FI89078C - Foerfarande foer soenderdelning av akrylamid med hjaelp av acylamidamidohydrolasenzym - Google Patents

Description

1 89078

Menetelmä akryyliamidin hajottamiseksi asyyliamidiamido-hydrolaasientsyymin avulla Tämä keksintö koskee menetelmää akryyliamidin ha-5 jottamiseksi, menetelmää akryyliamidin hajottamisessa käy tettävän amidaasientsyymin (akryyliamidiamidohydrolaasi EC numero 3-5-1-4) tuottamiseksi ja menetelmää akryylihapon tai sen suolan tai esterin tuottamiseksi akryyliamidin hajottamisella.

10 Polyakryyliamidipolymeerejä, nimittäin akryyliami din homo- ja heteropolymeerejä, käytetään laajalti flokku-lantteina juomavesiteollisuudessa, viemäriveden käsittelyssä, paperin valmistuksessa ja kaivosteollisuudessa. Niiden käyttömahdollisuus on kuitenkin rajoitettu ja niitä 15 ei voi esimerkiksi käyttää elintarvikkeiden yhteydessä, koska ne ovat yleensä kontaminoituneet reagoimattomalla akryyliamidimonomeerillä, joka on kumulatiivinen neurotok-siini ja karsinogeeni. Tällä hetkellä polyakryyliamidien sallitaan USArssa tavallisesti sisältävän reagoimatonta 20 akryyliamidia 500 ppm:ään saakka ja tämä raja luultavasti tulee voimaan muuallakin. Tämä reagoimattoman monomeerin määrä voidaan saavuttaa käyttämällä pitempiä polymerisaa-tioaikoja ja lämpökäsittelymenetelmällä. Sellaiset käsittelyt lisäävät tuotantokustannuksia ja alentavat tuotettu-25 jen polymeerien tehokkuutta aiheuttamalla näissä polymeereissä haaroittumista. Lineaarisilla polymeereillä on korkeampi flokkulaatiotehokkuus ja niitä pidetään parempina. On olemassa tarve luotettavasta menetelmästä, joka alentaa reagoimattoman monomeerin määrän polyakryyliamideissa 500 30 ppm:n tasolle ja mieluummin jopa alemmille tasoille (5 -10 ppm tai alemmaksi) ilman polymeerin vahingoittumista. Jos läsnäolevan reagoimattoman monomeerin määrä voitaisiin luotettavasti alentaa hyvin alhaisille tasoille (1-5 ppm tai vähemmän), polyakryyliamideja voitaisiin harkita käyt-35 tötarkoituksiin, joista ne nykyään on suljettu pois, esi- 2 89078 merkiksi valmistettaessa elintarvikkeiden kanssa kosketuksissa olevia materiaaleja tai ollessaan suorassa kosketuksessa elintarvikkeisiin.

JP-patenttijulkaisussa nro 79 Oli 389 (vastaa Ja-5 panese kokai nro 53 860 078) kuvataan menetelmä esimerkiksi jätevedessä tai polyakryyliamideissa olevan akryyliami-dimonomeerin hajottamiseksi saattamalla ne kosketuksiin Brevibacterium ammoniogenes -bakteerin, edullisesti kantojen ATCC 1641, ATCC 6871 ja ATCC 6872 intrasellulaarisen 10 entsyymin kanssa. Kuitenkin huolimatta siitä, että tämä menetelmä on ollut tunnettu lukuisia vuosia, sitä ei ole tunnuttu käytetyn kaupallisesti missään merkittävässä määrin. Lisäksi Brevibacterium ammoniogenes -entsyymi toimii huonosti polyakryyliamidilateksisysteemeissä.

15 US-patenttijulkaisussa 4 687 807 kuvataan amidaasin käyttöä akryyliamidipitoisuuden alentamiseksi alkyyliami-dipolymeerejä sisältävissä vesi-öljyemulsioissa. Julkaisussa Chem. Abstr. 105 (1986) 167667w, J. Basic Microbiol. 26(5) (1986) ss. 299 - 311, kuvataan asyyliamidiamidohyd-20 rolaasin puhdistamista Brevibacterium sp. R312 -kannasta sekä ko. entsyymin ominaisuuksia. Julkaisussa Chem.

