FI87532C - Monoklonala antikroppar mot metallkelat - Google Patents

Description

! 87532

Monoklonaalisia vasta-aineita metallikelaatteja vastaan

Keksinnön ala Tämä keksintö koskee menetelmää monoklonaalisen 5 vasta-aineen valmistamiseksi, joka on spesifinen metalli-kompleksille, sekä menetelmää metalli-ionin osoittamiseksi nesteestä mainitulla vasta-aineella.

Tausta

Monoklonaalisista vasta-aineista on tulossa lisään-10 tyvässä määrin tärkeitä välineitä sairauksien tai muiden fyysisten tilojen diagnostisoinnissa tai hoidossa. Niillä on myös lupaavia teollisia sovellutuksia esimerkiksi puhdistettaessa kaupallisesti arvokkaita materiaaleja, jotka esiintyvät seoksissa ja joita on vaikea eristää muuten 15 kuin affiniteettipuhdistuksella.

Näissä sovellutuksissa vasta-aine valitaan antigeenin sitomiskykynsä perusteella. Tietyissä sovellutuksissa vasta-ainetta voidaan käyttää sitä modifioimatta. Esimerkiksi passiivisissa hoitokäsittelyissä vasta-ainetta käy-20 tetään modifioimatta. Useimmissa sovellutuksissa, mukaan lukien sellaiset sovellutukset, joilla on eniten ajankoh-: : täistä kaupallista merkitystä, käytetään kuitenkin jolla kin lailla modifioitua vasta-ainetta. Siten vasta-aineet ____ voidaan sitoa kiinteään faasiin ja käyttää immunoadsor- 25 benttina affiniteettipuhdistuksessa tai immunologisissa määritysmenetelmissä.

Muissa sovellutuksissa vasta-aine voidaan leimata esimerkiksi radioaktiivisella isotoopilla antigeenin osoittamiseksi diagnostisissa määritysmenetelmissä tai in 30 vivo -kuvantamisessa. Radioaktiivisella isotoopilla, lääkeaineella tai solumyrkyllä leimatulla vasta-aineella voi olla hoitosovellutuksia.

Monoklonaalisten vasta-aineiden leimauksen tekee monimutkaiseksi se, että jokaisella tällaisella vasta-ai-35 neella, koskapa se on erillinen kemiallinen yhdiste, on 2 87532 omat leimautumisominaisuutensa. Siksi taito leimata tehokkaasti ja yksinkertaisesti on erittäin toivottua.

Tämä huomioon ottaen tarkoituksemme on leimata mo-noklonaalisia vasta-aineita radioaktiivisilla metalli-iso-5 toopeilla metallia kelatoivaa ainetta käyttäen. Kelatoiva aine liitetään ensin haluttuun monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Koska sama kelatoiva aine voi sitoa useita eri metalleja, on vain tarpeellista suunnitella sellainen kemiallinen työjärjestys, jolla saadaan vasta-aineen opti-10 maalinen sitoutuminen kelatoivaan aineeseen, jotta vasta-aine voidaan leimata millä tahansa niistä monista radioaktiivisista isotoopeista, joita kelatoiva aine sitoo. Vaikka tämä menetelmä on suuresti yksinkertaistanut monoklo-naalisten vasta-aineiden leimaamista radioaktiivisella 15 isotoopilla, on kuitenkin tarpeen määrittää optimaaliset sitoutumisolosuhteet jokaiselle vasta-aine-kelatoiva aine -yhdistelmälle.

Keksinnön yhteenveto

Olemme havainneet, että on mahdollista saada sel-20 laisia monoklonaalisia vasta-aineita, joilla yllättäen on kyky sitoutua ensisijaisesti kelatoivan aineen ja tietyn metallin muodostamaan kompleksiin verrattuna sen kykyyn ' sitoutua joko pelkkään kelatoivaan aineeseen tai kelatoi- — van aineen ja jonkin muun metallin muodostamaan komplek- ____:25 siin. Esimerkiksi olemme onnistuneet saamaan monoklonaali- sen vasta-aineen käyttämällä immunogeeninä tulivuorikoti-loiden hemosyaniinin sitoutunutta In(III):n ja L-amino-bentsyylietyleenidiamiinitetraetikkahapon (aminobentsyy-li-EDTA) muodostamaa kelaattikompleksia ja tämän vasta-30 aineen affiniteetti In(III)-kelaattikompleksiin (KA) on suurempi kuin 109 M'1. Vertailun vuoksi mainittakoon, että vasta-aineen affiniteetti muihin L-aminobentsyyli-EDTA-. metallikomplekseihin on oleellisesti pienempi (KA = 108 M"1 tai vähemmän).

