FI88399B - L-aminodikarboxylestrar, en soetningskomposition som innehaoller dessa och ett foerfarande foer framstaellning av dessa - Google Patents

Description

1 88399 L-amlnodikarboksyyllhappoestereitä, niitä sisältävä makeu-tuskoostumus ja menetelmä niiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusia yhdisteitä, jotka eri-5 tyisen hyvin soveltuvat makeutusaineiksi syötäväksi kel-paaviin elintarvikkeisiin.

Tämän keksinnön kohteena ovat uudet makeutusaineyh-disteet, joilla on kaava (I) L ** 10 H2N-CH-CONH-C(A)CH3 CH2 C02-jB(+)-fenkyyli co2h ja niiden ravintoaineissa käytettäviksi hyväksyttävät suo-15 lat, jossa kaavassa A on vety tai metyyli, edellyttäen, että kun kaksoistähdellä merkitty hiili on asymmetrinen tai kiraalinen keskus, konfiguraatio mainitun hiilen ympärillä on D-muodossa. Tämän keksinnön spesifiset yhdisteet ovat a-L-aspartyyli-D-alaniinin ja a-L-aspartyylimetyyli-20 alanlinin B(+)-fenkyyliesterit.

Nämä uudet yhdisteet ovat tehokkaita makeutusainei-ta käytettynä yksinään tai yhdistelmänä muiden makeutus-aineiden kanssa nautittavaksi kelpaavassa aineessa, esim. elintarvikkeissa tai lääkeaineissa. Muita luonnossa esiin-25 tyviä ja/tai keinotekoisia makeutusaineita, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten uusien yhdisteiden kanssa, ovat esimerkiksi sakkaroosi, hedelmäsokeri, kiinteä maissisiirappi, rypälesokeri, ksylitoli, sorbitoli, mannitol! , asetosulfaarni, taumatiini, inverttisokeri, sakarii-30 ni, tiofeeniSakariini, meta-aminobentsoehappo, meta-hyd-roksibentsoehappo, syklamaatti, kloorisakkaroosi, dihyd-rokalkoni, hydratut glukoosisiirapit, aspartaami (L-aspar-tyyli-L-fenyylialaniinin metyyliesteri) ja muut dipepti-dit, glycyrrhizin ja stevioside ja näiden kaltaiset ai-’ 35 neet. Näiden makeutusaineiden käytettyinä yhdessä keksin- 2 88399 ηΰπ mukaisten makeutusaineiden kanssa uskotaan voivan aiheuttaa synergistisiä makeutusreaktioita.

Lisättäessä keksinnön mukaisia makeutusaineita ravintoon, makeutusaineita voidaan edelleen lisätä yksinään 5 tai yhdessä toksittomien kantajien kuten edellä mainittujen makeutusaineiden tai muiden ravintoaineosien kuten asidulanttien, luonnon ja keinotekoisten hartsien, täyteaineiden kuten polyhiilihydraattien, dekstriinien, ja muiden ravintoaineissa käytettäviksi hyväksyttävien hiilihyd-10 raattien ja niiden johdannaisten kanssa. Tyypillisiä ravintoaineita ja farmaseuttisia valmisteita, joissa tämän keksinnön mukaisia makeutusaineita voidaan käyttää, ovat esimerkiksi virkistysjuomat mukaan lukien alkoholittomat juomat, hiilihappopitoiset juomat, valmiiksi sekoitetta-15 vissa olevat juomat ja näiden kaltaiset juomat, uutetut ravintoaineet (esim. vihannekset tai hedelmät), kastikkeet, höysteet, salaattikastikkeet, mehut, siirapit, jälkiruoat, mukaan lukien vanukkaat, hyytelö- ja pakasteval-misteet, kuten jäätelöt, mehujäätelöt, sokerikuorrutukset 20 ja puikoissa olevat maustetut pakastetut jälkiruoat, makeiset, purukumit, maissihiutaleet, leivonnaiset, puoli-kosteat ravintoaineet (esim. koiran ruoka), hammastahna, suuvesi ja näiden kaltaiset aineet.

Haluttujen vaikutusten aikaansaamiseksi keksinnön 25 mukaisia yhdisteitä lisätään yleensä ravintotuotteeseen pitoisuus, joka on tehokas makeuden aikaansaamiseksi ravintoaineessa ja sopiva on määrä, joka on alueella noin 0,0005 - 2 paino-% käytettävän tuotteen määrästä. Suuremmat määrät ovat käyttökelpoisia mutta eivät käytännössä 30 suotavia. Edulliset määrät ovat alueella noin 0,001 - noin 1 % ravintoaineen määrästä. Yleisesti näillä yhdisteillä saavutettu makeuttava vaikutus on todettu laajalla pH-alueella, esim. välillä 2 - 10, edullisesti välillä 3-7, ja puskuroiduissa ja puskuroimattomissa seosmuodoissa.