Abstr. 96 (1982) 214089s, Zentralbl. Bakteriol., Mikro-biol. Hyg., Abt. 1, Suppl. 1981, 11 (Actinomycetes), ss. 297 - 307, kuvataan akryyliamidia amidaasin avulla hajot-25 tavaa Rhodococcus 10021R -kantaa. Julkaisussa Chem. Abstr. 101 (1984) 193536q, Sen’i Gakkaishi 40(8) (1984) T302 -T309, kuvataan Cladosporium cladosporioides FERMJ-8 -kannan tuottaman amidaasin, esteraasin ja hydrataasin vaikutuksia polyakryylinitriilikuituihin. Julkaisussa Chem.

30 Abstr. 91 (1979) 112077r, JP Tokkyo Koho 79 11389, 15.5.1979, kuvataan menetelmä akryyliamidin hajottamiseksi jätevedessä Brevibacterium ammoniagenesin avulla. Julkaisussa Chem. Abstr. 93 (1980) 43912m, Biosources Dig. 2(2) (1980) ss. 89 - 97, kuvataan akryylihapon tuottamista Clo-35 stridium propionicumin avulla. Julkaisussa Chem. Abstr. 91 3 89078 (1979) 8955CM, JP Kokai Tokkyo Koho 79 46887, 13.4.1979, kuvataan akryylihapon ja metakryylihapon tuottamista ak-ryylimidista ja metakryyliamidista amidaasia sisältävän Streptomyces -kannan avulla.

5 Tämän keksinnön yhtenä kohteena on menetelmä akryy- liamidin hajottamiseksi sitä sisältävässä alustassa, jossa menetelmässä alusta saatetaan kosketuksiin akryyliamidia hajottamaan kykenevän entsyymin kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajo-10 tukselle. Menetelmälle on tunnusomaista, että entsyymi on asyyliamidiamidohydrolaasientsyymi, joka on indusoitu Methylophilus methylotrophus -lajiin kuuluvassa bakteerissa.

Lisäksi keksinnön kohteena on menetelmä asyyliami-15 diamidohydrolaasientsyymin tuottamiseksi, jolloin Methylophilus methylotrophus -lajiin kuuluvaa bakteeria viljellään sopivia ravinteita ja amidia sisältävässä kasvualustassa sellaisissa olosuhteissa, että asyyliamidiamidohyd-rolaasientsyymi indusoituu bakteerissa. Keksinnön mukai-20 sella menetelmällä tuotetut modifioidut bakteerit sisällytetään myös keksinnön piiriin.

Lisäksi keksinnön kohteena on menetelmä akryylihapon tai sen suolan tai esterin tuottamiseksi, jossa menetelmässä akryyliamidia sisältävä alusta saatetaan koske-. 25 tuksiin entsyymin kanssa, joka kykenee hajottamaan akryyliamidia akryylihapoksi olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajotukselle akryy-lihapoksi tai sen suolaksi tai esteriksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että entsyymi on asyyliamidiamidohydrolaa-30 sientsyymi, joka on indusoitu Methylophilus methylotrophus -lajiin kuuluvassa bakteerissa.

Keksinnön mukaista menetelmää käytetään edullisimmin indusoimaan akryyliamidia hajottamaan kykenevä amidaa-sientsyymi bakteerissa, jota entsyymiä voidaan käyttää 35 keksinnön menetelmissä. Tästä eteenpäin keksintöä kuvataan pääasiassa tämän entsyymin tuotannon ja käytön kannalta.

4 89078

Amidaasit ovat osa typen assimilaatiokoneistoa monissa soluissa, jotka on kasvatettu olosuhteissa, joissa ainoa typenlähde on alifaattinen amidi.

Näin ollen amidaasin metabolinen rooli on vapauttaa 5 ammoniakkia kyseisestä amidista esimerkiksi seuraavalla reaktiolla:

O O

II II

CH3-C-NH2 + H20 -» CHj-C-OH + NH3 10

Vapautettu ammoniakki assimiloidaan proteiini-biosynteesiin. Tuotettu alifaattinen happo joko assimiloidaan tai ei, riippuen mikro-organismityypistä.

Amidaasit voivat myös katalysoida akryyliamidin 15 muuttamista akryylihapoksi seuraavalla reaktiolla: CH2=CH-C-NH, + H,0--► CH,*CH-C-0H + NH.

