20040063147A1 (en) | Novel applications of acridinium compounds and derivatives in homogeneous assays | |
| CA1178269A (en) | Fluorescent polarization immunoassay utilizing substituted carboxyfluoresceins | |
| US20090136931A1 (en) | Novel fluorescent labeling compound | |
| KR19990014715A (ko) | 에스에이치기 표지용 시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 | |
| US5879953A (en) | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays | |
| ES2327141T3 (es) | Compuestos luminiscentes dotados de un brazo de enlace funcionalizado utilizado en bioconjugacion y marcado de biomoleculas. | |
| JP3248628B2 (ja) | 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法 | |
| JP3325370B2 (ja) | 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法 | |
| JPS62502548A (ja) | 新規な螢光性化合物および生物学的検査装置 | |
| RU1833690C (ru) | Способ определения антигенов или антител |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: DADE BEHRING MARBURG GMBH |
|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: DADE BEHRING MARBURG GMBH |