3 88399

Jos makeutusaineena käytetään a-L-aspartyyll-D-alaniini-[6(+)-fenkyyli]esteriä, makeutusaineen määrä voi edullisemmin olla alueella noin 0,0005 - 0,005 paino-% ravintoaineen määrästä. Kun makeutusaineena käytetään a-L-5 aspartyyli-2-metyylialaniini-[e(+)-fenkyyli]esteriä, käy tettävät määrät voivat olla laajemmalla edellä esitetyllä tavalla, mutta erityisen edullista on käyttää sitä noin 0,0005 - noin 0,01 paino-% ravintoaineen määrästä.

Toivottavaa on, että käytettäessä tämän keksinnön 10 makeutusaineita yksinään tai yhdistelmänä muun makeutus aineen kanssa, makeutusaine tai makeutusaineiden yhdistelmä vastaa sakkaroosiekvivalenttia, joka on alueella noin 2 paino-% - noin 40 paino-% ja edullisemmin noin 3 paino-% - noin 15 paino-% ravintoaineessa tai farmaseuttisessa 15 valmisteessa.

Maistamismenettelyyn makeuden määrittämiseksi sisältyy ainoastaan sakkaroosiekvivalenssin määrittäminen. Makeutusaineiden sakkaroosiekvlvalenssi on helposti määritettävissä. Makeutusaineen määrä, joka vastaa tiettyä 20 painoprosenttia sakkaroosia, voidaan määrittää antamalla maistaja-lautakunnan maistaa tunnetun väkevyisiä makeutusaineen liuoksia ja verrata sen makeutta sakkaroosin stan-dardliuoksiin.

Yritettäessä eliminoida hiilihydraattimakeuttajiin 25 liittyviä epäkohtia on paljon tutkimustyötä ja kustannuk sia käytetty keinotekoisten makeuttajien, kuten sakarii-nin, syklamaatin, dlhydrokalkonin, aspartaamin, jne. tuottamiseen. Vaikka jotkut näistä makeuttajlsta täyttävätkin asetetut vaatimukset siltä osalta, että niillä on makea 30 maku ja ne ovat vähäkalorisia, ja ovat sen vuoksi saavuttaneet kaupallista menestystä, niilläkin on kuitenkin omat epäkohtansa. Niinpä esimerkiksi monet näistä synteettisistä makeuttajlsta ovat tuotantokustannuksiltaan kalliita, lisäksi epäkohtina on viipymä ennen makean maun havaitse-35 mistä, pitkään jatkuva makean maun viipyminen ja hyvin 4 88399 epämiellyttävä karvas, metallinen jälkimaku, kun näitä makeuttajia käytetään elintarvikkeissa.

Ennestään tunnetuille makeutusaineiksi esitetyille dipeptidlestereille on ollut luonteenomaista, että niiltä 5 on puuttunut stabiilisuus alhaisissa pH-arvoissa ja/tai terminen stabiilisuus. Nämä puutteet ovat rajoittaneet näiden makeuttajien käyttää ravintoaineissa, joiden pH on usein alhainen ja/tai jotka valmistetaan tai tarjotaan korotetuissa lämpötiloissa. Sen vuoksi on toivottavaa saada 10 aikaan yhdisteitä, joilla on hyvät makeutusominaisuudet, kun niitä lisätään pieninä pitoisuuksina ravintoaineisiin, jolloin voidaan eliminoida tai suuresti vähentää näitä tunnettuihin makeuttaJiin liittyviä epäkohtia. Nämä tavoitteet saavutetaan keksinnön mukaisilla uusilla yhdis-15 teillä.

Tämän keksinnön mukaisten B(+)-fenkyyliesterien on todettu olevan merkittävästi makeampia kuin tunnetut ma-keuttajat. Esimerkiksi tutkittuna kuten jäljempänä esimerkkien yhteydessä on esitetty L-aspartyyli-D-alaniinin 20 β( + )-fenkyyliesterin suhteellinen makeus sakkaroosiin ver rattuna oli 2000X ja jopa 5000X sakkaroosin makeus, kun taas vastaavalla B(-)-yhdisteellä vastaava arvo oli 400 -500X, a(-)-yhdisteellä 800X ja a(+)-yhdisteellä vain 100 -200X.

25 Keksinnön mukaisista fenkyyliestereistä poiketen muilla bisykloalkyyliestereillä on vain alhaiset makeusta-sot. Esimerkiksi vastaavat bornyyliesterit ovat vain heikosti makeita tai ne eivät ole lainkaan makeita. Aspartyy-li-D-alaniinin bornyyliesteriltä makeus puuttuu kokonaan. 30 Bisyklononanyyli[3,3,1]esterin makeus on noin 200X sakka- roosiekvivalentilla 2 %, mikä on oleellisesti pienempi kuin keksinnön mukaisten fenkyyliesterien makeus.