Il 2 2 II

0 O

20 Sopivien suolojen tai alkoholien läsnäollessa tuo tettu akryylihappo voidaan muuttaa sen suoloiksi tai estereiksi .

Keksinnön mukaista hajottamismenetelmää voidaan käyttää hajottamaan akryyliamidia missä tahansa alustassa, 25 jossa sitä esiintyy. Se on erityisen käyttökelpoinen poly-akryyliamidipolymeereissä läsnäolevan reagoimattoman akryyliamidin ja jätevesissä, esimerkiksi polyakryyliamidien tuotantoprosessin jätevedessä läsnäolevan akryyliamidin hajottamiseen. Polyakryyliamideja tuotetaan kolmentyyppi-30 sinä polymeereinä, nimittäin liuos-, kuiva- ja suspensio-polymeereinä .

Polyakryyliamideja valmistetaan polymeereinä, joita on kolmea kemiallista tyyppiä. Nämä ovat kationiset, anio-niset ja ei-ioniset polymeerit, joissa akryyliamidit voi-35 vat olla kopolymeroituina muiden monomeerien, esimerkiksi 5 89078 akryylihapon kanssa. Näitä polymeerejä voidaan tuottaa jollakin seuraavista kolmesta perustekniikasta: liuospolymeraatio, jossa valmistetaan geelityyppi-nen tuote polymeroimalla monomeerit vesiliuoksessa; 5 kuivat polymeerit, jotka ovat edellä mainitulla tavalla tuotettuja polymeerejä, mutta jotka tämän jälkeen lämpökuivataan ennen käyttöä; ja lateksi- tai suspensiopolymeraatio, jossa vedessä oleva monomeeriliuos sekoitetaan detergenttien tai vedet-10 tömän lievästi tuoksuvan parafiinisen liuottimen kanssa muodostamaan vesipisaroista koostuva stabiili suspensio, jossa polymeeripisarat muodostetaan lisäämällä systeemiin vesiliukoista polymeraatio-initiaattoria.

Lateksi- tai suspensiopolymeerit muodostavat suu-15 rimman polyakryyliamidiryhmän markkinaosuuksien perusteella.

Anionisia ja neutraaleja polyakryyliamidipolymeere-jä on helppo käsitellä amidaasin suoralla lisäämisellä käyttäen keksinnön mukaista menetelmää, tai muita menetel-20 miä, kuten GB-patenttihakemuksen nro 8 630 012 (ICI hakemus B 34139) mukaista menetelmää, koska ne on formuloitu siten, että niiden pH-arvo on välillä 6-9.

Kationisia polakryyliamidipolymeerejä voidaan myös käsitellä amiidaasilla käyttäen keksinnön mukaista mene-25 telmää tai muita menetelmiä, mutta nämä polymeerit on formuloitu niin, että niillä on hapan pH-arvo välillä 3-4, ja käsittely suoralla amidaasin lisäyksellä on vähemmän tehokas kuin anionisten ja neutraalien polymeerien kohdalla.

30 Tämän keksinnön toisen aspektin mukaan esitetään menetelmä kationisten polyakryyliamidipolymeerien käsittelemiseksi niissä läsnäolevan reagoimattoman akryyliamidin hajottamiseksi käyttäen asyyliamidiamidohydrolaasientsyy-miä, jolloin menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: 35 A) käsiteltävän polymeerin pH nostetaan arvosta 3 - 3,5 arvoon 4 - 9 ja sen jälkeen 6 89078 B) polymeeri käsitellään Methylophilus methylotrop-hus -lajiin kuuluvassa bakteerissa indusoidulla asyyliami-diamidohydrolaasientsyymillä olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajotukselle.

5 Keksinnön toisen aspektin mukainen menetelmä voi daan suorittaa käyttämällä mistä tahansa lähteestä peräisin olevaa amidaasia, vaikkakin Methylophilus methylotrop-hus -kannoissa indusoitu amidaasi on edullinen. Tässä hakemuksessa kuvattujen muiden parametrien suositeltavat 10 arvot koskevat myös keksinnön toisen aspektin mukaista menetelmää. Vaiheessa A) pH voidaan nostaa millä tahansa sopivalla keinolla. pH nostetaan edullisesti arvoon 4,5 -7 ja erityisesti arvoon 4,5 - 5,5 tai 6.