35 Vasta-aineet, joilla on tällainen kelaattikomplek- ...· sispesifisyys, ovat hyödyllisiä radioaktiivisten isotoop- li 3 87532 pien liittämisessä vasta-aineisiin, hivenainemetalleja puhdistettaessa sekä muissa tässä myöhemmin kuvatuissa sovellutuksissa.

Keksinnön mukaisille menetelmille on tunnusomaista 5 se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Kuten yllä on mainittu tämä keksintö liittyy mono-klonaalisiin vasta-aineisiin, jotka ovat spesifisiä kela-toivan aineen ja tietyn metallin muodostamalle kompleksille) le verrattuna pelkkään kelatoivaan aineeseen tai aineen muihin metallikomplekseihin. Tässä käytettynä monoklonaa-lisen vasta-aineen katsotaan olevan spesifinen tietyn metallin ja kelatoivan aineen muodostamalle kompleksille silloin, kun vasta-aineen ja kompleksin välinen sitoutu-15 misvakio (KA) on kertaluokkaa (kymmenen kertaa) suurempi kuin vasta-aineen KA pelkästään kelatoivalle aineelle tai kelatoivan aineen ja jonkin toisen metallin muodostamalle kompleksille. Keksinnössä käyttökelpoiset kelatoivat aineet on julkaistu Adams et al.:n FI-patentissa 82379 ja 20 tämä julkaisu on liitetty viitteeksi. Seuraavat kokeet kuvaavat tätä keksintöä ja niissä käytetään L-aminobent-syyli-EDTA:n In(III)-kelaattia hapteenina.

Esimerkki I

In(III):n ja L-aminobentsyyli-EDTA:n muodostaman .... 25 kompleksin valmistus

Tulivuorikotiloiden hemosyaniinin (9,3 mg) annettiin reagoida 265 pl:ssa vesipitoista liuosta (pH 9) L-SCN-C6H4CH2-EDTA:n kanssa 36 °C:ssa 8 tuntia. Saatu liuos sekoitettiin 90 pl:aan 0,1 mol/1 indiumsitraattia ja seos-'30 ta dialysoitiin 1 mmol/1 EDTA:ta 0,15 mol/1 NaCl:ssa vastaan. Tiourearyhmän absorbanssin avulla 310 nm:ssa määritettiin, että liuoksessa oli noin 0,1 mg kiinnittynyttä kelaattia mg proteiinia kohti.

35 4 87532

Esimerkki II

Monoklonaalinen vasta-ainevalmiste Vasta-ainetta tuottavat hybridoomasolulinjat valmistettiin seuraavasti. Yllä kuvatulla antigeenillä useaan 5 kertaan immunisoitujen BALB/c-hiirien pernasolut yhdistettiin P3653-myelooma-solulinjan variantin kanssa. Katso Gerhard, Monoclonal Antibodies, toim. Kennett ja hänen työtoverinsa, Plenum Press, New York (1980). Saadut hybri-doomat seulottiin radioimmunologisella määritysmenetel-10 mällä, jossa käytettiin kiinteään faasiin sidottua toista vasta-ainetta, niiden In(III)-aminobentsyyli-EDTA -kompleksin sitomiskyvyn selville saamiseksi (Wang ja hänen työtoverinsa, Journal of Immunological Methods, 18 (1977) 157). Korkeiden tiittereidensä ja suhteellisen korkean 15 sitomiskykynsä, joka määritettiin inhiboimalla sitoutumista leimaamattomalla antigeenillä, perusteella valittiin jatkotutkimuksiin kaksi vasta-ainetta, jotka olemme nimenneet CHA255:ksi ja CHB235:ksi, ja niitä ruiskutettiin BALB/c-hiirien vatsaonteloon askitesnesteen tuottamiseksi. 20 Monoklonaaliset vasta-aineet puhdistettiin hiiren askites-nesteestä ioninvaihtokromatografisesti DEAE-selluloosaa : : käyttäen, kuten Parham ja hänen työtoverinsa ovat kuvan- | neet, J. Immunol. Meth., 53 ( 1982) 133.