US-patenttijulkaisussa 4 411 925 kuvataan makeutus-aineina yhdisteitä, joilla on kaava 5 88399 /NH2 a

HOQC - CH2 - CH^ ^NH

J CHCONHR

5 0 jossa R on fenkyyli, di-isopropyylikarbinyyli, d-metyyli-tert-butyylikarbinyyli, d-etyyli-tert-butyylikarbinyyli, 2-metyylitio-2,4-dimetyylipentan-3-yyli, di-tert-butyyli-karbinyyli,

10 , ** ., *· P

£> -c * *V L<Ch,>- L«"* 15 >-<«** *'\/

Ci £>- - P

ja R* on metyyli, etyyli, n-propyyli tai isopropyyli, ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät kationi- ja happoaddi-tiosuolat. US-patenttijulkaisussa 3 907 766 kuvataan ma-25 keutusaineina käyttökelpoisina yhdisteinä L-aspartyyliami-nomalonihapon alkyylifenkyylidiesteri ja sen fysiologisesti hyväksyttävät suolat. Näistä julkaisuista samoin kuin myös julkaisusta J. Med. Chem. 16 (11) 1974 s. 1284-1287 tunnettuihin makeuttajayhdisteisiin liittyy kuitenkin 30 edellä mainittuja epäkohtia, jotka vältetään keksinnön mukaisilla yhdisteillä.

EP-hakemusjulkaisussa 168112 kuvataan tiettyjä L-aspartyyli-D-fenyyliglysiinln estereitä ja amideja inten-siivimakeuttajina; näihin yhdisteisiin kuuluu mm. 6( + )-35 fenkyyliesteri, jonka makeus on sakkaroosiin verrattuna 6 88399 noin 5000-kertainen. Koska tämä esteri kuitenkin sisältää dipeptidiosassa aryy 1 iaminohapon, sen on katsottava jo ra* kenteeltaan eroavan olennaisesti keksinnön mukaisista di-peptidiestereistä.

5 Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistami seen voidaan käyttää useita reaktiokaavioita. Erään reak-tiokaavion mukaisesti kondensoidaan yleisen kaavan II mukaisia yhdisteitä (suojattu α-aminodikarboksyylihappo) ja yleisen kaavan III mukaisia yhdisteitä (amlnoesteriyhdis-10 te), jolloin muodostuu yleisen kaavan IV mukaisia yhdisteitä. Poistamalla sen jälkeen suojaryhmät B ja Z yleisen kaavan IV mukaisista yhdisteistä, saadaan haluttuja yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä:

H

15 I

Z - N - CH - C00H NH_ - C(A) CH- I ^ | Λ ^ CH2 + C02-p (+)-fenkyyli

C00B

II III

20 i

H OH

I II I

Z-N-CH-C-N- C(A) CH-25 1 | _ 3 CH2 C02-p ( + ) -fenkyyli

C00B

IV

Näissä ryhmä Z on aminon suojaryhmä, B on karboksyylin 30 suojaryhmä ja A:11a on sama merkitys kuin edellä on esitetty. Käyttökelpoisia ovat monet erilaiset alalla tunnetut suojaryhmät. Esimerkkejä monista näistä mahdollisista ryhmistä on löydettävissä julkaisusta "Protective Groups in Organic Synthesis”, T.W. Green, John Wiley and Sons, 35 1981. Edullisia käyttökelpoisia ryhmiä ovat esimerkiksi 7 88399 bentsyylioksikarbonyyll ryhmänä A ja bentsyyli ryhmänä B.

Yleisen kaavan lii mukaisen yhdisteen kytkemiseen yleisen kaavan II mukaisiin yhdisteisiin käytetään pep-tidikemian vakiintuneita menetelmiä. Eräässä sellaisessa 5 menetelmässä käytetään disykloheksyyli-karbodi-imidiä (DCC). DCC-raenetelmää voidaan käyttää lisäaineiden kuten 4-dimetyyliaminopyridiinin tai kupari (II):n kera tai ilman niitä. DCC-kytkentäreaktio tapahtuu (ll):n tavallisesti huoneen lämpötilassa, joskin se voidaan suorittaa väli-10 llä -20 - +50 °C, erilaisissa reagensslen suhteen iner-telssä liuottimissa. Täten sopivia liuottimia ovat, niihin kuitenkin rajoittumatta, Ν,Ν-dimetyyliformamidi, metylee-nikloridl, tolueeni ja näiden kaltaiset liuottimet. Reaktio suoritetaan edullisesti lnertin atmosfäärin kuten ar-15 gonin tai typen suojaamana. Kytkeytyminen on tavallisesti päättynyt 2 tunnin kuluessa, mutta se voi kestää niinkin kauan kuin 24 tuntia reagensseista riippuen.

Haluttujen yhdisteiden valmistamiseen voidaan käyttää erilaisia muitakin menetelmiä. Seuraavassa kuvataan 20 sellaisia menetelmiä.