Keksinnön mukaisissa hajottamia- ja akryylihapon 15 tuottomenetelmissä käytetty amidaasientsyymi voi olla läsnä missä tahansa sopivassa muodossa kokonaisissa mikro-organismisoluissa tai raakana tai puhdistettuna entsyymi-ekstraktina. Entsyymi voidaan tuoda menetelmiin kokonaisina viljelmässä olevina soluina, jotka on valmistettu alun-20 perin keksinnön mukaisella menetelmällä, tai kasvualustana, joka on tuotettu erottamalla vain osittain vesi ja muut komponentit sellaisista viljelmistä. Yleisesti kuitenkin pidetään parempana, että solut erotettaisiin viljelmästä ennen käyttöä menetelmissä.

25 Methylophilus methylotrophus -laji (aiemmin nimel tään Pseudomonas methylotropha), jonka kantoja viljellään keksinnön mukaisessa menetelmässä, on kuvattu GB-patentti-julkaisussa nro 1 370 892. Tämän lajin kannat, jotka ovat sopivia käytettäviksi keksinnön mukaisessa menetelmässä, 30 on tallennettu seuraaviin kolmeen viljelmäkokoelmaan, joista viljelmät ovat saatavissa: 1) The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torrey Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey

Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland, Englanti; 7 89078 2) The Acricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA; ja 3) The Fermentation Research Institute (RFI), Agency of 5 Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3 Higashi 1-Chome, Yatabe-mac-hi, Tsukuba-kun, Ibaragi-ken, Japan.

Vastaavat tallennetuille kannoille annetut koodinumerot näissä viljelmäkokoelmissa ovat seuraavat: 10 NICB 10508 - 10515 ja 10592 - 10596, kaikki mukaan luettuina; NRRL B 5352 - B 5364 mukaan luettuina; ja FRI 1215 - 1227 mukaan luettuina.

Suositeltava kanta keksinnön mukaisessa menetelmäs-15 sä käytettäväksi on Methylophilus methylotrophus -kanta AS-1 (NCIB 10515), jota voidaan turvallisesti käyttää esimerkiksi elintarvikkeiden yhteydessä käytettäväksi tarkoitettujen polyakryyliamidipolymeerien käsittelyssä. Methylophilus methylotrophus -laji ja edellä mainitut kannat, 20 varsinkin kanta AS-1, ovat tulleet laajalti tunnetuiksi ja ne on mainittu lukuisissa julkaisuissa sekä tämän keksinnön keksijän että muiden taholta. Edellä mainittujen tallennuspaikkojen lisäksi niiden viljelmiä säilytetään monissa yliopistoissa ja laboratorioissa Englannissa ja 25 muissa maissa. Myös erittäin sopiva keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi on NCIB:sta saatavissa oleva kanta NCIB 11585, jonka tuotanto kannan NCIB 10515 geneettisellä modifikaatiolla on kuvattu EP-patenttijulkaisussa 35 831 B ja lukuisissa muissa julkaisuissa.

30 Methylophilus methylotrophus -kannassa indusoidulla amidaasientsyymillä on seuraavansa mainitut ominaisuudet.

8 89078

Methylophilus methylotrophus -kannan amidaasin ominaisuudet:

Fysiologinen status:Indusoituva Sijainti: Sytoplasminen 5 Proteiini: Liukoinen

Hapan Isoelektrinen piste 4,2

Tetrameer i nen

Natiivi MW (Geelikromatografia 10 155000

Monomeerin MW (SDS page) 38000

Ominaisuudet: pH optimi: Asetamidi 5

Akryyliamidi 8 Lämpötila

15 optimi: 60 °C

KB Asetamidi 0,2 mM

Akryyliamidi 10 mM Aktiviteetit: Asyyliamidaasi

Asyylitransferääsi 20 Substraatti: Cx < C2 < C3 > C4 > C5

Asetamidi < Akryyli-amidi > Propionamidi

Keksinnön mukaisessa menetelmässä Methylophilus 25 methylotrophus -kantaa viljellään aerobisesti hiilen, typen, fosforin ja muiden tarkoituksenmukaisten ravinteiden lähteitä sisältävässä alustassa amidin läsnäollessa sellaisissa olosuhteissa, että amidaasi indusoituu bakteeri-soluissa. Sopiva viljely tapahtuu lämpötilavälillä 20 - 40 30 °C, edullisesti 34 - 38 °C ja pH:ssa 5,0 - 8,0, edullisesti 5,8 - 7,6. Kasvatus voi tapahtua panosviljelynä, yksivaiheisena jatkuvana viljelynä tai monivaiheisena jatkuvana viljelynä. Sopiva jatkuvan viljelyn laimennusnopeus on välillä 0,05/tunti - 0,55/tunti. Metanoli on edullinen 35 hiilenlähde. Mikä tahansa sopiva amidi voi olla läsnä kas- 9 89078 vatusalustassa. Asetan»idi tai formamidi ovat edullisia. Muita sopivia amideja ovat karboksyylihappojen amidit, joilla on kaava

R-C-OH

o jossa R on lyhytketjuinen alifaattinen ryhmä sisältäen 1 -5 hiiliatomia, joka voi olla suora tai haarautunut ketjultaan. Amidi on edullisesti ainoa tai pääasiallinen typen-10 lähde ja kasvatus tapahtuu jatkuvana viljelynä typen rajoittaessa. Erittäin edullisella kasvatusalustalla on seu-raava koostumus:

Komponentti Määrä/litra

Fosforihappo 1,6 ml 15 MgS04 · 7H20 1,912 g K2S04 0,952 g

CuS04 · 5H20 0,840 mg

ZnS04 · H20 2 , 568 mg

MnS04 · 4H20 4 , 04 mg 20 FeS04 · 7H20 37,20 mg

Kalsiumformiaatti 0,173 g

Typpi hankitaan joko yksinään asetamidista tai asetamidista ja ammoniakista. Soluja kasvatetaan typen 25 ylimäärässä tai typen rajoittaessa solukonsentraatioiden rajoissa.

Jatkuvalla, panos- tai syötetyllä panosfermentaa-tiolla tuotetut solut voidaan kerätä millä tahansa sopivilla keinoilla, edullisesti ultrasuodatuksella tai sent-30 rifugaatiolla liemen tuottamiseksi, jonka painosta 10 - 25 % on kuiva-aineita. Tämä liemi hajotetaan esimerkiksi useilla jäähdytys/sulatus-sykleillä tai mekaanisesti jauhamalla helmimyllyssä tai french-pressure -laitteella. Solujätteet voidaan sitten poistaa sentrifugaatiolla jät-35 täen jäljelle raa'an soluvapaan, amidaasin sisältävän 10 89078 ekstraktin. Lämpökäsittely voi tapahtua ennen tätä sentri-fugaatiota tai sen jälkeen, mutta mieluummin ennen, koska sen avulla saadaan aikaan aktiviteettia stimuloivan vaikutuksen lisäksi tuotteen parempi sedimentaatio sentrifugaa-5 tion aikana. Tämä ekstrakti voidaan haluttaessa lisäpuh-distaa anioninvaihtokromatografiällä ja geelisuodatuksel-la. Soluvapaat amidaasipreparaatit on sopivaa säilyttää kylmässä 0-10 °C:ssa tai jäädytettyinä liuoksina tai kylmäkuivattuina preparaatteina ennen liuotusta ja käyttöä. 10 Kun amidaasia sisältävät, keksinnön mukaisella me netelmällä valmistetut solut tai soluvapaat ekstraktit kuumennetaan lämpötilaan 40 - 80 °C, kuten on kuvattu GB-patenttihakemuksessa nro 8 630 012 (ICI hakemus B 34139), on havauttu, että erittäin epätavallisesti amidaasiaktivi-15 teetti nousee 1,5 - 35-kertaisesti riippuen entsyymiprepa-raatista. Tämä vaikutus on suurin 55 - 65 °C:n välillä olevissa lämpötiloissa, erityisesti 58 - 62 °C:ssa, pH:ssa 4 -9, erityisesti pHrssa 6 - 7, ja proteiinikonsentraation ollessa 0,1 - 200 mg/ml. Näissä olosuhteissa tapahtuu vain 20 vähän merkittävää amidaasin denaturaatiota.