.... Esimerkki III

____:25 Assosiaatiovakioiden määritys

Alla olevassa taulukossa julkaistaan esimerkissä II kuvattujen kahden monoklonaalisen vasta-aineen assosiaa-' tiovakiot useille kelaateille. Kohdassa A esitetään vasta- aineiden suhteelliset sitoutumiskyvyt In(III):n ja muiden '-30 ionien aminobentsyyli-EDTA -komplekseihin. Kohdassa B on · esitetty vasta-aineiden sitoutumisvakiot In(III):n komp- lekseille muiden kelatoivien aineiden kanssa. Vertailuun valitut metallit olivat kolmiarvoisia ioneja, jotka ovat samantapaisia kuin In(III), ja kaksiarvoisia ioneja, joi-: 35 den EDTA-kompleksit ovat rakenteellisesti samantapaisia ·... kuin In-EDTA -kompleksi. Kelaattien sitoutumisvakiot mää- 5 87532 ritettiin Eisenin menetelmällä, Meth. Med. Res. 10 (1964) 106, dialysoimalla vasta-aine ja metallikelaatit lähes tasapainoon (24 h) 37 °C:ssa liuoksessa, joka sisälsi 0,05 mol/1 2-hydroksietyylipiperatsiinietaanisulfonaat-5 tia, 0,1 mol/1 NaCl:a, 0,1 % NaN3: a ja 0,1 % naudan seerumin albumiinia ja jonka pH oli 7. Dialyysipussin sisäinen vasta-aineen sitoutumispaikkojen pitoisuus oli 10~7 mol/1 ja vapaan In(III)-L-aminobentsyyli-EDTA:n pitoisuus oli samaa suuruusluokkaa.

10 Tunnettuja määriä toista kelaattia lisättiin liuok seen, kun se oli tasapainossa, kunnes noin puolet tasapainossa sitoutuneista indiumkelaateista oli syrjäytetty.

Taulukko 1

Metallikelaattien suhteelliset ominaisuudet 15 A. L-bentsyyli-EDTA:n eri metallien kanssa muodos tamat kelaatit

Metallit log KEDTA(M) KCHA255 WCHB235

Ionisäde K

20 _<™"> 5_* A

In(III) 0,081 25,0 4,0 x 10^(±6,9%) 1,1 χ 108(±7,9%)

Sctni) 0,081 23,1 3,0 x 106(±13%) 4,6 x 104(±39%)

Fe(111) 0,064 25,1 1,8 x 108(±13%) 2,4 x 106(±18%)

Ga(III) 0,062 20,3 4,8 x 105(±45%) 5,2 x 104(±16%) 25 Tb(III) 0,100 17,9 1,2 x 106(±12%) 2,7 x 104(±15%)

Yb(IXI) 0,094 19,5 1,1 x 106(±20%) 2 x 104(±90%) - : Mn(II) 0,080 13,9 2,8 x 106(±9,1%) 2,8 x 104(±24%)

Co(II) 0,074 16,3 1,9 x 108(±37) 9,4 x 104(±22%)

Co(III) 0,063 41,4 8,3 x 105(±60%) <1 x io4 30 Cu(II) 0,069 18,8 1,7 x 106(±12%) 8,1 x 104(±11%)

Zn(II) 0,074 16,5 1,4 x 108(±14%) 3,5 x 104(±27%)

Cd(II) 0,097 16,5 1,5 x 107(±8%) 1,6 x 105(±8,1%) 6 87532 B. Indium eri kelatoivien aineiden kanssa muodostamat kelaatit