Esimerkiksi US-patenteissa 3 786 039, 3 833 553, 3 879 372 ja 3 933 781 kuvataan N-suojattujen asparagiini-happoanhydridien reaktio aminohappojen ja aminohappojohdannaisten kanssa, jolloin saadaan haluttuja tuotteita. 25 Näiden N-suojattujen asparagiinihappoanhydridien voidaan antaa reagoida kaavan lii mukaisten yhdisteiden kanssa edellä mainituissa patenteissa esitetyin menetelmin. Kuten US-patentissa 3 786 039 on selostettu, kaavan III mukaisten yhdisteiden voidaan antaa reagoida suoraan iner-30 teissä orgaanisissa liuottimissa L-asparagiinihappoanhyd- ridin kanssa, jonka aminoryhmä on suojattu formyyli-, kar-. . bobentsyylioksi- tai p-metoksikarbobentsyyliokslryhmällä, joka sitten kytkennän jälkeen poistetaan, jolloin saadaan yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä. N-asyyli-L-aspara-35 giinihappoanhydridejä valmistetaan antamalla vastaavien 8 88399 happojen reagoida etikkahappoanhydridin kanssa käyttämällä tätä 1,0 - 1,2 moolia moolia kohden N-asyyli-L-asparagii-nihappoa 0-60 eC:ssa inertissä liuottimessa. N-asyyli-asparagiinihappoanhydridien annetaan reagoida edullisesti 5 1-2 moolin kanssa kaavan III mukaisia yhdisteitä orgaa nisessa liuottimessa, joka pystyy liuottamaan molemmat ja on inertti niiden suhteen. Sopivia liuottimia ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, etyyliasetaatti, metyylipropio-naatti, tetrahydrofuraani, dioksaani, etyylieetteri, N,N-10 dimetyyliformamidl ja bentseeni. Reaktio tapahtuu sujuvasti 0 - 30 eC:ssa. N-asyyliryhmä poistetaan kytkennän jälkeen hydraamalla katalyyttisesti hiilellä olevan palladiumin avulla HBr:n tai HCl:n läsnä ollessa tavanomaiseen tapaan. US-patentissa 3 879 372 esitetään, että tämä kyt-15 kentämenetelmä voidaan suorittaa myös vesipitoisessa liuottimessa -10 - +50 *C:n lämpötilassa ja pH:n ollessa 4 - 12.

Vielä yksi menetelmä haluttujen yhdisteiden synte-soimiseksi on kaavan III mukaisten yhdisteiden reaktio 20 sopivien asparagiinihappojohdannaisten kanssa, joissa suo-jaavat ryhmät on liitetty amino- ja β-karboksiryhmiin ja α-karboksiryhmä on muutettu reaktiokykyiseksi esterifunktioksi. Kuten US-patentissa 3 475 403 on esitetty, suojaukset voidaan poistaa näistä kytkentätuotteista kuvatul-25 la tavalla, jolloin saadaan haluttuja kaavan I mukaisia yhdisteitä.

Vaihtoehtoiseen kaavioon haluttujen kytkentäyhdis-teiden saamiseksi sisältyy kaavan III mukaisten yhdisteiden reaktio L-asparagiinihappo-N-tiokarboksianhydridin 30 kanssa menetelmällä, jonka ovat esittäneet Vinick ja Jung, Tet. Lett. 23, 1315-18 (1982). Erästä kytkentämenetelmää on kuvannut lisäksi T. Miyazawa, Tet. Lett., 25, 771 (1984).

Yleisen kaavan III mukaisia yhdisteitä syntesoidaan 35 käyttämällä tunnettuja menetelmiä. Kaavan III mukaisia 9 88399 yhdisteitä voidaan syntetisoida esimerkiksi alalla tunnetuin tavanomaisin esteröintimenetelmin antamalla vapaan hapon tai sen happoa vastaavasti reagoivien johdannaisten, kuten esterien tai anhydridien, reagoida vastaavien alko-5 holien kanssa esterinmuodostusolosuhteissa, kuten esimerkiksi epäorgaanisten happojen, kuten kloorivetyhapon tai rikkihapon, tai orgaanisten happojen, kuten p-tolueensul-fonihappojen läsnä ollessa. Reaktiolämpötilat ovat -78 °C:n ja kiehumislämpötilan välisellä alueella. Reaktio 10 suoritetaan liuottimessa, Joka liuottaa molemmat reagens-sit ja on myös inertti kummankin suhteen. Liuottimia ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, metyleenikloridi, dietyy-lieetteri, tetrahydrofuraani, dimetyylisulfoksidi, N, N-dimetyyliformamidi, ja näiden kaltaiset liuottimet.

15 Mitä tulee suojaryhmien poistamiseen kaavan IV mu kaisista yhdisteistä ja N-suojatuista kaavan III mukaisten yhdisteiden esiasteista, alalla tunnetaan useita suojauk-senpoistomenetelmiä ja niitä voidaan käyttää edullisesti riippuen suojaryhmien luonteesta. Tällainen menetelmä on 20 esim. katalyyttinen hydraus hiilellä olevan palladiumin avulla tai siirtohydraus 1,4-sykloheksadieenin kanssa. Tavallisesti reaktio suoritetaan huoneenlämpötilassa, mutta se voidaan suorittaa välillä 5 - 65 eC. Tavallisesti reaktio suoritetaan sopivan liuottimen läsnäollessa, jona voi 25 olla, näihin rajoittumatta, vesi, metanoli, etanoli, diok-saani, tetrahydrofuraani, etikkahappo, t-butyylialkoholi, isopropanoli tai niiden seokset. Reaktio suoritetaan tavallisesti positiivisen 345 kPa:n (50 psi:n) vetypaineen alaisena, mutta voidaan suorittaa paineen ollessa rajois-30 sa 138 - 1724 kPa (20 - 250 psi). Reaktiot ovat yleensä kvantitatiivisia kestäen 1-24 tuntia tapahtuakseen täy- ···; dellisesti.