Sopiva kuumennus tapahtuu aikavälillä 20 minuuttia - 10 tuntia, erityisesti 30 minuuttia - 180 minuuttia joissakin tapauksissa. Nousseen aktiviteetin tuottamiseksi solut tai soluvapaa entsyymi voidaan kuumentaa välittömäs-25 ti sen jälkeen, kun ne on tuotettu keksinnön mukaisella menetelmällä, tai jonakin muuna myöhempänä ajankohtana. Keksinnön mukainen menetelmä voidaan käyttökelpoisesti suorittaa joko kuten on kuvattu edellä tai samanlaisella prosessilla, joka käsittää neljä vaihetta, nimittäin 30 ensimmäisen fermentaatiovaiheen, jossa indusoitua amidaa sia sisältäviä soluja kasvatetaan fermentorissa, toisen sentrifugaatiovaiheen, jossa solut konsentroidaan 10 - 20 % kuiva-aineita sisältäväksi suspensioksi, kolmannen lämpöshokkivaiheen, Jossa solut kuumennetaan 35 edellä mainittuihin lämpötilaväleihin, ja n 89078 neljännen erotteluvaiheen, jossa solujäänteet sisältävä presipitaatti erotetaan entsyymin sisältävästä superna-tanttinesteestä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä amidaasia voi-5 daan käyttää vähentämään kaikissa akryyliamidipolymeeri-tyypeissä, erityisesti kolmen kemiallisen perustyypin verkkorakenteissa esiintyvien vapaiden akryyliamidijäänteiden määrää. Lateksia käsiteltäessä amidaasiliuosta lisätään lateksiin ja dispergoidaan lateksin läpi ravistele-10 maila samanlaisilla sekoitustekniikoilla määränä 1 - 10 000 U/kg lateksia, edullisesti 100 - 2 000 U/kg lateksia. Amidaasin inkubaatio lateksin kanssa aiheuttaa vapaan akryyliamidin muuttumisen akryylihapoksi tai sen suolaksi. Inkubaatiolämpötilat 10 - 100 °C (erityisesti 30 - 80 °C) 15 ovat suositeltavia. Verkkorakenteita on sopiva käsitellä pH:ssa 3-10, edullisesti 5-7.

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotettu amidaasi muuttaa akryyliamidin akryylihapoksi. Tätä reaktiota voidaan näin ollen käyttää keinona tuottaa akryylihappoa tai 20 kun reaktio suoritetaan sopivan suolan tai alkoholin läsnäollessa, tuottaa akryylihapon suoloja tai estereitä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetulla ami-daasilla, erityisesti kuumennettuna kuten edellä on kuvattu, on erittäin korkea aktiviteetti. Näin ollen keksinnön 25 mukaisen menetelmän käyttäminen akryyliamidin hajottamiseen laajentaa suuresti polyakryyliamidipolymeerien käyttöaluetta.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

Esimerkki 1 30 Methylophilus methylotrophus AS-1 -kannan soluva- paiden ekstraktien amidaasiaktiviteetin lämpöstimu-laatio

Sarja Methylophilus methylotrophus AS-1 -kannasta sitraattifosfaattipuskurisysteemiin (pH 6,0) ja proteiini-35 konsentraatioon 30 mg/ml valmistettuja soluvapaita eks- 12 89078 trakteja kuumennettiin vesihauteessa 1 ja 2 tunnin ajan lämpötilasarjoissa välillä 30 - 70 °C. Otettiin näytteitä eri aikoina ja niistä määritettiin amidaasiaktiviteetti 30 °C:ssa. Kaikissa tapauksissa käytetty substraatti oli ak-5 ryyliamidi konsentraationa 100 mM. Määritykset tehtiin 30 °C:ssa 0,1 M sitraatti/0,2 M fosfaattipuskurisysteemissä (pH 6,0).

Tulokset esitetään taulukossa ja ne osoittavat kohonneen aktiviteetin useimmissa käytetyissä olosuhteissa, 10 korkeimpien lisääntymisten ollessa 60 °C:ssa. Lisääntymiset olivat suurempia kahden tunnin kuin yhden tunnin kuumennuksella.