Kelatoiva aine KCHA255 kcha235 ___A____A_ 5 L-bentsyyli-EDTA 4,0 x 109 (+6,9%) 1,1 x 10® (±7,9%) D-bentsyyli-EDTA 6,3 x 107 (±40 %) 3,6 x 107 (±9,3%) EDTA 1,7 x 10® (±8,3%) 1,3 x 10® (±13%) HED3A 4,2 x 107 (±12%) 4,0 x 107 (±14%) 10 Taulukko l:n selitys: A: Pylväs 1, metallit, joiden L-bentsyyli-EDTA-ke-laatit kokeiltiin indiumkelaattia vastaan. Pylväs 2, jokaisen metallin ionisäde nanometreinä Paulingin mukaan, The Nature of the Chemical Bond, (3. painos, Cornell Uni-15 versity Press (1960)). Pylväs 3, jokaisen metalli-EDTA-kompleksin pysyvyysvakion logaritmi. (Katso Stability Constants of Metal Ion Complexes, L.G. Sillen ja A.E. Mar-tell, toim., Chemical Society, Lontoo, 1964; Critical Stability Constants, A.E. Martell ja R.M. Smith, toim., Ple-20 num, New York, 1974). Pylväät 4 ja 5, jokaisen metalli-L-bentsyyli-EDTA-kelaatin vasta-aineeseen sitoutumisvakiot - : tutkituille kahdelle eri monoklonaaliselle vasta-aineelle.

: Jokaisen mittauksen vaihtelukerroin on annettu suluissa.

B. Pylväs 1, indium-kelaattien muodostamisessa käytetyt ____: 25 eri kelatoivat aineet. Pylväät 2 ja 3, jokaisen indium- kelaatin vasta-aineeseen sitoutumisvakiot.

V'. Taulukon 1 kohdan A asiatiedot osoittavat, että metallin vaihtaminen kelaattikompleksissa saattaa johtaa KA:n pienenemiseen jopa neljällä (4) kertaluvulla. Vaikka :30 emme haluakaan sitoutua mihinkään tiettyyn teoriaan, us- - ‘ komme, että vasta-aineen osoittama spesifisyys johtuu to- dennäköisesti metallin ja vasta-aineen välisestä suorasta .··*. vuorovaikutuksesta.

- Vasta-aineen kyky tunnistaa tietyn ionin kelaatti- 35 kompleksi suhteessa kelatoivan aineen ja jonkin toisen ionin muodostamaan kompleksiin sallii metalli-ionien 7 87532 osoittamisen ja/tai eristämisen muita metalleja sisältävistä liuoksista silloin, kun haluttu metalli muodostaa kelaatin. Esimerkiksi veden, lääkeaineiden tai biologisten nesteiden hivenainemetalli-määritys voidaan suorittaa im-5 munologisella määritysmenetelmällä. Tämän saavuttamiseksi kiinteään faasiin sidottua kelatoivaa ainetta (esim. poly-styreeniin, sepharoosiin, polyakryyliamidiin kovalentti-sesti sidottua aminobentsyyli-EDTA:ta) voitaisiin käyttää ionin uuttamiseksi kyseenä olevasta nesteestä, jonka jäl-10 keen sitten, kun neste on erotettu, kiinteää faasia inku-boidaan tavalliseen tapaan liuoksessa, joka sisältää ke-laatti-metalli-ioni-kompleksia vastaan tuotettua vasta-ainetta, joka on leimattu entsyymillä tai muulla aineella, jonka avulla leimattu vasta-aine voidaan osoittaa. Radio-15 aktiivisia leimoja, fluoresoivia leimoja ja muita leimoja, jotka soveltuvat immunologisiin määritysmenetelmiin, voidaan myös käyttää entsyymin sijasta. Sitoutumattoman vasta-aineen erottamisen jälkeen kelatoivaan aineeseen sidotun leimatun vasta-aineen läsnäolo osoittaa sen läsnäolon 20 nestenäytteessä. Joko sidotun tai vapaan vasta-aineen osoittamista ja sen määrän mittaamista voidaan käyttää nestenäytteessä olevan ionin määrän määrittämiseksi.

' ' ] Metallit voidaan valikoiden poistaa nesteestä li- ;··: säämällä kelatoivaa ainetta nesteeseen, jonka jälkeen 25 uutetaan kiinteään faasiin sidotulla vasta-aineella.