Kaikissa edellä esitetyissä synteettisissä menetelmissä halutut tuotteet otetaan edullisesti talteen reak-35 tioseoksista kiteyttämällä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyt- 10 88399 tää normaalia tai käänteisfaasikromatografiaa samoin kuin neste/nesteuuttamista tai multa keinoja.

Halutut kaavan I mukaiset yhdisteet saadaan tavallisesti vapaan hapon muodossa; niitä voidaan saada myös 5 fysiologisesti hyväksyttävinä suoloinaan eli vastaavina aminosuoloina, kuten hydrokloridi-, sulfaatti, vetysul-faatti-, nitraatti-, hydrobromidi-, hydrojodidi-, fosfaatti- tai vetyfosfaattisuoloina, tai alkalimetalllsuoloina, kuten natrium-, kalium- tai litiumsuoloina, tai maa-alka-10 limetallisuoloina, kuten kalsium- tai magnesiumsuoloina, samoin kuin aluminiumsuoloina, sinkkisuoloina ja näiden kaltaisina suoloina.

Kaavan 1 mukaisten vapaiden peptidijohdannaisten muuttaminen fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloikseen 15 suoritetaan tavanomaisin keinoin, kuten esimerkiksi saattamalla kaavan I mukaiset yhdisteet kosketuksiin epäorgaanisen hapon, alkalimetallihydroksidin, alkalimetallioksi-din tai -karbonaatin tai maa-alkalimetalllhydroksidln, -oksidin, -karbonaatin tai muun kompleksimuodon kanssa.

20 Näitä fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan myöskin käyttää makeutusaineina, näiden liukoisuuden ja stabiilisuuden ollessa tavallisesti parempi kuin vapaiden muotoj en.

Alan ammattimiehelle on selvää, että tämän keksin-25 nön mukaiset yhdisteet, joissa on asymmetrisiä hiiliatomeja, voivat esiintyä raseemisina tai optisesti aktiivisina muotoina.

Tämän keksinnön mukaisissa yhdisteissä on yksi asymmetrinen kohta, joka on merkitty tähdellä (*) alla 30 olevassa kaavassa, ja yksi pseudoasymmetrinen kohta, joka on merkitty kaksoistähdellä (**).

“ 88399

COOH

?H2

H-N-CH - CONH - C(A)CH-^ * I

5 C02-^3(+)-fenkyyli

Kaikki stereokemialliset konflguraatiot sisältyvät edellä esitetyn kaavan piiriin. Tämä keksintö kohdistuu kuitenkin vain yhdisteisiin, joiden kaava on: 10 - H-N - CH - CONH - C(A)CH3 2 l I „ CH2 C02-yö ( + )-fenkyyli

COOH

jossa dlkarboksyylihapporyhmä on L-konfiguraatiossa kuten 15 on osoitettu kaavassa I ja A:n ollessa H, pseudoasymmet-riakeskus on D-muodossa.

Kaavan l mukaisia yhdisteitä valmistettaessa, L,L-diastereomeerl, vaikkakaan itse ei ole makea, voi olla seoksena L,D-stereoisomeerin kanssa. L,L- ja L,D-stereo-20 isomeeriseoksessa ilmenee makeutta, mutta mainittu seos ei ole yhtä makea kuin L,D-stereoisomeeri puhtaassa muodossaan .

Seuraavat esimerkit valaisevat edelleen keksintöä. Seuraavissa esimerkeissä makuarvio saatiin asiantuntija-25 lautakunnalta käyttämällä tunnetun painoprosenttisla esi- merkkiyhdistelden vesiliuoksia, joita verrattiin sakkaroosin standardiliuoksiin.

Esimerkki 1 a-L-aspartyyli-2-metyylialaniini- [β( +)-fenkyyli]-30 esteri N-CBZ-suojattua aminoisovoihappoa (Chemical Dynamics, Inc) liuotettiin 1,2-dikloorietaaniin (50 ml) 0° C:ssa argonin suojaamana. Lisättiin liuos, jossa oli N,N-dimetyyliaminopyrldiiniä (0,5 ekvivalenttia) ja B(+)-fen-35 kyyllalkoholia (1 ekvivalentti) 1,2-dikloorietaanissa (10 12 88399 ml). Lopuksi lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (1,1 ekvivalenttia) kiinteänä aineena. Viiden päivän sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa urea poistettiin suodattamalla ja suodos laimennettiin petrolieetterillä (50 5 ml). Liuos selkeytettiin jälleen suodattamalla ja suodos klertohaihdutettiin korkeavakuumissa pastaksi. Kromato-grafoimalla pylväässä silikageelillä petrolieetteri/etyy-liasetaattiseoksella 15:1 saatiin puhdasta tuotetta 75 -79 %:n saannoin valkeana kiteisenä kiinteänä aineena.