Taulukko Käsittely Amidaasiaktiviteetti Stimulaatio 15 (U/ml) (1 ei mitään 3,69 1 tunnin kuumennus 30 °C 3,69 1 x 50 °C 5,91 1,6 x 20 60 °C 24,65 6,7 x 70 °C 14,48 3,9 x 2 tunnin kuumennus 30 °C 3,76 1,02 x 50 °C 8,86 2,04 x 25 60 °C 40,06 10,8 x 70 °C 2,28 0,62 x 1 yksikkö vastaa määrää, joka vapauttaa 1 pmoolia NH3/- minuutti 30

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 kuvattuja soluvapaita ekstrakteja in-kuboitiin 55 °C:ssa, 60 °C:ssa ja 65 °C:ssa kutakin erikseen. Otettiin näytteitä eri aikoina ja niistä määritet-35 tiin amidaasiaktiviteetti kuten on kuvattu esimerkissä 1.

13 8 9078

Tulokset esitetään kuviossa 1, joka on piirros amidaasiak-tiviteetista (U/ml) aktivaatioajan (minuutteja) funktiona ja osoittaa amidaasiaktiviteetin optimaalista stimulaatiota 60 °C:ssa kahden tunnin ajanjakson aikana. Inkubaatio 5 alemmissa lämpötiloissa saa aikaan matalamman aktivaation. Inkubaatio korkeammissa lämpötiloissa, esimerkiksi 65 °C:ssa, osoittaa alussa 60 °C:seen verrattavissa olevaa ak-tivaationopeuden stimulaatiota, mutta alempaa lopullista amidaasiaktiviteettia.

10 Esimerkki 3

Akryyliamidin poistaminen anionisesta lateksista

Anionista lateksia Nalfloc tyyppi A 626 (valmistaja Nalfloc Co., Cheshire, Englanti), jonka pH on säädetty 5,9:ään 60 °C:ssa, käsiteltiin lisäämällä siihen keksinnön 15 mukaisella menetelmällä tuotettua amidaasiliuosta, jonka aktiivisuus oli 300 U/ml ja lopputaso 1 000 U amidaasia/kg lateksia. Otettiin näytteitä eri aikoina ja niistä määritettiin vapaa akryyliamidi korkeapainenestekromatografiällä (HPLC).

20 Tulokset esitetään kuviossa 2, joka on piirros va paan akryyliamidin (mM) määrästä käsittelyäjän (minuutteja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliamidin määrän vähentymisen 2,78 mM:sta (126 ppm) 0,02 mM:een (1,4 ppm) 30 minuutissa.

25 Esimerkki 4

Akryyliamidin poistaminen kationisesta lateksista

Kationista lateksia Nalfloc tyyppi 4625-SC, jonka pH oli säädetty 6,0:aan, käsiteltiin kuten on kuvattu esimerkissä 3, analysoiden näytteet HPLC:llä.

30 Tulokset esitetään kuviossa 3, joka on piirros va paan akryyliamidin (mM) määrästä käsittelyajan (minuutteja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliamidin määrän vähentymisen 2,2 mM:sta (156 ppm) 0,02 mM:een (1,4 ppm) 45 minuutissa.

14 89078

Esimerkki 5

Akryyliamidin poistaminen ei-ionisesta lateksista

Ei-ionista lateksia Nalfloc tyyppi 8861-SC, jonka pH oli säädetty 6,Oraan, käsiteltiin kuten on kuvattu esi-5 merkissä 3, analysoiden näytteet HPLC:llä.

Tulokset esitetään kuviossa 4, joka on piirros vapaan akryyliamidin (mM) määrästä käsittelyajan (minuutteja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliamidin määrän vähentymisen 3,1 mM:sta (220 ppm) 0,15 mM:een (10,7 ppm) 10 120 minuutissa.

Esimerkki 6

Anionista lateksia Nalfloc tyyppi A 625, jonka pH oli säädetty 5,9:ään 20 °C:ssa, käsiteltiin amidaasiannok-sella 1 000 yksikköä (U)/kg A 625 -substraattia kuten on 15 kuvattu esimerkissä 3.

Tulokset esitetään kuviossa 5, joka on piirros ak-ryyliamidijäänteen määrästä [ppm BOL (standardilyhenne käsitteelle "perustuu lateksin kokonaipainoon")] käsittely-ajan (minuutteja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliami-20 din määrän vähentymisen 383 ppm:stä (5,4 mM) 161 ppm:ään (2,27 mM) 390 minuutissa.