- .*. Bifunktionaalinen vasta-aine, joka on saatu poly- doomasta tai jollakin toisella tavalla, kuten Martinis et ai.'n WO-patenttihakemuksessa 8 303 679 on kuvattu ja joka . . on liitetty viitteeksi, ja jolla on yksi spesifisyys me- ; 30 tallin ja kelatoivan aineen muodostamalle kompleksille ja toinen spesifisyys toiselle antigeenille, on käyttökelpoi-: nen. Esimerkiksi tällaista bifunktionaalista vasta-ainet ta, jonka toinen spesifisyys kohdistuu kasvaimeen liitty-. . vään antigeeniin, voidaan käyttää in vivo kasvaimen kuvan- ; 35 tamisessa tai hoidossa liittämällä radioaktiivinen iso tooppi kelaattiin. Tällaisissa hoidoissa bifunktionaalinen 8 87532 vasta-aine annetaan infuusiona ja sen annetaan paikallistaa kasvaimen paikka, jossa sen tunnistama kasvaimeen liittyvä antigeeni sijaitsee. Radioaktiivinen isotooppi-kelaatti -kompleksi annetaan verenkiertoon myöhemmin. Esi-5 merkiksi haluttaessa kuvata kasvain radioaktiivinen isotooppi valitaan edullisesti sen lähettämän säteilyn perusteella, joka on tyypillisesti ^-fotoni, ja joka voidaan havaita photoscanning-menetelmillä. Jos halutaan käsitellä kasvainta sen koon pienentämiseksi, radioaktiivinen iso-10 tooppi on edullisesti elektroni- tai alfahiukkassäteilijä. Sen jälkeen kun toinen kelaatin infuusio on tehty, kompleksi, joka ei sitoudu bifunktionaaliseen vasta-aineeseen, koska se on pieni molekyyli, voidaan nopeasti puhdistaa kehosta, jolloin kasvainta sisältämättömän kudoksen 15 vaurioitumisen mahdollisuus pienenee.

Kasvaimeen liittyvät antigeenit, joita vastaan bi-funktionaalinen vasta-aine voidaan kohdistaa, sisältävät alfaproteiinin, karsinoembryonaalisen antigeenin, ihmisen korionganodotropiinin, eturauhasen happaman fosfataasin ja 20 eturauhasspesifisen antigeenin mutta eivät rajoitu niihin. Käyttökelpoisista J^säteilijöistä mIn on edullinen. Käyt-: t tökelpoisista elektronisäteilijöistä 90Y on edullinen.

• Vasta-aineen kyky tunnistaa radioaktiivisen iso- toopin kelaattikompleksi vähentää tarvetta kehittää komp- ____· 25 lekseja, joissa käytetään useita kelatoivia aineita moni- ionihoitoa varten. Siten voidaan helposti kehittää vasta--’ aineita, jotka erottavat sellaiset kelaattikompleksit, joissa radioaktiiviset isotoopit poikkeavat toisistaan mutta joissa kelatoiva aine on sama.

- 30 Toisessa sovellutuksessa bifunktionaalinen vasta- ' aine, jonka yksi spesifisyys kohdistuu metallikelaattiin ja toinen kasvaimeen liittyvään antigeeniin, voidaan antaa infuusiona ja antaa sen paikallistaa kasvaimeen liittyvä antigeenin paikka. Solumyrkky tai lääkeaine, johon on lii-35 tetty metallikelaatti, voidaan sen jälkeen antaa verenkiertoon, jolloin vasta-aine kasvaimen kohdassa sitoo sen.

9 87532 Tässä sovellutuksessa, jos metalli on radioaktiivinen isotooppi, joka hajotessaan muuttaa atomilukuaan, jolloin siitä syntyy metalli, jonka kelaatti ei sitoudu tiukasti vasta-aineeseen, tämä tarkoittaa sitä, että hajoamistuot-5 teen kelaatin KA on pienempi kuin noin 1 x 107 M'1 tai edullisesti pienempi kuin 1 x 106 M'1, kelaatti ja siihen liit-tynyt lääkeaine tai solumyrkky irtoavat vasta-aineesta kasvainsolun läheisyydessä, jolloin sen pääsy soluun helpottuu. Tällaisessa tapauksessa radioaktiivinen isotooppi 10 valitaan siten, että sen puoliintumisaika on sellainen, että se varmistaa, ettei irtipääsy tapahdu liian aikaisin eikä liian pitkän ajan kuluessa.