10 NMR (CDC13): 6 0,90 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,10 (s, 3H), 1.20- 1,80 (m, 7H), 1,60 (s, 6H), 4,20 (s, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,55 (s, 1H), 7,40 (s, 5H).

[a] p5 - -ll,65e (MeOH), sp. 83 - 85 eC.

Edellä saadusta esteristä poistettiin suojaus ta-15 valliseen tapaan hydraamalla hiilellä olevan palladiumin (10 %) avulla metanolissa. Jolloin saatiin kvantitatiivisin saannoin vapaata aminoesteriä.

Amiini liuotettiin heti DMF:iin ja kytkettiin aspa-ragiinihappo-esiasteeseen kuparit II)kloridi-menetelmällä, 20 jolloin saatiin 90 %:n saannoin N-CBZa-L-asparagiinihap-po-8-bentsyyliesteri-a2-metyylialaniini-[8( + )-f enkyyli] esteriä.

NMR (CDCI3): δ 0,90 (S, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,10 (s, 3H), 1.20- 1,80 (m, 7H), 1,6 (d, 6H), 2,70-3,15 (m, 2H), 4,1- 25 4,2 (m, 1H), 4,20 (s, 1H), 4,60 (s, 1H), 5,10 (s, 4H), 5,60 (d, 1H), 5,90 (d, 1H), 5,90 (d, 1H), 7,40 (s, 10H).

Tuotteesta poistettiin suojaus hydraamalla ja se puhdistettiin Rp C18-pylväskromatografialla käyttäen eluenttina metanoli/vesiseosta 85:15.

30 [a] p5= -3,30* (MeOH), sp. 121,3 *C.

Makeuden määritys tämän yhdisteen osalta antoi seuraavat tulokset:

Konsentraatio Sakkaroosiekvivalenssi Makeus suhteessa sakkaroosiin (x sakkaroosi) 13 88399 0,00750 8,5% 1133 5 0,00375 6,0% 1600 0,00185 5,7% 3100 0,00692 3,5% 3800 0,0025 6,0% 2400 0,0025 4,3% 1733 10 0^ 0025 4,25% 1700 0,005 7,37% 1475 0,005 7,0% 1400 0,005 6,0% 1200 0,01 9,25% 925 15 0,01 9,0% 900

Esimerkki 2 α-L-aspartyyli-D-alaniini-[β(+)-fenkyyli]esteri A. ekso-B-(+)-fenkoli

Kiehuvaan suspensioon, jossa oli 72,65 g aluminium-20 lsopropoksidia 300 ml:ssa vastatislattua isopropyylialko-holia, lisättiin tiputtamalla 27,1 g R-(-)-fenkonia 50 ml:ssa isopropanolia. Reaktio keskeytettiin kuuden päivän kuluttua, jolloin kaasukromatografialla (Carbowax 20 M) määritettiin, että enemmän kuin 50 % ketonista oli pelkis-25 tynyt. Kapillaarikromatografiällä (Supelcowax 10) määritettiin myös, että ekso/endosuhde fenkolin osalta oli 3/1. Jäähdyttämisen jälkeen seos suodatettiin ja pestiin perusteellisesti dikloorimetaanilla. Sakka liuotettiin 5-pro-senttiseen HCl:ään (100 ml) ja uutettiin dikloorimetaa-- 30 nilla (50 ml). Yhdistetyt dikloorimetaanlliuokset pestiin 5-prosenttisella HCl:llä (50 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (50 ml) ja vedellä (50 ml) ja kuivattiin MgS04:lla. Suodattamalla ja poistamalla liuotin saatiin 23,44 g öljyä, jossa oli 40 % reagoimatonta fenkonia ja 60 % a- ja 8-fenko-35 li-isomeerejä.

14 8 8 399

Seosta, jossa oli 12 g (0,78 moolia) B- ja a-fen-koleja, 11,9 ml (1,1 ekv) trietyyliamiinia ja 15,9 g p-nitrobentsoyylikloridla (1,1 g) 500 ml:ssa kuivaa dikloo-rimetaania, refluksoitiin 24 tuntia, β/α-esterien seos 5 erotettiin flash-kromatografoimalla silikageelillä käyttäen eluenttina heksaani/etyyliasetaatti-seosta (40:1). Eristettiin 6,0 g ekso-fenkyyli-para-nitrobentsoaattia; [o] “ -17,1* (bentseenissä). 3 g fenkolia (9/1; B/a) saatiin hydrolysoimalla emäksellä nitrobentsoaattiesteriä 10 (refluksoimalla NaOH-ylimäärän kanssa metanolissa). B-(+)- fenkoli; [a]” - +23,4* (puhdas); NMR: δ 0,95-1,8 (16H, m, CH2, CH3); 3,0 ppm (1H, s, CH-0).