Esimerkki 7

Kationista lateksia Nalfloc tyyppi 4625-SC käsiteltiin amidaasiannoksella 1 000 yksikköä (U)/kg lateksia 60 25 °C:ssa sekä sen natiivissa pH:ssa (Λ/4) että säädetyssä pH:ssa 6. Otettiin näytteitä eri aikoina ja niiden akryy-liamidipitoisuus määritettiin HPLCrllä.

Tulokset esitetään kuviossa 6, joka on piirros ak-ryyliamidijäänteen määrästä (ppm BOL) käsittelyajan (mi-30 nuutteja) funktiona ja osoittaa vapaan akryyliamidin nopean vähentymisen lateksissa, jonka pH oli säädetty 6,Oraan, mutta vain rajoitetun vähenemisen luonnollisen pH:n omaavassa lateksissa.

Claims (10)

1. Menetelmä akryyliamidin hajottamiseksi sitä sisältävässä alustassa, jossa menetelmässä alusta saatetaan 5 kosketuksiin akryyliamidia hajottamaan kykenevän entsyymin kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajotukselle, tunnettu siitä, että entsyymi on asyyliamidiamidohydrolaasientsyymi, joka on indusoitu Methylophilus methylotrophus -lajiin 10 kuuluvassa bakteerissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliamidiamidohydrolaasi- entsyymi on indusoitu missä tahansa kannoista NCIB 10 508 - 10 515, NCIB 10 592 - 10 596, kaikki mukaanlukien, ja 15 kannassa NCIB 11 585 tai missä tahansa näiden jälkeläisistä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliamidiamidohydrolaasi- entsyymi on kuumennettu 40 - 80 °C:n välillä olevaan lämpö- 20 tilaan riittäväksi ajaksi sopivissa olosuhteissa entsyymin aktiivisuuden kohottamiseksi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliamidiamidohydrolaasi- entsyymi on kuumennettu 58 - 62 °C:n välillä olevaan lämpö- . :25 tilaan.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on kuumennettu 40 - 80 °C:n välillä olevaan lämpötilaan silloin, kun se sisältyy hajotettuihin soluihin ja/tai on assosioitunut solu- 30 jätteisiin.

6. Menetelmä asyyliamidiamidohydrolaasientsyymin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että Methylophilus methylotrophus -lajiin kuuluvaa bakteeria viljellään sopivia ravinteita ja amidia sisältävässä alustassa sellaisis- 35 sa olosuhteissa, että asyyliamidiamidohydrolaasientsyymi indusoituu bakteerissa. 16 89078

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että amidi on asetamidi.

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sen jälkeen kun asyyliamidi- 5 amidohydrolaasientsyymi on indusoitu bakteerissa, bakteerisolut kerätään ja sitten rikotaan ja entsyymi kuumennetaan 40 - 80 °C:n välillä olevaan lämpötilaan silloin, kun se sisältyy rikottuihin soluihin ja/tai on assosioitunut solujätteisiin.

9. Menetelmä akryylihapon tai sen suolan tai este rin tuottamiseksi, jossa menetelmässä akryyliamidia sisältävä alusta saatetaan kosketuksiin entsyymin kanssa, joka kykenee hajottamaan akryyliamidia akryylihapoksi olosuhteissa, jotka ovat sopivia entsyymin aiheuttamalle akryy-15 liamidin hajotukselle akryylihapoksi tai sen suolaksi tai esteriksi, tunnettu siitä, että entsyymi on asyy-liamidiamidohydrolaasientsyymi, joka on indusoitu Methylo-philus methylotrophus -lajiin kuuluvassa bakteerissa.

10. Menetelmä kationisten polyakryyliamidipolymee-20 rien käsittelemiseksi niissä läsnäolevan reagoimattoman akryyliamidin hajottamiseksi asyyliamidiamidohydrolaasi-entsyymiä käyttäen, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: A) käsiteltävän polymeerin pH nostetaan arvosta 3 25 - 3,5 arvoon 4 - 9 ja sen jälkeen B) polymeeri käsitellään Methylophilus methylotrop-hys -lajiin kuuluvassa bakteerissa indusoidulla asyyliami-diamidohydrolaasientsyymillä olosuhteissa, jotka ovat sopivat entsyymin aiheuttamalle akryyliamidin hajotukselle. 17 89078