Tämä vasta-aineen kyky tunnistaa kelaattikomplek-seja sallii useiden lääkeaineiden käytön saman vasta-ai-15 neen kanssa yksinkertaisesti liittämällä ne samaan vasta-aineeseen, jolloin menetelmä sellaisten bifunktionaalisten vasta-aineiden paneelin saamiseksi, joilla vasta-aineilla on spesifisyys sairauteen liittyvää antigeeniä kohtaan ja toinen spesifisyys solumyrkylle tai lääkeaineelle, suures-20 ti yksinkertaistuu, koska samaa kelatoivaa ainetta voidaan käyttää solumyrkkyjen tai lääkeaineiden liittämisessä.

Alan asiantuntijoille on itsestään selvää, vaikka- • : : kaan yllä oleva kuvaus ei ole sitä nimenomaisesti sanonut- ·:-· kaan, että monoklonaalisia vasta-ainefragmentteja, mukaan - ' 25 lukien Fab- ja Fab2-fragmentit, voidaan käyttää kokonaisen vasta-aineen sijasta lukuunottamatta sitä, ettei Fab-frag-menttia voida yksin käyttää niissä sovellutuksissa, joissa tarvitaan bifunktionaalinen vasta-aine.

Nämä ja muut tämän keksinnön edut ovat itsestään 30 selviä alan asiantuntijoille. Sen mukaisesti tätä keksintöä katsotaan rajoittavan vain liitetyt patenttivaatimuk- • ’ ’": set.

Claims (9)

10 87532

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka on spesifinen kompleksille, joka käsittää 5 kelatoivan aineen ja metalli-ionin, ja vasta-aineen asso-siaatiovakio (KA) kompleksille on vähintään kymmenen kertaa suurempi kuin vasta-aineen KA pelkälle kelatoivalle aineelle tai sen kompleksille minkä tahansa muun metalli-ionin kanssa, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vas- 10 ta-aine tuotetaan solulinjalla, joka on saatu fuusioimalla pernasoluja, jotka on immunisoitu metallikelaatilla, ja ei vasta-ainetta tuottava myeloomasolulinja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metalli-ioni on radioaktiivinen 15 isotooppi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on bifunktionaalinen vasta-aine, jonka yksi spesifisyys kohdistuu kelatoivan aineen ja metalli-ionin muodostamaan 20 kompleksiin ja toinen antigeeniin, joka on jokin muu kuin mainittu kompleksi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n- ' : ] n e t t u siitä, että toinen spesifisyys kohdistuu kas- ;·! vaimeen liittyvään antigeeniin. •;·-· 25 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n- . n e t t u siitä, että metalli-ioni on radioaktiivinen isotooppi, jonka radioaktiivisen hajoamisen tuote on metalli-ioni, jonka atomiluku on eri kuin mainitun metalli-. . ionin, ja vasta-aineen KA hajoamistuotteen ja kelatoivan ; 30 aineen muodostamalle kompleksille on pienempi kuin 1 x io7 m-1.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, t u n-·' '· n e t t u siitä, että vasta-aineen KA hajoamistuotteen ja kelatoivan aineen muodostamalle kompleksille on pienempi • ·* 35 kuin noin 1 x 10b M'1. 11 87532

7. Menetelmä metalli-ionin osoittamiseksi nesteestä, tunnettu siitä, että a) saatetaan neste yhteen kiinteään faasiin sidotun kelatoivan aineen kanssa olosuhteissa, joissa muodostuu 5 kelaattikompleksi metallin kanssa; b) erotetaan neste kiinteästä faasista; c) saatetaan kiinteä faasi yhteen patenttivaatimuksen 1 mukaisesti tuotetun monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine sisältää leiman, joka sallii sen 10 läsnäolon osoittamisen ja /tai sen pitoisuuden määrittämisen; d) erotetaan sitoutumaton vasta-aine kompleksiin sitoutuneesta vasta-aineesta; e) osoitetaan kelaattikompleksiin sitoutunut vasta- 15 aine.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritetään sitoutuneen tai sitoutumattoman leimatun vasta-aineen määrä ja suhteutetaan se ionin pitoisuuteen nesteessä.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leima on radioaktiivinen al-... kuaine, fluoresoiva alkuaine tai entsyymi. 12 87532