B. N-Cbz-D-alaniinin B-(+)-fenkyyliesteri

Sekoitettuun liuokseen, jossa oli 1,3 g B(+)-fen- 15 kolia 20 ml:ssa kuivaa dikloorimetaania, lisättiin 1,9 g (0,0084 moolia) N-Cbz-D-alaniinia, ja liuos jäähdytettiin 0 °C:seen. Sitten lisättiin 0,113 g p-dimetyyliaminopyri-diiniä ja 1,91 g disykloheksyylikarbodi-imldiä. 24 tunnin kuluttua reaktio keskeytettiin ja suodatettiin. Liuotin 20 haihdutettiin pois ja öljymäinen jäännös liuotettiin di-etyylieetteriin, pestiin 5-prosenttisella HCl:llä (25 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (25 ml), vedellä (25 ml) ja kuivattiin MgS04:lla. Suodattamisen ja liuottimen haihduttamisen jälkeen tuote puhdistettiin silikageelillä kromato-25 grafoimalla, jolloin saatiin 1,86 g N-Cbz-D-alaniinin B-( + )-fenkyyliesteriä; [a]” +3,86°.

NMR: 6 0,8-1,8 ppm (19H, m, CH2, CH3), 4,2 ppm (1H, s, CH-0); 4,4 ppm (1H, m, CH-C); 5,1 ppm (2H, s, CH2-Ph), 0 30 5,4 ppm (1H, d, NH), 7,4 ppm (5H, s, Ph).

C. D-alaniinin B-fenkyyliesteri N-Cbz-D-alaniinin B-(+)-fenkyyliesteriä (1,86 g) liuotettiin 50 ml:aan metanolla ja hydrattiin 0,1 grammalla 5-%:lsen Pd/C-katalyytin (0,1 g) avulla Paar-ravis-35 timessa. 2 tunnin kuluttua reaktio oli päättynyt; suoda- is 88399 tettiln Cellte*n läpi, pestiin etanolilla, haihdutettiin kuiviin ja kiteytynyt jäännös liuotettiin dikloorimetaa-niln.

D. N-Cbz-B-bentsyyli-L-aspartyyli-D-alaniinin B- 5 (+)-fenkyyliesteri

Dikloorimetaaniliuokseen, jossa oli D-alaniinieste-ri (0,00355 moolia), lisättiin ekvimoolimäärä B-bentsyyli-N-Cbz-L-asparagiinihappoa (1,27 g) ja 0,526 g Cu(II)Cl2:a. CuCl2:n liuettua lisättiin DCC:tä (0,81 g). 24 [tunnin ku-10 luttua reaktio oli päättynyt, urea suodatettiin erilleen ja liuotin haihdutettiin pois. Keltainen öljy liuotettiin dietyylieetteriin (25 ml) ja pestiin 5-prosenttisella HClrllä (25 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (25 ml) ja H20:lla (25 ml). Eetterikerros kuivattiin MgS04:lla ja 15 haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 0,95 g tuotetta. NMR: 6 0,85-1,80 (19H, m, CH2, CH3), 4,2 ppm (1H, s, CH-0); 4,5-4,7 ppm (2H, m, N-CH-C), 5,1 ppm (4H, s,

O

5,95 ppm (1H, d, NH), 7,05 ppm (1H, d, NH), 7,4 ppm (10H, 20 s, Ph).

E. α-L-aspartyyli-D-alaniinin B-(+)-fenkyyli-esteri 0,95 g suojattua dipeptidiä liuotettiin 50 ml:aan metanolia, johon oli lisätty 0,1 g 10-%:ista Pd/C-kata-lyyttiä. Seosta hydrattiin Paar-ravistimessa 2 tuntia. 25 Liuos suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saa tiin 0,194g kiinteätä ainetta; [a]„5- -0,867°.

Tuote puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:n avulla (85 % metanoli/vesiseoksella), jolloin saatiin 75 mg L-aspar-tyyli-D-alaniinin B-(+)-fenkyyliesteriä.

30 NMR: δ 0,8-1,8 (19H, m, CH2, CH3); 2,3-2,4 ppm (2H, m, 0

K

CH2-C); 4,2 ppm (1H, s, OCH), 4,5 ppm (2H, m, N-CH), 8,8 ppm (1H, s, NH-C).

0 ie 88399

Makeuden määritys tämän yhdisteen osalta antoi seuraavat tulokset:

Konsentraatio Sakkaroosiekvivalenssi Makeus suhteessa sakkaroosiin 5 (x sakkaroosi) 0,00012 0,6% 5000 0,00024 1,42% 5900 0,00047 2,28% 4900 0,00092 4,7% 5100 10 0,00185 6,5% 3500 0,0025 6,0% 2400 0,00375 8,6% 2300 0,005 9,3% 1860 0,005 10,0% 2000 15 0,0075 9,0% 1200 0,01 11,0% 1100 Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden makeus on suurempi ja stabiilisuus parempi verrattuna aikaisemmin tunnettui-20 vastaaviin estereihin.

Esimerkki 3 a-L-aspartyyli-2-metyylialaniini-[β( +)-fenkyyli] -esterin (esimerkki 1), a-L-aspartyyli-D-alaniini-[e(+)-fenkyyli]esterin (esimerkki 2) ja aspartaamin (L-aspartyy-25 li-L-fenyylialaniinimetyyliesterin) stabiilisuutta tutkittiin pH-arvoissa 3, 5 ja 7 puskuriliuoksissa, joita pidettiin 50 *C:ssa, 75 *C:ssa tai 100 °C:ssa, jolloin saatiin seuraavia tuloksia:

Puoliintumisaika, tunteja 30 100 ec:ssa pH 3 pH 5 pH 7

Esimerkki 1 8,4 33 67

Esimerkki 2 3,9 14 10

Aspartaami 5,3 5,3 <<1 17 88399

Puoliintumisaika, vuorokausia 75 °C:ssa pH 3 pH 5

Esimerkki 1 3,0 15,0

Esimerkki 2 1,3 5,1 5 Aspartaami 0,9 1,1

Puoliintumisaika, vuorokausia 50 *C:ssa pH 3 pH 5

Esimerkki 1 64 150

Esimerkki 2 22 131 10 Esimerkin 1 ja esimerkin 2 makeutusaineiden stabii lisuus on erinomainen puskuroiduissa liuoksissa pH-arvois-sa 3, 5 ja 7. Esimerkin 1 ja esimerkin 2 yhdisteiden stabiilisuus on parempi tutkituissa puskuroiduissa liuoksissa kuin aspartaamin stabiilisuus, paitsi tapauksessa pH 3, 15 10 °C, jolloin aspartaamin stabiilisuus on esimerkin 1 ja esimerkin 2 yhdisteiden stabiilisuuden välillä. Esimerkin 1 yhdiste on stabiilimpi kuin esimerkin 2 yhdiste. Esimerkin 1 yhdisteen puoliintumisaika on 2-3 kertaa pitempi puskuroiduissa liuoksissa 75 °C:ssa ja 100 °C:ssa pH-ar-20 voissa 5 kuin esimerkin 2 yhdisteen puoliintumisaika. Esimerkin 1 yhdisteen puoliintumisaika puskuroidussa liuoksessa 50 0C:sea ja pH-arvossa 5 on noin 1,1 - 2,9 kertaa pitempi kuin esimerkin 2 yhdisteen puoliintumisaika.

Claims (8)

1. L-aminodikarboksyylihappoesteri, jolla on kaava (I)

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, joka on 15 α-L-aspartyyli-D-alaniini-[B(+)-fenkyyli]esteri.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, joka on a-L-aspartyyli-2-metyylialaniini-[β(+)-fenkyyli]esteri.

4. Makeutusaineena käyttökelpoinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa 20 patenttivaatimuksen 1-3 mukaista yhdistettä.

5 COOB jossa Z on aminon suojaryhmä ja B on karboksyylin suoja-ryhmä, tai sen johdannainen saatetaan reagoimaan amiinin kanssa, jolla on kaava (III)

10 NH2-C(A)CH3 C02~fi (+)-fenkyyli (III) jossa λ merkitsee samaa kuin edellä, amidin muodostumis-olosuhteissa ja mahdollisesti poistetaan suojaryhmät, 15 milloin niitä on läsnä, ja mahdollisesti muodostetaan saadun yhdisteen fysiologisesti hyväksyttävä suola.

5. Menetelmä nautittavaksi kelpaavan koostumuksen makeuttamiseksi, tunnettu siitä, että nautittavaksi kelpaavaan koostumukseen lisätään patenttivaatimuksen 1 mukaista yhdistettä.

5 L ** h2n-ch-conh-c(A)ch3 CU2 C02-/3 (+) —fenkyyli (I) co2H ja sen ravintoaineissa köytettäviksi hyväksyttävät suolat, 10 jossa kaavassa A on vety tai metyyli, edellyttäen, että kun kaksoistähdellä merkitty hiili on asymmetrinen tai kiraalinen keskus, konfiguraatio mainitun hiilen ympärillä on D-muodossa.

6. Menetelmä kaavan (1) L h2n-ch-conh-c(A)ch3 CH2 C02—(+)—fenkyyli co2h 30 mukaisen yhdisteen ja sen ravintoaineissa käytettäviksi hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa A on vety tai metyyli, tunnettu siitä, että karbok-syylihappo, jolla on kaava (II) ie 88399 u Z-N-CH-COOH (11) CH2

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu yhdiste on a-L-aspartyyli-D-alaniini-[B(+)-fenkyyli]esteri.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettu yhdiste on a-L-aspartyyli-2-metyylialaniini-[β(+)-fenkyyli]esteri. 20 8 8 399